专利名称：甘露糖结合凝集素及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及纯化的甘露糖结合凝集素(MBL)及其在治疗中的应用，上述甘露糖结合凝集素中基本不含有与丝氨酸蛋白酶(MASPs)相缔合(associated)的MBL。
背景技术：
甘露糖结合凝集素(MBL)，有时称为甘露聚糖结合凝集素或甘露糖结合蛋白，是一种来源于肝脏的C型血清凝集素，其与补体成分Clq具有结构上的同源性。MBL可以通过凝集素和经典途径激活补体，并且能够与噬菌细胞表面特异的Clq类受体相互作用，因此它在首要的宿主防卫体系中起着非常重要的作用。
MBL属于胶原凝集素(collectin)蛋白家族的成员，这类蛋白中不仅存在胶原区域，而且也具有球状凝集素区域。MBL的结构单元是由3个32kDa亚单元组成的96kDa胶原蛋白三股螺旋，其中每一个亚单元都具有碳水化合物识别区域，上述螺旋通过N末端半胱氨酸之间的二硫键实现稳定作用。多个这种96kDa单元组成了MBL寡聚体，天然蛋白通常以三聚体到六聚体的形式存在，分子量在270kDa到大约650kDa之间。MBL只有在以较高寡聚体形式存在时才能获得其全部功能。目前已有证据表明MBL至少必须以四聚体的形式存在才能有效地进行补体激活。这种寡聚体结构使MBL有多个配体结合位点，并且可以摹拟IgM的多重结合特性。
MBL可以和多种不同的糖类进行结合，但其最强烈地与甘露糖和N-乙酰氨基葡萄糖相结合。上述糖类大量存在于许多病原菌的细胞壁上，例如酵母、革兰氏阴性肠道细菌、革兰氏阳性细菌、分枝杆菌、一些病毒和特定的寄生虫等。多数的MBL糖类靶都不在哺乳动物细胞表面进行高密度的表达，同时MBL还具有自身和非自身识别的能力，因此在首要的宿主防卫体系中，MBL可以作为一种模式识别分子发挥作用，称之为先天性免疫系统的核心部分(Turner，1996)。
MBL具有高效而有力的补体激活功能，和其激活功能的核心与体内至少两种原酶密切相关联，它们分别称为MBL关联(associated)丝氨酸蛋白酶1，2和3(MASP1，MASP2和MASP-3)。当MBL与它们各自的配体相结合，并且通过凝集素途径启动有效的补体激活作用时，上述分子量分别为93kDa、76kDa和105kDa的单一多肽就分别转换为活性形式(Turner，1996)。研究表明MAPS2是补体激活作用所必须的，该酶能在缺少MASP1或最近记述的MASP3时单独起始补体级联作用，因此MASP2是与MBL启动补体级联激活作用相关联的至关重要的酶类。
MBL基因(MBL2)位于第10号染色体的10q11.2-q21上，它包含4个外显子。已经记述了多个影响功能蛋白表达的MBL2突变体。目前认为MBL2基因外显子1中密码子52、54和57处的单核苷酸取代作用破坏了MBL亚单元组装成其基本的三聚体结构单元。
此外，目前至少描述了两个可以改变个体MBL亚单元表达水平的启动子区域多态性(分别在位置-550和-221处)。在不同的人种群中MBL基因突变的频率也不同。例如在高加索人(Caucasians)中，密码子54处突变体发生的频率为15％，而仅仅在非洲人中才会出现密码子57处发生突变的变体。基因突变和启动子多态性共同发生的实际意义在于在普通人群中发生MBL缺乏是相当普遍的。在具有野生型基因的纯合个体中，血清中MBL的水平为1到5μg/mL；在MBL2基因发生突变的纯合个体中，血清中MBL的水平为5到25ng/mL；在杂合个体中，血清中MBL的水平为常规的1/8，但是也存在有相当大的变化。
许多线索表明MBL缺乏可以导致重大的临床后果。
1968年，人们认为孩童时期反复感染、不能健壮发育以及慢性腹泻等综合症状与体外血浆中缺乏调理素有关。后来的研究证明这种综合症状与10个年龄在15个月到9岁的儿童低水平的MBL相关。通过对医院已确认发生感染的345个儿童进行连续的研究表明，MBL2缺乏是造成儿童感染的非常危险的因素之一。在已发生感染的儿童中，MBL2基因突变的发生率是未感染儿童的两倍，同时在杂合个体和纯合个体中都增加了易感染性。感染种类从胸部感染和耳炎直到威胁生命的脑膜炎球菌血症(meningococcaemia)。
通过对266份病例的大量研究，已经证实了MBL缺乏与儿童流行性脑脊髓膜炎(meningcoccal disease)之间的相关性。7.7％的医院基础上的病例属于MBL多态性纯合型，而对照组为1.5％，让步比(odds ratio)为6.5。由此可以得出结论，全部病例中的1/3是由MBL发生遗传突变引起的。
上述儿科群体中的数据产生了下面一种假设，即MBL的主要作用是在所谓的“易获病期”提供一种保护，而所谓的“易获病期”(window ofvulnerability)是指母体抗体丧失之后和婴儿自身抗体组成部分尚未成熟之前的这段时期(6个月到18个月)。
最近的研究结果表明MBL基因型突变体与常见的可变免疫缺陷和急性成淋巴细胞白血病的早期发作和显现相关，上述结果有力地支持了以下假设，即当免疫系统中其它组分尚未成熟或受到损伤时，MBL介导的宿主防卫体系发挥着更重要的调节作用。
最近对149个囊肿性纤维化(CF)受试者的研究表明，常见的MBL基因遗传突变与疾病严重性的增加和感染Burkholderia cepacia危险的增大相关。MBL突变体等位基因也与预后不良和夭折(early death)相关-与通常的CF群体中的纯合体相比，突变体等位基因携带者的预计存活时期也缩小了8年。
MBL缺乏在成人中的重要性被越来越多的医疗证据所证实，通过对患有“严重且异常”感染的成人受试者(包括反复性皮肤感染、隐孢子虫病(cryptosporidiosis)、具有反复性单纯疱疹和食管念珠菌病的流行性脑脊髓膜炎(meningococal meningitis)、以及Klebsiella pneumonia)的研究表明涉及了MBL2基因密码子52或54处的突变。
在228个疑似具有非HIV相关性免疫缺陷的成人受试者中，杂合性MBL2基因突变的发生频率与对照群体相同，但是在上述疑似具有免疫缺陷的群体中，纯合性MBL2基因突变的发生频率却显著增加(8.3％对0.8％)。相关数据还显示出在男性MBL多态性纯合体中，感染HIV的危险性较大并且AIDS进展的比率也较快。
在因采用化学疗法而使机体适应性免疫反应受到损害(compromise)的受试者体内，MBL结构基因突变后果和循环性MBL水平较低是与感染发生率和感染严重性的增加明显相关的。在因血液恶性肿瘤疾病而接受化学治疗的成人中，MBL水平低于0.5μg/mL的受试者感染的发生率和严重性都显著增加。人们发现在成人进行同种异体干细胞移植之后，供体和受体的MBL基因型对发生感染的风险起着重要的作用。在100个接受化学治疗的儿童中，与具有野生型MBL基因的儿童相比，那些具有MBL结构基因突变的受试者发生发热性嗜中性白血球减少症的天数是其两倍，而是那些因感染送入ICU的四倍。在此项研究中，MBL水平低于1μg/mL是一项关键因素。
在预期的研究之中，还对研究地区的252名儿童进行了检查(Koch等，2001)，结果发现年龄在6个月到17个月的儿童中，MBL缺乏与急性呼吸感染显著相关(发生的风险增加两倍)，对年龄在0个月到5个月的儿童发生急性呼吸感染会产生很小的影响，而对年龄在18个月到23个月的儿童则没有影响。
自从1980年以来，可以在实验室规模上对MBL-MASP复合体进行常规纯化。可以采用各种形式的亲和层析对MBL-MASP复合体进行纯化。配基通常采用酵母甘露聚糖(Anderson等，1992；Holmskov等，1993)，通过柱用高盐或EDTA进行第一次洗脱(Koppel等，1994；Anderson等，1992；Holmskov等，1993)，用甘露糖进行最后一次洗脱(Koppel等，1994；Anderson等，1992；Matsushita等，1992；Holmskov等，1993)，上述洗脱进行1或2个循环。
可以在实验室规模(Kilpatrick，2000)，在Statens Serum Institut的GMP条件下(Valdimarsson等，1998)，从分级分离血浆蛋白产生的废弃部分纯化人MBL-MASP复合体。Scottish Cohn部分III是一种血浆分级分离生产IgG的过程中所产生的废弃产品，可以用21％的乙醇对血浆中产生的冰冷上清液进行沉淀，此步骤产生的沉淀称之为级分(fraction)I+II+III。采用8％的乙醇进行进一步的沉淀产生了级分I+III。可以采用Emphaze-甘露聚糖柱从其中进行亲和捕获而获得MBL-MASP复合体，先用EDTA，然后采用甘露糖溶液进行MBL-MASP复合体的洗脱。采用此程序，从级分I+III糊剂所获得的MBL-MASP复合体的产量为10mg/kg，特异性活性比集中血浆提高7倍(Kilpatrick，2000)。以这种方式，也可以采用简单的甘露糖洗脱获得高纯度的MBL-MASP复合体(300-600μg/L血浆)。
在WO99/64453中还讨论了另外一种纯化技术，其揭示了采用非共轭性多聚糖基质进行层析纯化的步骤。
发明概述本发明发现在激活补体级联过程中，缺少MASP的MBL组合物比经纯化获得的与MASPs相结合的MBL复合体更加优良。因此本发明进一步发现，为给受试者明确提供一种安全、有效的治疗药物产品，在MBL-MASP复合体纯化过程中或在其纯化之前或在其纯化之后，MASPs或者至少已被激活的MASPs应从MBL中去除。
因此本发明的第一方面提供了一种药物组合物，其包含了分离的非重组性甘露糖结合凝集素(MBL)以及制药学上可接受的载体或稀释剂，其中分离的非重组性甘露糖结合凝集素中基本上不含有已被激活的与丝氨酸蛋白酶(MASPs)相交联的MBL。
优选的上述组合物中基本上不含有MASPs，无论其被激活与否。典型的MBL是人MBL。
本发明发现缺少MASP的MBL能够从血浆中补充MASPs，进而产生功能性复合体，其可成功地激活补体级联作用。与之相比，纯化的MBL-MASP复合体仅具有有限的补充原酶(或新鲜的)MASP的能力。这可能是由于在纯化过程中，作为激活的结果(例如在结合到甘露聚糖柱上时被激活)，在纯化复合体中已被激活的MASP吸附在MBL结合位点上，并且已被激活的MASP很难被置换下来。相反在纯化的缺少MASP的MBL中，原酶MASPs可以被不断地补充到其结合位点上，这也恢复了MBL-MASP复合体中的调节成分，从而生产出更加安全有效的治疗产品。
在一个优选实施例中，可以采用以下方法获得MBL(i)提供一种非重组性MBL和一个或更多个MASPs的复合体；(ii)在适当的缓冲液中培养上述复合体，使MBL与一个或更多个MASPs发生分离；并且(iii)从一个或更多个MASPs中将MBL分离出来。
在步骤(ii)中，缓冲液优选pH从4.0到5.0的EDTA/乙酸盐缓冲液。
此外，缓冲液中优选含有NaCl，缓冲液中优选NaCl的浓度至少为0.5M，缓冲液中更加优选NaCl的浓度大约为1M。
在步骤(iii)中，优选包含一种层析方法和/或过滤方法。在进一步优选的实施例中，层析方法选自以下组粒径分离层析和离子交换层析。
本发明的第二方面提供了一种生产药物组合物的方法，该方法包括(i)提供一种非重组性MBL和一个或更多个MASPs的复合体；
(ii)从至少部分(some)的一个或更多个MASPs中使MBL发生分离；(iii)从至少部分的一个或更多个MASPs中使MBL分离出来；并且(iv)将第(iii)步产生的MBL与制药学上可接受的载体或稀释剂相混合。
步骤(ii)优选包括在适当的缓冲液中培养复合体。
缓冲液优选pH从4.0到5.0的EDTA/乙酸盐缓冲液。
此外，缓冲液中优选含有NaCl，缓冲液中优选NaCl的浓度至少为0.5M，缓冲液中更加优选NaCl的浓度大约为1M。
在步骤(iii)中，优选包含一种层析方法和/或过滤方法。在进一步优选的实施例中，层析方法选自以下组大小排阻层析和离子交换层析。
在优选实施方案中，步骤(i)包括了从血浆分级过程(Plasma fractionproccess)中提供附加级分(side fraction)的步骤。步骤(i)进一步优选包括采用甘露聚糖亲和层析法从其它血浆蛋白中分离非重组MBL和一个或更多个MASPs复合体的步骤，其中其它血浆蛋白存在于血浆分级过程中产生的附加级分中。
本发明还提供了一种药物组合物，其是通过本发明第二方面所述的方法获得的。优选的组合物中基本上不含有激活的MASPs。
另一方面，本发明提供了一种在受试者中治疗或预防疾病的方法，该方法包括给受试者施用有效剂量的本发明所述的药物组合物。
疾病可以是任何条件的，可以通过给受试者施用纯化的缺少MASP的MBL以帮助对疾病的治疗和预防作用。该方法适合的接受者包括，但并不局限于，骨髓同种异体移植接受者、囊肿性纤维化受试者、免疫缺陷受试者、急性成淋巴细胞白血病受试者、社区获得性或医院性败血病受试者、病原体感染或病原体易感性受试者、低出生体重和/或早熟婴儿。典型的是，受试者MBL产生缺乏。
本发明还提供了包含分离的非重组性MBL的组合物在预防和治疗中的应用，上述组合物基本上不含有MASPs。
本发明进一步提供了包含分离的非重组性MBL的组合物在生产药物中的应用，上述组合物基本上不含有MASPs，该药物用于施用给实际需要上述组合物的受试者。
适合的接受者包括，但并不局限于，骨髓同种异体移植接受者、囊肿性纤维化受试者、免疫缺陷受试者、急性成淋巴细胞白血病受试者、社区获得性或医院性败血病受试者、病原体感染或病原体易感性受试者、低出生体重和/或早熟婴儿。典型的是，受试者MBL产生缺乏。
为了测定样品中MASP的活性水平，本发明者还设计了裂解性底物及其应用试验。上述试验可用于监控此处描述的MBL纯化步骤或其它任何需要分析MASP活性的目的。
因此本发明的另一方面提供了一种通式为X-R1-Arg-R2-Y的肽，其中R1-Arg-R2是来源于补体蛋白MASP切割位点的由6个或更多个连续氨基酸组成的肽；X为氨基，保护基团或可检测性标记；Y为羧基或可检测性标记，并且当X是氨基或保护基团时，Y不能是羧基，当Y为羧基时，X不能是氨基或保护基团(blocking group)。
优选的补体蛋白是C4。
优选的C4蛋白是人的C4并且切割位点包含Arg756。
在进一步的优选实施方案中，X是猝灭剂分子并且Y是荧光标记，反之亦然，从而保证当底物被切除时可以获得荧光信号。
本发明的另一方面提供了本发明的肽在确定样品中存在MASP活性的方法中的应用。
本发明的再一方面提供了一种确定样品中存在MASP活性的方法，该方法包括将样品与本发明的肽相接触，从而确定上述肽是否被切除。
本发明的另一方面提供了一种生产本发明药物组合物的方法，该方法包括(i)提供一种非重组性MBL和一个或更多个MASPs的复合体；(ii)在适当的缓冲液中培养上述复合体，使MBL与一个或更多个MASPs发生分离；(iii)从一个或更多个MASPs中将MBL分离出来；(iv)采用本发明的方法在步骤(iii)获得的MBL中筛选MASP活性；并且(v)将上述产生的纯化的MBL与制药学上可接受的载体或稀释剂相混合。
附图简述附
图1缺少(depleted)MASP的MBL和MBL-MASP复合体中MBL水平与C4富集(deposition)对照图，显示出缺少MASP的级分在体外补充MASP2和补体激活的优势。在数值达到1.0时，C4产生超量。
附图2缺少MASP的MBL和MBL-MASP复合体中MBL水平与C4富集对照图，显示出缺少MASP的级分在体外补充MASP2和补体激活的优势。在数值达到1.0时，C4产生超量。
发明详述除非特殊说明，否则此处所用的所有技术和科学术语与本领域普通技术人员通常理解的含义相同(例如在细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学等方面)。在分子、遗传免疫和生物化学方法及化学方法中采用标准的技术(参见常规的，Sambrook et al.，Molecular CloningALaboratory Manual，3rded.(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y和Ausubel et al.，Short Protocols in Molecular Biology(1999)4thEd，John Wiley & Sons，Inc.-和the full version entitled CurrentProtocols in Molecular Biology，Ed Harlow and David Lane(editors)AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory，(1988)，和J.E.Coliganet al.(editors)Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons(includingall updates until present)，which are incorporated herein by reference)。
A.基本上不含有MASPs的MBL的纯化可以从非重组性资源获得本发明的纯化的缺少MASP的MBL，例如从血浆等动物或人体的生物材料中纯化获得。然而，在上述材料中MBL与MASPs以复合体的形式存在，因此为获得本发明纯化的基本上不含有激活的MASPs的MBL，需要从上述MASPs中分离MBL。
典型的纯化过程包括两个主要步骤-从其它生物材料中纯化MBL-MASP复合体和分离MBL-MASP复合体以获得基本纯化的缺少MASP的MBL。上述两个步骤可以以任何顺序发生，甚至可以同时进行。然而，由于MBL在血浆总蛋白含量中通常低于0.05％，因此为了富集MBL-MASP复合体，在分离步骤之前，需要进行一个典型的预纯化步骤以至少去除一些生物材料，例如非MBL-MASP血浆蛋白等。所以诸如血浆等生物材料需要进行典型的处理以获得包含MBL-MASP复合体的部分纯化的组合物。
MBL纯化的一个起始点是血液、血浆、肝脏和肝细胞培养物。然而可以从来源于血浆的产品或副产品来纯化缺少MASP的MBL。缺少MASP的MBL的优选来源是血浆分级分离过程中产生的附加级分(side fraction)。具体实例包括，但并不局限于，来源于沉淀或过滤过程的沉淀物或上清液，或来源于离子交换层析的附加级分，或来源于亲和层析的附加级分，或并非用于生产其它血浆类产品的方法所产生的级分。作为熟练的人员可以了解有许多不同的已知方法进行血浆分级分离。然而，熟练的人员可以容易地分离MBL以确定既定的血浆分级分离过程中所产生的级分中是否包含有MBL，例如采用此处描述的甘露聚糖结合、MBL抗原或C4富集试验和/或亲和层析纯化不同级分中的MBL。
工业大规模乙醇分级分离过程中所产生的原始血浆蛋白级分，例如Cohn级分II和/或III是生产缺少MASP的MBL的一个实例，它是在血浆分级分离过程中所产生的附加级分。这些级分通常是被废弃的，但其中含有MBL-MASP复合体，并且该MBL-MASP复合体中包含了源自Cohn上清液I的糊剂(此处称为“真球蛋白糊剂”)，因此作为起始材料，它们具有经济上的优势。同时由于血液是有价值的稀有资源，因此需要最大限度地利用上述附加级分。
缺少MASP的MBL可以来源于动物体或人体，但优选从人体资源中纯化缺少MASP的MBL。
当采用血浆/血浆副产品时，通常需要对其进行处理以富集血浆蛋白。典型的从血浆或血浆来源的产品获得血浆蛋白的方法例如是进行沉淀处理。可以使用本领域公知的各种合适的试剂对血浆或血浆副产品进行沉淀以获得血浆蛋白，例如各种分子量形式的聚乙烯(乙二醇)、乙醇和硫酸铵。
进一步可选择的步骤包括过滤，例如深度过滤，和脱脂。
例如可以采用如下的方法获得真球蛋白糊剂用注射用水(WFI)和冷乙醇在低于5℃的温度下处理已解冻的新鲜冷冻血浆，通过离心分离所产生的沉淀。上清液经通常的脱脂反应以利于吸收脂蛋白，并通过过滤进行澄清。然后采用截除分子量不低于10000道尔顿的超滤膜对上清液进行完全过滤以降低电导率。降低完全过滤所获得的上清液的pH以促进真球蛋白发生沉淀，并且通过过滤作用回收澄清的上清液，在此过程中收集真球蛋白糊剂。
可以通过典型的亲和纯化方法从其它血浆蛋白中提取MBL-MASP，该方法可以从其它血浆蛋白中分离MBL(大多数是与MASP形成的复合体)。通常的亲和俘获配体采用糖类，例如包括但并不局限于甘露聚糖和N-乙酰氨基葡萄糖。在优选的实施例中，亲和俘获配体采用甘露聚糖，例如甘露聚糖-琼脂糖凝胶(Sepharose)或甘露聚糖-琼脂糖。由于MBL-MASP复合体存在于真球蛋白糊剂等沉淀物中，因此在上亲和树脂之前，需要对沉淀蛋白进行重新溶解。合适的溶解缓冲液是Tris/NaCl/CaCl2缓冲液，例如可以在室温下，采用Tris/NaCl/CaCl2缓冲液将真球蛋白糊剂溶解1小时。
通常采用离心和/或过滤的方法去除不溶性物质。将可溶性血浆蛋白沉淀上亲和树脂，在采用EDTA等螯合性钙离子洗脱MBL-MASP复合体之前，需要对树脂进行清洗。
在WO99/64453中描述了另外一种纯化MBL-MASP复合体的方法，其仅仅采用了多聚糖基质，而未使用任何甘露聚糖等共轭性碳水化合物配体。由于MBL可以直接结合于多聚糖基质，因此可以采用相似的甘露聚糖亲和树脂进行有效的纯化，同时并不需要制备共轭性亲和树脂。
然后对通过上述方法或其它适当方式所获得的溶解在溶液中的MBL-MASP复合体进行处理以使MBL复合体发生分离，即使MASPs从MBL中分离出来。例如可以在适当的含有乙酸钠溶液(pH4.0-5.0)和EDTA的缓冲液中培养MBL复合体以实现上述分离的目的。此外，缓冲液中可以进一步含有NaCl，可以采用本领域公知的技术容易地确定用于分离MBL-MASP复合体所合适的NaCl浓度。在一个具体实施方案中，缓冲液中NaCl的浓度至少为0.5M，更优选缓冲液中NaCl的浓度约为1M。
然后采用适当的纯化步骤从MASPs中分离MBL以获得纯化的缺少MASP的MBL。典型的分离方法是基于大小/分子量进行的，例如大小排阻层析，或采用过滤和/或电泳方法，或基于电荷进行，例如离子交换层析，但是也可以采用其它适当的方法。例如，采用聚丙烯酰胺葡聚糖S-300大小排阻层析或过滤方法。收集含有MBL的级分之后是对其进行典型的浓缩过程。
在整个纯化过程中，为增加缺少MASP的MBL和/或MBL-MASP复合体的浓度，需要在一个或更多个阶段包括浓缩步骤。可以通过亲和纯化方法达到上述目的，但也可以包括一个或更多个超滤步骤。优选超滤膜具有10,000Da到100,000Da的截断(cut-off)分子量。通常在整个浓缩过程中需要将MBL和/或MASP复合体保存在适当的缓冲液中。
由于缺少MASP的MBL来源于动物体/人体的生物产品，因此在缺少MASP的MBL的纯化过程中优选包含一个或更多个病毒灭活过程。病毒灭活技术是本领域公知的一项技术，典型的方法包括将MBL与病毒灭活试剂相接触，例如清洁剂/溶剂联合使用。美国专利US4,314,997和US4,315,991中描述了合适的清洁剂，同时也包括了Triton X-100和吐温80，合适的溶剂包括了二烷基磷酸盐和三烷基磷酸盐，例如三(n-丁基)磷酸盐。
“分离的”非重组性MBL是指非重组性MBL至少部分与其天然状态下相关联或连接的分子发生分离。分离的非重组性MBL优选至少50％、优选至少75％、更优选至少90％与其天然状态下相关联的组分发生分离。
本发明者的研究表明，去除结合于非重组性MBL上的MASPs可以增强MBL激活补体途径的能力。熟练人员可以掌握在纯化过程中去除任何结合于MBL的已被激活的MASPs都将增强MBL组分的活性。通常情况下，去除越多的结合于MBL的已被激活的MASPs，MBL组分所具有的活性就会越高。基于此本发明生产出的药物组合物，在与其起始来源(例如血浆)相比，非重组性MBL与已激活的MASPs之间具有较高的比率。
本发明的一个方面提供了一种组合物，其包含基本上不含有已激活的MASPs的纯化的非重组性MBL，特别是不含有已激活的MASP-2。在上下文中，术语“基本上不含有(substantially free)”是指包含5μg分离的非重组性MBL的组合物，其C4富集试验的结果大于约0.3U/μl。优选C4富集试验的结果约大于0.5U/μl，更优选约大于0.75U/μl，更优选约大于1U/μl，更优选约大于1.25U/μl，甚至更优选约大于1.5U/μl。合适的C4富集试验为本领域所公知，同时此处也进行了描述。
本发明的另一方面提供了一种纯化基本上不含有已激活的MASP的非重组性MBL的方法。在上下文和一个具体实施例中，术语“基本上不含有”是由上述的C4富集试验所决定的。或者术语“基本上不含有”也可以通过将起始材料的MASP活性与至少部分纯化的MBL产品的MASP活性进行对比来决定，此时尚未采用任何方法步骤对起始材料的MBL-MASP复合体进行分离。在一个优选的实施方案中，MASP的活性至少降低75％，更优选至少降低80％，更优选至少降低85％，更优选至少降低90％，更优选至少降低95％，更优选至少降低97％，甚至更优选至少降低99％。MASP活性试验为本领域所公知，同时也包括了此处所描述的那些方法。
术语“已激活的MASP”是指MASP已不是原酶形式，而是由于蛋白质水解作用而处于激活状态。可以通过大小来区分已激活的MASP和原酶，原酶的分子量大约在70到110kDa，而已激活形式的酶由一条大约50到65kDa的重链和一条大约30到40kDa的轻链构成。可以通过在还原条件下进行凝胶电泳来区分，电泳结束后进行显影和/或免疫检测(例如Western印迹)。
然而，在一个优选的实施方案中，MBL是基本上不含有MASPs的，因此激活与否是相对于MBL-MASP复合体来计算的。
由于亲和力的增加，MBL在以低聚体的形式存在时功能更强。因此本发明的缺少MASP的MBL优选保持其天然的低聚体状态。优选至少50％纯化的MBL以低聚体形式存在，更优选为四聚体或较高级数的低聚体。
B.药物组合物本发明纯化的缺少MASP的MBL可以与各种成分组合来生产缺少MASP的MBL组合物。典型的包括有用以生产药物组合物(其可用于人体或动物体)的药物学上可接受载体或稀释剂的组合物以生产本发明的药物组合物。术语“药物学上可接受的”是指那些施与动物体、特别是哺乳动物体，甚至特别是人体时，不会产生过敏、毒性或其它不良反应的分子实体和组合物。药物学上可接受的介质或载体包括了任何一种和所有的溶剂、分散剂、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、稳定剂、等渗剂和延迟吸收剂等类似物质。上述介质和试剂作为药物活性物质的使用为本领域所公知。
合适的载体和稀释剂包括了等渗盐溶液，例如磷酸盐缓冲液。载体也可以是溶剂或含有水、乙醇、多羟基化合物(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等类似物)和它们适当混合物的分散介质以及植物油。可以通过使用包衣剂，例如卵磷脂，在进行散开时通过保持所需颗粒的大小以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂来阻止微生物体的活动，例如parabens、氯丁醇、苯酚、山梨酸和硫柳汞等类似物。在许多情况下，优选含有等渗剂，例如糖类或氯化钠。可以通过在组合物中使用延迟吸收剂来延长注射型组合物的吸收，例如单硬脂酸铝和白明胶。
合适的稳定剂包括了，但并不局限于药物纯级别的单糖、二糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、肌醇、葡聚糖等类似物和除MBL或MASP之外的血浆蛋白产品，如白蛋白、氨基酸以及多元醇(polyol)(例如聚乙二醇)等类似物。
组合物可以是诸如液体或固体等适当的形式。可以通过本领域公知的任何技术获得固体组合物，例如喷雾干燥、冷冻干燥、喷雾冷冻干燥、空气干燥、真空辅助干燥和流床式干燥等类似方法。
本发明的组合物可以通过直接注射进行给药。组合物也可以设计成各种给药途径，包括肠胃外给药、肌肉给药和静脉给药。其它给药系统可以包括按时释放(time-release)、延迟释放或持续释放。上述系统可以避免重复施与本发明的缺少MASP的MBL组合物，为受试者和医师带来了方便。可以采用本领域普通技术人员可以获得并公知的多种类型延迟释放给药系统。
它们包括基于聚合体的系统，例如聚乳酸、聚乙醇酸、聚酐和聚己酸内酯；非聚合体系统，包括了脂质，例如固醇，特别是胆固醇、胆甾醇酯和脂肪酸或中性脂肪，例如单甘油酯、二甘油酯和三甘油酯；水凝胶释放系统；硅橡胶系统；肽基础系统；蜡包衣，采用传统的结合剂和赋形剂的压缩片剂，部分融合包埋等类似系统。此外，也可以使用基于泵技术的金属物给药系统(hardware delivery system)，其中的一些系统适合于进行移植操作。
也可以采用长期持续释放植入物。此处所说的长期释放是指合理构建和安排植入物以便纯化的MBL的治疗水平可以保持至少30天，优选60天。长期持续释放植入物为本领域普通技术人员所公知。
MBL蛋白的典型给药量是每千克体重0.001到100毫克，优选0.01到10毫克/千克，更优选0.05到1毫克/千克体重。
例如对于MBL缺乏的成人而言，适合的起始剂量为100毫升盐中含有6毫克MBL，如果采用灌输的形式，随后剂量为约6毫克，如果需要每周进行两次。
上述给药途径和剂量仅仅起到一种指导作用，因为一名熟练的医师能够根据特定受试者和条件决定合适的给药途径和剂量。
本发明的组合物可以与含有未被激活的纯化的MASPs组合物联合给药。可以采用本领域公知的重组技术制备适于联合给药的上述MASPs。可以通过GenBank Accession No.NM_001879获得人MASP-1核酸序列，通过GenBank Accession AH010229获得人MASP-2核酸序列，通过GenBankAccession AF284421获得人MASP-3核酸序列C.MASP活性试验需要通过试验来证实本发明的MBL组合物中基本上不含有MASP。可以通过使用包括免疫方法(例如ELISA)在内的各种技术测定MASP的存在。此外，还可以在切除标记底物的基础上进行试验来测定MASP的活性，例如MASP切除补体蛋白产生产物的C末端标记肽-C2、C3、C4或C5。
此外，本发明提供了一种高灵敏度测定活性MASP的试验方法，其所使用的底物来源于C4蛋白上的MASP切割位点。上述底物与美国专利US6,235,494中所公开的底物不同，因为在未进行切割的补体蛋白的切割位点两侧都含有氨基酸序列，而美国专利US6,235,494中所公开的底物，其精氨酸切割位点的C-末端则不含有任何氨基酸残基。额外氨基酸的增加使精氨酸的两侧为氨基酸所侧接，从而提供了附加的特异性和稳定性。
因此本发明提供了一种通式为X-R1-Arg-R2-Y的肽，其中R1-Arg-R2是来源于补体蛋白MASP切割位点的包含6个或更多个连续氨基酸的肽；X为氨基，保护基团或可检测性标记；Y为羧基或可检测性标记，并且当X是氨基或保护基团时，Y不能是羧基，当Y为羧基时，X不能是氨基或保护基团。
优选R1和/或R2包含至少3个氨基酸，优选至少4个氨基酸。优选R1-Arg-R2包含少于10个氨基酸，更优选R1-Arg-R2由7或8个氨基酸组成。
衍生出R1-Arg-R2的补体蛋白切割位点优选C2、C3、C4或C5蛋白的MASP切割位点，例如人C4的Arg756(登录号(Accession No).P01028)。
本发明的肽包括，但并不局限于X-Lys-Gly-Gly-Leu-Gln-Arg-Ala-Leu-Glu-Ile-Y (序列1)X-Gly-Leu-Gln-Arg-Ala-Leu-Glu-Ile-Y (序列2)
X-Gly-Gly-Leu-Gln-Arg-Ala-Leu-Glu-Y(序列3)X-Gly-Gly-Leu-Gln-Arg-Ala-Leu-Glu-Ile-Y(序列4)X-Glu-Ser-Leu-Gly-Arg-Lys-Ile-Gln-Ile-Gln-Y(序列5)X-Ser-Leu-Gly-Arg-Lys-Ile-Gln-Ile-Y(序列6)X-Glu-Ser-Leu-Gly-Arg-Lys-Ile-Gln-Y(序列7)X-Ser-Leu-Gly-Arg-Lys-Ile-Gln-Ile-Gln-Y(序列8)也可以采用天然产生的补体蛋白切割位点序列的衍生物。术语“衍生物”是指除精氨酸残基外，补体蛋白切割位点序列天然发生的微小的取代、插入和缺失，从而导致产生的序列可以为一个或更多个MASPs进行切割，并且精氨酸切割位点的C-末端产生至少2个，优选至少3个或至少4个氨基酸残基。
可以使用如下表所示的保守取代，第二栏中同一(block)区的氨基酸，优选第三栏中同一行的氨基酸可以相互进行取代。
也可以使用非天然存在的氨基酸类似物进行取代。
基于此处所公开的内容，熟练人员很容易筛选出标记了已知MASP切割底物的衍生物(既包括天然产生的氨基酸，和/或包括非天然产生的氨基酸)，并确定出适于在本发明试验中所采用的衍生物。
X或Y之中至少一个是可检测性标记，从而允许对切割底物进行检测。可以使用任何合适的检测性标记，例如放射性标记、比色标记、生物发光标记、产色标记或荧光标记。然而，在一个优选实施方案中，其中的一个标记是荧光标记。在一个高度优选的实施方案中，X是一种荧光标记，而Y是一种猝灭剂分子，反之亦然。按照这种方式，在未进行切割的底物中，如果X和Y相互之间在一定的距离之内(例如相距8或更少个氨基酸)，就不会产生荧光信号。然而通过MASP对底物进行切割后，猝灭剂分子就会与荧光标记相分离，从而产生荧光信号。
猝灭剂分子包括，但并不局限于二硝基苯乙二胺(EDDnp)和赖氨酸(Dnp)。荧光标记包括，但并不局限于7-氨基-4甲基香豆素(AMC)和氨基苯甲酸(Abz)。比色分子包括，但并不局限于对(Para)-硝基苯胺。
可以采用本领域普通技术人员公知的典型合成技术制备本发明的肽，例如采用固相合成技术。Borgia和Fields(2000)总结了各种化学合成肽的技术，其详细描述在此处一并作为参考。
可以通过试剂盒的形式提供本发明的试验体系，这样有助于测定样品中已激活的MASP的水平。试剂盒所包括的底物盛装在适当的容器中，或者与固体支持物相连，例如微量滴定板或其它适当的支持物，或盛装在微量滴定板的孔中。试剂盒中也可以包含进行试验所需要的试验指导。
试剂盒中也可以任选包含完成试验所需要的其它试剂，其中包括了对照，胰岛酶，Futhan或其它丝氨酸蛋白酶抑制剂，缓冲液，例如PBS，终止溶液和其它此类试剂。试剂盒中也可以包含合适的辅助性供应品，例如微量滴定板，小瓶，已标记的配体或已标记的抗-配体，标准溶液，对照，清洗溶液，固相支持物等类似物。
本发明的肽可以用于检测样品中的MASP活性，例如含有上述纯化的缺少MASP的MBL样品，也可以用于检测例如血液等生物样品，上述样品来源于受试者，其中包括了怀疑患有MBL缺乏症的受试者。
由上可见，本发明提供了一种检测样品中存在MASP活性的方法，其中包括了将样品与本发明的肽相接触，并且检测所述肽是否被切割。
检测例如切割底物等蛋白水解活性的方法往往因标记种类的不同而有所变化，例如基于定量测量或定性测量所进行的检测。
就定量测量而言，典型的作法是从反应开始时就测量标记激发所产生的信号，其结果用于获得起始速率。仅仅由C4切割位点N-末端残基组成的底物在被Cls和MBL-MASP复合体切割时才符合通常的Michaelis-Menten动力学。这意味着切割反应的起始速率与底物浓度之间可以描绘成直角双曲线，并且可以从数据的非线性回归适合度中获得常数km(米氏常数等同于酶和底物之间的亲和性)和Vmax(最大反应速度)。
然而，C4切割位点的N端和C端同时含有氨基酸残基的底物在被Cls和MBL-MASP复合体切割时不符合Michaelis-Menten动力学。相反切割反应的起始速率与底物浓度之间可以很好地描绘成S(Sigmoidal)曲线，这表明酶显示出变构行为或在切割P4-P’4底物时表现出正的共协作关系。此时曲线的非线性回归适合度产生了3个不同的常数Vmax(仍是相互作用最大反应速度)，k0.5(或最大反应速度达到一半时底物的浓度，表明了酶和底物之间的亲和性)以及Hill常数(h，表明了正的共协作程度)。
以前曾经报道过C1抑制子(C1INH)与MASPs以1∶1的比率进行结合。因此可以采用活性浓度已知的C1INH制品来测量MASP制品中活性酶的含量。可以将Cls设为阳性对照来进行，然后计算MASPs和荧光底物之间相互作用的Kcat。一旦绘制出相对于C1INH浓度的活性(荧光)，就可以从直线与X轴交汇点处测定出MASP制品中活性酶的浓度。
然后可以采用变构动力学来确定酶底物反应的k0.5和Vmax值。通过使用以下方程式等有关活性酶浓度的知识可以计算出酶底物反应的Kcat常数Kcat＝Vmax/[活性酶]其中Vmax是酶-底物反应的最大速度，[活性酶]是制品中具有切割底物能力的酶的摩尔数。
一旦确定了Kcat值，MASP制品可在底物的浓度是k0.5值的二倍时分析，所产生的速度通常等同于Vmax。然后将Kcat和Vma值代入方程式Kcat＝Vmax/[活性酶]。通过对方程式进行重新排列就可以估测出样品中活性酶的浓度。
D.治疗用途本发明的药物组合物可用于治疗需要MBL的受试者。
此处所采用的“有效剂量”是指至少能足以提高受试者免疫系统调理病原体的能力并且可以诱导针对病原体的补体级联反应的剂量。
受试者可包括骨髓同种异体移植接受者、囊肿性纤维化受试者、免疫缺陷受试者、急性成淋巴细胞白血病受试者、社区获得性(communityacquired)或医院性败血病受试者、病原体感染或病原体易感性受试者、低出生体重和/或早熟婴儿。典型的是，受试者具有MBL缺乏，例如适度MBL缺乏症。
此处所采用的“MBL缺乏症”是指受试者的MBL水平低于500ng/ml和/或受试者的C4富集(deposition)试验结果小于0.3U/μl。特别是那些MBL水平低于400ng/ml的受试者将受益于本发明所描述的方法，例如MBL水平低于300ng/ml的受试者，或MBL水平低于250ng/ml的受试者，或MBL水平低于200ng/ml的受试者。
病原体可以是任何生物体，其包含有能与MBL相结合的分子，从而激活补体途径。上述病原体可以是酵母、革兰氏阴性肠道细菌、革兰氏阳性细菌、分枝杆菌、一些病毒和特定的寄生虫等。上述病原菌更具体的实例包括，但并不局限于那些选自以下组的病原体寄生虫，例如Cryptospridiumparvum和Plasmodium falciparum；真菌，例如隐球酵母属，包括新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)，白色假丝酵母(Candida albican)和烟曲霉(Aspergillus fumigatus)；细菌，例如β溶血链球菌组(haemolytic streptoccus)A，Bifidobacterium bifidum，Actinomyces israelli，Proprionibacterium acnes，拟杆菌属(Bacteroides sp.)，大肠杆菌，真细菌属(Eubacterium sp.)，梭菌属(Fusobacterium sp.)，韦荣氏球菌属(Veillonella sp.)，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)，淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)，脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，Salmonella enterica，Burkholderia cepacia和肺炎克雷白氏杆菌(Klebsiellapneumoniae)。
特定的适应症包括神经病学慢性炎性脱髓鞘多聚神经病(CIDP)，多焦肌肉运动性神经病，多重硬化症(Multiple Sclerosis)，肌无力(Myasthenia)Gravis，伊顿脉管炎-兰伯特(Eaton-lamlert’s)综合病症，Opticus神经炎(Neuritis)，癫痫症；妇科医学习惯性流产(Abortus habitualis)，原发性(primary)抗磷脂综合病症；风湿病学风湿性关节炎，系统性狼疮erythematosus，系统性硬皮病，脉管炎(vasculitis)，Wegner氏肉芽肿病(granulomatosis)，Sjogren氏综合病症，青少年风湿性关节炎；血液病学自体免疫性嗜中性白血球减少症，自体免疫性溶血性贫血，嗜中性白血球减少症；肠胃病学克罗恩氏(crohn’s)病，大肠溃疡(Colitis)，乳糜泄(coeliacdisease)；其它哮喘(Asthma)，白血病(Septic)休克综合病症，慢性疲劳(fatigue)综合病症，牛皮癣(Psoriasis)，中毒性休克综合病症，糖尿病，Sinuitis，膨胀性心肌炎(Dilated cardiomyopathy)，心内膜炎(Endocarditis)，动脉硬化症(Atherosclerosis)，成人AIDS和细菌感染，包含普通可变性免疫缺陷的原发性亚/丙种球蛋白缺乏症，Wiskot-Aldrich综合病症和严重性结合免疫缺陷(SCID)，患有慢性淋巴性白血病(CLL)和多种骨髓瘤的次发性亚/丙种球蛋白缺乏症(hypo/agammaglobulinaemia)，儿童AIDS和细菌感染，急性和慢性先天性血小板紫癜(thrombocytopenic purpura)(ITP)，异源性骨髓移植(BMT)，川崎(Kawasaki’s)病和Guillan-Barre氏综合病症。
现有结果表明缺乏MBL的婴儿容易感染急性成淋巴细胞白血病。因此，也可以采用本发明的方法预防由MBL缺乏或与MBL缺乏相关的各种紊乱，例如急性成淋巴细胞白血病。因此适合于本发明的还包括那些由于MBL缺乏而经受上述紊乱的那些受试者，例如经受急性成淋巴细胞白血病危险升高的MBL缺乏婴儿。
参照以下实施例来进一步阐述本发明，其仅仅是对本发明进行解释说明并不对其构成限制作用。
实施例实施例1-缺少MASP的MBL的纯化在低于5℃的温度下软化并溶解新鲜冷冻的血浆，然后采用连续流动离心从冰冷的上清液中分离冰冷的沉淀。向冰冷的上清液中加入冷乙醇，终浓度达到8％(v/v)。在-2℃±1℃下，采用离心或过滤方法从上清液中分离形成的沉淀。处理上清液以吸收脂蛋白，并过滤澄清。采用截断分子量不低于10000道尔顿的超滤膜对脱脂上清液进行完全过滤以降低电导率。降低脱脂的完全过滤所获得的上清液的pH以促进真球蛋白发生沉淀，并且通过过滤作用回收澄清的上清液，在此过程中收集的真球蛋白糊剂经进一步纯化处理以提取MBL-MASP复合体。
在环境温度下进行纯化过程。在室温下，采用20mM Tris/100mMNaCl/15mM CaCl2缓冲液溶解真球蛋白糊剂1小时。通过离心去除不溶性物质。采用亲和层析方法从其它血浆蛋白中分离MBL-MASP复合体，将可溶性真球蛋白糊剂上甘露聚糖-琼脂糖柱，在采用10mM EDTA洗脱MBL-MASP复合体之前，用Tris/NaCl/CaCl2/吐温20缓冲液清洗柱子。
然后用含有EDTA的0.1M乙酸钠溶液(pH5.0)培养洗脱液，使MASPs从MBL分子上分离出来。上述材料上聚丙烯酰胺葡聚糖S-300大小排阻柱并用SDS page胶对级分进行分析。结果显示出已从其它蛋白成分中分离出MBL。采用本发明描述的底物试验对级分的MASP活性进行分析。7种含有MBL的级分具有较低水平或几乎缺少MASP活性。每一级分的总蛋白浓度在10-90μg/mL之间。
实施例2-证实缺少MASPs的试验对实施例1获得的混合MBL级分进行检测以确定MBL基本上不含有MASPs。
底物设计MASPs的底物设计是在C4蛋白天然底物切割位点(756R)周围氨基酸序列的基础上进行的。上述底物用于确定MBL纯化材料中MASPs的活性。
本发明发现所包括的额外氨基酸使精氨酸的侧接为氨基酸，从而提供了附加的特异性和稳定性(表1)。
表1-纯化的MBL-MASP复合体中MASPs蛋白水解活性的动力学常数，合成底物的是基于补体蛋白C4的P4-P1和P4-P4’氨基酸
底物(2Abz-GLQRALEI-Lys(Dnp)-NH2)中，在C4切割位点的前面和后面各有4个氨基酸，并且氨苯甲酸(aminobenzoic acid)(Abz)荧光基团吸附于N末端。当Lys(Dnp)与Abz基团的距离不超过8个氨基酸时，Lys可使Abz发生猝灭(quench)作用。底物的切割位点位于Abz基团和Lys(Dnp)基团之间，从而保证了当酶对底物进行切割时，Lys(Dnp)的猝灭能力丧失，Abz基团发出荧光。然后对荧光的变化进行检测，其与酶的蛋白水解活性呈一定的比例关系。试验证实存在于纯化的MBL材料中的MASPs可以对该底物进行切割(K0.5＝6.5μM)。
如果在以纯化的MBL材料进行试验时，观察到了蛋白水解活性(例如荧光发生改变)，这表明没有成功去除MASPs，接下来以抗-MASP的抗体进行ELISA或免疫杂交试验以证实上述结果是由于MASPs的蛋白水解活性造成的，而不是由MBL产品中一些其它蛋白酶而引起的。底物切割试验中可以使用与MASPs同源性最近的Cls作为阳性对照。
底物切割试验用荧光试验缓冲液对底物进行稀释(FAB-50mM tris-羟基亚甲基，150mM NaCl，0.2％聚乙二醇8000，0.02％叠氮化钠，pH7.4)，从而使终浓度达到与Vmax相等。底物和酶(Cls(10μg/mL)或纯化的MBL材料)在荧光板中培养几分钟，读数器设定在37℃。然后将100μL稀释底物转移到含有100μL稀释酶(Cls或纯化的MBL材料)的孔中，并在激发波长＝320nm，发射波长＝420nm处测量荧光动力学。每次检测执行3次。然后从标准曲线中读出荧光数量，进而计算出纯化的MBL材料中活性MASP酶的浓度。
实施例3-缺少MASP的MBL能够从血浆中补充MASPs并且能够激活补体级联反应定量试验的标准曲线和对照材料采用国际主要标准混合血清(Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark)对全部的定量试验进行标准化，其中每毫升血清中含有3.3μgMBL。对于夹层(Sandwich)ELISA和C4富集试验，对上述血清进行1∶25、1∶50、1∶75、1∶100、1∶150、1∶200倍稀释以绘制标准曲线，进行3重测定。对于甘露聚糖结合ELISA则按照1∶25、1∶50、1∶100、1∶150、1∶200、1∶300和1∶400倍进行稀释，稀释液详述如下。采用混合的正常供体血浆制备内部(in-house)二级对照，每一检测板进行3次，将每次检测的结果进行绘图。任何一次检测结果中，如果获得的内部对照MBL数值与之前确定的平均值相比超过+/-ZSD，则放弃整次检测。每次(run)与每次之间的标准曲线进行覆盖以确保获得恒定的斜率，因此也为定性对照提供了灵敏的工具。
采用双抗体夹层ELISA对MBL进行定量(“双抗体试验”)此MBL抗原检测试验是在Garred等(1992)提出的原始方法的基础上进行的，除商业性IgG鼠单抗外，采用抗-人MBL替代兔抗-MBL多克隆抗，因为抗-人MBL可与MBL结构单元成胶(collagenous)颈项区域的肽抗原表位靶向结合。
简言之，盖上平底微量滴定板(Nunc-Immuno Maxisorp，Nalge NuncInternational)，并在4℃下过夜培养，微量滴定板中装有2μg/ml抗-MBL单抗(Staten Serum Institiut，Copenhagen，Denmark)，上述单抗溶于新鲜的50mM碳酸盐-重碳酸盐(bicarbonate)缓冲液，pH9.6中。用0.1M PBS-0.05％吐温20，pH7.4(TBST)将正常的供体血浆稀释1∶25和1∶100倍，并进行3重测定，上述缓冲液也用作清洗缓冲液。22℃培养90分钟后，将孔清洗3次，按1∶4000的比例加入用生物素标记(Biotin Tag)(Sigma-Aldrich Pty Ltd)的单克隆抗-MBL，上述稀释比例是采用混合正常血浆通过棋盘(chequerboard)格滴定所确定的。22℃培养90分钟后，将孔清洗3次，加入ExtrAvidin过氧化物酶共轭体(1∶500)，并在22℃培养40分钟。采用OPD片剂和稀释液(AbbottLaboratories，Illinois，USA)进行显色，用1N的硫酸终止反应，并在Bio-Rad读板仪(Bio-Rad laboratories Pty Ltd.，Regents Park，Australia)中在490nm下立即读取数据。
run变异系数(cv)在1∶25时为8.2％和在1∶100时为12％。Run to run标准曲线重叠以确定恒定斜率(costant slope)，由此提供了定性对照的灵敏的工具。
采用甘露聚糖结合ELISA对MBL进行定量(“甘露聚糖结合试验”)此试验是在Holmskov等(1993)方法的基础上测量MBL与甘露聚糖相结合的能力，上述甘露聚糖包被于聚丙烯基质上。
盖上微量滴定板(如上所述)，并在4℃下过夜培养，微量滴定板中装有10μg/ml甘露聚糖(Sigma-Aldrich Pty Ltd，Castle Hill，Australia)，其溶于新鲜的50mM碳酸盐-重碳酸盐缓冲液，pH9.6中。按照夹层ELISA方法进行正常供体血浆检测，但以加入15mM CaCl2、并含有0.05％吐温-20的Tris缓冲盐(TBST)，pH7.5作为稀释液和清洗缓冲液。所有培养都在22℃下进行，MBL和抗体每次捕获时间为90分钟。与ExtrAvidin过氧化物酶培养仅需30分钟。按照夹层ELISA的方法进行显色和数据读取。
按1∶25进行稀释时，两次检测(run)之间的变异系数(CV)为6.1％，按1∶100进行稀释时，CV为8.8％。每次与每次之间的标准曲线进行覆盖以确保获得恒定的斜率，因此也为定性对照提供了灵敏的工具。
采用Statens Serum Institut主要标准混合血清所绘制的线性标准曲线证实了上述试验中MBL的特异性。在每次试验中，本发明也采用纯化的甘露聚糖结合凝集素进行了有限的稀释测验，上述甘露聚糖结合凝集素由甘露聚糖亲和层析制备而来并经Western免疫印迹所证实。在甘露聚糖结合试验中，本发明通过采用10mM EDTA或0.1M甘露糖溶液稀释检测样品阻止了与血浆MBL之间的结合作用。
功能性补体(C4)富集试验(“C4富集试验”)在此之前，Super等(1989)描述了对C3b和C3bi富集(deposited)进行检测，Valdimarsson等(1998)对其进行了改进。本试验显示了通过结合固相纯化甘露聚糖使MBL发生激活之后所进行的C4b富集作用。
盖上微量滴定板(如上所述)，并在4℃下过夜培养，微量滴定板中装有1μg/ml甘露聚糖(Sigma-Aldrich Pty Ltd，Castle Hill，Australia)，其溶于新鲜的50mM碳酸盐-重碳酸盐缓冲液，pH9.6中。用含有15mM CaCl2的TBST溶液，pH7.2，将正常的供体血浆稀释1∶25倍，并进行3重测定，上述缓冲液也用作清洗缓冲液。同时检测1∶10倍的稀释液，其作用仅仅是证实在MBL低含量的供体中，C4富集的水平也很低或几乎不存在。22℃培养90分钟后，将孔清洗5次，加入缺少MBL的人血清(完全缺少MBL，获得于informedconsent)，其是用巴比妥(barbital)溶液，14mM NaCl，10mM巴比妥钠(sodiumbarbitone)和5mM CaCl2按1∶20的比例稀释而得的。22℃培养30分钟以保证完成补体激活。用清洗缓冲液将孔清洗5次，加入用TBST按1∶1500倍稀释的经生物素标记(Sigma-Aldrich Pty Ltd)的兔抗-人C4(Sigma-Aldrich PtyLtd)。22℃培养90分钟后，将孔清洗5次，加入用TBST按1∶500倍稀释的ExtrAvidin过氧化物酶(Sigma-Aldrich Pty Ltd)，并在22℃培养40分钟。显色反应和数据读取与定量试验相同。
1μl Statens Serum Institut(SSI)的MBL标准对应于1个单位的C4富集活性。参照SSI的标准可以将试验进行标准化。按1∶25倍进行稀释时，两次检测之间的CV为9.4％。
缺少MASP的MBL能够补充MASP并且能够激活补体级联反应的证实
(4)聚合物JR30M，购自Amerchol(5)聚合物LR400，购自Amerchol(6)Polyox WSR N-750，购自Amerchol(7)Polyox WSR N-3000，购自Amerchol(8)Polyox WSR N-60K，购自Amerchol(9)Viscasil 330M，购自General Electric Silicones(10)DC1664，购自Dow Corning Silicones(11)ZPT，其平均粒径为约2.5m，购自Arch/Olin。
洗发剂组合物-实施例11-20
(1)瓜耳胶，其分子量为约400,000，且其电荷密度为约0.84meq/g，购自Aqualon。
(2)瓜耳胶，其分子量为约400,000，且其电荷密度为约2.0meq/g，购自Aqualon。
(3)阳离子瓜耳胶Jaguar C17，购自Rhodia(4)聚合物JR30M，购自Amerchol(5)聚合物LR400，购自Amerchol(6)Polyox WSR N-750，购自Amerchol(7)Polyox WSR N-3000，购自Amerchol(8)Polyox WSR N-60K，购自Amerchol(9)Viscasil 330M，购自General Electric Silicones(10)DC1664，购自Dow Corning Silicones(11)ZPT，其平均粒径为约2.5m，购自Arch/Olin。
实施例4-缺少MASP的MBL补充MASP和补体激活能力的证实按照总蛋白浓度将实施例3中获得的级分进行混合。第一个混合样品包括级分3-7，其总蛋白浓度为85μg/ml。第二个混合样品由级分8和9组成，其总蛋白浓度为35μg/ml。在浓度为1-100μg/ml的范围内，以MBL-MASP复合体为平行对照，再次对上述两个缺少MASP的MBL混合样品进行滴定。所有的样品都要平行进行甘露聚糖结合试验和C4富集试验。相对于级分的C4激活能力，将实际MBL的量化结果(甘露聚糖结合试验)进行绘图。
结果与实施例3中每一单独级分的分析结果相比，不含有MASP的MBL混合级分表现出了可重复再现的结果。由级分3-7组成的混合样品，其补体激活能力过剩，由级分8和9组成的混合样品，其补体激活能力达到试验上限，而MBL-MASP复合体在12μg时，开始出现最高稳定水平，并且随着MBL浓度的不断增加，C4富集基本不再增加，上述结果重复了实施例3的试验结果。缺少MASP的MBL具有超级的补充MASP的能力，并且如结果所示其具有比MBL-MASP复合体更加有效的激活补体级联反应的能力(参见附图2和表3)。
表3-在甘露聚糖结合试验和C4富集试验中对缺少MASP的混合级分(3-7和8-9)和亲和纯化的MBL-MASP复合体进行的滴定
结果也绘制于附图2中。
结论实施例3和4的结果显示出缺少MASP的MBL能够从血浆中补充MASPs，并且能够成功地激活补体级联反应。游离的MASPs在血浆中处于循环状态，并且其含量超过了MBL-MASP复合体。个体的MASP-1水平在1.48到12.83μg/ml之间。血清中MASP-1水平的算术平均数±标准差为6.27±1.85μg/ml。研究表明血清中MASP-1的水平与年龄强烈相关，血清中MBL的水平也如此。同时研究也表明血清中MASP-1的水平显著高于MBL的水平(1.71±1.13μg/ml)，并且人体血清中绝大多数的MASP-1似乎以循环的形式存在，其并不与MBL相结合(Terai等，1995)。通常认为MASP-2的水平低于MASP-1。当采用乙酸钠缓冲溶液(pH5.0)对MBL-MASP复合体进行透析时，MASP与MBL发生破坏分离，随后用TBST EDTA缓冲溶液(pH7.8)进行透析时，MBL与MASP重新形成复合体。采用低pH方法分离MBL-MASP复合体是一种可逆的过程(Tan等，1996)。
此外，这些数据表明以复合体形式被纯化的MBL具有有限的激活补体级联反应的能力，这可能是由于在纯化过程中，MBL的MASP结合位点被已激活的MASP所封堵，从而降低了其与新鲜MASPs相结合的能力。例如，当采用先前描述的甘露聚糖柱亲和纯化或采用WO99/64453中教导的非共轭性多糖基质对MBL进行纯化时，MBL与MASPs共同被纯化下来。虽然在亲和纯化步骤中，由于与多糖底物相接触，保证了一定级分的MASPs仍保持其原酶形式(90kDa)，但大多数MASPs仍以被激活的形式与MBL一起洗脱下来。
通过对缺少MASP的MBL进行的体外C4富集试验检测表明，与纯化的MBL-MASP复合体相比，其具有超级的补充MASP和起始补体激活的能力。通常情况下，体内产生的与MBL-MASPs复合体相关联的MASPs仅仅在MBL与外源生物体发生特异性结合后才能被激活，这就是MBL途径中补体激活的主要调控点。因此施与含有已激活的MASPs的MBL就消除了上述调控机制。
包括C1抑制子(C1INH)在内的生理性抑制子可与已激活的MASP-1和MASP-2形成复合体，同时ClINH也可以剂量依赖的方式抑制MASP-1的C3切割作用。MASP-1对C2的激活作用以及MASP-2对C4和C2的激活作用也是相同的。具有非常强大的蛋白酶抑制活性的β2-巨球蛋白也对MASPs具有抑制作用(Storgaard等，1995)。
然而，缺乏如C1INH等抑制子的情况是很少发生的，这就意味着缺少抑制子的个体在施与MBL-MASP复合体之后，容易产生并发症，这是因为激活了不适当的补体级联反应。因此本发明认为吸附有关联性MASPs的MBL纯化产品不仅效率很底，甚至存在着潜在的医疗危险。
以上说明书中提及的全部出版物此处一并作为参考。
对于本领域的普通技术人员而言，对本发明所述方法和系统所作的各种修改和变化都显然未超出本发明的范围和精神。虽然本发明是在结合具体优选实施例的基础上进行描述的，但应理解为本发明请求保护的并不仅仅局限于上述特定的实施方案。事实上，对于分子生物学或相关领域的普通技术人员而言，对完成本发明所描述方式的各种修改都将落入本发明的范围之内。
在整个说明书中，除非上下文需要，否则词语“包含”及其变化形式应理解为暗示包含了确定的整体或步骤或几组整体或步骤，但也不排除其它任何整体或步骤或其它几组整体或步骤。
上述特定部分中对特定的实施方案进行了描述，但对上述实施例进行必要的修正后也可恰当地用于其它部分。
任何对本说明书中已包括的文献、技术、材料、装置、文章等类似物所进行的讨论，其目的仅仅是为了提供本发明所包括的内容。没有必要将上述内容之任一或全部看作是形成部分已有技术的基础或是与本发明相关领域的普通常识性知识，这是因为在本申请每项权利要求的优先权日之前它们就已经存在了。
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序列表<110>昆士兰医学研究学院理事会(The Council of the Queensland Institute of Medical Research)<120>甘露糖结合凝集素及其应用<130>501303<150>AU PS 1961<151>2002-04-24<150>AU 2002953324<151>2002-12-13<160>8<170>Patcntln version 3.1<210>1<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>切割底物<400>1Lys Gly Gly Leu Gln Arg Ala Leu Glu Ile1 5 10<210>2<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>切割底物<400>2Gly Leu Gln Arg Ala Leu Glu Ile1 5<210>3<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>切割底物<400>3Gly Gly Leu Gln Arg Ala Leu Glu1 5
<210>4<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>切割底物<400>4Gly Gly Leu Gln Arg Ala Leu Glu Ile1 5<210>5<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>切割底物<400>5Glu Ser Leu Gly Arg Lys Ile Gln Ile Gln1 5 10<210>6<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>切割底物<400>6Ser Leu Gly Arg Lys Ile Gln Ile1 5<210>7<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>切割底物<400>7Glu Ser Leu Gly Arg Lys Ile Gln1 5<210>8<211>9<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>切割底物<400>8Ser Leu Gly Arg Lys Ile Gln Ile Gln1 权利要求
1.一种药物组合物，其包含分离的非重组性甘露糖结合凝集素(MBL)以及药学上可接受的载体或稀释剂，其中分离的非重组性甘露糖结合凝集素中基本上不含有已被激活的与丝氨酸蛋白酶(MASPs)相缔和的MBL。
2.按照权利要求1所述的组合物，其中MBL基本上不含有MASPs。
3.按照权利要求1或2所述的组合物，其中MBL是人MBL。
4.按照权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中的MBL通过下述方法获得(i)提供一种非重组性MBL和一个或更多个MASPs的复合体；(ii)在适当的缓冲液中培养上述复合体，使MBL与一个或更多个MASPs发生解离；并且(iii)从一个或更多个MASPs中将MBL分离。
5.按照权利要求4所述的组合物，其中步骤(ii)中的缓冲液是pH从4.0到5.0的EDTA/乙酸盐缓冲液。
6.按照权利要求4或5所述的组合物，其中步骤(ii)中的缓冲液包含NaCl。
7.按照权利要求4至6中任意一项所述的组合物，其中步骤(iii)中包括层析方法和/或过滤。
8.按照权利要求7所述的组合物，其中层析方法选自下组大小排阻层析和离子交换层析。
9.一种生产药物组合物的方法，其包括(i)提供一种非重组性MBL和一个或更多个MASPs的复合体；(ii)从至少部分的一个或更多个MASPs中使MBL发生解离；(iii)从至少部分的一个或更多个MASPs中使MBL分离；并且(iv)将第(iii)步产生的MBL与药学上可接受的载体或稀释剂相混合。
10.按照权利要求9的方法，其中步骤(ii)包括在适当的缓冲液中培养复合体。
11.按照权利要求10的方法，其中缓冲液是pH从4.0到5.0的EDTA/乙酸盐缓冲液。
12.按照权利要求10或11的方法，其中缓冲液中包含NaCl。
13.按照权利要求9至12中任意一项的方法，其中步骤(iii)中包括层析方法和/或过滤。
14.按照权利要求13所述的方法，其中层析方法选自下组大小排阻层析和离子交换层析。
15.按照权利要求9至14中任意一项所述的方法，其中步骤(i)中包括从血浆分级过程中提供附加级分。
16.按照权利要求15所述的方法，其中步骤(i)进一步包括了采用甘露聚糖亲和层析法从其它血浆蛋白中分离非重组MBL和一个或更多个MASPs复合体的步骤，其中所述其它血浆蛋白存在于血浆分级过程中产生的附加级分中。
17.由权利要求9至16中任一项的方法所获得的药物组合物。
18.按照权利要求17所述的药物组合物，其基本上不含有已激活的MASPs。
19.一种在受试者中治疗或预防疾病的方法，其包括了给受试者施用有效剂量的权利要求1至8、17或18中任一项所述的药物组合物。
20.按照权利要求19所述的方法，其中受试者为骨髓同种异体移植接受者。
21.按照权利要求19所述的方法，其中受试者为免疫缺陷受试者。
22.按照权利要求19所述的方法，其中受试者为社区获得性或医院性败血病受试者。
23.按照权利要求19所述的方法，其中受试者为低出生体重和/或早熟婴儿。
24.按照权利要求19所述的方法，其中受试者为病原体感染受试者。
25.按照权利要求19至24中任意一项所述的方法，其中受试者具有MBL缺陷。
26.按照权利要求25所述的方法，其中受试者具有发展为急性成淋巴细胞白血病危险的婴儿。
27.包含分离的非重组性MBL的治疗组合物在预防或治疗中的应用，上述组合物基本上不含有已活化的MASPs。
28.包含分离的非重组性MBL的治疗组合物在预防或治疗中的应用，上述组合物基本上不含有MASPs。
29.包含分离的非重组性MBL的组合物在生产药物中的应用，上述组合物基本上不含有MASPs，该药物用于施用给需要上述组合物的受试者。
30.按照权利要求29所述的应用，其中受试者为骨髓同种异体移植接受者。
31.按照权利要求29所述的应用，其中受试者为免疫缺陷受试者。
32.按照权利要求29所述的应用，其中受试者为社区获得性或医院性败血病受试者。
33.按照权利要求29所述的应用，其中受试者为具有发展为急性成淋巴细胞白血病危险的婴儿。
34.按照权利要求29所述的应用，其中受试者为低出生体重和/或早熟婴儿。
35.按照权利要求29所述的应用，其中受试者为病原体感染受试者。
36.按照权利要求29至35中任意一项所述的应用，其中组合物基本上不含有MASPs。
37.一种通式为X-R1-Arg-R2-Y的肽，其中R1-Arg-R2是来源于补体蛋白MASP切割位点的由6个或更多个连续氨基酸组成的肽；X为氨基、保护基团或可检测性标记；Y为羧基或可检测性标记，并且当X是氨基或保护基团时，Y不是羧基，当Y为羧基时，X不是氨基或保护基团。
38.按照权利要求37所述的肽，其中补体蛋白是C4。
39.按照权利要求38所述的肽，其中C4蛋白是人C4蛋白并且切割位点包含Arg756。
40.按照权利要求37至39中任意之一所述的肽，其中X是猝灭剂分子，Y是荧光标记，反之亦然，从而保证当底物被切割时可以获得荧光信号。
41.权利要求37至40中任意一项所述的肽在确定样品中存在有MASP活性的方法中的应用。
42.按照权利要求41所述的应用，其中样品是权利要求1至8、17或18中任意一项所述的组合物。
43.一种确定样品中存在MASP活性的方法，其包括将样品与权利要求37至40中任意一项所述的肽相接触，并确定上述肽是否被切割。
44.按照权利要求43所述的方法，其中样品是权利要求1至8、17或18中任意一项所述的组合物。
45.一种生产权利要求1至3中任意一项药物组合物的方法，其包括(i)提供一种非重组性MBL和一个或更多个MASPs的复合体；(ii)在适当的缓冲液中培养上述复合体，使MBL与一个或更多个MASPs发生解离；(iii)从一个或更多个MASPs中将MBL分离；(iv)采用权利要求43所述的方法，在步骤(iii)所获得的MBL中筛选MASP活性；并且(v)将上述产生的纯化的MBL与药学上可接受的载体或稀释剂相混合。
全文摘要
本发明表明缺少MASP的MBL能够从血浆中补充MASPs，并且能够成功地激活补体级联反应。此外，本发明发现与缺少MASP的MBL相比，纯化的MBL复合体具有有限的激活补体级联反应能力。因此，本发明提供了一种药物组合物，其包含分离的非重组性甘露糖结合凝集素(MBL)以及制药学上可接受的载体或稀释剂，其中分离的非重组性甘露糖结合凝集素中基本上不含有已被激活的与丝氨酸蛋白酶(MASPs)相交联的MBL。同时，本发明还提供了一种治疗需要MBL的受试者的方法，包括了给受试者施用有效剂量的本发明的药物组合物。
文档编号A61P33/00GK1646152SQ03808971
公开日2005年7月27日 申请日期2003年4月24日 优先权日2002年4月24日
发明者格雷斯·奥布赖恩, 罗伯特·N·派克, 梅林达·M·迪安, 罗宾·M·明钦顿, 特里萨·M·马蒂内利 申请人:昆士兰医学研究学院理事会