专利名称：在微生物中生产重组蛋白质的方法
技术领域：
本发明涉及在微生物中生产重组蛋白质的方法。更具体地，本发明涉及在微生物中生产重组功能性纤溶酶原的方法和鉴定纤溶酶原激活剂的方法。
背景技术：
人体纤维蛋白溶解体系包含了一个核心成分—血纤维蛋白溶解酶(Pm，以下简称纤溶酶)。纤溶酶一方面可以降解纤维蛋白，另一方面可以激活基质金属蛋白酶(MMPs)和生长因子，而激活基质金属蛋白酶(MMPs)和生长因子在细胞外基质的降解和伤口愈合中共同发挥作用。
纤溶酶来源于它的前体分子—血纤维蛋白溶解酶原(以下简称纤溶酶原)。迄今为止，己知纤溶酶原的两种生理性激活剂(也被称为纤溶酶原激活剂，PA)。它们是组织型纤溶酶原激活剂(组织型PA，t-PA)和尿激酶型纤溶酶原激活剂(尿激酶型PA，u-PA)。此外，这套系统通过一套蛋白酶抑制剂如α2-抗纤溶酶进行调节。纤溶酶原和纤溶酶具有非常重要的生物学功能，这两种生物学功能分别与两种不同的激活剂直接相关。
所谓的t-PA介导的途径，负责调节体内纤维蛋白的动态平衡，而u-PA介导的途径在细胞移动和组织重塑方面作用突出。这一功能在当u-PA缺陷型小鼠罹患慢性、不愈合性创伤时，表现得尤为突出。纤溶酶原、t-PA和u-PA基因分别失活的小鼠会出现同样的病情。此外，特别是由于血栓形成和器官衰竭，实验动物的寿命明显缩短。关于纤溶酶原/纤溶酶系统的概述，已在Desire Collen出版的书中有所描述(《血栓形成和止血(Thrombosis and Haemostasis)》，82，1999(1))。
纤溶酶疗法适用于心脏病发作或中风患者的治疗，在这种情况下，快速溶解纤维蛋白凝块是存活所必需的，因此，所述纤溶酶疗法是除了使用纤溶酶原激活剂治疗患者之外的另一种方式，而纤溶酶原激活剂仅间接地促成了纤维蛋白凝块的水解。
上述提及的小鼠疾病模型，显示了纤溶酶还是一种潜在的治疗药物，用来治疗不愈合性创伤或仅仅愈合慢的创伤。
通常t-PA激活纤溶酶原只出现在纤维蛋白存在的情况下，即血液级联凝结完成之后。在缺乏底物的情况下，纤溶酶总是立即被α2-抗纤溶酶抑制。公认当纤溶酶结合到纤维蛋白上，并由此能激活纤维蛋白凝块溶解时，这种抑制作用明显减弱。
由于在心脏病发作或中风病例中，溶解血栓通常是病人存活所必需的，因此治疗中使用了不同的纤溶酶原激活方案。例如，注射链激酶使血管快速再通。因此，链激酶激活纤溶酶原，不是建立在蛋白水解活化的基础上，而是形成了复合物，然后，此复合物激活其它的纤溶酶原分子而使其转变为纤溶酶，所述链激酶是一种细菌蛋白。
对尿激酶治疗应用的进一步研究认为，如同链激酶一样，尿激酶在分子水平上不能区分结合到纤维蛋白上的纤溶酶原和游离的纤溶酶原。因此，开发了重组人t-PA，在临床研究中，已经证实重组人t-PA作用优于链激酶。但是，这种诊断学上的发现未能被其它研究证实。
利用分子遗传学的方法建立的生产体系在生产现代治疗中使用的重组蛋白中具有重要作用，而重组产生的诸如rt-PA(及其不同的衍生物)等的纤溶酶原激活剂、重组单链尿激酶-PA和重组葡萄球菌激酶又恰好突出显示了所述生产体系的重要性。
纤溶酶原是纤维蛋白溶解酶的前体分子。已经在科学文献中发表了人纤溶酶原的cDNA(Malinowski等，Biochemistry，23，1984(12)；Forsgren等，FEBS Lett.213，1987(2))和包含非编码内含子的基因(Petersen等，J.Biol.Chem.，265，1990(3))。
人纤溶酶原(hPg)是作为丝氨酸蛋白酶的纤溶酶的酶原，其是由791个氨基酸的多肽链组成的糖蛋白，分子量为92,000，理论等电点为7.1，糖基化比例为2％(Collen，1999，(1))。在肝脏内生成纤溶酶原，血浆浓度大约为200mg/l[1.5-2μM(微摩尔每升)]。
此分子分为7个结构域，包括N末端的前激活肽(Glu-1～Lys-77)，部分同源的五个环饼结构域(Kringle domain)和具有催化活性的蛋白酶结构域(Val-562～Asn-791；Collen，1999(1))。催化性三联体结构与所有的丝氨酸蛋白酶的结构一致，都由以下氨基酸构成His-603、Asp-646和Ser-741。环饼结构域1是纤溶酶原结合纤维蛋白的识别序列(Petersen等，1990(3))，也是纤溶酶原与不同的细胞表面受体结合的识别序列。
在翻译后修饰中，两个必需的糖基化位点Asn-289和Thr-346都位于环饼结构域3中，其对于纤溶酶原的功能尤为重要(具有分别被不同蛋白酶和链激酶激活的能力，还具有受体结合特性)。根据所述的修饰，区分两种主要形式的纤溶酶原—纤溶酶原I具有上述糖基化特性—纤溶酶原II缺少Asn-289糖基化修饰。
另一个糖基化位点是氨基酸Ser-248。氨基酸Ser-578可以以磷酸化形式存在。
在生物体内，纤溶酶原经氨基酸Arg-561和Val-562之间的蛋白水解切断而活化。随后，另一蛋白水解酶水解激活作用发生在Lys-77和Lys-78之间，形成Lys-78-hPg。或者在Glu-Pg中，所述化学键还可最先直接被水解掉。活化的纤溶酶Lys-78-hPm皆由二硫键连接。因此，hPm(1/78-561)的重链负责与底物相互作用，所述底物如纤维蛋白原和纤维蛋白。来源于C末端的轻链(562-791)是具有催化活性的亚单位。
从文献中已知，在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中重组生产纤溶酶原的纤维蛋白结合结构域的方法，其产量为17mg/l(Duman等，Biotechnol Appl Biochem.28；39-45，1998(4))。作者可证实这个结构域(环饼1-4)的糖基化位点。另一引文描述了人纤溶酶原的环饼4和5这两个结构域的生产(Guan等，Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao，17，2001(5))。该工作的目的是，鉴定能够抑制内皮细胞生长的结构域。
然而，由上述两个工作小组在巴斯德毕赤酵母中重组生产的纤溶酶原结构域，均不含有对生理功能具有决定性意义的催化结构域。
Gonzalez-Gronow等人(Biochimica et Biophysica Acta，1039，1990(6))相互比较了重组人纤溶酶原在大肠杆菌(Escherichia coli)和COS细胞(一种猿肾细胞系)中的表达。在大肠杆菌中的微生物生产是失败的，作者把其归咎于糖基化不充分。可以成功产生肽链，然而其是一种不能被激活的形式，即用激活剂(尿激酶和t-PA)处理后，不能产生活化的纤溶酶。
蛋白质缺乏糖基化，将会导致与活化能力相关的重要生理功能缺陷(没有检测到酶活性)，以及与内皮细胞识别相关的重要生理功能缺陷(Gonzalez-Gronow等，Biochimica et Biophysica Acta，1039，1990(6))。此外，用碳水化合物进行翻译后修饰，对蛋白质在哺乳动物血液中的半寿期有显著影响。
然而，该作者在COS细胞中生产出了功能性纤溶酶原。其他作者描述了在昆虫细胞中的功能性表达(Whitefleet-Smith等，Arch.Biochem.Biophys.，271，1989(7))。然而，在使用哺乳动物细胞和昆虫细胞时，具有下列缺点浪费时间、培养条件耗费大量成本以及得到的蛋白产量低。此外，在哺乳动物细胞中，由于要在细胞内表达蛋白，而细胞质中含有蛋白酶，所以不适于生产更多量的酶原[Nilsen和Castellino，蛋白质的表达与纯化(Protein Expression and Purification)，16，1999(8)；Busby等，J.Biol.Chem.，266，1991(9)]。通常在杆状病毒(baculovirus)/鳞翅目(lepidopteran)(昆虫细胞)系统中，此系统的表达产量为3-10mg/ml。
在公开号为WO0250290的专利申请中，公开了在酵母中重组生产功能性小纤溶酶原(mini-plasminogen)和微纤溶酶原(micro-plasminogen)的方法。为此，作者在作为宿主生物体的巴斯德毕赤酵母中，表达了含有环饼结构域的催化结构域基因(小纤溶酶原)或不含环饼结构域的人纤溶酶原(微纤溶酶原)。随后分别纯化这样重组产生的小纤溶酶原和微纤溶酶原，并分别加工成小纤溶酶和微纤溶酶，并通过动物实验证明了它们的活性。据称对于小纤溶酶原，重组蛋白的产量为100mg/l；对于微纤溶酶原，重组蛋白的产量为3mg/l。然而使重组蛋白产物的表达量更高是更为困难的，这在公开号为WO0250290的专利申请中得到了证实，在所述专利申请中，小纤溶酶原和微纤溶酶原的产量明显下降了2个数量级。未提及任何表达长片段纤溶酶原变异体的实施方案的例子，所述长片段纤溶酶原变异体如赖氨酸纤溶酶原(Lys-plasminogen)或谷氨酸纤溶酶原(Glu-plasminogen)。
在微生物中重组生产功能性纤溶酶原的方法尚未公开到本领域技术人员能够实施的程度。
发明内容
因此，本发明的目的在于以低廉的方法生产功能性人纤溶酶原，并进一步使其加工成为具有催化活性的纤溶酶。
如权利要求1所述，在微生物中重组生产纤溶酶原的方法完成了所述目的。在独立权利要求中提及了更多的解决方法。从属权利要求反映了优选的实施方案。
令人惊奇的发现是，在微生物中生产重组功能性谷氨酸纤溶酶原或赖氨酸纤溶酶原是可能的。在此基础上进一步研究表明，重组微纤溶酶原、小纤溶酶原、赖氨酸纤溶酶原和谷氨酸纤溶酶原可以达到意想不到的高表达量。
本发明的主题是采用分子遗传学方法，在表达载体中克隆纤溶酶原基因，所述纤溶酶原基因优选为微纤溶酶原和小纤溶酶原基因，更优选为谷氨酸纤溶酶原或赖氨酸纤溶酶原基因，或前述基因的每种功能变异体；和重组产生功能性纤溶酶原，优选为功能性人纤溶酶原。此外，本发明描述了一种蛋白酶的鉴定方法，所述蛋白酶催化纤溶酶原转变为纤溶酶。利用本发明分别生产出的纤溶酶原和纤溶酶，不会被动物蛋白或病毒所污染，所述污染通常出现在从人、牛和其它哺乳动物进行分离的过程中，并会导致患者的不良反应。
本发明的特征在于一种生产重组蛋白的方法，该方法至少包括以下步骤a)将至少编码纤溶酶原肽段的功能部分的核酸序列与至少编码一段信号肽的核酸序列融合，为切割信号肽，所述编码功能性纤溶酶原肽段的核酸序列和至少编码信号肽的核酸序列由蛋白酶的酶切位点密码子偶联。重组生产系统越来越多地生产治疗性蛋白产物。由于成本因素，要力争在微生物中，特别是细菌体内生产这种重组产物。所述系统具有以下优势除了产物价格相对低廉外，蛋白产量可以达到g/l级，并且重组蛋白不会被污染，该污染是指对患者有害的病毒或像朊病毒这样的蛋白。由于细菌生产系统通常不能生成正确折叠的蛋白，因此，除了对错误折叠的蛋白进行体外再折叠以外，常常在真核细胞系统中进行生产，所述真核细胞系统例如酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞。用于生产的真核细胞株和细胞系提供了有利条件，即它们可用来生产糖基化蛋白。但尤其是昆虫细胞或哺乳动物细胞来源的重组蛋白产物成本极高，并且通常产量非常低。此外，它们还有缺点，即可被对人体有害的病毒和蛋白质污染。所述被污染的情况不会出现在使用真核微生物情况下。真核微生物培养所需的仪器设备与细菌培养所需的设备相似，不会出现被哺乳动物病毒和蛋白污染的情况，并且蛋白产量可达g/l级。尤为合适的一种真核宿主生物体是酵母的一个分支，优选为子囊菌门(Ascomycota)。更优选Saccharomycotina，尤其是酵母(Saccharomycetes)纲，其中酵母(Saccharomycetales)目尤为重要。根据更优越的实施方案，宿主应为酵母(Saccharomycetaceae)科，尤其是毕赤酵母属(Pichia)。本发明优选的示例性真核微生物为面包师常用的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，其它的例如念珠菌属(Candida)，属于甲醇营养酵母的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇营养性的毕赤酵母(Pichiamethanolica)和多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)，或曲霉属(Aspergillus)的丝状真菌如黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)和构巢曲霉(Aspergillus nidulans)。特别优选的是巴斯德毕赤酵母。
所述重组产物的生产方法另一特征在于，将至少编码纤溶酶原的功能部分的核酸分子整合入这些微生物中使用的表达载体，这些优选编码人纤溶酶原的核酸分子，与编码至少一个信号肽[优选为一段前肽原(prepropeptide)，优选用于转运至内质网]的核酸分子融合；蛋白酶切点的密码子插入所述两个核酸分子之间，可以在宿主体内，切割信号序列或前肽原。优选使用的核酸分子是编码人纤溶酶原的核酸分子。除了编码人纤溶酶原的核酸分子以外，也可以使用那些编码来源于其它哺乳动物纤溶酶原的核酸分子。这样，就可以生产各种哺乳动物的纤溶酶原。根据本发明的方法通过过量表达可以形成重组的人纤溶酶原，如果需要，它可以被分泌进培养基，并根据目前熟练技术人员己知的方法，将其通过离心、过滤或沉淀与培养基中的宿主细胞分开，并进行蛋白纯化，而不需要复杂的细胞裂解过程。可通过蛋白酶将纤溶酶原激活成为纤溶酶，这种蛋白酶具有将纤溶酶原加工为具有催化活性的纤溶酶的能力。
在本发明中使用的下列术语的定义为“重组生产方法”意思是，在适当的宿主中，核酸序列(优选为DNA序列)表达生成肽或蛋白质，所述核酸序列来源于一个克隆，以及单个核酸片段的融合产物。
本文所述的“克隆”应包括现有技术中的所有已知克隆方法。然而，不会详细描述所述方法，因为它们属于本领域技术人员显而易见的常用技术。
本文所述的“在合适的表达系统中表达”应包括现有技术中的所有已知表达方法，尤其是在权利要求书中提及的表达方法。
在“功能性纤溶酶原肽段部分”这一术语中，应该理解为能完成纤溶酶原相关的生物学功能的部分纤溶酶原或纤溶酶原肽段(plasminogen-peptide)。这些相关的生物学功能至少具有能被纤溶酶原激活剂激活成为纤溶酶的能力，所述激活剂例如是组织纤溶酶原激活剂、尿激酶、吸血蝙蝠(vampire-bat)纤溶酶原激活剂、链激酶、葡萄球菌激酶(以下简称葡激酶)和来源于鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)的Pla蛋白等；和蛋白水解的能力，其特征在于水解纤维蛋白。在本说明书和实施例中所用的术语“纤溶酶原激活剂”，应指能进行蛋白水解和不能进行蛋白水解的纤溶酶原激活剂。
此外，谷氨酸纤溶酶原应理解为，通过纤溶酶催化切割前激活肽(preactivation peptide)，所述谷氨酸纤溶酶原具有被加工成为赖氨酸纤溶酶原的能力。
纤溶酶原结合到纤维蛋白、层粘连蛋白、纤维结合素、透明连接蛋白、硫酸乙酰肝素糖蛋白、4型胶原和其它底物后，其激活能力可提高到1000倍，同样，所述激活能力属于生物学功能。
应理解加工纤溶酶原后获得的纤溶酶应该确保具有纤溶酶相关的生物学功能，其中包括以下物质的降解层粘连蛋白、纤维结合素、透明连接蛋白和硫酸乙酰肝素糖蛋白；以下物质的激活前胶原酶、前基质金属蛋白酶、潜在的巨噬细胞弹性蛋白酶、激素原和生长因子，该生长因子例如TGFβ-1(潜在的转化生长因子)，VEGF(血管内皮生长因子)或bFGF(基本成纤维细胞生长因子)。
纤溶酶的另一项生物学功能是被纤溶酶抑制剂所抑制的能力，所述纤溶酶抑制剂如α2-抗纤溶酶和α2-巨球蛋白。
根据纤溶酶的相关生物学功能，其功能不仅还包括结合纤维蛋白、层粘连蛋白、纤维结合素、透明连接蛋白、硫酸乙酰肝素糖蛋白和4型胶原，也包括结合受体如α-烯醇酶、膜联蛋白(annexin)II或兼性因子(amphoterin)。
最初，形成的所有的纤溶酶原都是无活性的谷氨酸纤溶酶原形式。这种谷氨酸纤溶酶原，可被纤溶酶切割所述的前激活肽而生成赖氨酸纤溶酶原。两者都可被组织纤溶酶原激活剂(在这种情况下，仅指上述蛋白水解激活剂)通过蛋白酶水解切割生成纤溶酶，该纤溶酶由二硫键连接的亚单位组成。较小的亚单位包括蛋白水解结构域和磷酸化位点，较大的亚单位携带有三个糖基化位点，并负责结合到纤维蛋白。糖基化位点的重要性进一步表现在血浆中的稳定性上。纤溶酶原通过与链激酶或葡激酶形成1∶1的复合物，纤溶酶原又可以转化成一种具有蛋白水解活性的酶，该酶能够将纤溶酶原加工为纤溶酶。
据此，功能性纤溶酶原是指一种这样的纤溶酶原，其能够被纤溶酶原激活剂作用而成为具有蛋白水解活性的纤溶酶。进一步地，功能性纤溶酶原，优选包括纤维蛋白结合结构域，并可至少包括三个糖基化位点中的一个。
功能性纤溶酶原的最小形式是微纤溶酶原和小纤溶酶原，稍大的形式是赖氨酸纤溶酶原。谷氨酸纤溶酶原，其仍然包括前激活肽，也是功能性纤溶酶原。然而可以想象的是，所述区域可被忽略，尤其存在于长链中而没有显著妨碍所述功能(尤其是蛋白水解功能、纤维蛋白结合功能)的区域。
制造不同形式的包括功能性催化结构域的纤溶酶原(以下称为纤溶酶原衍生物)对于熟练技术人员来说显而易见。就已描述的功能而言，应理解在被纤溶酶原激活剂激活后，所述纤溶酶原变异体具有的蛋白水解特性，所述纤溶酶原激活剂如链激酶或尿激酶。
—催化结构域可包括，缺失和置换的氨基酸，或与其它氨基酸或肽或蛋白融合。
—大结构域可包括从Glu20到Arg580的所有中间区域(基于前纤溶酶原序列)，它可被纤溶酶原激活剂激活生成活化的纤溶酶。
以下是三种形式的赖氨酸纤溶酶原的具体实施例变异体1N末端氨基酸Met88变异体2N末端氨基酸Lys97变异体3N末端氨基酸Val98优选，纤溶酶原衍生物比相应的微-、小-、Lys-或Glu-纤溶酶原短或长大约1至50个氨基酸；或优选以置换了1至10个氨基酸为特征，此外，所述衍生物显示被纤溶酶原激活剂激活的特性。在这些特定的微-、小-、Lys-或Glu-纤溶酶原及相应的纤溶酶原衍生物间，序列的同源性(序列匹配)超过80％，优选超过85％，更优选超过90％，更进一步优选超过95％，特别优选超过98％，更进一步特别优选超过99％。
优选纤溶酶原衍生物具有如下特征—催化结构域可包含，至少一个缺失，和/或至少一个氨基酸的置换，和/或与至少另一氨基酸或至少另一肽段或至少另一蛋白融合；—大结构域可包含从Glu20到Arg580的所有中间区域(基于前纤溶酶原序列)，它可被纤溶酶原激活剂激活生成活化的纤溶酶；—纤溶酶原衍生物，其特征是氨基酸序列的同源性(序列匹配)超过80％，优选超过85％，更优选超过90％，更进一步优选超过95％，更进一步特别优选超过99％。
“微生物”包括所有具备了微小个体特征的生命形式。因此，其既包括真核微生物，也包含了原核微生物。特指细菌、酵母、真菌和病毒。
“核酸”包括DNA和RNA，两者均为所有可能的构型，例如，双链形式的核酸、单链形式的核酸、它们的组合物、以及线装或环状的核酸。
应理解“信号序列”是一段肽链的序列，它能够保证另外一段肽链序列进入或穿越生物膜，例如进入内质网。因此，所述信号序列的例子可以是前肽原(prepropeptide)、前肽(prepeptide)或原肽(propeptide)。
“切点”是指在肽链序列中的位点，所述位点为在宿主生物体内进行如下加工提供了位点从另一肽段序列切割掉信号序列、前肽原或原肽，或通常将一段肽段序列切割成两部分。
“编码至少一个信号肽或前肽原的核酸”是指一个核酸序列，它编码了一个肽段或蛋白结构，所述肽段或蛋白结构帮助其它多肽穿越生物膜，例如进入内质网。
“引物”是指一种起始寡核苷酸。意思是短链、单链、寡聚核糖核酸或脱氧核糖核酸，其可与单链核酸分子的某个区域互补，并与之杂交形成双链。双链中游离的3’-羟基末端可作为DNA聚合酶的底物，并作为将整个单链合成双链的聚合反应的起点。引物专门应用于PCR，即聚合酶链式反应，所述反应为本领域技术人员所知晓。
“质粒”是指核酸分子，它不被整合进入染色体，而是出现在很多原核微生物和一些真核微生物中，长度大约为2kb至超过200kb。
“连接”指通过连接酶连接两个核酸分子的末端或自身连接，自身连接即指经分子内的闭环反应而完成的连接，其中倘若一个线性DNA分子的两个单链末端能够彼此形成碱基对，两者将会二聚化。
“限制性核酸内切酶”是指一类细菌产生的酶，它能够切开DNA双链分子的特定碱基序列中的磷酸二酯键。
“电穿孔”是一种介导核酸进入细胞的方法。因此当受体细胞暴露于核酸溶液时，利用高场强的短暂电脉冲，使在悬液中生长至对数期的受体细胞的细胞膜局部通透高分子量的分子。
应理解“过量表达”是指，与野生型细胞的产量相比，细胞生产功能性纤溶酶原的产量增加。通常，过量表达是指，当在细胞内生产时，外源基因的表达量约占宿主细胞的全部细胞内蛋白总量的1～40％。
应理解“表达载体”是指这样的载体，当该载体进入合适的宿主细胞后，其能转录克隆入该载体的外源基因，并随后以形成的mRNA(信使RNA)进行翻译。表达载体通常包含控制信号，该控制信号在原核或真核细胞的基因表达中是必需的。
在本发明中，优选可被甲醇诱导的启动子如AOX1-启动子，或特别优选组成性启动子如YPT1-启动子或GAP-启动子，所述启动子被用来控制酵母中的基因的表达，所述酵母如巴斯德毕赤酵母。特别优选为组成性的GAP-启动子。
“AOX1”是源自巴斯德毕赤酵母的乙醇氧化酶1的基因；“GAP”是源自巴斯德毕赤酵母的甘油醛-3-磷酸盐脱氢酶的基因；及“YPT1”是源自巴斯德毕赤酵母的GTP结合蛋白的基因。
由PHO-1、SUC-2、PHA-E或α-MF基因编码的蛋白的信号肽，通常应用在酵母的分泌产物中。
“PH01”是源自巴斯德毕赤酵母的酸性磷酸酶基因；“SUC-2”是源自酿酒酵母的分泌性转化酶基因；“PHA-E”是源自Phaseolus vulgaris Agglutinis的酸性磷酸酶基因；“α-MF”是源自酿酒酵母的α-杂交因子基因。
特别优选的是蛋白酶切点的密码子，及蛋白酶Kex2或Ste13切割原肽的切点的密码子。特别优选在上述步骤a)用密码子进行所述连接，所述密码子编码Kex2切点和另外两个Ste13切点。在本发明的一个优选实施方案，编码信号肽或前肽原的核酸分子来源于酵母，尤其来源于酿酒酵母。在一个更优选实施方案中，涉及编码信号肽或前肽原的核酸分子，该核酸分子编码酿酒酵母的α-因子的信号肽或前肽原。在上述步骤a)中描述的所形成的融合产物优选通过PCR扩增，并进一步优选进行适当的纯化。
在公开号为WO02/50290的专利申请中，公开了通过适用于酵母的表达载体pPICZαA重组产生小纤溶酶原和微纤溶酶原，所述载体含有可诱导的AOX1-启动子和酵母α-因子的前肽原。这些较小的纤溶酶原变异体没有(如微纤溶酶原)，或仅有一个(如小纤溶酶原)环饼结构域。表达载体pPICZαA包含蛋白酶Kex2和Ste13切点。但在小纤溶酶原和微纤溶酶原相应的表达载体中，Ste13切点被删除。
已知酵母中用于可诱导的表达体系的一组启动子。到目前为止尤其包括，AOX1-启动子、AOX2、CUP1(Koller A，Valesco J，SubramaniS.，Yeast 200016(7)，651-6)、PH01(EP0495208)、HIS4(US 4885242)，FLD1(Shen等，Gene 1998216(1)，93-10)和XYL1-启动子(Den Haan和Van Zyl，Appl.Microbiol.Biotechnol.200157(4)，521-7)。
通过甲醇诱导的AOX1-启动子的方法，可以选择性地定向生产异源的蛋白，并且可以得到均一的数量。在诱导外源蛋白进行表达之前，使宿主生物体可达到高的生长密度而没有在表达外源蛋白中发生的筛选缺陷。
公开号为WO02/50290的专利申请中，在AOX1-启动子控制下表达了较小的变异体，与所述较小的变异体相反，本发明中重组生产的谷氨酸纤溶酶原和赖氨酸纤溶酶原包含了所有的五个环饼结构域，由于以下原因，使其重组生产变得复杂化—宿主在表达外源蛋白时，由于其生长缺陷，可能会导致表达元件丢失；—表达蛋白的蛋白水解降解；和—低产量。
由于所述的缺陷，在公开号为WO02/50290的专利申请中未公开谷氨酸纤溶酶原和赖氨酸纤溶酶原的生产。
在本发明中，尤其通过以下方式这些困难已被解决重组蛋白包含了信号肽、Kex2和至少一个Ste13，优选两个Ste13蛋白酶切点。进一步来说，一个优选的实施方案中，供应作为另一种碳源的甘油，其速率为0.1至10ml/h，更优选为0.5至5ml/h，进一步优选为0.8至1.5ml/h。培养基是pH7.0的中性缓冲体系。注意保证充分的氧供应。
在一个优选实施方案中，应注意重组核酸未连接到AOX1基因的5’端，而是连接到了源自巴斯德毕赤酵母的磷酸甘油醛脱氢酶基因的5’端。在这里，使用了组成性的、不能被诱导的启动子。可使用的在酵母中有活性的组成性启动子是GAP-启动子、YPT1-启动子(Sears等，Yeast199814(8)，783-90)、TKL-启动子(Den Haan和Van Zyl，Appl.Microbiol.Biotechnol.200157(4)，521-7)、ACT-启动子(Kang等，Appl.Microbiol.Biotechnol.200155(6)，734-4”和PMA1-启动子(Yeast200016(13)，1191-203)。优选的启动子是GAP-启动子和YPT1-启动子。特别优选的启动子是GAP-启动子。
与可诱导的启动子相反，组成性的启动子有其缺陷，即要表达的外源蛋白在整个生长周期持续组成性生成。这是对宿主细胞的不利条件，尤其表现为宿主细胞生长延缓。由于优势选择压力，丢失了重组表达元件的宿主细胞具有生长优势，并能过度生长重组宿主细胞。这样，可出现异源混和种群中，而异源混和种群是应当避免的。然而令人惊讶的发现是，根据本发明优选的实施方案，组成性GAP-启动子能产生更高的产量。
当应用AOX1-启动子时，赖氨酸纤溶酶原的产量在诱导120小时后可以获得至少17U/l(单位/升)(＝1.5mg/l)，进一步优选为120U/l(＝11mg/l)，更优选为180U/l(＝16mg/l)，更进一步优选是200U/l(＝18mg/l)，再优选是220U/l(＝20mg/l)，再进一步优选是240U/l(＝22mg/l)，特别优选是260U/l(＝24mg/l)，更特别优选是280U/l(＝25.5mg/l)；在使用组成性启动子，特别是GAP-启动子时，产量显著升高。
在一个优选的实施方案中，组成性的启动子如GAP-启动子与核酸可操作性偶联，所述核酸编码至少纤溶酶原序列的功能部分，并与编码至少一段信号肽的核酸序列融合，所述编码功能性纤溶酶原的核酸序列和编码至少信号肽的核酸序列用蛋白酶的酶切位点密码子偶联，该蛋白酶用于切割信号肽。
在特别优选的实施方案中，组成性的启动子如GAP-启动子，可操作性偶联控制微-、小-、Lys-或Glu-纤溶酶原核酸序列，此序列与源自酵母的信号肽的核酸序列融合。
这可看作是一个令人惊奇的发现，根据本发明的优选实施方案，组成性GAP-启动子可达高于10倍的产量(见实施例7c，赖氨酸纤溶酶原的生产，1375U/l，可换算为125mg/l)。在另一个优选实施方案中，供应作为另一种碳源的甘油，速率为0.1至10ml/h(毫升/小时)，更优选为0.5至5ml/h，进一步优选为0.8至1.5ml/h，培养基是pH＝7.0的中性缓冲体系。因此，生长速度μ[l/h]介于0.002和0.10之间，优选在0.004和0.020之间，进一步优选在0.008和0.010之间。
在应用GAP-启动子中，在发酵持续250小时后，获得的赖氨酸纤溶酶原的产量至少为660U/l(＝60mg/l)，优选为1000U/l(＝91mg/l)，再优选为1500U/l(＝136mg/l)，进一步优选为2000U/l(＝182mg/ml)，特别优选为2500U/l(＝227mg/l)，进一步特别优选为2750U/l(＝250mg/l)。
因此，重组小纤溶酶原和微纤溶酶原产物可获得更高的表达量。小纤溶酶原的产量介于每升100mg到2g之间，优选为300mg/l-1.5g/l，进一步优选为400mg/l-1g/l，更进一步优选为500mg/l-800mg/l，特别优选为600mg/l-700mg/l。微纤溶酶原的产量至少高于小型纤溶酶原产量的10％。相较于赖氨酸纤溶酶原重组产物，获得的谷氨酸纤溶酶原重组产物的产量稍低。
本发明所述的方法，适用于生产小-、微-、Lys-和Glu-纤溶酶原。因此，优选实施方案也集中在重组产生小-、微-、Lys-和Glu-纤溶酶原上，在表达载体上所述小-、微-、Lys-和Glu-纤溶酶原均与信号序列或前原序列(prepro sequence)偶联，这些载体包含了组成性启动子如GAP-启动子。在进一步优选的实施方案中，信号序列由信号肽或酿酒酵母的a因子的前肽原组成。在特别优选实施方案中，组成性启动子如GAP-启动子，可操作性地与Seq.ID.No.7或9，或Seq.ID.No.13或15中的一个，或Seq.ID.No.50至59中的一个的核酸序列相偶联，并在适当的表达载体中表达。
在另一优选的实施方案中，组成性启动子如GAP-启动子，可操作性地与编码至少包含纤溶酶原功能部分的核酸序列相偶联。在一个特别优选的实施方案中，组成性启动子如GAP-启动子，可操作性地与Seq.ID.No.13、15、7和9，或Seq.ID.No.50至59中的一个相偶联，或与Seq.ID.No.11的核酸序列相偶联，并在适当的表达载体中表达。
谷氨酸纤溶酶原(用EditSeqTM(DNASTAR)程序计算数据)分子量88431.67Dalton(道儿顿)791个氨基酸pH＝7.0时，7.121等电点为1.351糖基化作用位点0-268、N-308、0-365(根据由810个氨基酸组成的前纤溶酶原的顺序编号)赖氨酸纤溶酶原(用EditSeqTM(DNASTAR)程序计算数据)分子量为79655.71Dalton741个氨基酸pH＝7.0时，7.492等电点为5.287糖基化作用位点0-268、N-308、0-365(根据由810个氨基酸组成的前纤溶酶原的顺序编号)小纤溶酶原(用EditSeqTM(DNASTAR)程序计算数据)分子量为38169.63Dalton348个氨基酸pH＝7.0时，7.203等电点为0.893糖基化作用位点无微纤溶酶原(用EditSeqTM(DNASTAR)程序计算数据)分子量为27230.41Dalton249个氨基酸pH＝7.0时，7.934等电点为3.733糖基化作用位点无本发明所述的方法详细描述如下本发明步骤a)产生的融合产物，能够被整合到适合于微生物的表达载体中。所述表达载体优选从下列载体中挑选pPICZαA、B和C，pPICZA、B和C，pGAPZαA、B和C，pGAPZA、B和C，pPIC6αA、B和C，pPIC6A、B和C，以及pAO815、pPIC3.5K和pPIC9K。更优选使用连接的方法，导入表达载体。在用T4DNA连接酶连接之前，PCR产物和表达载体优选使用限制性核酸内切酶KspI和XhoI酶切。连接后的核酸可通过电穿孔转化到优选大肠杆菌的微生物中，可从由此获得的微生物中提取出DNA，并优选使用内切酶XhoI或SfuI和KspI，进行酶切分离。由此获得的核酸可以是一种质粒，优选选自下列质粒pMHS476.1、pSM54.2、pSM49.8、pSM82.1、und pSM58.1、pAC37.1、pJW9.1、pPLG1.1、pPLG2.1、pPLG3.2、pPLG4.2、pPLG5.3、pPLG6.1、pPLG7.1、pPLG8.3、pPLG9.1、pPLG10.1、pPLG11.2、pPLG11.2、pPLG13.1、pPLG14.2、pPLG15.1、pPLG16.3、pPLG17.2、pPLG18.1、pPLG19.2或pPLG20.1。用于上述扩增的两个寡核酸引物，可优选选自如下序列NO34(Seq.ID No.1)、NO36(Seq.ID No.2)、NO36a(Seq.ID No.19)、NO36b(Seq.ID No.20)、NO36c(Seq.ID No.21)、NO36d(Seq.ID No.22)、NO36e(Seq.ID No.23)、NO36f(Seq.ID No.24)、NO36g(Seq.ID No.25)、NO36h(Seq.ID No.26)、NO36i(Seq.ID No.27)、NO36j(Seq.IDNo.28)、NO57(Seq.ID No.3)、NO37(Seq.ID No.4)、NO35(Seq.ID No.5)或NO56(Seq.ID No.6)。
根据本发明，下列实施方案是特别优选的—编码蛋白酶Kex2酶切位点和纤溶酶原融合基因的密码子，其特征性的核酸序列显示于Seq.ID No.7或13的序列中。
—编码蛋白酶Kex2酶切位点和纤溶酶原融合蛋白的密码子，其特征性的氨基酸序列特征显示Seq.ID No.8或14的序列中。
—编码蛋白酶Kex2、Ste13酶切位点和纤溶酶原融合基因的密码子，其特征性的核酸序列显示于Seq.ID No.9或15的序列中。
—编码蛋白酶Kex2、Ste13酶切位点和纤溶酶原融合基因的密码子，其特征性的氨基酸序列显示于Seq.ID No.10或16的序列中。
优选将从上述多个质粒中优选出的上述质粒，转化到宿主微生物中。可以采用如电穿孔的转化方法。使用的微生物优选为真核微生物，其是真菌的分支。优选的微生物是子囊菌门，其中优选Sacchariomycotina，其中更优选酵母纲，进一步优选为Saccharomycetales，更优选为Saccharomycetaceae科，其中特别优选的是毕赤酵母属、酵母属、汉逊属(Hansenula)和曲霉属(Aspergillus)。
根据本发明特别优选的实施方案，在转化了步骤a)所产生的融合产物的宿主微生物中，编码至少纤溶酶原功能部分的核酸序列呈过度表达状态，并且至少分泌出所述纤溶酶原功能部分，优选分泌到培养基中。根据另一优选的实施方案，纤溶酶原功能部分的核酸序列，是序列Seq.IDNo.60、61、62、63、64、65或66中的一个。根据另一种优选的实施方案，纤溶酶原功能部分的核酸序列与完整的纤溶酶原序列相一致。利用本发明所述的重组产物生产方法，优选生产人功能性纤溶酶原。
根据本发明所述的重组产物生产方法获得的纤溶酶原，或者所述纤溶酶原经蛋白酶作用后获得的纤溶酶，均能够用于生产治疗创伤的药物，尤其适用于治疗愈合慢或难愈性创伤，也能够用于治疗血栓形成事件或者预防血栓形成事件。
此外发现，根据本发明生产的纤溶酶原以及从中获得的纤溶酶具有抗凝特性。这些有利特性使得纤溶酶原和/或纤溶酶，还可以作为抗血栓剂和抗凝活性剂使用，可用于预防和/或治疗下列疾病心脏病发作、血栓形成、心瓣膜术后再狭窄、缺氧、缺血、凝固性坏死、血管炎；可用于以下疾病的后续治疗心脏病发作、搭桥手术、血管形成术、球囊扩张术。纤溶酶原还可用于急性心脏病发作中的溶栓治疗、动静脉短路的再通和急性心脏病发作中闭塞冠状动脉的再灌注。根据本发明生产的纤溶酶原，还可用于预防和治疗下列疾病急性肺栓塞、新发性的或陈旧性的静脉血栓凝结、急性和亚急性动脉血栓、静脉血栓、急性肢端动脉阻塞、慢性闭塞性动脉病、动静脉短路处血栓形成、臀部和肢端深静脉血栓、闭塞(desobliterated)血管区域的早期血栓形成、急性眼中央血管栓塞、I型纤溶酶原缺乏导致的结膜炎、烧伤和冻伤、碱或酸灼伤以及休克时弥漫性血管内凝血。
当患有上述疾病时，优选与抗凝剂一起使用纤溶酶原和/或纤溶酶。适用的抗凝剂为肝素、肝素衍生物或乙酰水杨酸。
因此，本发明所述的药物组合物也很重要，该药物组合物包含根据本发明所述重组产物生产方法获得的纤溶酶原或者由此获得的纤溶酶，以及所需的药物学上可接受的基质、添加剂和/或溶剂。此外，优选药物组合物可包含抗凝活性剂，尤其是肝素、肝素衍生物或者乙酰水杨酸。
根据本发明生产的纤溶酶原和/或由此获得的纤溶酶，用于创伤的体外治疗，优选以药物组合物形式用于创伤的局部治疗。在此应用中，纤溶酶原和/或纤溶酶的使用浓度为，每克药物组合物中含0.01-500U的纤溶酶原和/或纤溶酶，优选为0.1-500U，进一步优选为0.1-250U，更进一步优选为0.5-250U，特别优选的是1-150U。如果用膏药或其他敷料代替如软膏、糊剂或胶剂等半固体制剂的物质，需分别考虑每2cm2膏药表面积的上述给定的用药浓度和敷料表面积。
根据已知方法及适当剂量的所需应用类型，使用常用的固态、液态基质或稀释剂和普遍使用的药物辅剂来生产本发明所述的药物组合物。优选的药物制剂或组合物为适合局部外用的药物剂型。所述药物剂型例如，软膏、糊剂、胶剂、包衣、散剂、乳剂、悬浮剂或其他特殊制剂态，该特殊制剂如纳米分散系统，包括脂质体、纳米乳剂或脂质纳米颗粒的形式，也包括无表面活性剂的制剂、多聚体稳定的或微粒稳定的乳剂。
本领域普通技术人员已知各种制剂的生产方法和不同的应用方法，并在如“Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton PA”中有详细描述。
在以下情况下，将药物组合物制成为用于胃肠外给药的形式是合适的药物组合物用于预防和/或治疗下列疾病，心脏病发作、血栓形成、心瓣手术后再狭窄、缺氧、缺血、凝固性坏死、血管炎和急性心脏病发作；和用于以下疾病的后续治疗心脏病发作、搭桥手术、血管形成术和球囊扩张术。
此外、所述药物组合物也适各种系统的应用、包括急性肺栓塞、急性心脏病发作中溶栓治疗、新发性的或陈旧性的静脉血栓、急性和亚急性动脉血栓、动静脉短路再通、静脉栓塞、急性心脏病发作中闭塞冠状动脉的再灌注、急性肢端动脉阻塞、慢性闭塞性动脉病、动静脉短路血栓、臀部和肢端深静脉血栓、闭塞血管区域的早期血栓形成、急性眼中央血管栓塞、I型纤溶酶原缺乏导致的结膜炎、烧伤、碱或酸灼伤和冻伤以及休克时弥漫性血管内凝血。
所述药物组合物也可用于纤溶酶原缺乏的情况，例如遗传性或先天性(congenital)纤溶酶原缺乏(纯合子I型纤溶酶原缺乏)，所述纤溶酶原缺乏能导致木样结膜炎(conjunctivitis lignosa)或血栓形成倾向状态。也可通过例如静脉注射重组纤溶酶原，治疗上述疾病，所述纤溶酶原包括Glu-，Lys-，小-和微-纤溶酶原及其衍生物(Heinz等，Klin.Monatsblatt Augenheilkunde 2002，219(3)156-8)。
另一种可能的应用是，可通过施用纤溶酶原，消除呼吸道假膜，使呼吸道正常化，以及使创伤更快愈合。所述应用已经用于新生儿(The NewEngland Journal of Medicine 1998，339，23，1679-1686)。
重组产生的纤溶酶原与由此获得的纤溶酶一起使用，或在药物组合物中只加入纤溶酶，均适用于预防和/或治疗下列疾病急性肺栓塞、新发性的或陈旧性的静脉血栓、急性和亚急性动静脉血栓、动静脉短路再通、静脉栓塞、急性心脏病发作中闭塞冠状动脉的再灌注、急性肢端动脉阻塞、慢性闭塞性动脉病、动静脉短路血栓形成、臀部和肢端深静脉血栓形成、闭塞血管区域的早期血栓形成、急性眼中央血管栓塞、I型纤溶酶原缺乏导致的结膜炎、烧伤、碱或酸灼伤和冻伤以及休克时弥漫性血管内凝血。
优选含有本发明重组生产的纤溶酶原的药物组合物，其可适于下列疾病的局部治疗烧伤、冻伤、碱或酸灼伤、损伤和/或创伤，尤其是难愈性创伤。优选所述重组纤溶酶原与至少一种激活剂一起使用，所述纤溶酶原激活剂可以是例如尿激酶或链激酶。另一种优选的方法是，使用本发明生产的纤溶酶原前，通过激活剂将纤溶酶原完全或部分激活为纤溶酶，并将其用于上述适应症，此方法的药物制剂包括，单用纤溶酶或纤溶酶加纤溶酶原的形式。
特别值得考虑的胃肠外给药途径为静脉内施用、动脉内施用、腹膜内施用、皮下施用和肌肉施用。如果采用胃肠外给药途径，注射或输液用的溶液中的蛋白质浓度范围在0.1-100百万单位/10ml溶液，优选为10-100百万单位/10ml，进一步优选为1-10百万单位/10ml，特别优选为3-5百万单位/10ml。如果采用口服方式，则蛋白质浓度为0.1-100,000单位/克制剂，优选为100-80,000单位/克，特别优选为1,000-50,000单位/克。
具有进一步优点的药物制剂，例如，含有蛋白酶的膏药、敷料剂或其他外敷用物质。这些制剂特别适合于创伤愈合的局部用药，或用于下列疾病的治疗烧伤、冻伤、碱或酸灼伤和/或损伤。优选本发明重组生产的纤溶酶原用在药物组合物中，所述药物组合物尤其包括创伤愈合剂、软膏以及其他用于外敷的材料，它们与至少一种激活剂(所述纤溶酶原激活剂如尿激酶、链激酶)，或由前述激活剂预先激活形成的纤溶酶一起使用，在所述药物组合物和制剂中和/或上，纤溶酶潜在地与纤溶酶原一起使用，或潜在地与至少一种激活剂一起使用。在膏药和外敷用物质内和/或上特别优选使用纤溶酶原，优选纤溶酶原和一种激活剂；或纤溶酶或纤溶酶加纤溶酶原和一种激活剂，所述制剂适用于创伤治疗，尤其用于难愈性创伤的治疗，也可用于治疗烧伤、冻伤、碱或酸灼伤，或其他损伤。
敷料、创伤愈合敷料或膏药，含有本发明生产的纤溶酶原和/或由此获得的纤溶酶，其中，每平方厘米药物制剂含有0.01-500U纤溶酶原和/或纤溶酶，优选每平方厘米敷料或膏药分别含有0.1-500U纤溶酶原和/或纤溶酶。优选每平方厘米膏药或敷料中的药物制剂中，含有的纤溶酶原和/或由此产生的纤溶酶的浓度为0.1-250U，进一步更优选为0.5-250U，特别优选为1-150U。
为激活1mg纤溶酶原，尿激酶的用量为1ng(纳克)-100μg(微克)，优选用量为10ng-10μg。为激活1mg纤溶酶原，链激酶的用量为1μg-1mg，优选用量为3μg-300μg。为激活1mg纤溶酶原，从灰色链霉菌(S.griseus)来源的蛋白酶的用量为10ng-100μg，优选用量为100ng-10μg。为激活1mg纤溶酶原，蛋白酶VIII的用量为10ng-100μg，优选用量为100ng-10μg。
编码纤溶酶原功能部分的核酸序列优选是DNA序列。
另外，与本发明相关的质粒如下质粒pPLG1.1质粒pPLG2.1质粒pPLG3.2质粒pPLG4.2质粒pPLG5.3质粒pPLG6.1质粒pPLG7.1质粒pPLG8.3质粒pPLG9.1质粒pPLG10.1质粒pPLG11.2质粒pPLG11.2质粒pPLG13.1质粒pPLG14.2质粒pPLG15.1质粒pPLG16.3质粒pPLG17.2质粒pPLG18.1质粒pPLG19.2质粒pPLG20.1质粒pMHS476.1(保藏号DSM 14678)质粒pSM54.2(保藏号DSM 14682)质粒pSM49.8(保藏号DSM 14681)
质粒pSM82.1(保藏号DSM 14679)质粒pSM58.1(保藏号DSM 14680)质粒pAC37.1(保藏号DSM 15369)质粒pJW9.1(保藏号DSM 15368)。
(保藏号指德国微生物和细胞培养物保藏中心的保藏编号(GermanCollection of Microorganisms and Cell Cultures Ltd.，MascheroderWeg 1b，D-38124 Braunschweig)。
另外，本发明涉及适合表达的DNA序列，该序列包含至少编码纤溶酶原功能部分的核酸序列，该核酸序列可根据本发明所述的重组生产方法获得。此外，本发明还涉及宿主微生物，其包含融合产物和由此衍生出的一段核酸序列，所述融合产物见上述步骤a)。本发明还涉及载体、DNA分子或RNA分子，所述载体、DNA分子或RNA分子包含融合产物和由此衍生出的一个核酸序列，所述融合产物见上述步骤a)。
最后，本发明还涉及鉴定纤溶酶原激活剂的筛选方法，所述激活剂尤其指纤溶酶原激活性蛋白酶，其中，使用根据上述重组产物的生产方法来生产的功能性纤溶酶原。根据此目的，优选蛋白酶预温育后得到的纤溶酶，与根据本发明所述方法生产的功能性纤溶酶原一起测量活性。可使用一段合成肽来测量所得纤溶酶的活性。特别优选使用N-tosyl(甲苯磺酰)-Gly-Pro-Lys-pNA来测量所得纤溶酶的活性。
使用附图来更为详细地解释本发明，附图如下图1质粒pMHS476.1(5682bp)的物理图谱。α因子前肽原基因通过Kex2酶切位点的密码子，与人赖氨酸纤溶酶原基因连接，所述α因子前肽原基因在AOX1启动子的控制下。
图2质粒pSM54.2(5694bp)的物理图谱。α因子前肽原基因通过一个Kex2和两个Ste13酶切位点的密码子，与人赖氨酸纤溶酶原基因连接，所述α因子前肽原基因在AOX1启动子的控制下。
图3质粒pSM49.8(5715bp)的物理图谱。人前纤溶酶原基因在AOX1启动子的控制下。
图4质粒pSM82.1(5913bp)的物理图谱。α因子前肽原基因通过Kex2酶切位点的密码子，与人赖氨酸纤溶酶原基因连接，所述α因子前肽原基因在AOX1启动子的控制下。
图5质粒pSM58.1(5925bp)的物理图谱。α因子前肽原基因通过一个Kex2和两个Ste13酶切位点的密码子，与人谷氨酸纤溶酶原基因连接，所述α因子前肽原基因在AOX1启动子的控制下。
图6质粒pAC37.1(11400bp)的物理图谱。α因子前肽原基因通过一个Kex2和两个Ste13酶切位点的密码子，与人赖氨酸纤溶酶原基因连接，所述α因子前肽原基因在AOX1启动子的控制下。
图7质粒pJW9.1(5925bp)的物理图谱。α因子前肽原基因通过一个Kex2和两个Ste13酶切位点的密码子，与人赖氨酸纤溶酶原基因连接，所述α因子前肽原基因在GAP启动子的控制下。
图8质粒pPLG1.1的物理图谱。α因子前肽原基因通过一个Kex2和两个Ste13酶切位点的密码子，与人小纤溶酶原基因连接，所述α因子前肽原基因在AOX1启动子的控制下。
图9质粒pPLG11.2的物理图谱。α因子前肽原基因通过一个Kex2和两个Ste13酶切位点的密码子，与人小纤溶酶原基因连接，所述α因子前肽原基因在GAP启动子的控制下。
图10通过Klrhof分析检测纤维蛋白溶解活性。
图11实施例6g中纯化的馏分在7.5％的SDS-PAGE电泳的结果。
具体实施例方式
根据本发明，能够具有糖基化作用和分泌蛋白(如果需要)特性的所有微生物都可以作为宿主生物体。举例如下酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、多形汉逊酵母曲霉属的丝状真菌。
在药物制剂中特别考虑使用根据本发明分别生产的功能性纤溶酶原和纤溶酶。在这样的制剂中，功能性纤溶酶原可以与药物可接受的基质、辅剂和其他本领域技术人员已知的辅剂或添加剂混合使用。
原肽上存在着能被Kex2蛋白酶切割的Kex2酶切位点，所述Kex2蛋白酶位于高尔基体中。该蛋白酶也被称作蛋白酶YscF或Kexin，是一种能够加工原蛋白的丝氨酸蛋白酶，其从基本氨基酸对(basic amino acidpairs)(如Lys-Arg)切割C末端。
原肽上存在着能被Ste13蛋白酶切割的Ste13酶切位点，所述Ste13蛋白酶位于高尔基体中。蛋白酶Ste13(也被称作蛋白酶YscVI或二肽氨肽酶A)分布于晚期的高尔基体，能够逐步水解N端的Xaa-Ala二肽，如酿酒酵母未成熟的α因子的N端的Xaa-Ala二肽。
除了蛋白酶Kex2和Ste13的酶切位点外，也可以插入其他酶切位点，所述其他酶切位点可被位于内质网或高尔基体中的蛋白酶识别为底物。
也可以只与纤溶酶原基因的信号序列(前肽)融合，该信号序列负责将产物转运进内质网，即，在所述过程中诸如酿酒酵母的杂交因子原肽并非必须。
本领域技术人员熟知在实施例中涉及的微生物学、分子生物学和蛋白质化学的方法。以下是参考书目Maniatis等，Molecular CloningA Laboratory Manual(分子克隆实验室手册)，Cold Spring Harbor press(冷泉港出版社)，1989(10)；Gassen & Schrimpf，Genetic EngineeringMethods(基因工程方法)，Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，1999(11)；EasySelectTMPichia Expression Kit Instruction Manual(EasySelectTMPichia表达试剂盒操作手册)，Invitrogen，Groningen，荷兰，目录号K1740-01。巴斯德毕赤酵母菌株和表达系统均可购自Invitrogen，并在上述操作手册中有所描述。
pPICZA、B和C是3.3kb的巴斯德毕赤酵母表达载体，该载体较短。载体上存在梅衣灵(zeocin)抗性基因，用来直接筛选巴斯德毕赤酵母转化体。此外，该载体上存在C端标记序列，用来快速纯化和检测融合蛋白。pPICZalpha A、B和C是3.6kb的巴斯德毕赤酵母表达载体，也具有梅衣灵抗性基因和上述的C端标记序列。此外，它们还包含酿酒酵母α因子分泌信号，用于把蛋白有效地分泌到培养基中。
此外，纤溶酶原能够被激活。纤溶酶原和一种蛋白酶孵育后能被激活，所述蛋白酶采用本发明的筛选方法鉴定。
优选纤溶酶原与下列酶一起温育来源于灰色链霉菌的蛋白酶、蛋白酶VIII、蛋白酶XVIII、无花果蛋白酶、金属内肽酶、梭菌蛋白酶、谷氨酸-C端内蛋白酶、蛋白酶XIII、蛋白酶A、胰蛋白酶、天冬氨酸-N端内蛋白酶或弹性蛋白酶。
进一步可以设想，通过t-PA、u-PA或vb-PA[吸血蝙蝠-PA]与纤溶酶原孵育来激活纤溶酶原。
在另一种优选的实施方案中，纤溶酶原通过与葡激酶和链激酶一起孵育而被激活。链激酶或葡激酶与纤溶酶原形成一种1∶1复合物。通过形成这种复合物，复合物中的纤溶酶原的构象发生改变，从而其具有蛋白水解活性，并能激活纤溶酶原使之转变为纤溶酶。
根据本重组方法获得的功能性纤溶酶原，或活化的功能性纤溶酶原，均具有水解纤维蛋白的能力。所述纤溶酶原也具有激活原基质金属蛋白酶和生长因子的能力。
将通过下列实施例更详细地说明本发明。
实施例1a扩增赖氨酸纤溶酶原基因，所述基因在5’端插入Kex2酶切位点的密码子使用QIAGEN质粒中提试剂盒(QIAGEN，Hilden)，从HB101大肠杆菌株(含有pPLGKG)中提取质粒pPLGKG(Forsgren等，FEBS Lett.1987年3月23日；213(2)254-60(2))，该质粒含有前-谷氨酸-纤溶酶原(pre-Glu-plasminogen)基因。用10U的EcoRI限制性内切酶(Roche，Mannheim)酶切150ng pPLGKG-DNA使之线性化，随后使用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN，Hilden)纯化DNA。用引物NO34(Seq.ID No.1)和NO36(Seq.ID No.2)扩增纤溶酶原基因。除与纤溶酶原基因互补的碱基外，寡核苷酸引物NO36还具有Kex2酶切位点的密码子。每个反应体系包含0.5U Pwo-DNA-聚合酶(Hybaid，Heidelberg)、400nM的寡核苷酸引物、200μM dNTP、3ng的线性pPLGKG-DNA和各自的反应缓冲液，终体积为50μl。引物结合温度为58℃。
通过琼脂凝胶电泳来检测PCR产物条带预期大小是否正确，并用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化。
实施例1b把纤溶酶原基因克隆到pPICZaA载体中取400ng的PCR产物用各10U的KspI和XhoI(Roche，曼海姆)限制性内切酶酶切。质粒pPICZαAA(Invitrogen，Groningen，荷兰)含有来源于酿酒酵母α-因子的前肽原序列，取300ng所述质粒的DNA也用10U的KspI和XhoI限制性内切酶酶切。在0.9％琼脂糖凝胶上分离酶切后的DNA，用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN，Hilden)从凝胶中回收获得的片段。将载体DNA和插入DNA混合并在1U T4-DNA-连接酶(Roche，曼海姆)作用下，4℃连接过夜。
随后用QIAquick PCR纯化试剂盒，纯化该批连接产物DNA，将所述纯化产物通过电穿孔用于转化大肠杆菌JM109。
将电穿孔转化后的JM109大肠杆菌细胞，接种入1ml SOC培养基中，37℃培养1小时，然后铺于加有20μg/μl梅衣灵(Invitrogen，Groningen，荷兰)的LB琼脂固体琼脂基上，37℃温育过夜。
从一个由此获得的大肠杆菌中，使用QIAGEN质粒小提试剂盒(QIAGEN plasmid mini kit，QIAGEN，Hilden)提取DNA，用XhoI和KspI限制性内切酶酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳分离出300ng核酸。分离出的质粒包含预期大小的片段，该质粒被称作pMHS476.1(图1)。通过序列分析，确定融合基因的序列正确无误，该融合基因由源自酿酒酵母α-因子前肽原基因、赖氨酸纤溶酶原基因以及蛋白酶Kex2酶切位点的密码子组成(Seq.ID No.7)。
实施例1c用质粒pMHS476.1转化巴斯德毕赤酵母使用QIAGEN质粒中提试剂盒(QIAGEN plasmid midi kit，QIAGEN，Hilden)从JM109大肠杆菌株(含pMHS476.1)中，提取纤溶酶原的表达载体pMHS476.1质粒DNA。用100U PmeI(New England Biolabs，Frankfurt)酶切10μg pMHS476.1-DNA使其线性化，按照EasySelectTMPichia表达试剂盒操作手册所示方法，将其电穿孔转化到巴斯德毕赤酵母KM71H株中，该KM71H株的基因型为his4HIS 4 arg 4 aoxl巴斯德毕赤酵母Y-11430株的ARG 4(Northern Regional Research Laboratories，Peoria，美国)。所述克隆在YPDS固体培养基里生长三到四天后，铺板于含有100μg/ml梅衣灵的YPDS固体培养基并培养，并用于接种液态培养基。将所述克隆命名为巴斯德毕赤酵母KM71H/pMHS476.1-1/a，此处“a”代表从1开始的克隆的连续编号。
实施例1d巴斯德毕赤酵母KM71H/pMHS476.1-1/1至-1/3的生长和纤溶酶原基因表达的诱导为制备预培养物(precultures)，100ml BMGY培养基(EasySelectTMPichia表达试剂盒操作说明)置于1L的Schikane烧瓶中，在28℃和250rpm(转/每分钟)条件下培养，至OD600达到20-30。然后，将预培养物以4645g(离心力)，在4℃下离心10分钟。为了使菌体的湿润团块浓度达到80g/L，将收集的细菌重悬于BMMY-培养基(含0.5％甲醇)中。取60ml所述主要培养物于300ml的Schikane烧瓶中培养118小时，条件为28℃和250rpm。24和72小时后加入2％甲醇。Schikane烧瓶须以250rpm的高速摇转，以给菌液提供充足的氧，这是使用AOX启动子时必须的条件。
实施例1e使用链激酶激活后，在主要培养物上清液中检测纤溶酶原的活性把主要培养物的样品在16000g的条件下离心10分钟。取300μl上清液，加入1μl链激酶(S8026)(Sigma，Deisenhofen)，在37℃条件下培养20min。在750μl的100mM(毫摩尔每升)的磷酸钠缓冲液(pH＝8)、0.36mM CaCl2、0.9％NaCl中，加入100μl N-tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA溶液(9.5mg溶于75mg甘氨酸/10ml、2％吐温(Tween)20)，37℃温育10分钟。加入250μl用链激酶预处理的上清液启动反应，在37℃进一步温育。在405nm处测量吸光值，表明消耗在增加。同时也测量作为对照的平行组巴斯德毕赤酵母KM71H培养物的上清液，和未用链激酶激活的上清液。例如，样品经过72小时诱导后，检测其活性值(1U/l定义为1升培养物上清液1分钟内转化1μmol N-tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA)为，KM71H/pMHS476.1-1/12U/l，KM71H/pMHS476.1-1/22U/l，KM71H/pMHS476.1-1/31U/l。经过诱导118小时后，检测其活性值为，KM71H/pMHS476.1-1/17U/l，KM71H/pMHS476.1-1/29U/l，KM71H/pMHS476.1-1/38U/l。
实施例2a扩增赖氨酸纤溶酶原基因，所述基因5’端插入一个Kex2和两个Ste13酶切位点的密码子用两个寡核苷酸引物NO34和NO57(Seq.ID No.3)来扩增赖氨酸纤溶酶原基因，所述基因插入编码一个Kex2和两个Ste13酶切位点的密码子，该扩增产物用于插入载体pPICZαA，扩增条件如实施例1a所述。寡核苷酸引物NO57在纤溶酶原基因的的互补碱基旁，具有Kex2和Ste13酶切位点的密码子。
实施例2b克隆实施例2a中扩增的赖氨酸纤溶酶原基因到pPICZαA载体中利用与实施例1b类似的方法，将人赖氨酸纤溶酶原基因克隆到载体pPICZαA中以生产融合基因，该融合基因由酿酒酵母α因子的前肽原基因和已插入蛋白酶Kex2和Ste13酶切位点密码子的人纤溶酶原基因组成。获得的质粒命名为pSM54.2(图2)。经序列分析，确认序列(Seq.ID No.9)正确无误。
实施例2c用质粒pSM54.2转化巴斯德毕赤酵母如实施例1c中所述的转化pMHS476.1的方法，用质粒pSM54.2转化巴斯德毕赤酵母KM71H株。获得的克隆命名为巴斯德毕赤酵母KM71H/pSM54.2-1/a，此处“a”仍然代表从1开始的克隆的连续编号。
实施例2d巴斯德毕赤酵母KM71H/pSM54.2-1/1至-1/3的培养和纤溶酶原基因的诱导预培养物和主要培养物的生产，以及用甲醇诱导的方法，均与实施例1d中的类似。
实施例2e使用链激酶激活后，主要培养物的样品中纤溶酶原活性的测定链激酶激活后的纤溶酶原的活性测定，见实施例1e中对于KM71H/pMHS476.1-1/1至-1/3的描述。诱导72小时后，样品的活性值如下KM71H/pSM54.2-1/12U/l，KM71H/pSM54.2-1/28U/l，KM71H/pSM54.2-1/36U/l。诱导118小时后测得的活性值如下KM71H/pSM54.2-1/18U/l，KM71H/pSM54.2-1/217U/l，KM71H/pSM54.2-1/313U/l。
实施例3a扩增具有本身信号序列的纤溶酶原基因，并克隆到pPICZA载体中；转化巴斯德毕赤酵母用两个寡核苷酸引物NO34和NO37(Seq.ID No.4)来扩增纤溶酶原基因，该基因带有编码本身信号肽(前纤溶酶原)的序列，将扩增产物插入载体pPICZA，所使用的条件如实施例1a所述。
用类似实施例1b中所述的方法，将载体和PCR产物都用SfuI和KspI限制性内切酶酶切，然后把纤溶酶原基因克隆到pPICZA载体中。获得的质粒命名为pSM49.8(图3)。经序列分析，确认序列(Seq.ID No.11)正确无误。
类似实施例1c中对pMHS476.1的描述，用质粒pSM49.8转化巴斯德毕赤酵母KM71H株。得到的克隆命名为巴斯德毕赤酵母KM71H/pSM49.8-1/a，此处“a”仍然代表从1开始的克隆的连续编号。
实施例4a扩增人谷氨酸纤溶酶原基因，并克隆到表达载体pPICZαA中，所述人谷氨酸纤溶酶原基因插入了Kex2酶切位点的密码子；转化巴斯德毕赤酵母使用两条寡核苷酸引物NO34和NO35(Seq.ID No.5)，扩增谷氨酸纤溶酶原基因，并克隆到载体pPICZαA中，所述谷氨酸纤溶酶原基因插入了Kex2酶切位点的密码子，所述过程所用条件如实施例1a所述。寡核苷酸引物NO35在谷氨酸纤溶酶原基因的互补序列旁具有Kex2酶切位点的密码子。
将谷氨酸纤溶酶原基因克隆到载体pPICZαA中是为了生产融合基因，所述融合基因由酿酒酵母α因子的前肽原基因，和已插入蛋白酶Kex2酶切位点密码子的人谷氨酸纤溶酶原基因组成，所述过程类似于实施例1b所述的克隆过程。
获得的质粒命名为pSM82.1(图4)。经序列分析，确认序列(Seq.IDNo.13)正确无误。
类似实施例1c中对pMHS476.1的描述，用质粒pSM82.1转化巴斯德毕赤酵母KM71H株。得到的克隆命名为巴斯德毕赤酵母KM71H/pSM82.1/a，此处“a”仍然代表从1开始的克隆的连续编号。
实施例5a扩增人谷氨酸纤溶酶原的基因并克隆到表达载体pPICZa A，所述人谷氨酸纤溶酶原的基因在5’端插入编码Kex2和两个Ste13酶切位点的密码子；转化巴斯德毕赤酵母利用两个寡核苷酸引物NO34和NO56(Seq.ID No.6)，扩增谷氨酸纤溶酶原的基因，并克隆到表达载体pPICZa A中，所述谷氨酸纤溶酶原的基因插入了编码Kex2和两个Ste13酶切位点的密码子，具体扩增条件见实施例1a。引物NO56在谷氨酸纤溶酶原基因的互补碱基旁具有Kex2和Ste13酶切位点的密码子。
将人谷氨酸纤溶酶原的基因克隆到载体pPICZa A中，以生产融合基因，该融合基因由编码酿酒酵母的a因子的前肽原基因，和已插入编码蛋白酶Kex2和Ste13酶切位点序列的人谷氨酸纤溶酶原基因组成，具体步骤与实施例1b中提到的步骤相似。获得的质粒称为pSM58.1(图5)。通过序列分析，确认序列(Seq.ID No.15)正确无误。
如实施例1c中所描述的pMHS476.1一样，用质粒pSM58.1转化巴斯德毕赤酵母KM71H株，得到的克隆命名为巴斯德毕赤酵母KM71H/pSM58.1/a，此处“a”仍然代表从1开始的克隆的连续编号。
实施例6a从质粒pSM54.2中获得人赖氨酸纤溶酶原基因，并插入到载体pPIC9K中用10U的每种限制性内切酶SacI和NotI(均来自RocheDiagnostics，曼海姆)切割150ng的载体pPIC9K(Invitrogen，Groningen，荷兰)。用同样的酶同样切割300ng的纤溶酶原表达载体pSM54.2(见实施例2b)。然后用0.9％的琼脂糖凝胶对经酶切的DNA片段进行电泳分离。用QIAgen凝胶纯化试剂盒(QIAgen gel extraction kit，Qiagen，Hilden)将较大的片段纯化出来。混合两个较大的片段并在4℃，1U的T4DNA连接酶作用下连接过夜。
用与实施例1b中所述类似的方法，转化大肠杆菌DH5α，对所得质粒进行纯化和鉴定，但是，对于筛选转化体的抗生素，以氨卞青霉素代替梅衣灵。这样构建的质粒命名为pAC37.1(图6)。
实施例6b用质粒pAC37.1转化巴斯德毕赤酵母如实施例1c中所描述的用pMHS476.1转化巴斯德毕赤酵母KM71H株一样，用质粒pAC37.1转化巴斯德毕赤酵母KM71，所述质粒pAC37.1己用SalI酶切使之线性化。转化后的细胞接种到不含组氨酸的MD-琼脂糖培养基中(参见多拷贝Pichia表达试剂盒(multi-copy pichiaexpression kit instruction manual)并进行培养。所得到的克隆命名为巴斯德毕赤酵母KM71/pAC37.1-3/a，此处“a”仍然代表从1开始的克隆的连续编号。
实施例6c巴斯德毕赤酵母KM71/pAC37.1-3/1的培养和纤溶酶原基因的诱导预培养物和主要培养物的生产和甲醇诱导的方法，与实施例1d中的描述的条件类似。诱导持续时间超过216个小时。最初用0.5％的甲醇诱导，24小时后改为2％甲醇，每48小时再加一次2％甲醇。
实施例6d链激酶激活后，主要培养物的样品中纤溶酶原活性的测定链激酶激活后纤溶酶原活性的测定方法，与实施例1e中KM71H/pMHS476.1-1/1至1/3的活性测定方法一致。诱导120小时后取出的样品的活性为120U/L；诱导216小时后，可测得的活性为190U/L。
实施例6e巴斯德毕赤酵母KM71/pAC37.1-3/1在基本培养基(BSM)中的诱导和链激酶激活后，主要培养物样品中纤溶酶原活性的测定当在BMGY复合培养基(见实施例1d)培养巴斯德毕赤酵母KM71/pAC37.1-3/1后，将80克离心所得的细胞重新悬浮到100毫升包含基本盐类的基本培养基中进行诱导。包含基本盐类的培养基-基本培养基组分如下H3PO4，85％26.0ml/l；CaCl2·2H2O0.6g/l；K2SO418.0g/l；MgSO4·7H2O14.0g/l；KOH4.0g/l；甘油20ml/l；止泡剂1.0ml/l；微量元素溶液8.0ml/l；酵母生长素溶液(0.2g/l)8.0ml/l。
微量元素溶液的组成H2SO45.0ml/l；CuSO4·5H2O6.0g/l；KI0.08g/l；MnSO4·H2O3.0g/l；Na2MoO40.2g/l；H3BO30.02g/l；CoCl20.5g/l；ZnCl220.0g/l；FeSO4·7H2O65.0g/l。
为进行诱导，每天加入2％甲醇。链激酶激活后，纤溶酶原活性的测定方法，与实施例1e中测定KM71H/pMHS476.1-1/1至-1/3诱导后活性的测定方法一致。诱导120小时后，测定的纤溶酶原活性为193U/l，168小时后测定的活性为289U/l。
实施例6f在Klrhof纤维蛋白溶解试验中测定主要培养物的样品中，链激酶激活后纤溶酶原的活性Klrhof纤维蛋白溶解试验[Stack，M.S.，Pizzo，S.V.，和Gonzalez-Gronow，M.(1992)Effect of desialylation on thebiological properties of human plasminogen.(去唾液酸对人纤溶酶原生物学特性的影响)，Biochem.J.284，81-86(13)]的准备如下将1.5克GTG低熔点琼脂糖，通过煮沸溶解到75毫升50mM的pH＝7.4的磷酸钠缓冲液中；将35ml纤维蛋白原溶液(每37.5ml 50mM的pH＝7.4的磷酸钠缓冲液中溶解225mg的纤维蛋白原)与350μl凝血酶溶液(10U/ml，用50mM的pH＝7.4的磷酸钠缓冲液配制)混合，勿产生气泡；将混合溶液搅拌加入到所述琼脂糖溶液中，然后倒入培养皿。纤维蛋白凝固以后在培养基上刻1mm大小的小孔。
为了测定链激酶激活后重组纤溶酶原的纤维蛋白溶解活性，在每个小孔中注入20μl组分如下的溶液，并在37℃培养20小时10.5mg/ml纤溶酶原(Roche，曼海姆)；2实施例6e中的KM71/pAC37.1-3/1的培养上清液；30.5mg/ml纤溶酶原，由链激酶激活；4由链激酶激活的实施例6e中的KM71/pAC37.1-3/1的培养上清液；50.25mg/ml纤溶酶原，由链激酶激活；6稀释一倍的实施例6e中的KM71/pAC37.1-3/1的培养上清液，由链激酶激活；70.125mg/ml纤溶酶原，由链激酶激活；
8与实施例6e中KM71/pAC37.1-3/1同样方法获得的KM71H的培养上清液，由链激酶激活。
链激酶激活时，将2μl链激酶(100U/μl，Sigma，Deisenhofen)加入40μl所述各溶液中，37℃下孵育60分钟。
由溶解纤维蛋白活性所产生的菌斑见图10。
实施例6g通过亲和层析纯化纤溶酶原，该纤溶酶原由在巴斯德毕赤酵母KM71/pAC37.1-3/1重组产生将50ml实施例6c/6d中的巴斯德毕赤酵母KM71/pAC37.1-3/1的上清液在pH＝7.5的4升50mM磷酸钠缓冲液中于4℃下透析。24小时后更换透析缓冲液，继续透析24小时。透析后的产物用0.02μm孔径的滤器过滤，然后用经过50mM、pH7.5的磷酸钠缓冲液平衡的赖氨酸-琼脂糖TM 4B柱(直径16mm，高95mm)(Amersham Biosciences)进行亲和层析。可以通过pH＝7.5的50mM磷酸钠缓冲液、0.5M的氯化钠去除柱上的非特异性结合的蛋白。结合的纤溶酶原可以用50mM、pH7.5的磷酸钠缓冲液、0.01M的ε-氨基己酸洗脱。得到的样品可以用7.5％的SDS-PAGE进行电泳，然后用银染法染色(图11)。在凝胶上，馏分中含有的重组的纤溶酶原与作为对照加入的人纤溶酶原处于同一位置。
图11显示了实施例6g中纯化的馏分在7.5％的SDS-PAGE电泳的结果。图11中所用的缩写代表的含义如下M蛋白大小标准(从上至下为116kDa、66kDa、45kDa、35kDa)D透析液N未结合馏分W清洗馏分F1-F5为洗脱的包含纤溶酶原的馏分Plg纤溶酶原(American Diagnostica，Pfungstadt)实施例6h通过巴斯德毕赤酵母KM71/pAC37.1-3/1的发酵，来评价pH值和底物的影响将2ml甘油低温处理的巴斯德毕赤酵母KM71/pAC37.1-3/1接种到50ml的YEP-G培养基(10克/升酵母提取物、20克/升酪蛋白胨、20克/升甘油)中，所述YEP-G培养基在不含Schikanes的1升宽颈摇瓶中。以30℃、300转/分钟的条件培养9个小时。然后将5ml的这种培养物接种到50ml MG培养基[5克/升不含氨基酸的酵母含氮碱基(nitrgen base)、20克/升甘油、2.5毫升/升生物素溶液(0.2g/l)]中，所述MG培养基在不含Schikanes的1升宽颈摇瓶中。将该第二预培养物以30℃、300转/分钟的条件培养16个小时。将主要培养物在“stirrer-pro”(DASGIP，Jülich)多重发酵罐中进行发酵，这种装置可以允许同时进行4个不同条件下的发酵。因此，将15毫升的第二预培养接种到150ml BSM培养基中(见实施例6e)。在加完一定剂量的底物后，在pH＝6下开始进行发酵，努力维持该pH。不同培养条件下平行进行的发酵的结果见表1表1
在实验IV的培养基中加入了30克/升的蛋白胨。在甲醇开始作用前，先加入供给甘油的培养基[500克/升无水甘油、10毫升/升微量元素溶液、10毫升/升生物素溶液(见实施例6e)]以24毫升/小时的恒定速度持续4个小时。实验I、II和IV中的项目组合是由下面的这个公式来确定剂量函数，f(x)＝P1+(P2/1+exp(-P3(t-P4))))+(P5/(1+exp(-P6(t-P7))))，其中P1＝0，P2＝0.7，P3＝0.2，P4＝15，P5-P6＝P7＝0。从表1中可以看出，中性pH且混合甲醇和甘油剂量下所得到的纤溶酶原浓度最高。
实施例7a从pAC37.1获得赖氨酸纤溶酶原基因，并插入到pGAPZaA中将150ng载体pGAPZαA(Invitrogen，Groningen，荷兰)用10U的限制性内切酶XhoI和NotI(均来自Roche Diagnostics，曼海姆)进行酶切。同时也用这两个酶切300ng的纤溶酶原表达载体pAC37.1(见实施例6a)。用0.9％的琼脂糖对酶切后的DNA片段进行凝胶电泳分离。将pAC37.1酶切后得到的2715个碱基(bp)长的纤溶酶原基因片段，和pGAPZαA酶切后得到的3073个碱基长的片段，用QIAgen凝胶纯化试剂盒纯化(Qiagen，Hilden)。然后混合这两个片段并在4℃、1U的T4DNA连接酶的作用下连接过夜。
转化大肠杆菌DH5α，得到质粒的纯化和鉴定方法与实施例1b中的方法类似。但是，用氨卞青霉素代替梅衣灵来筛选转化体。所构建的质粒命名为pJW9.1(图7)。
实施例7b用质粒pJW9.1转化巴斯德毕赤酵母如实施例1c中用pMHS476.1转化巴斯德毕赤酵母KM71H株的方法一样，用质粒pJW9.1转化巴斯德毕赤酵母KM71H株，转化前先用内切酶BlnI将pJW9.1线性化。转化后的细胞涂板于含有100微克/毫升梅衣灵的YPDS-琼脂上(EasySelectTMPichia表达试剂盒使用手册)并培养。所得到的克隆命名为巴斯德毕赤酵母KM71H/pJW9.1-a，此处“a”仍然代表从1开始的克隆的连续编号。
实施例7c通过巴斯德毕赤酵母KM71H/pJW9.1-3的发酵培养，在不同甘油供给速度下来评价pH值预培养物和在“stirrer-pro”中的发酵培养方法见实施例6i，所得结果见表2。
表2
同样，在中性pH条件下发酵得到的结果最好，从表中也可以清楚地看出，底物剂量(供给速度)对产物形成的影响。
实施例7d巴斯德毕赤酵母KM71H/pJW9.1-3的发酵将巴斯德毕赤酵母KM71H/pJW9.1-3接种到50ml的YEP-G培养基(10克/升酵母提取物、20克/升酪蛋白胨、20克/升甘油)中，所述YEP-G培养基在不含Schikanes的1升宽颈瓶中，以30℃、300转/分钟的条件培养9个小时。然后将10ml的所述培养物接种到40ml MG培养基(5克/升不含氨基酸的酵母含氮碱基、20克/升甘油、2.5毫升/升生物素溶液(0.2g/l)中，所述MG培养基在不含Schikanes的1升宽颈瓶中。以30℃、300转/分钟的条件培养所述培养物16个小时。
将上述的30毫升培养物接种到3升的BSM-培养基(见实施例6e)，然后在7.5升的发酵罐(型号Labfors，Infors AG，CH)中发酵。发酵温度为25℃，气体恒定供给速度为3.2升/分钟。24小时后加入甘油溶液[500克/升甘油、10毫升/升微量元素溶液、10毫升/升生物素溶液(见实施例6e)]。在发酵过程中，供应剂量的速度，从10毫升/小时逐步增加到45毫升/小时。250小时后，在链激酶激活条件下可以测得1375U/L的纤溶酶原的活性。
实施例8纤溶酶原激活剂的鉴定测定了24种市售的蛋白酶的激活纤溶酶原的活性。实验反应的体系为100mM pH＝8.0的磷酸钠缓冲液、0.36mM CaCl2、0.9％NaCl。
如果提供的蛋白酶是粉末，则溶解到缓冲液中；如果是溶液，则直接使用，可以根据需要用缓冲液稀释。将25μl的蛋白酶溶液与本发明的25μl的纤溶酶原溶液(20mg/ml)混合并在37℃条件下温育10分钟。然后通过水解底物N-tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA的方法，来测定纤溶酶的活性。具体方法是取200μl的底物溶液[9.5毫克的N-tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA溶解于75毫克甘氨酸/10毫升和2％吐温20中]加入到850μl缓冲液中，然后与50μl先前温育的纤溶酶原-蛋白酶溶液混合，并继续在37℃条件下温育。消耗的增加程度，可以通过测405nm下的光吸收值来测定。消耗是由于蛋白酶所致。在测定消耗时，使用类似的预温育的缓冲液和蛋白酶的混合物，来代替预温育的纤溶酶和蛋白酶的混合物。
灰色链霉菌(S.griseus)蛋白酶、蛋白酶VIII、蛋白酶XXIII、蛋白酶XIX、蛋白酶XVIII、无花果蛋白酶、金属内肽酶、梭菌蛋白酶、Glu-C内蛋白酶、蛋白酶XIII、糜木瓜蛋白酶、糜蛋白酶、蛋白酶X、菠萝蛋白酶、舒血管素和蛋白酶A均购自Sigma公司，Deisenhofen；胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、Asp-N内蛋白酶、中性蛋白酶I、Lys-C内蛋白酶、凝血酶和弹性蛋白酶均购自Roche，曼海姆；蛋白酶K购自QIAGEN，Hilden。制备的各蛋白酶储存液的浓度见表3。稀释系数F表明为进行测定而将蛋白酶储存液稀释的倍数。
激活后，可以测定下列纤溶酶的活性(1U/mg＝每分钟每毫克蛋白质转化1μmol的N-tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA)表3
*对于以下的酶，没有检测到纤溶酶原的活性蛋白酶XXIII、蛋白酶XIX、糜木瓜蛋白酶、Lys-C内蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶I、蛋白酶X、菠萝蛋白酶、舒血管素和蛋白酶K。
实施例9药物制剂下面这些实施例中所用到的重组的功能性纤溶酶原，都是通过本发明的创新方法得到的。根据这种意义而言，“纤溶酶原”指重组的微-、小-、赖氨酸-和谷氨酸纤溶酶原，而“纤溶酶”指蛋白水解切割重组的微-、小-、赖氨酸-和谷氨酸纤溶酶原而得到的纤溶酶。可以用相同的纤溶酶原激活剂激活微-、小-、赖氨酸-和谷氨酸纤溶酶原，尤其是上面所描述的纤溶酶原激活蛋白酶，但也不局限于这些例子；激活剂和纤溶酶原(微-，小-，赖氨酸-和谷氨酸纤溶酶原)的比例约是1∶1000。
可以通过蛋白水解方法激活纤溶酶原，即这些本专利申请中提到的蛋白酶作为组织型纤溶酶原激活剂的尿激酶，或蛋白酶VIII、灰色链霉菌蛋白酶等蛋白酶；也可以通过和链激酶或者葡激酶形成复合物，从而激活纤溶酶原。
实施例9a药物制剂水凝胶水凝胶的基本组分(100克)纤溶酶原 100U纤溶酶原激活剂0.1U羟乙基纤维素10000 3.5克可选组分(山梨酸/山梨酸钾0.1-0.4％，PHB酯0.1％)纯净水加至100.0克选择性地，可以分别用羟丙甲纤维素(hypromellose)或甲基纤维素代替羟乙基纤维素，所述羟丙甲纤维素或甲基纤维素的用量为0.5-15.0克。
凝胶纤溶酶原 1000U纤溶酶原激活剂 1U甘油(85％) 150.0克羟乙基纤维素10000 32.5克可选组分(山梨酸/山梨酸钾0.1-0.4％，PHB酯0.1％)不含乳酸盐的林格液 加至1000.0克或者是100克凝胶包括纤溶酶原 100U纤溶酶原激活剂 0.1U羟乙基纤维素30000 2.5克甘油(85％) 10.0克可选组分(山梨酸/山梨酸钾0.1-0.2％，PHB酯0.1％)纯净水 加至100.0克或者是100克凝胶包含纤溶酶原 100U纤溶酶原激活剂 0.1U多聚丙烯酸 1克丙二醇 8克中聚甘油三酯 8克二乙胺(调节pH) 适量可选组分(山梨酸/山梨酸钾0.1-0.2％，PHB酯0.1％)2-丙醇 0-1克水 加至100克亲水性软膏(聚乙二醇软膏)50克包含纤溶酶原 50U纤溶酶原激活剂0.05U聚乙二醇400 30.0克聚乙二醇4000 10.0克可选组分(山梨酸/山梨酸钾0.1-0.2％，PHB酯0.1％)纯净水加至50.0克或者是无水聚乙二醇软膏100克包含纤溶酶原 100U纤溶酶原激活剂0.1U聚乙二醇300 50克聚乙二醇1500 加至100克或者是吸水性软膏纤溶酶原 100U纤溶酶原激活剂0.1U十六烷基硬脂醇29克石蜡，粘性34克凡士林，白色 100克疏水性软膏纤溶酶原 100U纤溶酶原激活剂0.1U凡士林80.0克稀液体石蜡加至100克疏水膏剂纤溶酶原 100U纤溶酶原激活剂0.1U羟丙甲纤维素400 20克凡士林，白色 加至100克或者是纤溶酶原 100U纤溶酶原激活剂0.1U卡波姆(例如聚羰乙烯974p) 15克石蜡，粘性40克凡士林，白色 加至100克乳酯(creme)纤溶酶原 100U纤溶酶原激活剂0.1U中聚甘油三酯 20克乳化十六烷基硬脂醇10克羊毛脂10克山梨醇10克可选组分(山梨酸/山梨酸钾0.1-0.2％，PHB酯0.1％)纯净水加至100克非离子亲水性乳脂纤溶酶原 100U纤溶酶原激活剂0.1U软酯醇20克
2-豆蔻酸乙酯10克85％甘油6克山梨酸钾0.14克柠檬酸 0.07克水 加至100克非离子性乳脂纤溶酶原100U纤溶酶原激活剂 0.1U聚山梨酸酯605克十六烷基硬脂醇 10克85％甘油10克凡士林，白色25克可选组分(山梨酸/山梨酸钾0.1-0.2％，PHB酯0.1％)水 加至100克脂质体制剂纤溶酶原100U纤溶酶原激活剂 0.1U大豆卵磷脂、鸡卵磷脂15克可选组分(山梨酸/山梨酸钾0.1-0.2％，PHB酯0.1％或重氮联苯脲1-2克)水 加至100.0克胶囊一粒0.25克粉末/颗粒的胶囊，包含纤溶酶原5U纤溶酶原激活剂 0.005U淀粉0.1克二氧化硅 0.02克硬脂酸镁 0.002克聚甲基丙烯酸酯共聚多酯/聚甲基丙烯酸 0.015克柠檬酸三乙酯 0.0005克滑石粉 0.001克微晶体纤维素 加至0.25克或者是一粒0.25克粉末/颗粒的胶囊，包含纤溶酶原 5U纤溶酶原激活剂 0.005U二氧化硅 0.01克硬脂酸镁 0.002克聚甲基丙烯酸酯共聚多酯/聚甲基丙烯酸 0.015克柠檬酸三乙酯 0.0001克滑石粉 0.001毫克甘露醇 加至0.25克丸剂100毫克粒状丸剂包含纤溶酶原 5U纤溶酶原激活剂 0.005U淀粉 30毫克二氧化硅 2毫克硬脂酸镁 4毫克聚甲基丙烯酸酯共聚多酯/聚甲基丙烯酸 5毫克柠檬酸三乙酯 0-1毫克滑石粉 0.00001毫克微晶体纤维素 加至100毫克小药丸100克小药丸包含纤溶酶原2000U纤溶酶原激活剂 2U淀粉20克硬脂酸蔗糖 20克二氧化硅2克硬脂酸镁3克聚乙烯吡咯烷酮 0-1克聚甲基丙烯酸酯共聚多酯/聚甲基丙烯酸 5克滑石粉 0.2克柠檬酸三乙酯0.1克微晶体纤维素加至100克针剂纤溶酶原500U纤溶酶原激活剂 0.5U乙醇0-1克丙二醇 10克聚乙二醇0-1克氯化钠 适量可选缓冲液(磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液)纯净水 加至100毫升在所述制剂中，可以使用产生相同活性量的纤溶酶来代替微-、小-、赖氨酸-或谷氨酸-纤溶酶原。如果直接使用纤溶酶，那么药物制剂中则不需要含有纤溶酶原激活剂。
实施例9b药物制剂a)水凝胶水凝胶的基本组分(100克)纤溶酶100U羟乙基纤维素400 2.5-5克纯净水加至100.0克膨胀时间需要1至3小时。
每克水凝胶中可以含有1-1000U的纤溶酶。
b)亲水性软膏亲水性软膏的基本组成(1000克)纤溶酶1000U无水甘油 85.0克羟乙基纤维素10000 32.5克可选择加入聚烟酸肌醇(polyhexanide)2重量％不含乳酸盐的林格液加至1000.0克聚烟酸肌醇可以作为抑制微生物生长的活性物质而被选择性地加入，但不超过总重的0.2％。可以加入羟乙基纤维素400(如TyloseH 300或Natrosol 250HX PHARM)来代替羟乙基纤维素10000(Natrosol 250HXPHARM)。
每克软膏可以含有1-10000U的纤溶酶。
c)软膏软膏的基本组成(50克)纤溶酶 50U聚乙二醇40030.0-32.5克聚乙二醇400012.5-7.5克纯净水 加至50.0克制备将12.5克聚乙二醇4000和30.0克聚乙二醇400(也可使用7.5克聚乙二醇4000和32.5克聚乙二醇400)混合放入软膏盘，热水加浴直至聚乙二醇熔化。冷却后，可加入适量按照本发明所述方法生产的纤溶酶原，该纤溶酶原已溶解于7.5克纯净水中，然后均质化。
d)胶囊0.5克胶囊的基本组成纤溶酶原5U乳糖0.42克淀粉0.06克硬脂酸镁0.02克每个胶囊可以含有0.1-100U的纤溶酶。
e)针剂/输液100ml的基本组成纤溶酶 500U乙醇0.01克丙二醇 30毫升纯净水 加至100ml每毫升溶液可以含有1-500U的纤溶酶。
可以用上述活性单位量的微-、小-、赖氨酸-、谷氨酸-纤溶酶原取代纤溶酶，如果同时加入至少一种纤溶酶原激活剂，所述加入的纤溶酶原激活剂与纤溶酶原之比应在1∶10000到1∶100之间，优选1∶1000，所述量为纤溶酶原的活性量。
实施例10a扩增不同形式的小纤溶酶原、微纤溶酶原基因，并克隆到载体pPICZaA中；转化巴斯德毕赤酵母。
小纤溶酶原、微纤溶酶原是比全长纤溶酶原短的衍生物，缺少N端结构域，但仍然具有被活化成为纤溶酶的活性。为了将小纤溶酶原、微纤溶酶原基因扩增并克隆到载体pPICZαA中，设计了3’端引物NO34和不同的5’端引物NO36a-j(序列号No.19至28)，扩增的条件与实施例1a中所描述的条件一致。除了与纤溶酶原基因的互补碱基外，寡核苷酸引物NO36a、c、e、j、i还具有Kex2酶切位点的密码子；引物NO36b、d、f、h、j，则在Kex2酶切位点密码子的下游加入了两个Ste13的酶切位点的密码子。引物NO34上还有KspI酶切位点，而引物NO36 a-j则含有XhoI酶切位点。
将小纤溶酶原、微纤溶酶原基因克隆到载体pPICZαA中的方法，与实施例1b中的方法类似，只是载体和特定PCR产物都用限制性内切酶XhoI和KspI来酶切。所用引物、得到的纤溶酶原衍生物的名称、编码的蛋白酶切位点、所得质粒的名称和分泌出的纤溶酶原衍生物N端氨基酸的名称，都归纳于下表。
*指的是由810个氨基酸构成的前纤溶酶原(Seq.ID No.12)。
图8显示了例子质粒pPLG1.1。
如实施例1c中的用pMHS476.1转化巴斯德毕赤酵母KM71H株方法一样，用pPLG1.1转化巴斯德毕赤酵母KM71H株，得到的克隆命名为巴斯德毕赤酵母KM71H/pPLG1.1-1/a，此处“a”仍然代表从1开始的克隆的连续编号。
根据产生KM71H/pPLG1.1-1/a菌株的方法，利用以下质粒产生不同的菌株pPLG2.1、pPLG3.2、pPLG4.2、pPLG5.3、pPLG6.1、pPLG7.1、pPLG8.3、pPLG9.1或pPLG10.1。
寡核苷酸引物NO36a-jNO36a AAAAACTCGAGAAAAGAGCACCTCCGCCTGTTGNO36b AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGCACCTCCGCCTGTTGNO36c AAAAACTCGAGAAAAGAAAACTTTACGACTACTGNO36d AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAAACTTTACGACTACTGNO36e AAAAACTCGAGAAAAGACTTTACGACTACTGTGNO36f AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCTTTACGACTACTGTGNO36g AAAAACTCGAGAAAAGAGCCCCTTCATTTGATTGTGNO36h AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGCCCCTTCATTTGATTGTGNO36i AAAAACTCGAGAAAAGATCATTTGATTGTGGGAAGCCNO36j AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTCATTTGATTGTGGGAAGCC实施例10b扩增不同形式的小-、微-纤溶酶原基因，并克隆到载体pGAPZaA中；将其转化巴斯德毕赤酵母。
为了将小-、微-纤溶酶原基因扩增并克隆到载体pGAPZαA中，设计了3’端引物NO34和不同的5’端引物NO36a-j(Seq.ID No.19至28)，扩增的条件与实施例1a中所描述的条件一致。寡核苷酸引物NO36a、c、e、j、i在纤溶酶原基因的互补碱基旁具有Kex2酶切位点的密码子；引物NO36b、d、f、h、j则在Kex2酶切位点密码子的下游加入了两个Ste13的酶切位点的密码子。引物NO34上还有KspI酶切位点，而引物NO36a-j则含有XhoI酶切位点。
将小-、微-纤溶酶原基因克隆到载体pGAPZαA的方法，与实施例1b中的方法类似，只是载体和PCR产物都用限制性内切酶XhoI和KspI酶切。所用引物、纤溶酶原衍生物的名称、编码的蛋白酶切位点、所得质粒的名称和分泌出的纤溶酶原衍生物N端氨基酸的名称，都归纳于下表。
*指的是由810个氨基酸构成的前纤溶酶原(Seq.ID No.12)。
图9显示了例子质粒pPLG11.2。
如实施例7a中用pJW9.1转化巴斯德毕赤酵母KM71H株的方法一样，用pPLG11.2转化巴斯德毕赤酵母KM71H株，转化前先用内切酶BlnI切割质粒使之线性化。所得的克隆命名为巴斯德毕赤酵母KM71H/pPLG11.2-1/a，此处“a”仍然代表从1开始的克隆的连续编号。
根据产生KM71H/pPLG1.1-1/a菌株的方法，利用以下质粒产生不同的菌株pPLG12.1、pPLG13.1、pPLG14.2、pPLG15.1、pPLG16.3、pPLG17.2、pPLG18.1、pPLG19.2和pPLG20.1。
序列记录序列1寡核苷酸引物NO34AAAAACCGCGGTCAATTATTTCTCATCACTCCC序列2寡核苷酸引物NO36AAAAACTCGAGAAAAGAAAAGTGTATCTCTCAGAGTG序列3寡核苷酸引物NO57AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAAAGTGTATCTCTCAGAGTG序列4寡核苷酸引物NO37AAAAATTCGAAAAATGGAACATAAGGAAGTGG序列5寡核苷酸引物NO35AAAAACTCGAGAAAAGAGAGCCTCTGGATGACTAT序列6寡核苷酸引物NO56AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGAGCCTCTGGATGACTAT序列7人赖氨酸纤溶酶原融合基因，其含有Kex2蛋白酶切位点的密码子，和酿酒酵母α因子的信号序列的基因ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAAAAGTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTACAGAGGGACGATGTCCAAAACAAAAAATGGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACTTCTCCCCACAGACCTAGATTCTCACCTGCTACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAACTACTGCAGGAATCCAGACAACGATCCGCAGGGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAAAAG
AGATATGACTACTGCGACATTCTTGAGTGTGAAGAGGAATGTATGCATTGCAGTGGAGAAAACTATGACGGCAAAATTTCCAAGACCATGTCTGGACTGGAATGCCAGGCCTGGGACTCTCAGAGCCCACACGCTCATGGATACATTCCTTCCAAATTTCCAAACAAGAACCTGAAGAAGAATTACTGTCGTAACCCCGATAGGGAGCTGCGGCCTTGGTGTTTCACCACCGACCCCAACAAGCGCTGGGAACTTTGCGACATCCCCCGCTGCACAACACCTCCACCATCTTCTGGTCCCACCTACCAGTGTCTGAAGGGAACAGGTGAAAACTATCGCGGGAATGTGGCTGTTACCGTTTCCGGGCACACCTGTCAGCACTGGAGTGCACAGACCCCTCACACACATAACAGGACACCAGAAAACTTCCCCTGCAAAAATTTGGATGAAAACTACTGCCGCAATCCTGACGGAAAAAGGGCCCCATGGTGCCATACAACCAACAGCCAAGTGCGGTGGGAGTACTGTAAGATACCGTCCTGTGACTCCTCCCCAGTATCCACGGAACAATTGGCTCCCACAGCACCACCTGAGCTAACCCCTGTGGTCCAGGACTGCTACCATGGTGATGGACAGAGCTACCGAGGCACATCCTCCACCACCACCACAGGAAAGAAGTGTCAGTCTTGGTCATCTATGACACCACACCGGCACCAGAAGACCCCAGAAAACTACCCAAATGCTGGCCTGACAATGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCCGATAAAGGCCCCTGGTGTTTTACCACAGACCCCAGCGTCAGGTGGGAGTACTGCAACCTGAAAAAATGCTCAGGAACAGAAGCGAGTGTTGTAGCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTTCCAGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAAGACTGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATACCGAGGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGGACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTCACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGA
GGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTzGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA序列8人赖氨酸纤溶酶原融合蛋白，其含有Kex2蛋白酶切位点和酿酒酵母α因子的信号肽MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKRKVYLSECKTGNGKNYRGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECEEECMHCSGENYDGKISKTMSGLECQAWDSQSPHAHGYIPSKFPNKNLKKNYCRNPDRELRPWCFTTDPNKRWELCDIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTGENYRGNVAVTVSGHTCQHWSAQTPHTHNRTPENFPCKNLDENYCRNPDGKRAPWCHTTNSQVRWEYCKIPSCDSSPVSTEQLAPTAPPELTPVVQDCYHGDGQSYRGTSSTTTTGKKCQSWSSMTPHRHQKTPENYPNAGLTMNYCRNPDADKGPWCFTTDPSVRWEYCNLKKCSGTEASVVAPPPVVLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*序列9人赖氨酸纤溶酶原融合基因，其含有Kex2蛋白酶切位点、两个Ste3蛋白酶切位点的密码子，和酿酒酵母α因子的信号肽序列ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTA
TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAAAGTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTACAGAGGGACGATGTCCAAAACAAAAAATGGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACTTCTCCCCACAGACCTAGATTCTCACCTGCTACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAACTACTGCAGGAATCCAGACAACGATCCGCAGGGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAAAAGAGATATGACTACTGCGACATTCTTGAGTGTGAAGAGGAATGTATGCATTGCAGTGGAGAAAACTATGACGGCAAAATTTCCAAGACCATGTCTGGACTGGAATGCCAGGCCTGGGACTCTCAGAGCCCACACGCTCATGGATACATTCCTTCCAAATTTCCAAACAAGAACCTGAAGAAGAATTACTGTCGTAACCCCGATAGGGAGCTGCGGCCTTGGTGTTTCACCACCGACCCCAACAAGCGCTGGGAACTTTGCGACATCCCCCGCTGCACAACACCTCCACCATCTTCTGGTCCCACCTACCAGTGTCTGAAGGGAACAGGTGAAAACTATCGCGGGAATGTGGCTGTTACCGTTTCCGGGCACACCTGTCAGCACTGGAGTGCACAGACCCCTCACACACATAACAGGACACCAGAAAACTTCCCCTGCAAAAATTTGGATGAAAACTACTGCCGCAATCCTGACGGAAAAAGGGCCCCATGGTGCCATACAACCAACAGCCAAGTGCGGTGGGAGTACTGTAAGATACCGTCCTGTGACTCCTCCCCAGTATCCACGGAACAATTGGCTCCCACAGCACCACCTGAGCTAACCCCTGTGGTCCAGGACTGCTACCATGGTGATGGACAGAGCTACCGAGGCACATCCTCCACCACCACCACAGGAAAGAAGTGTCAGTCTTGGTCATCTATGACACCACACCGGCACCAGAAGACCCCAGAAAACTACCCAAATGCTGGCCTGACAATGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCCGATAAAGGCCCCTGGTGTTTTACCACAGACCCCAGCGTCAGGTGGGAGTACTGCAACCTGAAAAAATGCTCAGGAACAGAAGCGAGTGTTGTAGCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTTCCAGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAAGACTGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATACCGAGGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGGACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTCACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCC
TTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA序列10人赖氨酸纤溶酶原融合蛋白，其含有Ste3、Kex2蛋白酶切位点，和酿酒酵母α因子的信号肽。
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAKVYLSECKTGNGKNYRGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECEEECMHCSGENYDGKISKTMSGLECQAWDSQSPHAHGYIPSKFPNKNLKKNYCRNPDRELRPWCFTTDPNKRWELCDIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTGENYRGNVAVTVSGHTCQHWSAQTPHTHNRTPENFPCKNLDENYCRNPDGKRAPWCHTTNSQVRWEYCKIPSCDSSPVSTEQLAPTAPPELTPVVQDCYHGDGQSYRGTSSTTTTGKKCQSWSSMTPHRHQKTPENYPNAGLTMNYCRNPDADKGPWCFTTDPSVRWEYCNLKKCSGTEASVVAPPPVVLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*
序列11人前纤溶酶原基因ATGGAACATAAGGAAGTGGTTCTTCTACTTCTTTTATTTCTGAAATCAGGTCAAGGAGAGCCTCTGGATGACTATGTGAATACCCAGGGGGCTTCACTGTTCAGTGTCACTAAGAAGCAGCTGGGAGCAGGAAGTATAGAAGAATGTGCAGCAAAATGTGAGGAGGACGAAGAATTCACCTGCAGGGCATTCCAATATCACAGTAAAGAGCAACAATGTGTGATAATGGCTGAAAACAGGAAGTCCTCCATAATCATTAGGATGAGAGATGTAGTTTTATTTGAAAAGAAAGTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTACAGAGGGACGATGTCCAAAACAAAAAATGGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACTTCTCCCCACAGACCTAGATTCTCACCTGCTACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAACTACTGCAGGAATCCAGACAACGATCCGCAGGGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAAAAGAGATATGACTACTGCGACATTCTTGAGTGTGAAGAGGAATGTATGCATTGCAGTGGAGAAAACTATGACGGCAAAATTTCCAAGACCATGTCTGGACTGGAATGCCAGGCCTGGGACTCTCAGAGCCCACACGCTCATGGATACATTCCTTCCAAATTTCCAAACAAGAACCTGAAGAAGAATTACTGTCGTAACCCCGATAGGGAGCTGCGGCCTTGGTGTTTCACCACCGACCCCAACAAGCGCTGGGAACTTTGCGACATCCCCCGCTGCACAACACCTCCACCATCTTCTGGTCCCACCTACCAGTGTCTGAAGGGAACAGGTGAAAACTATCGCGGGAATGTGGCTGTTACCGTTTCCGGGCACACCTGTCAGCACTGGAGTGCACAGACCCCTCACACACATAACAGGACACCAGAAAACTTCCCCTGCAAAAATTTGGATGAAAACTACTGCCGCAATCCTGACGGAAAAAGGGCCCCATGGTGCCATACAACCAACAGCCAAGTGCGGTGGGAGTACTGTAAGATACCGTCCTGTGACTCCTCCCCAGTATCCACGGAACAATTGGCTCCCACAGCACCACCTGAGCTAACCCCTGTGGTCCAGGACTGCTACCATGGTGATGGACAGAGCTACCGAGGCACATCCTCCACCACCACCACAGGAAAGAAGTGTCAGTCTTGGTCATCTATGACACCACACCGGCACCAGAAGACCCCAGAAAACTACCCAAATGCTGGCCTGACAATGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCCGATAAAGGCCCCTGGTGTTTTACCACAGACCCCAGCGTCAGGTGGGAGTACTGCAACCTGAAAAAATGCTCAGGAACAGAAGCGAGTGTTGTAGCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTTCCAGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAAGACTGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATACCGAGGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGGACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTCACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGT
GCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA序列12人前纤溶酶原MEHKEVVLLLLLFLKSGQGEPLDDYVNTQGASLFSVTKKQLGAGSIEECAAKCEEDEEFTCRAFQYHSKEQQCVIMAENRKSSIIIRMRDVVLFEKKVYLSECKTGNGKNYRGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECEEECMHCSGENYDGKISKTMSGLECQAWDSQSPHAHGYIPSKFPNKNLKKNYCRNPDRELRPWCFTTDPNKRWELCDIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTGENYRGNVAVTVSGHTCQHWSAQTPHTHNRTPENFPCKNLDENYCRNPDGKRAPWCHTTNSQVRWEYCKIPSCDSSPVSTEQLAPTAPPELTPVVQDCYHGDGQSYRGTSSTTTTGKKCQSWSSMTPHRHQKTPENYPNAGLTMNYCRNPDADKGPWCFTTDPSVRWEYCNLKKCSGTEASVVAPPPVVLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECF
ITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*序列13人谷氨酸纤溶酶原融合基因，其含有Kex2蛋白酶切位点的密码子，和酿酒酵母α因子的信号序列ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGCCTCTGGATGACTATGTGAATACCCAGGGGGCTTCACTGTTCAGTGTCACTAAGAAGCAGCTGGGAGCAGGAAGTATAGAAGAATGTGCAGCAAAATGTGAGGAGGACGAAGAATTCACCTGCAGGGCATTCCAATATCACAGTAAAGAGCAACAATGTGTGATAATGGCTGAAAACAGGAAGTCCTCCATAATCATTAGGATGAGAGATGTAGTTTTATTTGAAAAGAAAGTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTACAGAGGGACGATGTCCAAAACAAAAAATGGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACTTCTCCCCACAGACCTAGATTCTCACCTGCTACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAACTACTGCAGGAATCCAGACAACGATCCGCAGGGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAAAAGAGATATGACTACTGCGACATTCTTGAGTGTGAAGAGGAATGTATGCATTGCAGTGGAGAAAACTATGACGGCAAAATTTCCAAGACCATGTCTGGACTGGAATGCCAGGCCTGGGACTCTCAGAGCCCACACGCTCATGGATACATTCCTTCCAAATTTCCAAACAAGAACCTGAAGAAGAATTACTGTCGTAACCCCGATAGGGAGCTGCGGCCTTGGTGTTTCACCACCGACCCCAACAAGCGCTGGGAACTTTGCGACATCCCCCGCTGCACAACACCTCCACCATCTTCTGGTCCCACCTACCAGTGTCTGAAGGGAACAGGTGAAAACTATCGCGGGAATGTGGCTGTTACCGTTTCCGGGCACACCTGTCAGCACTGGAGTGCACAGACCCCTCACACACATAACAGGACACCAGAAAACTTCCCCTGCAAAAATTTGGATGAAAACTACTGCCGCAATCCTGACGGAAAAAGGGCCCCATGGTGCCATACAACCAACAGCCAAGTGCGGTGGGAGTACTGTAAGATACCGTCCTGTGACTCCTCCCCAGTATCCACGGAACAATTGGCTCCCACAGCACCACCTGAGCTAACCCCTGTGGTCCAGGACTGCTACCATGGTGATGGACAGAGCTACCGAGGCACATCCTCCACCACCACCACA
GGAAAGAAGTGTCAGTCTTGGTCATCTATGACACCACACCGGCACCAGAAGACCCCAGAAAACTACCCAAATGCTGGCCTGACAATGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCCGATAAAGGCCCCTGGTGTTTTACCACAGACCCCAGCGTCAGGTGGGAGTACTGCAACCTGAAAAAATGCTCAGGAACAGAAGCGAGTGTTGTAGCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTTCCAGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAAGACTGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATACCGAGGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGGACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTCACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA序列14人谷氨酸纤溶酶原融合蛋白，其含有Kex2蛋白酶切位点，和酿酒酵母α因子的信号肽MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREPLDDYVNTQGASLFSVTKKQLGAGSIEECAAKCEEDEEFTCRAFQYHSKEQQCVIMAENRKSSIIIRMRDVVLFEKKVYLSECKTGNGKNYRGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECEEE
CMHCSGENYDGKISKTMSGLECQAWDSQSPHAHGYIPSKFPNKNLKKNYCRNPDRELRPWCFTTDPNKRWELCDIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTGENYRGNVAVTVSGHTCQHWSAQTPHTHNRTPENFPCKNLDENYCRNPDGKRAPWCHTTNSQVRWEYCKIPSCDSSPVSTEQLAPTAPPELTPVVQDCYHGDGQSYRGTSSTTTTGKKCQSWSSMTPHRHQKTPENYPNAGLTMNYCRNPDADKGPWCFTTDPSVRWEYCNLKKCSGTEASVVAPPPVVLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*序列15人谷氨酸纤溶酶原融合基因，其含有Kex2、两个Ste13蛋白酶切位点的密码子，和酿酒酵母α因子的信号肽基因ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGAGCCTCTGGATGACTATGTGAATACCCAGGGGGCTTCACTGTTCAGTGTCACTAAGAAGCAGCTGGGAGCAGGAAGTATAGAAGAATGTGCAGCAAAATGTGAGGAGGACGAAGAATTCACCTGCAGGGCATTCCAATATCACAGTAAAGAGCAACAATGTGTGATAATGGCTGAAAACAGGAAGTCCTCCATAATCATTAGGATGAGAGATGTAGTTTTATTTGAAAAGAAAGTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTACAGAGGGACGATGTCCAAAACAAAAAATGGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACTTCTCCCCACAGACCTAGATTCTCACCTGCTACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAACTACTGCAGGAATCCAGACAACGATCCGCAGGGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAAAAGAGATATGACTACTGCGACATTCTTGAGTGTGAAGAGGAATGTATGCATTGCAGTGGA
GAAAACTATGACGGCAAAATTTCCAAGACCATGTCTGGACTGGAATGCCAGGCCTGGGACTCTCAGAGCCCACACGCTCATGGATACATTCCTTCCAAATTTCCAAACAAGAACCTGAAGAAGAATTACTGTCGTAACCCCGATAGGGAGCTGCGGCCTTGGTGTTTCACCACCGACCCCAACAAGCGCTGGGAACTTTGCGACATCCCCCGCTGCACAACACCTCCACCATCTTCTGGTCCCACCTACCAGTGTCTGAAGGGAACAGGTGAAAACTATCGCGGGAATGTGGCTGTTACCGTTTCCGGGCACACCTGTCAGCACTGGAGTGCACAGACCCCTCACACACATAACAGGACACCAGAAAACTTCCCCTGCAAAAATTTGGATGAAAACTACTGCCGCAATCCTGACGGAAAAAGGGCCCCATGGTGCCATACAACCAACAGCCAAGTGCGGTGGGAGTACTGTAAGATACCGTCCTGTGACTCCTCCCCAGTATCCACGGAACAATTGGCTCCCACAGCACCACCTGAGCTAACCCCTGTGGTCCAGGACTGCTACCATGGTGATGGACAGAGCTACCGAGGCACATCCTCCACCACCACCACAGGAAAGAAGTGTCAGTCTTGGTCATCTATGACACCACACCGGCACCAGAAGACCCCAGAAAACTACCCAAATGCTGGCCTGACAATGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCCGATAAAGGCCCCTGGTGTTTTACCACAGACCCCAGCGTCAGGTGGGAGTACTGCAACCTGAAAAAATGCTCAGGAACAGAAGCGAGTGTTGTAGCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTTCCAGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAAGACTGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATACCGAGGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGGACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTCACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGAC
AAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA序列16人谷氨酸纤溶酶原融合蛋白，其含有Kex2、Ste13酶切位点，和酿酒酵母α因子的信号肽MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAEPLDDYVNTQGASLFSVTKKQLGAGSIEECAAKCEEDEEFTCRAFQYHSKEQQCVIMAENRKSSIIIRMRDVVLFEKKVYLSECKTGNGKNYRGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECEEECMHCSGENYDGKISKTMSGLECQAWDSQSPHAHGYIPSKFPNKNLKKNYCRNPDRELRPWCFTTDPNKRWELCDIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTGENYRGNVAVTVSGHTCQHWSAQTPHTHNRTPENFPCKNLDENYCRNPDGKRAPWCHTTNSQVRWEYCKIPSCDSSPVSTEQLAPTAPPELTPVVQDCYHGDGQSYRGTSSTTTTGKKCQSWSSMTPHRHQKTPENYPNAGLTMNYCRNPDADKGPWCFTTDPSVRWEYCNLKKCSGTEASVVAPPPVVLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*序列17分泌到培养基中的谷氨酸纤溶酶原的序列(pSM49.8、pSM58.1和pSM82.1)EPLDDYVNTQGASLFSVTKKQLGAGSIEECAAKCEEDEEFTCRAFQYHSKEQQCVIMAENRKSSIIIRMRDVVLFEKKVYLSECKTGNGKNYRGTMSKTK
NGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECEEECMHCSGENYDGKISKTMSGLECQAWDSQSPHAHGYIPSKFPNKNLKKNYCRNPDRELRPWCFTTDPNKRWELCDIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTGENYRGNVAVTVSGHTCQHWSAQTPHTHNRTPENFPCKNLDENYCRNPDGKRAPWCHTTNSQVRWEYCKIPSCDSSPVSTEQLAPTAPPELTPVVQDCYHGDGQSYRGTSSTTTTGKKCQSWSSMTPHRHQKTPENYPNAGLTMNYCRNPDADKGPWCFTTDPSVRWEYCNLKKCSGTEASVVAPPPVVLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*序列18分泌到培养基中的赖氨酸纤溶酶原的蛋白序列(pMHS476.1、pSM54.2、pAC37.1和pJW9.1)。
KVYLSECKTGNGKNYRGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECEEECMHCSGENYDGKISKTMSGLECQAWDSQSPHAHGYIPSKFPNKNLKKNYCRNPDRELRPWCFTTDPNKRWELCDIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTGENYRGNVAVTVSGHTCQHWSAQTPHTHNRTPENFPCKNLDENYCRNPDGKRAPWCHTTNSQVRWEYCKIPSCDSSPVSTEQLAPTAPPELTPVVQDCYHGDGQSYRGTSSTTTTGKKCQSWSSMTPHRHQKTPENYPNAGLTMNYCRNPDADKGPWCFTTDPSVRWEYCNLKKCSGTEASVVAPPPVVLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADR
TECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*序列19寡核苷酸引物NO36aAAAAACTCGAGAAAAGAGCACCTCCGCCTGTTG序列20寡核苷酸引物NO36bAAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGCACCTCCGCCTGTTG序列21寡核苷酸引物NO36cAAAAACTCGAGAAAAGAAAACTTTACGACTACTG序列22寡核苷酸引物NO36dAAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAAACTTTACGACTACTG序列23寡核苷酸引物NO36eAAAAACTCGAGAAAAGACTTTACGACTACTGTG序列24寡核苷酸引物NO36fAAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCTTTACGACTACTGTG序列25寡核苷酸引物NO36gAAAAACTCGAGAAAAGAGCCCCTTCATTTGATTGTG序列26寡核苷酸引物NO36hAAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGCCCCTTCATTTGATTGTG
序列27寡核苷酸引物NO36iAAAAACTCGAGAAAAGATCATTTGATTGTGGGAAGCC序列28寡核苷酸引物NO36jAAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTCATTTGATTGTGGGAAGCC序列29小纤溶酶原(pPLG1.1和pPLG2.1)APPPVVLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*序列30微纤溶酶原(pPLG3.2和pPLG4.2)KLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*序列31微纤溶酶原(pPLG5.3和pPLG6.1)。
LYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFV
TWIEGVMRNN*序列32微纤溶酶原(pPLG7.1和pPLG8.3)。
APSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*序列33微纤溶酶原(pPLG9.1和pPLG10.1)。
SFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*序列34pPICZαA中的酿酒酵母α因子的DNA序列，该序列位于Kex2酶切位点的上游ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAG序列35pPICZαA中的酿酒酵母α因子的氨基酸序列，所述序列位于Kex2酶切位点的上游MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLE
序列36Kex2酶切位点的DNA序列AAAAGA序列37Ste13酶切位点的DNA序列GAGGCTGAAGCT序列38Kex2酶切位点的氨基酸序列KR序列39Ste13酶切位点的氨基酸序列EAEA序列40由以下序列组成的氨基酸序列质粒pPLG1.1中的人小纤溶酶原、Kex2酶切位点和酿酒酵母α因子的前肽原MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKRAPPPVVLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*序列41由以下序列组成的氨基酸序列质粒pPLG2.1中的人小纤溶酶原、Kex2酶切位点、两个Ste1酶切位点和酿酒酵母α因子的前肽原MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAAPPPVVLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPR
AGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWI EGVMRNN*序列42由以下序列组成的氨基酸序列质粒pPLG3.2中的人微纤溶酶原、Kex2酶切位点和酿酒酵母α因子的前肽原MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*序列43由以下序列组成的氨基酸序列质粒pPLG4.2中的人微纤溶酶原、Kex2酶切位点、两个Ste13酶切位点和酿酒酵母α因子的前肽原MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*序列44由以下序列组成的氨基酸序列质粒pPLG5.3中的人微纤溶酶原、Kex2酶切位点和酿酒酵母α因子的前肽原MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKRLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHS
WPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*序列45由以下序列组成的氨基酸序列质粒pPLG6.1中的人微纤溶酶原、Kex2酶切位点、两个Ste13酶切位点和酿酒酵母α因子的前肽原MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEALYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*序列46由以下序列组成的氨基酸序列质粒pPLG7.1中的人微纤溶酶原、Kex2酶切位点和酿酒酵母α因子的前肽原MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKRAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*序列47由以下序列组成的氨基酸序列质粒pPLG8.3中的人微纤溶酶原、Kex2酶切位点、两个Ste13酶切位点和酿酒酵母α因子的前肽原MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVI
ENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*序列48由以下序列组成的氨基酸序列质粒pPLG9.1中的人微纤溶酶原、Kex2酶切位点和酿酒酵母α因子的前肽原MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKRSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*序列49由以下序列组成的氨基酸序列质粒pPLG10.1中的人微纤溶酶原、Kex2酶切位点、两个Ste13酶切位点和酿酒酵母α因子的前肽原MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEASFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*序列50由以下序列组成的核酸序列质粒pPLG1.1中的人小纤溶酶原基因、Kex2酶切位点的密码子和酿酒酵母α因子前肽原的基因ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTTCCAGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAAGACTGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATACCGAGGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGGACGCCATGCCAG
GACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTCACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA序列51由以下序列组成的核酸序列质粒pPLG2.1中的人小纤溶酶原基因，Kex2酶切位点和Ste13酶切位点的密码子，以及酿酒酵母α因子前肽原的基因ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTTCCAGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAAGACTGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATACCGAGGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGGACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTCACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGG
GGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA序列52由以下序列组成的核酸序列质粒pPLG3.2中的人微纤溶酶原基因、Kex2酶切位点的密码子和酿酒酵母α因子前肽原的基因ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCT
TGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA序列53由以下序列组成的核酸序列质粒pPLG4.2中的人微纤溶酶原基因，Kex2酶切位点和Ste13酶切位点的密码子，以及酿酒酵母α因子前肽原的基因ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA序列54由以下序列组成的核酸序列质粒pPLG5.3中的人微纤溶酶原基因，Kex2酶切位点的密码子和酿酒酵母α因子前肽原的基因ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTA
TTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA序列55由以下序列组成的核酸序列质粒pPLG6.1中的人微纤溶酶原基因，Kex2酶切位点和Ste13酶切位点的密码子，以及酿酒酵母α因子前肽原的基因ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTG
GTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA序列56由以下序列组成的核酸序列质粒pPLG7.1中的人微纤溶酶原基因、Kex2酶切位点的密码子和酿酒酵母α因子前肽原的基因ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA序列57由以下序列组成的核酸序列质粒pPLG8.3中的人微纤溶酶原基因、Kex2酶切位点和Ste13酶切位点的密码子，以及酿酒酵母α因子前肽原的基因
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA序列58由以下序列组成的核酸序列质粒pPLG9.1中的人微纤溶酶原基因、Kex2酶切位点的密码子和酿酒酵母α因子前肽原的基因ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGATCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCC
TTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA序列59由以下序列组成的核酸序列质粒pPLG10.1中的人微纤溶酶原基因、Kex2酶切位点和Ste13酶切位点的密码子，以及酿酒酵母α因子前肽原的基因ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA
序列60质粒pPLG1.1和pPLG2.1中的人小纤溶酶原基因的核酸序列。
GCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTTCCAGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAAGACTGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATACCGAGGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGGACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTCACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA序列61质粒pPLG3.2和pPLG4.2中的人微纤溶酶原基因的核酸序列AAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGA
GTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA序列62质粒pPLG5.3和pPLG6.1中的人微纤溶酶原基因的核酸序列CTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA序列63质粒pPLG7.1和pPLG8.3中的人微纤溶酶原基因的核酸序列GCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGC
AATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA序列64质粒pPLG9.1和pPLG10.1中的人微纤溶酶原基因的核酸序列TCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA序列65人谷氨酸纤溶酶原基因的核酸序列GAGCCTCTGGATGACTATGTGAATACCCAGGGGGCTTCACTGTTCAGTGTCACTAAGAAGCAGCTGGGAGCAGGAAGTATAGAAGAATGTGCAGCAAAATGTGAGGAGGACGAAGAATTCACCTGCAGGGCATTCCAATATCACAGTAAAGAGCAACAATGTGTGATAATGGCTGAAAACAGGAAGTCCTCCATAATCATTAGGATGAGAGATGTAGTTTTATTTGAAAAGAAAGTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTACAGAGGGACGATGTCCAAAACAAAAAATGGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACTTCTCCCCACAGACCTAGATTCTCACCTGCTACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAACTACTGCAGGAATCCAGACAACGATCCGCAGGGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAAAAGAGATATGACTACTGCGACATTCTTGAGTGTGAAGAGGAATGTATGCATTGCAGTGGAGAAAACTATGACGGCAAAATTTCCAAG
ACCATGTCTGGACTGGAATGCCAGGCCTGGGACTCTCAGAGCCCACACGCTCATGGATACATTCCTTCCAAATTTCCAAACAAGAACCTGAAGAAGAATTACTGTCGTAACCCCGATAGGGAGCTGCGGCCTTGGTGTTTCACCACCGACCCCAACAAGCGCTGGGAACTTTGCGACATCCCCCGCTGCACAACACCTCCACCATCTTCTGGTCCCACCTACCAGTGTCTGAAGGGAACAGGTGAAAACTATCGCGGGAATGTGGCTGTTACCGTTTCCGGGCACACCTGTCAGCACTGGAGTGCACAGACCCCTCACACACATAACAGGACACCAGAAAACTTCCCCTGCAAAAATTTGGATGAAAACTACTGCCGCAATCCTGACGGAAAAAGGGCCCCATGGTGCCATACAACCAACAGCCAAGTGCGGTGGGAGTACTGTAAGATACCGTCCTGTGACTCCTCCCCAGTATCCACGGAACAATTGGCTCCCACAGCACCACCTGAGCTAACCCCTGTGGTCCAGGACTGCTACCATGGTGATGGACAGAGCTACCGAGGCACATCCTCCACCACCACCACAGGAAAGAAGTGTCAGTCTTGGTCATCTATGACACCACACCGGCACCAGAAGACCCCAGAAAACTACCCAAATGCTGGCCTGACAATGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCCGATAAAGGCCCCTGGTGTTTTACCACAGACCCCAGCGTCAGGTGGGAGTACTGCAACCTGAAAAAATGCTCAGGAACAGAAGCGAGTGTTGTAGCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTTCCAGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAAGACTGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATACCGAGGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGGACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTCACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCT
TGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA序列66人赖氨酸纤溶酶原基因的核酸序列AAAGTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTACAGAGGGACGATGTCCAAAACAAAAAATGGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACTTCTCCCCACAGACCTAGATTCTCACCTGCTACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAACTACTGCAGGAATCCAGACAACGATCCGCAGGGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAAAAGAGATATGACTACTGCGACATTCTTGAGTGTGAAGAGGAATGTATGCATTGCAGTGGAGAAAACTATGACGGCAAAATTTCCAAGACCATGTCTGGACTGGAATGCCAGGCCTGGGACTCTCAGAGCCCACACGCTCATGGATACATTCCTTCCAAATTTCCAAACAAGAACCTGAAGAAGAATTACTGTCGTAACCCCGATAGGGAGCTGCGGCCTTGGTGTTTCACCACCGACCCCAACAAGCGCTGGGAACTTTGCGACATCCCCCGCTGCACAACACCTCCACCATCTTCTGGTCCCACCTACCAGTGTCTGAAGGGAACAGGTGAAAACTATCGCGGGAATGTGGCTGTTACCGTTTCCGGGCACACCTGTCAGCACTGGAGTGCACAGACCCCTCACACACATAACAGGACACCAGAAAACTTCCCCTGCAAAAATTTGGATGAAAACTACTGCCGCAATCCTGACGGAAAAAGGGCCCCATGGTGCCATACAACCAACAGCCAAGTGCGGTGGGAGTACTGTAAGATACCGTCCTGTGACTCCTCCCCAGTATCCACGGAACAATTGGCTCCCACAGCACCACCTGAGCTAACCCCTGTGGTCCAGGACTGCTACCATGGTGATGGACAGAGCTACCGAGGCACATCCTCCACCACCACCACAGGAAAGAAGTGTCAGTCTTGGTCATCTATGACACCACACCGGCACCAGAAGACCCCAGAAAACTACCCAAATGCTGGCCTGACAATGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCCGATAAAGGCCCCTGGTGTTTTACCACAGACCCCAGCGTCAGGTGGGAGTACTGCAACCTGAAAAAATGCTCAGGAACAGAAGCGAGTGTTGTAGCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTTCCAGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAAGACTGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATACCGAGGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGGACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTCACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTC
AGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA
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<210>5<211>35<212>DNA<213>智人<400>5aaaaactcga gaaaagagag cctctggatg actat35<210>6<211>47<212>DNA<213>智人<400>6aaaaactcga gaaaagagag gctgaagctg agcctctgga tgactat 47<210>7<211>2400<212>DNA<213>智人<400>7atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct60ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt120tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat180aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta240tctctcgaga aaagaaaagt gtatctctca gagtgcaaga ctgggaatgg aaagaactac300agagggacga tgtccaaaac aaaaaatggc atcacctgtc aaaaatggag ttccacttct360ccccacagac ctagattctc acctgctaca cacccctcag agggactgga ggagaactac420tgcaggaatc cagacaacga tccgcagggg ccctggtgct atactactga tccagaaaag480agatatgact actgcgacat tcttgagtgt gaagaggaat gtatgcattg cagtggagaa540aactatgacg gcaaaatttc caagaccatg tctggactgg aatgccaggc ctgggactct600cagagcccac acgctcatgg atacattcct tccaaatttc caaacaagaa cctgaagaag660aattactgtc gtaaccccga tagggagctg cggccttggt gtttcaccac cgaccccaac720aagcgctggg aactttgcga catcccccgc tgcacaacac ctccaccatc ttctggtccc780acctaccagt gtctgaaggg aacaggtgaa aactatcgcg ggaatgtggc tgttaccgtt840tccgggcaca cctgtcagca ctggagtgca cagacccctc acacacataa caggacacca900gaaaacttcc cctgcaaaaa tttggatgaa aactactgcc gcaatcctga cggaaaaagg960gccccatggt gccatacaac caacagccaa gtgcggtggg agtactgtaa gataccgtcc1020tgtgactcct ccccagtatc cacggaacaa ttggctccca cagcaccacc tgagctaacc1080cctgtggtcc aggactgcta ccatggtgat ggacagagct accgaggcac atcctccacc1140accaccacag gaaagaagtg tcagtcttgg tcatctatga caccacaccg gcaccagaag1200accccagaaa actacccaaa tgctggcctg acaatgaact actgcaggaa tccagatgcc1260gataaaggcc cctggtgttt taccacagac cccagcgtca ggtgggagta ctgcaacctg1320aaaaaatgct caggaacaga agcgagtgtt gtagcacctc cgcctgttgt cctgcttcca1380gatgtagaga ctccttccga agaagactgt atgtttggga atgggaaagg ataccgaggc1440aagagggcga ccactgttac tgggacgcca tgccaggact gggctgccca ggagccccat1500agacacagca ttttcactcc agagacaaat ccacgggcgg gtctggaaaa aaattactgc1560cgtaaccctg atggtgatgt aggtggtccc tggtgctaca cgacaaatcc aagaaaactt1620tacgactact gtgatgtccc tcagtgtgcg gccccttcat ttgattgtgg gaagcctcaa1680gtggagccga agaaatgtcc tggaagggtt gtgggggggt gtgtggccca cccacattcc1740tggccctggc aagtcagtct tagaacaagg tttggaatgc acttctgtgg aggcaccttg1800atatccccag agtgggtgtt gactgctgcc cactgcttgg agaagtcccc aaggccttca1860tcctacaagg tcatcctggg tgcacaccaa gaagtgaatc tcgaaccgca tgttcaggaa1920atagaagtgt ctaggctgtt cttggagccc acacgaaaag atattgcctt gctaaagcta1980agcagtcctg ccgtcatcac tgacaaagta atcccagctt gtctgccatc cccaaattat2040
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1.一种在微生物中重组生产功能性纤溶酶原的方法，所述方法至少包括以下步骤a)将至少编码纤溶酶原的功能部分的核酸序列与至少编码一段信号肽的核酸序列融合，为了切割信号肽，所述编码功能性纤溶酶原的核酸序列和至少编码信号肽的核酸序列由蛋白酶的酶切位点密码子偶联。
2.如权利要求1所述的重组生产方法，其中，所述至少编码纤溶酶原的功能部分的核酸序列包含纤溶酶原的蛋白水解结构域，或其变异体或片段。
3.如权利要求1或2所述的重组生产方法，其中，所述至少编码纤溶酶原的功能部分的核酸序列编码谷氨酸纤溶酶原或赖氨酸纤溶酶原。
4.如权利要求1至3任一项所述的重组生产方法，其中，所述至少编码一段信号肽的核酸序列编码前肽原、前肽或原肽；和/或所述密码子编码蛋白酶Kex2和/或Ste13的酶切位点。
5.如权利要求4所述的重组生产方法，其特征在于，所述编码至少一段信号肽的核酸序列编码α因子的信号肽，或酿酒酵母的SUC2、PHA-E或PHO1的信号肽。
6.如前述任一项权利要求所述的重组生产方法，其特征在于，生产出至少为20mg/l的功能性谷氨酸纤溶酶原或赖氨酸纤溶酶原。
7.如前述任一项权利要求所述的重组生产方法，其特征在于，在经过120小时的处理后，生产出至少为120U/l的功能性赖氨酸纤溶酶原。
8.如前述任一项权利要求所述的重组生产方法，其中，用于扩增的两条寡核苷酸引物选自NO36a(Seq.ID No.19)、NO36b(Seq.ID No.20)、NO36c(Seq.ID No.21)、NO36d(Seq.ID No.22)、NO36e(Seq.ID No.23)、NO36f(Seq.ID No.24)、NO36g(Seq.ID No.25)、NO36h(Seq.ID No.26)、NO36i(Seq.ID No.27)或NO36j(Seq.ID No.28)。
9.如前述任一项权利要求所述的重组生产方法，其中，用于扩增的两条寡核苷酸引物选自NO34(Seq.ID No.1)、NO36(Seq.ID NO.2)、NO57(Seq.ID No.3)、NO37(Seq.ID No.4)、NO35(Seq.ID No.5)、NO56(Seq.ID No.6)；以及选自NO36a(Seq.ID No.19)、NO36b(Seq.ID No.20)、NO36c(Seq.ID No.21)、NO36d(Seq.ID No.22)、NO36e(Seq.ID No.23)、NO36f(Seq.ID No.24)、NO36g(Seq.ID No.25)、NO36h(Seq.ID No.26)、NO36i(Seq.ID No.27)或NO36j(Seq.ID No.28)。
10.如前述任一项权利要求所述的重组生产方法，其中，将步骤a)产生的融合产物整合到表达载体中，该表达载体适用于微生物。
11.如权利要求10所述的重组生产方法，其中，所述的表达载体适用于真菌。
12.如权利要求10或11所述的重组生产方法，其中，所述的表达载体包含诱导型启动子或组成型启动子。
13.如权利要求10或11所述的重组生产方法，其中，所述的表达载体包含巴斯德毕赤酵母的组成型GAP启动子。
14.如权利要求12所述的重组生产方法，其特征在于，所获得的核酸是质粒，优选所述质粒选自pPLG11.2、pPLG12.1、pPLG13.1、pPLG14.2、pPLG15.1、pPLG16.3、pPLG17.2、pPLG18.1、pPLG19.2、pPLG20.1、pAC37.1、pJW9.1、pMHS476.1、pSM54.2、pSM49.8、pSM82.1或pSM58.1。
15.如前述任一项权利要求所述的重组生产方法，其特征在于，所述密码子编码蛋白酶Kex2的酶切位点；所述纤溶酶原的融合基因具有如下所示的核酸序列Seq.ID No.7、13、50、52、54、56或58。
16.如前述任一项权利要求所述的重组生产方法，其特征在于，所述密码子编码蛋白酶Kex2的酶切位点；所述纤溶酶原的融合蛋白具有如下所示的氨基酸序列Seq.ID No.8、14、40、42、44、46或48。
17.如前述任一项权利要求所述的重组生产方法，其特征在于，所述密码子编码蛋白酶Kex2和Ste13的酶切位点；所述纤溶酶原的融合基因具有如下所示的核酸序列Seq.ID No.9、15、51、53、55或57。
18.如前述任一项权利要求所述的重组生产方法，其特征在于，所述密码子编码蛋白酶Kex2和Ste13的酶切位点；所述纤溶酶原的融合蛋白具有如下氨基酸序列Seq.ID No.10、16、41、43、45、47或49。
19.如前述任一项权利要求所述的重组生产方法，其中，用权利要求14的方法中所述的质粒转化所述微生物宿主。
20.如前述任一项权利要求所述的重组生产方法，其中，所使用的宿主为真核微生物。
21.如权利要求20所述的重组生产方法，其特征在于，所使用的宿主属于真菌属。
22.如权利要求21所述的重组生产方法，其特征在于，所使用的宿主属于毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、汉森酵母属(Hansenula)、念珠菌属(Candida)或曲霉属(Aspergillus)。
23.如权利要求22所述的重组生产方法，其特征在于，所使用的宿主属于以下种巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)或构巢曲霉(Aspergillus nidulans)。
24.如前述任一项权利要求所述的重组生产方法，其中过表达的核酸序列至少编码纤溶酶原的功能部分，而且所述至少纤溶酶原的功能部分由一种宿主微生物分泌，该宿主微生物由步骤a)产生的融合产物转化得到。
25.如前述任一项权利要求所述的重组生产方法，其中，所述纤溶酶原核酸序列的功能部分是下列序列之一Seq.ID No.60、61、62、63、64、65或66。
26.如前述任一项权利要求所述的重组生产方法，其特征在于，生产出一种功能性人纤溶酶原。
27.如前述任一项权利要求所述的重组生产方法，其特征在于，生产出一种与人类同源的功能性纤溶酶原。
28.一种质粒，其为质粒pPLG11.2、质粒pPLG12.1、质粒pPLG13.1、质粒pPLG14.2、质粒pPLG15.1、质粒pPLG16.3、质粒pPLG17.2、质粒pPLG18.1、质粒pPLG19.2或质粒pPLG20.1。
29.一种质粒，其为质粒pMHS476.1、质粒pSM54.2、质粒pSM49.8或质粒pSM82.1。
30.一种质粒，其为质粒pSM58.1、质粒pAC37.1或质粒pJW9.1。
31.根据权利要求1至27中任一项所述的重组生产方法获得的核酸序列，其特征在于，至少编码纤溶酶原功能部分的核酸序列与在酵母中具有活性的启动子可操作性偶联；所述至少编码纤溶酶原功能部分的核酸序列还和至少编码一段信号肽的核酸序列偶联，所述编码功能性纤溶酶原的核酸序列和至少编码信号肽的核酸序列由蛋白酶Kex2和Ste13的酶切位点密码子偶联。
32.纤溶酶原，该纤溶酶原由权利要求1至27中的任一项所述的重组生产方法获得。
33.如权利要求32所述的纤溶酶原，其特征在于，所述纤溶酶原为微纤溶酶原、小纤溶酶原、赖氨酸纤溶酶原、谷氨酸纤溶酶原或纤溶酶原衍生物。
34.如权利要求33所述的纤溶酶原衍生物，其特征在于，该衍生物包含纤溶酶原的功能性蛋白水解结构域，并包含至少一个缺失，和/或至少一个氨基酸置换，和/或与至少另一个氨基酸或至少一段肽或至少一个蛋白质融合。
35.如权利要求33或34所述的纤溶酶原衍生物，其特征在于，所述衍生物被至少一种纤溶酶原激活剂激活为具有活性的纤溶酶。
36.如权利要求33至35任一项所述的纤溶酶原衍生物，其特征在于，所述衍生物至少包含纤溶酶原的功能性蛋白水解结构域并且与微纤溶酶原、小纤溶酶原、赖氨酸纤溶酶原或谷氨酸纤溶酶原的同源性高于80％，优选高于90％，特别优选高于95％。
37.纤溶酶，该纤溶酶由至少一种纤溶酶原激活剂激活权利要求32-36任一项所述的纤溶酶原或纤溶酶原衍生物获得。
38.宿主微生物，该宿主微生物含有根据权利要求1至27任一项所述的方法在步骤a)中得到的融合产物或由其衍生的任一核酸序列。
39.如权利要求38所述的宿主微生物，其特征在于，该宿主微生物选自下列微生物巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、酿酒酵母、多形汉逊酵母、黑曲霉、米曲霉或构巢曲霉。
40.根据权利要求1至27任一项所述的方法生产的功能性纤溶酶原和/或由其得到的纤溶酶在制备药剂中的应用。
41.根据权利要求1至27任一项所述的方法生产的功能性纤溶酶原和/或由其得到的纤溶酶在制备用于治疗创伤、血栓事件或预防血栓事件的药物中的应用。
42.根据权利要求1至27任一项所述的方法生产的功能性纤溶酶原和/或由其得到的纤溶酶在作为抗血栓活性剂和抗凝结活性剂中的应用。
43.如权利要求42所述的应用，该应用尤其为预防和/或治疗以下疾病心脏病发作、中风、血栓形成、静脉血栓、心瓣膜术后再狭窄、缺氧、缺血、凝固性坏死、血管炎症、急性肺栓塞、急性和亚急性动脉血栓、新发性的或陈旧性的静脉血栓凝结、臀部和肢端深静脉血栓、闭塞血管区域的早期血栓形成、急性眼中央血管栓塞、I型纤溶酶原缺乏导致的结膜炎、烧伤、碱或酸灼伤和冻伤、休克时弥漫性血管内凝血、急性肢端动脉栓塞、慢性闭塞性动脉病、动静脉短路处血栓形成；以下疾病的后续治疗心脏病发作、搭桥手术、血管形成术、球囊扩张术；急性心脏病发作的溶栓治疗；动静脉短路的再通；急性心脏病发作时，对堵塞的冠状动脉再灌注。
44.如权利要求40至43任一项所述的应用，其中联合使用所述的功能性纤溶酶原和/或由其得到的纤溶酶，和抗凝剂。
45.如权利要求44所述的应用，其特征在于，所述抗凝剂为肝素、肝素衍生物或乙酰水杨酸。
46.根据权利要求1至27任一项所述的方法生产的功能性纤溶酶原和/或由其得到的纤溶酶在加入到敷料、膏剂中的应用或与创伤药联合使用中的应用。
47.敷料、创伤用绷带或膏剂，该敷料、创伤用绷带或膏剂含有根据权利要求1至27任一项所述的方法生产的功能性纤溶酶原和/或由其得到的纤溶酶。
48.如权利要求47所述的敷料、创伤用绷带或膏剂，其中每平方厘米药物制剂中含有0.01-500U的纤溶酶原和/或由其得到的纤溶酶，优选为0.1-250U，特别优选为1-150U。
49.权利要求47或48所述的敷料、创伤用绷带或膏剂在制备用于治疗烧伤、冻伤、碱或酸灼伤、损伤和/或创伤的药物中的应用。
50.药物组合物，该药物组合物含有权利要求1至27任一项所述的方法生产的功能性纤溶酶原和/或由其得到的纤溶酶，和药物学上可接受的载体、添加剂和/或溶剂，如果需要也含有活性抗凝剂。
51.如权利要求50所述的药物组合物，该药物组合物适用于以下用药途径口服、局部或胃肠外、血管内、腹膜内、皮下、或肌肉内，所述血管内优选静脉内。
52.如权利要求51所述的药物组合物，在局部用药时，每克所述药物组合物含有0.01-500U纤溶酶原和/或由其得到的纤溶酶，优选为0.1-250U，特别优选为1-150U。
53.如权利要求51所述的药物组合物，在口服用药时，每克所述药物组合物含有0.1-100,000U纤溶酶原和/或由其得到的纤溶酶，优选为100-80,000U，特别优选为1,000-50,000U。
54.如权利要求51所述的药物组合物，在注射或输液用药时，每10ml溶液含有0.1-100百万U纤溶酶原和/或由其得到的纤溶酶，优选为1-10百万U，特别优选为3-5百万U。
55.如权利要求50至54任一项所述的药物组合物在制备用于治疗以下疾病的药物中的应用预防和/或治疗以下疾病心脏病发作、中风、血栓形成、静脉血栓、心瓣膜术后再狭窄、缺氧、缺血、凝固性坏死、血管炎症、急性肺栓塞、急性和亚急性动脉血栓、新发性的或陈旧性的静脉血栓凝结、臀部和肢端深静脉血栓、闭塞血管区域的早期血栓形成、急性眼中央血管栓塞、I型纤溶酶原缺乏导致的结膜炎、烧伤、碱或酸灼伤和冻伤、休克时弥漫性血管内凝血、急性肢端动脉栓塞、慢性闭塞性动脉病、动静脉短路处血栓形成；以下疾病的后续治疗心脏病发作、搭桥手术、血管形成术、球囊扩张术；急性心脏病发作的溶栓治疗；在动静脉短路的再通；在急性心脏病发作时，对堵塞的冠状动脉再灌注。
56.载体，该载体包含由权利要求1中步骤a)得到的融合产物或由其衍生出的核酸序列。
57.DNA分子，该DNA分子包含由权利要求1中步骤a)得到的融合产物或由其衍生出的核酸序列。
58.RNA分子，该RNA分子包含由权利要求1中步骤a)得到的融合产物或由其衍生出的核酸序列。
59.鉴定纤溶酶原激活剂的筛选方法，该方法使用权利要求36或37所述的功能性纤溶酶原。
60.如权利要求59所述的筛选方法，其特征在于，在将蛋白酶与权利要求35或36所述的功能性纤溶酶原预孵育后，检测得到的纤溶酶的活性。
61.如权利要求59或60所述的筛选方法，其特征在于，使用合成肽作为底物，来检测得到的纤溶酶的活性。
62.如权利要求61所述的筛选方法，其特征在于，使用合成肽N-tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA来检测得到的纤溶酶的活性。
全文摘要
本发明公开了一种在微生物中生产重组功能性纤溶酶原的方法，和一种鉴定纤溶酶原激活剂的方法。编码纤溶酶原的功能部分的核酸序列与至少编码一段信号肽的核酸序列融合。编码功能性纤溶酶原的核酸分子和编码信号肽的核酸分子由蛋白酶的酶切位点密码子偶联，所述蛋白酶的酶切位点密码子确保信号肽的切割。适当施用含有所述重组纤溶酶原或相应纤溶酶的制剂，可治疗慢愈性或难愈性创伤。
文档编号A61K38/48GK1768138SQ03803326
公开日2006年5月3日 申请日期2003年2月6日 优先权日2002年2月6日
发明者鲁迪·舒希洛, 汉斯·克里斯琴·科廷, 汉斯·贡特尔·加森, 马丁·希尔斯, 拉尔夫·帕斯特纳克 申请人:N-酶生物技术有限公司