专利名称：诱导、增强或调节免疫应答的免疫刺激性双链rna和方法
技术领域：
本发明总体上涉及可用于诱导免疫应答的基序。具体地讲，本申请涉及在与或不与抗原组合的情况下被用于诱导，增强或调节包括B细胞(抗体)并且任选包括T细胞成分的免疫应答的非编码RNA基序。
背景技术：
大量的病毒感染与在正常状态下通常不会遇到的RNA种类相关，或者会导致它们的产生。所述RNAs是基因组片段(在含有双链RNAs的病毒的情况下)，复制性中间体或茎-环-结构，它们能由诸如Toll-样受体3(TLR3)的先天免疫受体识别，并且诱导IFN-I和其他可溶性介质的产生。另外，业已证实某些dsRNA基序，如polyI:polyC(pI:pC或pI:C)能激活不成熟的树突细胞达到能够发挥专门的APC的作用的阶段。尽管事实业已证实polyI:polyC和IFN-I能影响对蛋白抗原的抗体应答，所获得的有关由先天免疫模型产生的dsRNA-免疫调节基序的大部分信息限制的于天然杀伤细胞，巨噬细胞和其他缺乏特异性抗原受体的细胞亚型。因此，还没有证实与双链或其他RNA种类相关的基序仅仅对适应性免疫应答具有有限的作用，或者起着能防止免疫耐受并且指导特定T细胞的分化的危险信号的作用。另外，关于是否存在对免疫应答有潜在的分化影响的多种RNA相关的危险基序的关键问题没有得到解答。另外，尚未能确定非编码RNA基序是否能够在病毒感染期间促进I类-限制的免疫应答的诱导，直到最近还认为，在大部分情况下，是在抗原呈递细胞(APC)的无效的或生产性感染之后发生的。
在病毒感染期间，特定T淋巴细胞暴露于通过MHC分子展示的外源表位，并且B淋巴细胞识别可溶形式的抗原。确定所述适应性免疫应答的淋巴细胞的增殖和分化，所述免疫应答由特定的效应细胞和记忆细胞组成。在所述免疫应答的起始阶段，先天免疫能识别与微生物相关的基序以及病变诱导的内源危险信号，该信号能指导特定淋巴细胞随后的分化，以及免疫应答的总体特征。在缺乏危险信号的情况下，所述T和B细胞应答强度减弱，并且导致免疫耐受，特别是在中等至高剂量抗原情况下。业已提出它是分辨无害的和与感染相关的′危险′抗原的关键机制。该机制还显示了免疫系统分辨自身和非自身抗原的不同策略，以前认为只能在抗原-受体所有组成成分水平上确定。
发明概述适应性免疫应答是通过T和B细胞表位的识别诱导的，并且通过经先天免疫受体发挥作用的“危险”信号形成。在本申请中业已证实了与非编码双链或单链RNA相关的基序提供了所述免疫应答的关键特征，病毒感染的回忆，如，促炎趋化因子表达的快速诱导，抗原呈递细胞(APC)的募集和激活，调控细胞因子的调节，Th1细胞的分化，交叉激发的同种型转换和刺激，存在于MHC I类-限制的免疫应答中。本申请证实了RNA相关基序的异质性导致了对免疫应答特征的不同影响。根据特定RNA-基序阻断耐受性诱导和在病毒感染期间有效组织免疫防御的能力，证实了所述RNA种类是有效的″危险信号″。本申请披露了利用选定的RNA基序作为佐剂，以便优化对亚基疫苗的免疫应答。总之，在病毒感染期间产生的RNA-相关基序不仅对先天免疫具有短期影响，而且联系早期应答和晚期适应性阶段，包括抗原特异性B和T细胞的激活和分化。
在本申请中，证实了除了RNA的单链与双链性质之外，所述寡核苷酸组成是先天免疫受体识别非编码RNA基序的关键决定因素。另外，异源RNA基序对适应性免疫具有有效的和不同的影响，在病毒感染期间介导免疫应答的大部分特征。最后，业已证实了所披露的RNA-基序能有效启动防御机制，在传染性疾病或癌方面具有预防性或治疗性用途。
本申请要求2002年3月15日提交的美国申请流水号60/364,490和2002年9月20日提交的美国专利申请流水号60/412,219的优先权，并且被收作本文参考。
本发明的各种实施方案包括1.一种增强对抗原的免疫应答的方法，包括施用由双链RNA组成的组合物和与所述抗原共同施用所述组合物。
2.一种增强或调节对抗原的免疫应答的方法，当所述抗原已经存在于体内时，包括施用由双链RNA组成的组合物。
3.如段落1的方法，其中，所述RNA是非编码RNA。
4.如段落1或2的方法，其中，所述双链RNA由聚腺嘌呤和聚尿嘧啶组成。
5.如段落1或2的方法，其中，所述双链RNA由聚鸟嘌呤和聚胞嘧啶或聚肌苷和聚胞嘧啶之一组成。
6.如段落1或2的方法，其中，所述双链RNA由腺嘌呤和尿嘧啶组成。
7.如段落1或2的方法，其中，所述双链RNA由鸟嘌呤和胞嘧啶或肌苷和胞嘧啶组成。
8.如段落1的方法，其中，所述方法能增强Th1和Tc1细胞应答。
9.如段落1的方法，其中，所述方法能诱导Tc1细胞应答。
10.如段落1的方法，其中，所述方法能增强B细胞应答。
11.如段落1的方法，其中，所述抗原是与其他抗原共同施用的。
12.如段落1的方法，其中，所述方法能诱导CXC和CC趋化因子。
13.如段落12的方法，其中，所述方法能诱导MIP-1α，MIP-1β，MIP-3α和IP-10。
14.如段落1的方法，其中，所述组合物的施用能通过募集和激活CD11b+单核细胞或CD11c+树突细胞而增强T和B细胞应答。
15.如段落1的方法，其中，双链RNA组合物能通过恢复抗原呈递细胞而增强免疫应答。
16.如段落1的方法，其中，所述抗原呈递细胞是专门的APC。
17.如段落1或2的方法，其中，所述双链RNA组合物由肌苷和胞嘧啶组成，并且能诱导CD11c+树突细胞的有效募集。
18.如段落1或2的方法，其中，所述双链RNA选自含有肌苷和胞嘧啶的RNA组合物和含有腺嘌呤和尿嘧啶的RNA组合物，并且所述方法能诱导CD11b+单核细胞的有效募集。
19.如段落15的方法，其中，所述APC是激活的。
20.如段落4的方法，其中，所述抗原是非传染性抗原，而所述RNAMHC I类-限制的T细胞是通过聚腺嘌呤和聚尿嘧啶RNA组合物交叉激发的。
21.如段落4-7的方法，其中，所述RNA组合物是通过粘膜施用的。
22.一种防止对非传染性抗原的高区耐受的方法，包括一起施用所述非传染性抗原和含有聚腺嘌呤和聚尿嘧啶或聚肌苷和聚胞嘧啶的双链RNA组合物。
23.如段落22的方法，其中，所述非传染性抗原是以大剂量施用的或已经存在于体内。
24.如段落22的方法，其中，所述剂量是耐受量的抗原。
25.如段落22的方法，其中，所述方法能防止B细胞无反应性。
26.如段落1，2和22的方法，其中，所述组合物和抗原是通过下列途径之一施用的粘膜施用；呼吸道施用；静脉内施用；皮下施用；和肌内施用，与或不与各种载体复合。
27.一种免疫方法，包括通过使用与Ig主链连接的抗原的至少一个肽表位加载抗原呈递细胞，以便形成Ig-肽分子，并且体内施用与dsRNA基序联合的Ig-肽分子，其中，所述表位是通过MHC I途径有效加工和呈递的，导致了MHC I类分子的有效加载，并且在体内暴露于抗原之后，导致了MHC I类-限制的T细胞的有效的二次扩增。
28.如段落27的方法，其中，所述抗原是病毒。
29.如段落28的方法，其中，所述病毒是流感病毒。
30.如段落27的方法，其中，所述肽-表位是重组IgG-NP(Kd)。
31.如段落27的方法，其中，所述dsRNA是pA:pU。
32.如段落27的方法，其中，所述T细胞是细胞毒性T淋巴细胞。
33.如段落27的方法，其中，在体内暴露于所述抗原之后，导致的MHC I类-限制的T细胞的二次扩增，强于仅施用无菌盐水中的重组抗原。
34.一种在临床诊断之后控制和治疗肿瘤的方法，包括通过使用与Ig主链连接的至少一个肿瘤相关的T细胞表位加载抗原呈递细胞，以便形成IgG-肽分子，并且体内施用与dsRNA联合的Ig-肽分子。
35.如段落34的方法，其中，所述肿瘤相关的T细胞表位是通过MHC I途径有效加工和呈递的，导致了MHC I类分子的有效加载，并因此产生了MHC I类-肽复合物。
36.如段落34的方法，其中，所述方法导致了对所述肿瘤相关的T细胞表位的免疫应答和肿瘤排斥。
37.如段落34的方法，其中，所述dsRNA是pA:pU。
38.如段落34的方法，其中，所述IgG-肽复合物和dsRNA是作为抗-肿瘤治疗反复施用的。
39.如段落34和35的方法，其中，在肿瘤排斥时，产生了针对肿瘤相关表位的Tc1免疫。
40.如段落34的方法，其中，在施用IgG-肽和dsRNA时，产生了针对肿瘤相关表位的Tc2免疫。
41.如段落34的方法，其中，所述方法还包括诱导对相同肿瘤相关表位的有效的记忆应答。
42.如段落34的方法，其中，所述方法导致了对肿瘤细胞变体的连续的免疫。
43.一种增强对抗原的抗体应答的方法，包括给人或非人哺乳动物施用与选自下组的dsRNA联合的所述抗原pA:pU，pI:pC和pC:pG或它们的混合物。
44.一种增强对抗原的抗体应答的方法，包括给人或非人哺乳动物施用与选自下组的单链RNA种类的混合物联合的所述抗原pA，pC，pI，pU，p(G，U)，p(C，U)，p(A，C)，p(I，U)，p(C，I)，p(A，U)，p(A，G)，p(A，C，G)，p(A，C，U)和p(A，G，U)。
45.一种用于增强对抗原的免疫应答的组合物，包括由聚腺嘌呤和聚尿嘧啶组成的dsRNA序列。
46.如段落45的组合物，其中，所述组合物还包括抗原。
47.如段落45的组合物，其中，所述抗原已经存在于体内。
48.如段落45的组合物，其中，所述抗原是在可以药用的载体中施用的。
49.如段落45的组合物，其中，所述抗原是在免疫球蛋白中施用的。
50.如段落48的组合物，其中，所述可以药用的是IgG。
51.如段落45-47的组合物，其中，所述抗原是肿瘤相关表位。
52.如段落45-47的组合物，其中，所述抗原是病毒。
53.如段落51的组合物，其中，所述抗原是肿瘤相关的T细胞表位。
54.如段落45-53的组合物，其中，所述dsRNA是与所述抗原一起施用的。
55.如段落45-53的组合物，其中，所述dsRNA是与所述抗原分开施用的。
56.一种用于增强对抗原的免疫应答的组合物，包括由聚肌苷和聚胞嘧啶组成的dsRNA序列。
57.如段落56的组合物，其中，所述组合物还包括所述抗原。
58.如段落56的组合物，其中，所述抗原已经存在于体内。
59.如段落56的组合物，其中，所述抗原是在可以药用的载体中施用的。
60.如段落56的组合物，其中，所述抗原是在免疫球蛋白中施用的。
61.如段落59的组合物，其中，所述可以药用的载体是IgG。
62.如段落56-58的组合物，其中，所述抗原是肿瘤相关表位。
63.如段落56-58的组合物，其中，所述抗原是病毒。
64.如段落62的组合物，其中，所述抗原是肿瘤相关的T细胞表位。
65.如段落56-64的组合物，其中，所述dsRNA是与所述抗原一起施用的。
66.如段落56-64的组合物，其中，所述dsRNA是与所述抗原分开施用的。
67.双链(″dsRNA″)在生产用来增强对抗原的免疫应答的药物中的用途，包括给患者施用与所述抗原联合的所述dsRNA。
68.双链(″dsRNA″)在生产用来增强对抗原的免疫应答的药物中的用途，包括当所述抗原已经存在于患者体内时，给所述患者施用所述dsRNA。
69.如段落67或68的用途，其中，所述dsRNA是非编码RNA。
70.如段落67或68的用途，其中，所述双链RNA由聚腺嘌呤和聚尿嘧啶组成。
71.如段落67或68的用途，其中，所述双链RNA由聚肌苷和聚胞嘧啶或聚鸟嘌呤和聚胞嘧啶组成。
72.如段落67或68的用途，其中，所述双链RNA由腺嘌呤和尿嘧啶组成。
73.如段落67或68的用途，其中，所述双链RNA由鸟嘌呤和胞嘧啶或肌苷和胞嘧啶组成。
74.如段落67-73的用途，其中，所述用途能增强Th1和/或Tc1细胞应答。
75.如段落67-73的用途，其中，所述用途能诱导对抗原的Tc1细胞应答。
76.如段落67-73的用途，其中，所述方法能增强对抗原的B细胞应答。
77.如段落67或68的用途，其中，所述抗原是与其他抗原共同施用的。
78.如段落67或68的用途，其中，所述方法能诱导CXC和CC趋化因子。
79.如段落67或68的用途，其中，所述方法能诱导MIP-1α，MIP-1β，MIP-3α和IP-10。
80.如段落67-71的用途，其中，所述dsRNA的施用能通过募集和激活CD11b+单核细胞或CD11c+树突细胞而增强T和B细胞应答。
81.如段落67-71的用途，其中，双链RNA组合物能通过募集抗原呈递细胞而增强免疫应答。
82.如段落81的用途，其中，所述抗原呈递细胞是专门的APC。
83.如段落71的用途，其中，所述双链RNA组合物包括肌苷和胞嘧啶，并且能诱导CD11c+树突细胞的有效募集。
84.如段落67或68的用途，其中，所述双链选自含有肌苷和胞嘧啶的RNA组合物和含有腺嘌呤和尿嘧啶的RNA组合物，并且，所述方法能诱导CD11b+单核细胞的有效募集。
85.如段落67-70的用途，其中，所述抗原是非传染性抗原，并且所述RNA MHC I类-限制的T细胞是通过聚腺嘌呤和聚尿嘧啶RNA组合物交叉激发的。
86.如段落67-70的用途，其中，所述组合物和抗原是通过下列途径之一施用的粘膜施用；呼吸道施用；静脉内施用；皮下施用；和肌内施用，与或不与各种载体复合。
87.dsRNA在生产用来防止对非传染性抗原的高区耐受的药物中的用途，包括一起施用所述非传染性抗原和含有聚腺嘌呤和聚尿嘧啶或聚肌苷和聚胞嘧啶的双链RNA组合物。
88.如段落87的用途，其中，所述非传染性抗原是大剂量施用的或已经存在于体内。
89.如段落87的用途，其中，所述剂量是耐受量的抗原。
90.如段落87的用途，其中，所述方法能防止B细胞无反应性。
91.dsRNA在生产药物中的用途，包括通过使用与Ig主链连接的抗原的至少一个肽表位加载抗原呈递细胞，以便形成Ig-肽分子，并且体内施用与dsRNA基序联合的Ig-肽分子，其中，所述表位是通过MHC I途径有效加工和呈递的，导致了MHC I类分子的有效加载，并且在体内暴露于抗原之后，导致了MHC I类-限制的T细胞的有效的二次扩增。
92.如段落91的用途，其中，所述抗原是病毒。
93.如段落91的用途，其中，所述病毒是流感病毒。
94.如段落91的用途，其中，所述肽-表位是重组IgG-NP(Kd)。
95.如段落91的用途，其中，所述dsRNA是pA:pU。
96.如段落91的用途，其中，所述T细胞是细胞毒性T淋巴细胞。
97.dsRNA在生产用于在临床诊断之后控制和治疗肿瘤的药物中的用途，包括通过使用与Ig主链连接的至少一个肿瘤相关的T细胞表位加载抗原呈递细胞，以便形成IgG-肽分子，并且体内施用与dsRNA联合的Ig-肽分子。
98.如段落97的用途，其中，所述肿瘤相关的T细胞表位是通过MHC I途径有效加工和呈递的，导致了MHC I类分子的有效加载，并因此产生了MHC I类-肽复合物。
99.如段落97的用途，其中，所述方法导致了对所述肿瘤相关的T细胞表位的免疫应答和肿瘤排斥。
100.如段落97的用途，其中，所述dsRNA是pA:pU.
101.如段落97的用途，其中，所述Ig-G肽复合物和dsRNA是作为抗-肿瘤治疗反复施用的。
102.如段落97的用途，其中，在肿瘤排斥时，产生了针对肿瘤相关表位的Tc1免疫。
103.如段落97的用途，其中，在施用IgG-肽和dsRNA时，产生了针对肿瘤相关表位的Tc2免疫。
104.如段落97的用途，其中，所述方法还包括诱导对相同肿瘤相关表位的有效的记忆应答。
105.如段落97的用途，其中，所述方法导致了对肿瘤细胞变体的连续的免疫。
106.dsRNA在生产用来增强对抗原的抗体应答的药物中的用途，包括给人或非人哺乳动物施用与选自下组的dsRNA联合的所述抗原pA:pU，pI:pC和pC:pG。
107.dsRNA在生产用来增强对抗原的抗体应答的药物中的用途，包括给人或非人哺乳动物施用与选自下组的单链RNA种类的混合物联合的所述抗原pA，pC，pI，pU，p(G，U)，p(C，U)，p(A，C)，p(I，U)，p(C，I)，p(A，U)，p(A，G)，p(A，C，G)，p(A，C，U)和p(A，G，U)。
108.dsRNA在生产用于增强对抗原的免疫应答的药物中的用途，包括由聚腺嘌呤和聚尿嘧啶组成的dsRNA序列。
109.如段落108的用途，其中，所述组合物还包括抗原。
110.如段落108的用途，其中，所述抗原已经存在于体内。
111.如段落108的用途，其中，所述抗原是在可以药用的载体中施用的。
附图的简要说明
图1表示各种合成RNA基序对特异性抗体和T细胞免疫的影响；图2表示通过特定dsRNA基序对病毒抗原的免疫应答的增强；图3表示确定的dsRNA基序对先天免疫和抗原呈递细胞的影响；图4表示特定dsRNA基序的“危险信号”质量；图5表示将选定的dsRNA基序用作有效的疫苗佐剂；图6是表示dsRNA基序对免疫应答的影响的流程图。
图7表示在流感病毒感染期间产生的天然，非传染性双链RNA对于针对蛋白抗原的特异性免疫应答具有显著作用；图8A表示合成RNA基序的各种文库；
图8B表示不同的合成RNAs对针对原型蛋白抗原的B和T细胞应答具有增强作用；图9表示选定的RNA基序对所述先天免疫应答的影响；图10与抗原呈递细胞上的不同受体结合的独特的RNA基序；图11表示独特的RNA基序能诱导趋化因子的不同的上调；图12表示可以通过使用选定的合成RNA基序控制流感病毒的复制；图13表示选定的合成RNA基序pI:pC和pA:pU明显防止高区耐受，所述高区耐受通常与施用大量的纯化蛋白相关；图14表示选定的合成RNA基序对人单核细胞的影响；图15A-15B表示未标记过的pA:pU，而不是未标记过的pI:pC，能够竞争标记过的pA:pU与人THP-1单核细胞的结合；图16表示dsRNA的纯化和分级分离步骤；图17表示选定的合成RNA化合物的较小分子量的级份具有较高的生物学活性；图18表示是pI:pC而不是pA:pU能诱导针对它自身的抗体应答，具有针对另外一种RNA基序的交叉反应成分；图19表示在IgG介导的MHC I类-限制的表位送递之后，共同使用选定的合成RNAs促进IL-2和IFN-γ的有效诱导；图20表示与使用所述肽本身相比，通过重组IgG的离体APC加载，在形成MHC I类-肽复合物和产生Tc应答方面更有效；图21表示在共同施用选定的合成RNA时，由IgG介导的I类限制的表位的送递在激发I类限制的Tc1应答方面最有效；图22表示抗-病毒细胞毒性T细胞的有效激发同时需要用通过IgG送递的I类限制的表位体内加载APC，和通过选定的合成RNA基序进行合适的指导；图23表示具有病毒I类限制的表位的重组IgG和选定的合成dsRNA一起进行免疫，导致了能够限制在感染侵袭之后的病毒复制的免疫应答的激发；图24表示用于测试基于Ig-肽的分子的效力的肿瘤模型；图25表示用肿瘤相关的抗原对APC进行有效的体内加载，同时通过选定的合成RNA基序激活，足以有效控制肿瘤生长和诱导肿瘤排斥，并且是实现这一目的所必须的；图26表示用肿瘤相关的抗原对APC进行有效的体内加载，同时通过选定的合成RNA基序激活，能够启动针对肿瘤相关抗原的有效免疫应答；图27表示在用具有肿瘤相关表位的重组免疫球蛋白，和选定的合成dsRNA基序一起治疗时，具有T细胞受体标记TCRβ的肿瘤浸润性淋巴细胞获得了激活标记CD25的表达；图28表示成功地排斥肿瘤的治疗过的小鼠产生了针对治疗性Ig上的肿瘤相关的表位的Tc1应答，以及Tc2免疫；图29表示通过所标明的治疗诱导的成功的肿瘤排斥，随后能够有效防止相同肿瘤的后续侵袭，表明了有效免疫记忆的形成；图30A-30B表示在能导致肿瘤排斥的所标明的治疗之后出现的免疫，能防止抗原变体的侵袭，并且与细胞因子生产细胞的总体扩增相关；图31A表示(a)天然IgG(轻链-重链异二聚体)的示意图；(B)插入CDR(互补决定区)3，2，1或构架区的抗原(Ag)衍生肽；(C)用抗原或片段取代的VH片段；和(D)用抗原或抗原片段取代的VH和CH1片段；图31B图示了IgG-肽和Fc肽；图31C表示选定的人IgG主链的特性；和图31D表示所述重链恒定区的序列，以及预期的构建体的示意图。
本发明的详细说明随着对先天免疫的可能作用的理解的发展，在微生物感染期间免疫应答的机制，成了研究的主要领域。很快就了解到，所述先天免疫细胞具有多种类型的能区别各种微生物相关的基序或″外源″危险信号的受体。在所述形式的识别事件之后，先天和适应性免疫之间的联系，决定性地影响到T和B细胞应答的强度和特征。所述先天免疫迅速，但是辨别力较低，不过能指导发展较慢的适应性免疫，并且包括更有效的效应物，通过体细胞突变获得了大量组成成分。共同采用先天和适应性免疫的这种多模式的识别策略，将免疫辨别方式从自主/非自主转变成危险的/非危险的识别。纯化蛋白的较差的免疫原性，通过微生物基序进行的免疫介质的诱导，和所述介质(细胞因子，趋化因子和共刺激分子)对适应性免疫的活性的表征都支持这种观点。
正如在本申请中所披露的，采用了合理的方法来说明非编码RNA基序作为信号的作用，具有用于理解它们在病毒感染期间控制适应性免疫的作用的直接含义。另外，探究了它们作为佐剂用于免疫接种的用途。
采用了合成RNAs文库和双重策略，采用对适应性免疫，而不是先天免疫的影响作为结果。通过这种方法，惊奇地发现了除了RNA的双链性质之外，寡核苷酸组成在这方面起着作用。业已证实基于A∶U的基序具有启动Th1免疫，同种型转变成IgG2a(图1A-1C)和交叉激发(图3A-3E)至比基于I∶C的基序更高程度的能力。前面所限定的I∶C基序，导致了增强的T2和B细胞免疫(图1A-1C)。与dsRNA相关的C∶G-基序，或混杂的ssRNA基序，对适应性免疫具有较弱的影响，除非使用由互补的碱基组成的ssRNAs的混合物。由于所述发现在缺乏功能性TLR4的条件下得到了再现，在这里可以排除与内毒素识别所共有的途径。
最近，业已证实了TLR3在pI:pC识别方面起作用，不过，与pA:pU的共同识别途径似乎不是因为通过这两种基序诱导的免疫应答的显著不同的特征造成的(图1A-1C)。更有可能的是，在原始的免疫组成成分的记忆过程中，不同的TLR同种型和/或共同受体参与了根据核苷酸的性质辨别RNA基序的过程。一种可能性是，被证实能识别回文未甲基化的CpG寡脱氧核苷酸基序的TLR9或TLR的同种型，可能参与了dsRNA-基序辨别。但是，最新的证据没有证实TLR9的参与，因为与未甲基化的CpG基序相比，dsRNA诱导了不同范围的转录因子和共刺激分子。由于pI:pC和pA:pU都能诱导CXC趋化因子(图3A)，诸如CC的趋化因子的具有选择性地结合Th2细胞的能力的其他介质，有可能负责通过所述基序诱导的不同的Th特征。
根据以上资料，可以得出这样的结论所述新鉴定的pA:pU-相关基序能够诱导适应性免疫应答的大量特征，这些特征通常仅在病毒感染之后出现。T1应答(包括Th1和Tc1)的诱导用蛋白抗原(OVA和gp140)和灭活的流感病毒(图1-3)得到了记录。对蛋白抗原的I类MHC-限制的应答的诱导(图3D，E)，表明该RNA基序足以将APC激活到与该加工和呈递机制相的水平，增加了支持交叉激发作为病毒感染的主要机制的新的信息。这表明，可能是RNA-相关的危险基序，而不是APC的直接感染在诸如流感病毒的RNA病毒感染期间，决定细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的诱导。所述免疫应答的增强了的强度，可以解释为APC的迅速募集和激活(图3A-3E)。通过pA:pU促进的T1免疫性的诱导，伴随着同种型转变，导致了IgG2a抗体的产生(图1B)。不过，dsRNA不能诱导向IgA类的同种型转变。这和TGF-β的抑制相关(未示出)，表明dsRNA危险基序是通过促炎介质的诱导和抗炎介质的下调起作用的。以上结果与大量的，但不是排他性的，在诸如流感病毒感染期间dsRNA基序在形成适应性免疫方面的作用吻合。
由于有效的危险基序会影响免疫应答性与耐受性方面的结果，研究了dsRNAs是否能抑制对人IgG的高区耐受，它是一种业已充分表征的免疫无反应性模型。业已证实了pA:pU和pI:pC都是免疫耐受的有效抑制剂(图4A-4B)，而不仅是适应性应答的调节剂。这一发现丰富了dsRNAs所拥有的特征的范围，并且揭示了危险基序的佐剂作用的可能，一般至少部分是由防止免疫无反应性抑制所导致的可能性。最后，由于A和U，而不是I(肌苷)碱基，出现在天然RNA种类中，所述结果表明，在病毒感染期间dsRNA基序与免疫应答具有潜在的相关性。
pA:pU作为危险基序的效力，是通过它的控制流感病毒的原发性感染的能力说明的(图4A-4B)。这一特征可以通过先天和适应性应答的迅速动员，在原发性感染期间未甲基化的CpG寡DNA基序能改善免疫防御方面的能力是高度记忆的来解释。通过外推可以得出这样的结论先天免疫具有识别外源或内源产生的与感染相关的多核苷酸基序，并且相应地调控所述适应性免疫的卓越能力。因此，当系统中存在抗原时，再次暴露于dsRNA可能只会更有效动员所述免疫应答，直接提示抗原的清除。
根据本文所提供的结果，dsRNA基序是与亚基，重组或灭活的疫苗组合的佐剂的合理的候选物。具体地讲，在缺少载体复制的情况下，pA:pU似乎有可能提供活疫苗的某些优点。本申请描述了用于粘膜和系统接种的免疫复合物，它允许进行抗原和dsRNA的共同配制。如图5A-5D所示，用所述复合物进行的肺接种和癌症免疫治疗，导致了由抗体，T辅助细胞和MHCI类-限制的T细胞组成的强免疫应答的诱导。
总之，通过使用选择能影响适应性免疫应答的RNA基序的合理方法，确定了出乎意料的异质性和新的RNA相关的危险基序。对所述适应性免疫应答的系统性研究表明，选定的RNA基序能够协调多种特征，这些特征是天然感染的记忆。最后，本申请确定了含有所述RNA基序的新的制剂，它具有用于粘膜或系统免疫的潜在用途，以及通过消除免疫无反应性或耐受性进行免疫治疗的潜力。
A)材料和方法1)抗原和免疫调节剂将购自Sigma的一组18种单链和双链合成RNAs(参见表1)溶解在无菌PBS中。所述RNAs作为合并物使用或单独使用。卵白蛋白(OVA，低内毒素)购自Sigma(A7641)。霍乱毒素B亚基(CTB)购自Calbiochem(目录号227039)，完全弗氏佐剂(CFA)购自DIFCO(目录号263810)，人IgG(hIgG)购自Sigma(目录号I4506)。保留了构象表位并且具有三聚化能力的重组gp140HIV抗原，是通过导入终止突变由菌株IIIB的gp160包膜蛋白衍生的。抗原是用Bernard Moss博士(N.I.H.)馈赠的痘苗病毒载体，在BS-C-1(ATCC)细胞中表达的，并且通过扁豆凝集素琼脂糖凝胶层析(Pharmacia，Piscataway，NJ)纯化。使用购自Fitzgerald(目录号20-HG81)的HIV包膜特异性抗体通过Western印迹分析证实gp140抗原的身份。流感病毒(菌株A/WSN/32H1N1)在MDBK细胞上生长，并且通过蔗糖梯度离心从上清液中纯化。为了灭活病毒，在搅拌状态下，让所述毒粒暴露于短波紫外线15分钟。通过在允许的MDCK细胞上进行病毒滴定证实所述灭活作用。获得了在可变区内具有I-Ed-限制的血凝素-衍生肽SFERFEIFPKE(IgHA)[Seq.I.D.No.1]的重组小鼠IgG2b，并且按照前面的方法进行纯化。
表1
*p＝″聚″2)动物C57BL/6，BALB/c和TLR4-/-C3H/HeJ雌性小鼠，6-8周龄，购自Jackson Laboratories(Bar Harbor，MA)，并且在AlliancePharmaceutical Corp，在特定病原体条件下圈养。在C57BL/6和BALB/c小鼠中的重要发现，在对内毒素有缺陷型反应的C3H/HeJ小鼠中得到了再现。雌性Sprague Dawley大鼠(250-330克)购自Taconic农场，并且在类似条件下圈养。
3)免疫接种，侵袭和病毒滴度测定如上文所述，分别通过气管内滴注或气雾化对小鼠和大鼠进行激发，而对于小鼠来说，以2周为间隔进行2次鼻内加强免疫。为了诱导高区耐受，通过静脉注射对小鼠进行激发。最后，为了诱导强免疫应答，用在CFA中乳化的抗原对小鼠进行皮下免疫。用于激发、加强或诱导耐受性的抗原用量为OVA-100μg；HIV gp140-10μg；hIgG-200μg；以及蔗糖纯化的UV-WSN-20μg。所使用的合成RNA的量为40-50μg/剂，有或没有抗原，掺入或不掺入在短链脂类(SCL)复合物中。CTB的量/剂为10μg。所述抗原或者在盐水中送递，或者在配制时在全氟化碳(perflubron[纯全氟辛基溴化物]，Liquivent，Alliance Pharmaceutical Corp.)中送递，它是与SCL基质相容的惰性载体(滴注或气雾化的总体积为40-45μl)。
为了进行病毒侵袭，通过鼻途径，用亚致死剂量(104组织培养物感染剂量50％-CD50)的活的WSN病毒感染用Metofane麻醉的C57BL/6和TLR4-/-C3H/HeJ小鼠。在感染之后第五天，处死所述小鼠，取出肺，匀浆并且在-70℃下保存。通过将系列稀释的样品与允许性MDCK细胞一起温育48小时，然后用鸡红细胞(购自Animal Technologies)进行标准血细胞凝集，测定病毒滴度。终点滴度是用内推法通过三次测定估算的，并且表示为TCID50/器官。
4)免疫复合物获得用磷脂作为主要赋形剂的短链脂类(SCL)复合物(或″免疫复合物″)的技术方法是喷雾干燥。在这里采用了该方法的一种更简单的形式。简单地讲，在水中对磷脂进行匀浆(以便形成脂质体或微团)并且与所述赋形剂和活性成分混合，然后进行喷雾干燥，更具体地讲在即将进行喷雾干燥之前，通过混合两种制剂A和B，制备含水制剂。制剂A包括微团制剂，其中，0.14g二辛酰磷脂酰胆碱(AvantiPolar Lipids)溶解在23mL热DI水中。将0.0357g CaCl2·2H2O和0.714g乳糖溶解在所述磷脂微团制剂中。制剂B包括20mg卵白蛋白(Sigma)和4mg的pA:pU(无内毒素)，它们溶解在5mL的PBS中。用标准的B-191小型喷雾干燥器，在以下条件下对组合的输入制剂(2mL制剂A和制剂B)进行喷雾干燥入口温度＝70℃，出口温度＝43℃，抽吸器＝90％，泵＝2.2mL/分钟，氮气流＝2400L/h。所得到的复合物的PL∶OVA∶pApU∶CaCl2·2H2O∶乳糖重量比为12∶20∶4∶3∶61。
5)测定抗体和T细胞应答通过ELISA测定抗体应答。简单地讲，用抗原(分别是2μg/ml的gp140，8μg/ml的蔗糖纯化的病毒，10μg/ml的hIgG或OVA)对孔进行包被，并且用SeaBlock(Pierce，Rockford，IL，目录号37527)封闭。在室温下，将血清和支气管肺泡灌洗液的系列稀释液温育至少2小时。在洗涤之后，用碱性磷酸酶(Sigma，目录号A7434)偶联的抗-小鼠IgG抗体对分析进行显影，然后添加底物(pNPP，Sigma，目录号N2765)，并且通过使用装有SoftMax软件的自动化ELISA读数仪(Molecular Devices，ThermoMax)进行测定。
为了测定细胞应答，通过让器官通过70μm的尼龙Falcon滤网(Becton Dickinson，目录号352350)，然后，用红细胞裂解缓冲液(Sigma，目录号R7757)裂解红细胞，获得了脾细胞悬浮液。通过用胶原酶(Sigma，目录号C9891)消化肺组织，然后通过Ficoll-Paque(Amersham Pharmacia，目录号17-1440-02)梯度离心，从肺相关的淋巴组织中分离淋巴细胞。通过ELISPOT分析测定T细胞应答用4μg/ml的大鼠抗-小鼠抗-IFNγ，IL-2或IL-4单克隆抗体(分别为BD-PharMingen，目录号554430，目录号18161D，目录号554387)对96-孔45微米混合的纤维素酯平板(Millipore，目录号MAHA S4510)进行包被。在37℃下，在无菌盐水中用10％FCS封闭1小时之后，以5×105细胞/孔添加脾细胞悬浮液，其中有或没有抗原或肽。对于肺淋巴细胞而言，在刺激之前以1∶1的比例将效应细胞与丝裂霉素-处理过的脾刺激细胞混合。为了进行刺激，使用梯度量的抗原(OVA，gp140，hIgG或蔗糖纯化的WSN病毒)或肽II类-限制的HA SFERFEIFPKE[Seq.I.D.No.1]；或I类-限制的SIINFEKL[Seq.I.D.No.2]和以前所披露的HIV V3-衍生的R10K肽。在刺激72小时之后，用生物素化的大鼠抗-小鼠细胞因子抗体(BD-PharMingen)进行测定，然后用链霉抗生物素-HRP(BioSource Int.，Camarillo，CA)和不可溶的AEC底物对测定进行显影。利用装有多参数分析软件(Image Pro，MediaCybernetics)的自动化成像系统(Navitar/Micromate)测定所述结果。
6)趋化因子基因表达的测定通过以下DNA阵列技术，测定以前用合成RNA或对照处理1天的小鼠肺中趋化因子的表达水平用RNeasy试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)从肺中分离总RNA。通过用无RNase的DNase I(Stratagene，SanDiego，CA)处理，进一步纯化RNAs。通过使用购自SuperArray Inc.(Bethesda，MD)的Nonrad-GEArray试剂盒进行DNA阵列。简单地讲，利用MMLV逆转录酶，使用含有生物素-16-dUTP的dNTP混合物合成cDNA探针。在68℃下让所述GEArray膜预杂交1-2小时。杂交是通过将所述膜与生物素-标记过的cDNA一起温育进行的。杂交过的膜在2xSSC-1％SDS中洗涤2次，并且在0.1xSSC-0.5％SDS中洗涤2次。进一步用碱性磷酸酶-偶联的链霉抗生物素(BioSource Int.，Camarillo，CA)温育所述膜，并最终用CDP-Star化学发光底物显影。用装有Gel-Pro软件(Media Cybernetics，Silver Springs，MD)的Image-Pro分析系统测定信号强度。
7)流式细胞术通过按上述方法进行胶原酶消化和Ficoll梯度离心，制备事先用合成RNA或盐水处理1天的小鼠的肺细胞悬浮液。将所述细胞重新悬浮在含有1％(v∶v)小鼠血清(Sigma.目录号M5905)和1％(w∶v)牛血清白蛋白，级份V(Sigma，目录号A3059)的磷酸缓冲的盐水中，并且用PE-标记过的大鼠抗-小鼠CD11b(PharMingen，目录号01715A)，PE-标记过的仓鼠抗-小鼠CD11c(PharMingen，目录号09705A)或合适的PE-标记过的同种型对照(PharMingen，目录号11125A或11185A)，以1μg抗体/106细胞的浓度，在冰上染色40分钟。用Becton Dickinson FacsCalibur仪器进行所述分析。用碘化丙锭排除未存活的细胞。
8)磁力分离和过继转移通过利用与大鼠抗-小鼠抗-CD11c抗体(Miltenyi Biotech)偶联的磁珠，从BALB/c小鼠的脾中分离诸如CD11c+树突细胞的专门的APC。简单地讲，以107细胞/ml的密度将单细胞悬浮液重新悬浮在MACS缓冲液(BSA和EDTA)中，在冰上与磁珠一起温育15′，洗涤并且通过磁柱。在洗脱之前，洗涤所述柱三次，随后连续进行2次洗涤，并且，在有或没有50μg/ml RNA基序，或5ng/ml rIL-12(BiosourceInt.，Camarillo，CA)的条件下，用100μg/ml的IgHA体外脉冲过夜。另外，在事先用大鼠抗-小鼠CD40单克隆抗体(BD-PharMingen)包被的孔上，将所述细胞与IgHA一起温育过夜。洗涤所述细胞，重新悬浮在平衡的无菌盐水中，并且通过皮下注射过继转移到未接触过抗原的BALB/c小鼠(2.5×105APC/小鼠)体内。在第14天，通过IL-2ELISPOT分析测定所述T细胞应答，然后按照上述方法用II类HA-限制的肽刺激。
9)统计学分析利用t-试验比较免疫应答的强度，假定所述值的正态分布和相等的方差。
B.结果1)调节免疫应答的RNA基序的系统定义在病毒感染期间，产生了瞬时的，异常的RNA种类，并且起着“危险”信号的作用。因此，推测多种不同的RNA基序是由先天免疫细胞识别的，并且深远地调节适应性免疫应答。为了在系统基础上解释这种假说，筛选了合成的单链和双链RNA基序文库调节对通过呼吸道施用的蛋白抗原(OVA)的特异性IgG应答的能力。
为了简化这一过程，将所述筛选组织成两轮(1)第一轮涉及RNA种类的合并物(表1)；和，(2)第二轮剖析对所述免疫应答具有最大影响的合并物中的成分。
本发明的双链RNA(dsRNA)或单链RNA(ssRNA)是由Sigma公司按照以下方法制备的ssRNA多核苷酸(polyA，polyU)是利用核苷酸和多核苷酸-磷酸化酶，通过酶促方法制备的，没有源于动物的材料进入其制备过程。dsRNA让聚腺苷酸(polyA，pA)与聚尿苷酸(polyU，pU)退火。一般，对于dsRNA来说，本发明的dsRNA和ssRNA是均聚物，由单独一种碱基或核苷酸(例如，腺嘌呤)一致地构成一条链，由他的互补体一致地构成另一条链。对于ssRNA来说，所述单链是由相同的核苷酸均匀地构成的。不过，使用由混合的核苷酸(对于dsRNA来说，及其互补体)组成的dsRNA或ssRNA组合物属于本发明的范围。本发明的dsRNA和ssRNA组合物由碱基/核苷酸腺嘌呤(A)，鸟嘌呤(G)，胞嘧啶(C)，尿嘧啶(U)和肌苷(1)组成。表I和图8A所示的RNA组合物说明了用于这些实施例的各种RNA组合物。本发明的RNA组合物是按照例27的方法制备和纯化的。
用于本发明的各种RNA链的长度一般为100-2000个碱基对，不过，其长度可以为1-20，20-40，40-60，60-80，80-100，1-100，100-200，200-300，300-400，400-500，500-600，600-700，800-900，1000-1100，1100-1200，1200-1300，1300-1400，1400-1500，1500-1600，1600-1700，1700-1800，1800-1900，1900-2000，2000-2100，2100-2200，2300-2400，2400-2500，2500-3000，3000-4000，4000-5000，5000-10,000个碱基对，以及超过10,000个碱基对，和/或它们的混合物。
实施例1RNA基序的各种合并物对针对标准抗原(OVA)的抗体应答的影响在通过呼吸道用OVA进行共同免疫的C57B1/6小鼠测定各种RNA合并物(表1)对适应性免疫的影响。正如在″材料和方法″部分所描述的，所述抗体应答是以IgG终点滴度的平均值±SEM形式表示的(n＝4/组)。作为对照，分别使用了无菌PBS中的OVA，带有霍乱毒素亚基B的OVA(CTB)和单独的PBS。如图1A所示，相当于对抗体应答具有最大影响的dsRNA的合并物，具有明显增强的特异性免疫。另外，彼此互补的单链种类的合并物再现了这种增强作用。
这表明RNA的残基性质和二级结构都决定着它们起着″危险″基序作用的能力，对特异性B细胞应答产生影响。
实施例2各种单个的dsRNA基序对诱导针对OVA的抗体应答的影响按照在前面的例子和″材料和方法″部分中所披露的方法进行实验，不过，我们没有使用RNAs合并物，而是使用单个的dsRNAs。结果以与图1A相同的方式在图1B中示出。所述结果表示两个独立的实验。插图平均IgG2a和IgG1滴度与OVA的比例。从左到右的顺序与主图类似PBS OVA，CTB OVA，pC:pG OVA，pI:pC OVA和pA:pU OVA。在图1B所示的第二轮筛选中，证实了两种类型的基序组成双链RNA，即pA:pU和pI:pC，它们对C57BL/6小鼠体内针对特殊抗原的IgG应答的产生具有明显影响。在对内毒素的应答受损的TLR4-/-C3H/HeJ小鼠中获得了类似结果(未示出)。
因此，单个的RNA基序在强度和特征方面显示对抗体应答的影响具有不同的能力。
实施例3由OVA和各种单个的dsRNA基序诱导的T细胞应答的强度和特征通过ELISPOT分析获得的结果表示为每个脾脏的IFN-γ和IL-4斑点形成集落(SFC)数量的平均值±SEM(n＝4/组)。如图1C所示，pA:pU和pI:pC(40μg，参见“材料和方法”)都对特异性T细胞应答具有增强作用。令人吃惊的是，对特定抗原的T细胞应答的特征取决于RNA残基的性质，这表明免疫系统能够分辩RNA相关的危险基序。含有A和U残基，而不是I和C的RNA基序，在C57BL/6小鼠体内能够指导产生IFN-γ-的Th1细胞(图1C)的分化。这一结果体现了IgG同种型的不同的诱导作用，与所述Th特征吻合(图1B-INSET)。
总之，不同的dsRNA基序对T辅助细胞应答的强度和特征具有不同的影响。
实施例4确定的dsRNA基序对针对病毒抗原HIV重组gp140蛋白的抗体应答的影响如图2A所示，用通过呼吸道单用抗原或用抗原与pA:pU(40μg，参见“材料和方法”)免疫的C57BL/6小鼠测定对HIVgp140(10μg，材料和方法”)片段的抗体应答的影响。结果表示为IgG终点滴度的平均值±SEM(n＝3/组)。
因此，通过使用新的dsRNA基序增强了对具有潜在实用价值的病毒抗原的抗体应答。
实施例5确定的dsRNA基序对针对完整的UV-灭活的流感病毒，病毒株A/WSN/32H1N1(UV-WSN)的抗体应答的影响与实施例4一样，在用UV-灭活的WSN病毒(UV-WSN)(20μg，参见“材料和方法”)自身或与dsRNA基序(50μg)一起进行粘膜免疫接种之后，测定流感病毒-特异性IgG抗体。作为对照，使用了用相同的流感病毒株感染之后的抗体应答(n＝4/组)。结果在图2B中以IgG终点滴度的平均值±SEM形式表示。
因此，通过使用新的dsRNA基序增强了对完整的灭活的微生物形式的病毒抗原的抗体应答。
实施例6通过共同施用确定的dsRNA基序增强对完整的-灭活的流感病毒的T细胞应答通过对脾细胞进行ELISPOT分析研究了对完整的流感病毒的T细胞应答，并且，在扣除本底之后表示为IFN-γ，IL-4和IL-2 SFC(平均值±SEM，n＝4/组)。将针对抗原和pA:pU的T细胞应答与用抗原自身免疫接种或流感病毒感染之后的应答进行比较(参见图2C)。
因此，正如在实施例4-6中所证实的，dsRNA对抗体应答的影响用外源抗原，即HIV包膜蛋白(重组gp140)和完整的-灭活的流感病毒分别得到了证实(图2A，B)。事实上，是pA:pU，而不是pI:pC，将特异性抗体对流感病毒的滴度恢复到与通过感染诱导的类似水平(图2B)。此外，并且很明显的是，在用灭活的病毒进行免疫接种时，pA:pU将T细胞应答恢复到由天然感染所达到的水平(图2C)。因此，不同的RNA基序对T和B细胞应答产生了以前未知的广泛的影响。
2)与dsRNA相关的基序能调节专门的抗原呈递细胞的募集和激活有人假设与dsRNA相关的危险基序，如pA:pU和pI:pC能通过先天免疫的成分间接影响T细胞应答。为了验证这种假设，在施用RNAs之后，在肺淋巴组织中测定了趋化因子基因的表达。
实施例7dsRNA基序对趋化因子基因表达的局部上调在通过呼吸道治疗之后1天，通过DNA阵列技术(参见材料和方法″趋化因子基因表达的测定″)测定了dsRNA基序对趋化因子基因表达的局部上调。结果表示为相对在未处理过的小鼠的肺组织内测定的表达水平的增加倍数。通过dsRNA诱导的趋化因子表达模式与通过LPS诱导的表达模式不同。分别能选择性地结合Th1和Th2细胞上的受体的趋化因子，用连续的和间断的轮廓表示(图3A)。
所述DNA阵列技术表明，IP-10，MIG，MIP-1α，MIP-1β和MCP-1受到了pA:pU和pI:pC的强诱导(参见图3A)。不过，只有pI:pC能诱导具有结合由Th2细胞选择性地表达的受体的能力的RANTES，MCP-3和CC趋化因子的表达。LPS诱导了不同的趋化因子表达上调CXC趋化因子MIG和NIP-1α，以及CC趋化因子TCA-3(参见图3A)。因此，正如以前没有预料到的，趋化因子的复杂特征是通过确定的dsRNA基序诱导的。
实施例8在用dsRNA处理的小鼠肺中募集专门的APC在处理之后1天，通过FACS分析评估在用dsRNA处理的小鼠肺中专门的APC的募集。在图3B中，所述结果表示为CD11c+和CD11b+细胞占肺间质组织中总的细胞群体的百分比(n＝4/组)。CD11b+(单核细胞)是通过pA:pU和pI:pC募集的，与趋化因子表达的上调一致(参见实施例7)。相反，只有pI:pC能有效诱导CD11c+树突细胞的募集。总之，dsRNA基序能在施用部位募集APC。
实施例9通过dsRNA基序激活专门的APC(树突细胞)通过以下方法证实dsRNA基序对专门的APC的激活用抗原和dsRNA离体脉冲CD11c+细胞，然后通过过继转移实验进入未接触过抗原的BALB/c小鼠，并且测定T细胞应答(图3C)。作为对照，分别使用了抗原脉冲的APC，或用rIL-12和抗-CD40mAb共刺激的抗原加载的细胞。在图3C中示出的结果，表示为通过ELISPOT分析估算的脾脏中的IL-2 SFC数量。
因此，除了所述募集作用之外，dsRNA基序能激活APC。
实施例10在BALB/c小鼠中通过dsRNA基序刺激，交叉激发抗病毒抗原的MHC I类-限制的T细胞。
通过ELISPOT分析，在用重组-工程生产的HIVgp140抗原(10μg)和pA:pU一起处理过的BALB/c小鼠体内，研究了通过dsRNA基序刺激的交叉激发(是指特定场合，此时，在没有感染的情况下，APC获得了激发I类限制的T细胞的能力)，利用通过MHC I类-限制的相关肽进行的体外刺激(参见“材料和方法”)。作为对照，使用了剂量匹配的gp140抗原。在图3D中，所述结果表示为IFN-γ和IL-4 SFC数量/脾的平均值±SEM(n＝4/组)。
总之，dsRNA基序有利于对具有潜在实际用途的非传染性抗原的MHC I类-限制的诱导。
实施例11在C57BL/6小鼠中，通过dsRNA基序刺激，交叉激发针对OVA的MHC I类-限制的T细胞。
通过ELISPOT分析，在用完整的OVA和pA:pU一起处理过的C57BL/6小鼠体内，研究了通过dsRNA基序刺激的交叉激发，利用通过MHC I类-限制的肽进行的体外刺激(参见”材料和方法”)。作为对照，使用了剂量匹配的OVA抗原或无菌PBS。在图3E中，所述结果表示为IFN-γ和IL-4 SFC数量/脾的平均值±SEM(n＝4/组)。
总之，dsRNA基序有利于对具有潜在实际用途的非传染性抗原的MHC I类-限制的诱导。
在通过粘膜施用pA:pU和pI:pC之后，对肺间质细胞进行的FACS分析，表明促进了CD11b+单核细胞的募集，并且在第二种情况下，促进了CD11c+树突细胞募集(图3B)。另外，体外温育来自未接触过抗原的小鼠的CD11c+DC以及抗原和pA:pU，并且在较小程度上与pI:pC一起温涌，导致了它们的激活，因为随后将抗原脉冲的细胞过继转移到BALB/c受体中，诱导了增强的II类-限制的T细胞免疫(图3C)。通过用抗-CD40抗体或IL-12进行的APC温育测定了类似的增强作用。最后，在用重组HIV包膜蛋白(gp140)或OVA进行粘膜接种时，pA:pU具有强的CD8+T细胞-促进作用(图3D-E)，正如分别用来自HIV包膜蛋白和OVA的表征过的MHC I类-限制的肽进行的ELISPOT分析所表明的。因此，dsRNA具有将专门的APC的分化诱导到与MHC I类-限制的T细胞的交叉激发相容的阶段的能力。这种类型的免疫应答，通常只会在病毒感染的场合遇到。使用确定的dsRNA基序，可以消除对活疫苗载体的需要，它与因为载体复制而产生的副作用相关。总之，以上结果表明了RNA基序对先天免疫的因素的显著影响，后者具有调控适应性免疫应答的能力。
3)dsRNA基序能阻断高区耐受的诱导并且诱导预防性抗-病毒免疫危险分子参与分辨无害抗原和与感染过程相关的抗原。在大剂量情况下，非传染性纯化蛋白抗原能诱导无反应性或免疫耐受。获得对自身或无害抗原的耐受性的主要途径是″免疫忽略″和″免疫耐受″。在第一种场合下，由于空间隔离，抗原不能接触APC。在第二种场合下，接触APC的抗原被内化，加工，并且所得到的表位在共刺激较弱的情况下被呈递。净结果是在T细胞水平上诱导了免疫无反应或耐受。在感染或免疫刺激场合下，存在抑制″免疫忽略″和″耐受″的机制。所述机制是通过诱导APC的新迁移模式，和激活共刺激分子和促炎趋化因子和细胞因子的表达进行的。其结果是强免疫应答，而不是对免疫系统在通过″危险分子″的存在限定的场合下所暴露的任何抗原的忽略或耐受。作为一种例子，肿瘤相关抗原通常被免疫效应物忽略或以耐受性形式出现。恢复对所述抗原的免疫感受态的方式，在抗癌治疗中具有实际意义。为了检验pA:pU和pI:pC基序的危险信号感受态，使用了通过静脉接种hIgG获得的耐受模型。
实施例12在用人IgG注射过的小鼠体内，dsRNA基序能预防高区耐受。
首先，用标准耐受剂量(200μg)的hIgG自身(实心符号)或与pI:pC或pA:pU(40-50μg)一起(空心的符号；参见图4A)对小鼠进行静脉注射，随后用免疫剂量(50μg)的乳化在CFA中的hIgG进行皮下加强免疫。在加强免疫之后，通过ELISA以各种间隔测定抗hIgG的抗体滴度。作为对照，使用存在于CFA中的hIgG对小鼠进行免疫，并且表示最大滴度(不连续的线条)。在图4A中，所述结果表示为终点滴度的平均值±SEM(n＝5/组)。
以上结果表明，共同接种pA:pU或pI:pC与存在于盐水中的hIgG，能抑制B细胞无反应性的诱导，正如在用存在于CFA中的hIgG进行加强免疫之后的抗体滴度所证实的(图4A)。所述dsRNA相关的基序能够诱导较强的初级应答，并且恢复对它的原型抗原的次级反应答。类似地，T细胞特征的评估表明，通过共同施用dsRNA，部分恢复了IL-4和IL-2的产生。
实施例13dsRNA基序具有动员针对流感病毒感染的免疫防御的不同的能力据推测，危险基序具有迅速动员免疫防御的预防机制的能力。因此，试验了pA:pU和pI:pC是否对流感病毒的原发感染有任何影响。
在用亚致死剂量的流感病毒感染肺部之前和之后1天，通过呼吸道用pI:pC，pA:pU或盐水处理小鼠。在第五天，估算了肺组织中的病毒滴度，并且表示为总的感染单位/器官(平均值±SEM；n＝6/组；结果表示在C3H/HeJ TLR-4-/-和感受态鼠中进行的两次独立研究)。
如图4B所示，结果表明，通过呼吸道用RNA基序处理的小鼠受到了亚致死剂量的流感病毒的感染。在感染5天之后，对肺的病毒滴度进行定量。用C57BL/6和TLR4-/-C3H/HeJ小鼠获得了类似结果(未示出)。显然，所述dsRNAs能够有效协调肺病毒滴度的有效降低。令人吃惊的是，在控制肺病毒滴度方面，pA:pU明显比pI:pC更有效，这进一步突出了所述免疫系统分辨dsRNA相关的危险基序的能力。因此，在缺乏免疫记忆的情况下，dsRNA基序能够动员针对病毒感染的有效的初级应答。
4)通过与RNA危险基序一起共同包封而增强对蛋白抗原的免疫由于对未配制的亚单位疫苗的免疫应答，以及一般来说，对纯化蛋白抗原的免疫应答很弱，检验了在体内，在相同的微结构中，让APC同时暴露于抗原和dsRNA危险基序是否会导致更有利的结果。为此，将原型抗原(OVA)与短链脂类复合物(″SCL″)中的pA:pU或pI:pC(参见”材料和方法”)与生物相容性和免疫学惰性磷脂(例如，二辛酰磷脂酰胆碱)及作为赋形剂的乳糖共同配制。在与OVA+配制于短链脂类复合物中的pA:pU或pI:pC一起送递到C57BL/6小鼠呼吸道中之后，测定抗体应答，这种应答明显比用盐水中的未配制的抗原或在缺乏dsRNA基序的SCL复合物中配制的抗原接种的小鼠的抗体应答强(图5A)。
实施例14模型抗原(OVA)自身或与dsRNA基序一起加载的短链脂类复合物。
制备了由短链磷脂组成的并且用模型抗原(OVA)自身或与dsRNA基序一起加载的短链脂类复合物，并且在C57BL/6小鼠中进行了试验，如图5A所示。通过ELISA测定所述抗体应答，并且表示为气管内免疫接种之后2周IgG终点滴度的平均值±SEM(n＝4/组；数据表示两次独立的测定)。作为对照，使用了存在于PBS中的OVA和与存在于短链脂类复合物(二辛酰磷脂酰胆碱)中的CTB(霍乱毒素B)共同配制的OVA。所述结果表明，能够制备保留了所述RNA基序的免疫学特性的包括抗原和dsRNA的分子复合物，并且具有实用价值。
实施例15在用与dsRNA基序共同配制的OVA免疫接种之后，在C57BL/6小鼠体内对完整的OVA抗原或I类-限制的显性OVA肽的局部(肺)和系统(脾)T细胞应答。
图5B表示在C57BL/6小鼠中对完整的OVA抗原或I类-限制的显性OVA肽的局部(肺)和系统(脾)T细胞应答，它是在用有或没有pA:pU的存在于短链脂类复合物(二辛酰磷脂酰胆碱)中的OVA免疫的小鼠测定的。所述分析是通过ELISPOT进行的，结果表示为IFN-γSFC/器官(平均值±SEM；n＝4/组)。
有趣的是，在短链脂类复合物共同配制的情况下，CTB仅具有有限的佐剂作用。与以前的结果吻合，如图5B所示，T1免疫的诱导仅仅是由pA:pU颗粒测定的，而不是由pI:pC测定的，后者仅仅表现出T2免疫的增强(未示出)。另外，对pA:pU共同配制抗原的T细胞应答(参见“材料和方法”)表现出重要的局部成分(图5B)。最后，利用业已明确的I类-限制的SIINFEKL[Seq.I.D.No.2]肽，证实pA:pU保留了与SCL复合物联合促进交叉激发的能力(图5B)。
实施例16Sprague-Dawley大鼠对用通过与dsRNA基序共同配制的模型抗原(OVA)加载的SC-脂类复合物进行粘膜接种的系统和局部抗体应答。
用与OVA和dsRNA共同配制的脂类复合物对大鼠进行接种。作为对照，分别使用了缺少抗原的SCL复合物，用OVA加载的但缺少dsRNA基序的SCL复合物和存在于盐水中的剂量匹配量的OVA。所述结果表示为在第35天通过ELISA分别在血清(图5C)和支气管灌洗液(图5D)中测定的OVA-特异性抗体终点滴度(平均值±SEM；n＝4/组)。
对于Sprague-Dawley大鼠，用加载了OVA和pA:pU或pI:pC的SCL复合物进行气雾化，测定了抗体应答的类似的增强(图5C)。用缺少dsRNAs的SC-脂类复合物或存在于盐水中的OVA，获得了较低的滴度。粘膜抗体滴度的分析(图5D)发现了类似特征。
因此，通过使用新的喷雾干燥技术共同配制RNA相关的危险基序和蛋白抗原，保存了RNA基序的免疫调节特性，并且导致了局部和系统特异性免疫应答的显著增强。
实施例17非复制dsRNA基序起着适应性(B和T细胞)免疫应答的总开关的作用。
诸如dsRNA的缺少危险基序的抗原是弱免疫原性的，或者如果大剂量提供的话，可能诱导免疫耐受。不过，dsRNA基序能改变免疫系统察觉所述抗原的方式取代弱反应性或耐受的是，所述基序指示适应性(T和B细胞)免疫对同时存在的抗原产生强的反应，并且防止或阻断免疫耐受。因此，利用dsRNA基序识别的先天免疫起着适应性B和T细胞免疫的总开关的作用(图7)。
实施例18.天然存在的dsRNA能联系先天与适应性免疫应答。实施例18表示在流感病毒感染期间产生的天然的，非传染性双链RNA，对针对蛋白抗原的特异性免疫应答具有显著影响。
用WSN流感病毒(108TCID50/1×109细胞)感染允许性MDCK细胞，并且在24小时之后，收获所述细胞，洗涤，并且用RNA分离试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)提取总RNA。通过用无RNAse的DNAseI(Stratagene，San Diego，CA)处理，进一步纯化所述RNA。然后，通过在37℃下，用5μ的S1核酸酶(Ambion，Inc.，Austin，TX)/μg RNA温育30分钟除掉样品中的单链RNA。在所述消化之前和之后，通过凝胶电泳分析所述RNA。通过标准流感病毒滴定证实纯化的dsRNA的感染特性的存在。作为对照，使用了来自109个未感染过的MDCK细胞的，以类似方法纯化和处理的材料。通过分光光度测定法(A260nm)测定核酸浓度，并且通过Limulus分析证实内毒素的缺乏。分别使用了纯化的dsRNA和对照RNA，或者作为与gp140重组抗原的混合物(25μg的RNA和2μg的抗原，存在于25ml无菌PBS中)。
在证实缺乏感染性之后，将40μg的dsRNA或对照RNA与40μg的重组截短的抗原(gp140HIV包膜)混合，并且通过鼻腔滴注给BALB/c小鼠施用(n＝3/组)。其他对照是用存在于盐水中的40μg gp140蛋白(n＝3/组)接种的动物。在激发2周之后，对小鼠进行一次加强免疫。在加强免疫2周之后采集血液，制备血清，并且通过ELISA测定针对gp140的抗体应答。简单地讲，用抗原(2μg/ml gp140)对孔进行包被，并且用SeaBlock(Pierce，Rockford，IL，目录号37527)封闭。在室温下，将血清和支气管灌洗液的系列稀释液温育至少2小时。洗涤之后，用与碱性磷酸酶(Sigma，目录号A7434)偶联的抗-小鼠IgG抗体对所述测定进行显影，然后添加底物(pNPP，Sigma，目录号N2765)，并且利用装有SoftMax软件的自动化微量滴定板读数仪(Molecular Devices，ThermoMax)测定。
在图7的图片A中，示出了所述实验的一般原理。在图7中，图片B示出了对于完整的IgG，在测定显影之后的吸收，相当于各种血清稀释。在图7中，图片B表示对于IgG2a和IgG1抗体同种型，以1/50的比例进行血清稀释的吸收。
总体上，图7中的图片A-B的数据，表示来自流感病毒-感染的MDCK细胞的天然的、非传染性dsRNA对于针对原型抗原的适应性应答具有出乎意料的增强作用。IgG1和IgG2a抗体应答都得到增强，表明诱导了强的T辅助1和2反应。
实施例19.选定的RNA基序对先天免疫应答的影响异源基序。
本实施例出乎意料地表明，不同的合成RNA基序对针对蛋白抗原的适应性特异性免疫应答具有不同的影响。
图8A表示合成RNA基序的广泛的文库，将这些文库分成各种合并物，并且用于以下双滴度筛选过程(A)用RNA合并物对所述小鼠进行气管内免疫，随后间隔2周，通过鼻腔内滴注进行2次加强免疫。通过ELISA测定的抗体应答(图8B)表示为IgG终点滴度的平均值±SEM(n＝4/组)。作为对照，分别使用存在于无菌PBS中的剂量匹配的OVA，OVA与霍乱毒素亚单位B(CTB)和单独的PBS。简单地讲，用抗原(10μg/ml的OVA)对孔进行包被，并且用SeaBlock(Pierce，Rockford，IL，目录号37527)封闭。在室温下，将血清和支气管灌洗液的系列稀释液温育至少2小时。在洗涤之后，用与碱性磷酸酶(Sigma，目录号A7434)结合的抗-小鼠IgG抗体对所述测定进行显影，然后添加底物(pNPP，Sigma，目录号N2765)，并且利用装有SoftMax软件的自动化微量滴定板读数仪(Molecular Devices，ThermoMax)测定。
(B)各种dsRNA基序对诱导针对OVA的抗体应答的影响结果如图8C所示。结果表示两个独立实验。插图平均IgG2a和IgG1滴度与OVA的比例。为此，使用了生物素-偶联的抗-小鼠IgG1和IgG2a抗体，然后用链霉抗生物素-AKP偶联物培养。从左到右的顺序与图8C中的主图片类似PBS OVA，CTB OVA，pC:pG OVA，pI:pC OVA和pA:pU OVA。
(C)在雌性C57BL/6小鼠中，通过OVA和各种dsRNA基序诱导的T细胞应答的强度和特征。为了测定细胞应答，通过让器官通过70微米的尼龙Falcon滤网(Becton Dickinson，目录号352350)，然后用红细胞裂解缓冲液(Sigma，目录号R7757)裂解红细胞，获得了脾细胞悬浮液。通过用胶原酶(Sigma，目录号C9891)消化肺组织，然后进行Ficoll-Paque(Amersham Pharmacia，目录号17-1440-02)梯度离心，从肺相关的淋巴组织中分离了淋巴细胞。通过ELISPOT分析，按照以下方法测定T细胞应答用4μg/ml的大鼠抗-小鼠抗-IFNγ，IL-2或IL-4单克隆抗体(分别为BD-PharMingen，目录号554430，目录号18161D，目录号554387)对96-孔45微米混合的纤维素酯平板(Millipore，目录号MAHA S4510)进行包被。在37℃下，用存在于无菌盐水中的10％FCS封闭1小时之后，以5×105细胞/孔的密度添加脾细胞悬浮液，有或没有抗原/肽。为了刺激，使用了梯度量的抗原(OVA)。在刺激72小时之后，用生物素化的大鼠抗-小鼠细胞因子抗体(BD-PharMingen)，然后使用链霉抗生物素-HRP(BioSourceInt.，Camarillo，CA)和不可溶的AEC底物对所述测定进行显影。利用装有多参数-分析软件(Image Pro，Media Cybernetics)的自动化成像系统(Navitar/Micromate)测定所述结果。在图8D中，所述结果表示为每个脾脏的IFN-γ和IL-4斑点形成集落(SFC)数量的平均值±SEM(n＝4/组)。所述结果代表两个独立实验。
图8B-D中的结果，表示不同的合成RNAs对于针对原型蛋白抗原的B和T细胞应答具有增强作用。另外，包括特定核苷酸组合的不同的基序，在T1和T2诱导方面具有特殊影响，并且随后发生免疫球蛋白同种型转换。
实施例20.使用选定的合成RNA基序能促进产生IFN-γ的MHC I类-限制的Tc1细胞的诱导。
(A)在用10μg重组-工程产生的HIVgp140抗原与pA:pU一起处理(激发加2次加强免疫)的BALB/c小鼠中，研究了通过dsRNA基序刺激的交叉激发。通过实施例19所披露的ELISPOT分析测定应答，用源于V3结构域的MHC I类-限制的相关肽R10K进行体外刺激。作为对照，使用了剂量匹配的gp140抗原。在图9A中，结果表示为每个脾脏的IFN-γ和IL-4 SFC数量的平均值±SEM(n＝4/组)。
(B)在用100μg完整的OV与pA:pU一起处理(激发加2次加强免疫)的C57BL/6小鼠中，通过实施例19所披露的ELISPOT分析，利用MHC I类-限制的肽SUNFEKL[SEQ.I.D.No.2]进行体外刺激，研究了通过dsRNA基序刺激的交叉激发。作为对照，使用了存在于盐水中的OVA抗原或无菌PBS。在图9B中，结果表示为每个脾脏的IFN-γ和IL-4 SFC数量的平均值±SEM(n＝4/组)。
图9A-B中的结果表示，选定的合成RNA基序能够促进针对较大抗原(多肽)中所包含的不同MHC I类-限制的肽的增强的T细胞免疫。该免疫应答包括Tc1成分，它由能生产IFN-γ的MHC I类-限制的T细胞组成。
实施例21表示不同的合成RNA基序出乎意料地结合不同的细胞受体；换句话说，存在多种能分辨RNA基序的受体。
通过FACS分析，通过荧光-标记的pA:pU测定CD11b+APC的体外结合。在4℃下，将MACS-分离的APC与10μg/ml标记过的pA:pU([pA:pU]-F)一起温育30分钟，洗涤，并且分析。另外，将APC分别与20或100μg/ml未标记过的pA:pU，pA或pI:pC一起预温育10分钟，然后，用标记过的pA:pU染色，并且进行FACS分析。在每一个图片中，分别表示染色的(空心区域)，未染色的(实心区域)细胞和强染色的APC的百分比的曲线，X轴取对数。所述结果表示两次独立的测定，每一个样品获得了10,000个事件。
材料小鼠CD11b，CD11c磁力分离珠分别为Miltenyi Biotec，目录号130-049-601，目录号130-052-001；ULYSIS核酸标记试剂盒Alexa 488，Molecular Probes目录号U21650；RNA基序·pA:pU，(Sigma，批号22K4068)；·pI:pC，(Sigma，批号52K4047)；·pA，(Sigma，批号22K4022)；FACS缓冲液PBS，1％FCS，0.1％叠氮化钠；MACs缓冲液PBS，2mM EDTA，0.5％BSA；胶原酶缓冲液0.225mg BSA，0.0062mg胶原酶，存在于50ml RPMI中；和，70μm细胞过滤器(Falcon/Becton Dickinson，目录号352350。
方法I RNA基序的标记1.在以下方法中，用ULYSIS Alexa 488标记物标记每种RNA基序。
II 脾细胞制备1.从4只雌性C57BL/6小鼠中分离脾细胞和肺细胞；·与脾细胞不同，必须切碎肺细胞，并且在37℃下，在胶原酶缓冲液中温育30分钟，然后进行以下步骤；·通过70μm falcon细胞过滤器；·洗涤并且重新悬浮在MACS缓冲液中2.按照推荐的方法，用CD11b或CD11c特异性MACS珠进行标记；3.然后，用以下物质处理细胞·未标记过的pA，pA:pU，或pI:pC(20或100μg/ml)，在室温下标记10分钟；·分别以1.5μg/管和10μg/管ULYSIS标记过的pA或pA:pU的用量添加，以便与每种基序的染料dsRNA比例匹配。
混合，并且在冰上温育30分钟。
洗涤一次，并且重新悬浮在FACS缓冲液中。
III 流式细胞术进行流式细胞术分析，以便测定/比较标记过的和未标记过的RNA基序的竞争抑制和细胞受体结合。
图10中的结果表示pA:pU和pI:pC结合不同的细胞受体。由于pI:pC结合TLR3，业已证实，与TLR3不同的其他受体参与了RNA识别免疫功能。
实施例22表示选定的合成RNA基序能诱导对免疫活性重要的趋化因子基因的体内表达。
使用在通过呼吸道施用之后1天从肺组织中提取的RNA，通过DNA阵列技术测定dsRNA基序对趋化因子基因表达的局部上调。利用RNeasy试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)从肺中分离总RNA。通过用无RNase的DNase I(Stratagene，San Diego，CA)处理进一步纯化所述RNAs。通过使用购自SuperArray Inc.(Bethesda，MD)的Nonrad-GEArray试剂盒进行DNA阵列。简单地讲，利用MMLV逆转录酶和含有生物素-16-dUTP的dNTP混合物合成cDNA探针。在68℃下，将GEArray膜预杂交1-2小时。通过将所述膜与生物素-标记过的cDNA一起温育而进行杂交。杂交过的膜用2xSSC-1％SDS洗涤两次，并且用0.1xSSC-0.5％SDS洗涤两次。所述膜进一步与碱性磷酸酶-偶联的链霉抗生物素(BioSource Int.，Camarillo，CA)一起温育，并且最终用CDP-Star化学发光底物显影。利用装有Gel-Pro软件的Image-Pro分析系统(Media Cybernetics，Silver Springs，MD)测定信号强度。
结果(图11)表示为相对在未处理过的小鼠肺组织中测定的基因表达水平增加的倍数。比较了通过dsRNAs(分别是50μg的pA:pU和pI:pC)诱导的趋化因子表达模式，和通过1μg的LPS诱导的趋化因子表达模式。选择性地结合Th1和Th2细胞上的受体的趋化因子分别用连续的和不连续的轮廓表示。
图11中的结果表示pA:pU和pI:pC能诱导多种趋化因子的表达，并且其表达模式是基序-依赖型的，并且与LPS(内毒素)诱导的表达不同。
实施例23表示特定的合成RNA基序能动员能够控制肺病毒感染的棉衣防御。
dsRNA基序具有动员针对流感病毒感染的免疫防御的不同能力。在用亚致死剂量的流感病毒感染肺部之前和之后1天，通过呼吸道，用50μg的pI:pC，pA:pU或50μl盐水处理C3H/HeJ小鼠。为了进行病毒侵袭，通过呼吸道用亚致死剂量(104组织培养物感染剂量50％-TCID50)的活的WSN(A/WSN/H1n1)病毒感染用Metofane麻醉的C57BL/6和TLR4-/-C3H/HeJ小鼠。在感染之后第五天，处死所述小鼠，取出肺，匀浆，并且在-70℃下保存。通过将样品的系列稀释液与允许性MDCK细胞一起温育48小时，然后用鸡红细胞(购自AnimalTechnologies)进行标准血细胞凝集，测定病毒滴度。通过内推法进行三次测定评估终点滴度，并且表示为TCID50/器官(平均值±SEM；n＝6/组；结果代表用C3H/HeJ TLR-4-/-和感受态小鼠进行的两个独立研究)。用TLR4感受态，C57BL/6小鼠获得了类似结果。
因此，在图12中示出的结果表示通过使用选定的合成RNA基序能够实现对流感病毒复制的控制。
实施例24表示共同施用选定的合成RNA基序能破坏对高剂量标准抗原的耐受。
在用IgG注射的小鼠中，dsRNA基序能防止高区耐受。首先用耐受剂量的200μg的hIgG自身(实心的符号)或与100μg的pI:pC或pA:pU(空心的符号)一起对小鼠(C57BL/6)进行静脉注射，然后用乳化于CFA(完全弗氏佐剂)中的免疫原性剂量的100μg的hIgG通过皮下注射进行加强免疫。通过ELISA(如在实施例19中所披露的)测定对hIgG的抗体滴度，其不同之处在于，在首次注射之后，以不同的间隔，用10μg/ml的hIgG进行包被。作为对照，包括用乳化于CFA中的100μg的hIgG免疫的小鼠，并且在曲线上代表最大滴度(间断的线条)。
图13中的结果表示为终点滴度的平均值±SEM(n＝5/组)。用TLR4缺陷型(C3H/HeJ)和LPS反应型C3H/SnJ小鼠获得了类似结果。因此，图13中的结果表示选定的合成RNA基序pI:pC和pA:pU能大大防止通常与施用大量纯化蛋白相关的耐受。
实施例25表示选定的RNA基序能诱导人APC的不同的细胞因子产生。
在分化之后，将人THP-1单核细胞与不同浓度的合成RNA(pA:pU，pI:pC或pA)一起温育24小时，并且收集细胞上清液。通过ELISA测定IL-12和TNF-α的浓度。在图14中，结果表示为每种细胞因子和培养条件的pg/ml(浓度)。
图14中的结果表示选定的合成RNA基序对人单核细胞的影响；另外，这种影响是异源的，取决于所述基序(核苷酸组成)的化学结构。选定的，而不是所有的合成RNA基序能够诱导人单核细胞的IL-12产生，它是一种重要的T1调控细胞因子。
材料THP-1人单核细胞系ATCC，目录号TIB-202；IL-12细胞因子人ELISA，IL-12超敏(US)目录号KHC0123；TNFα细胞因子人ELISA，TNFα目录号KHC3012；RNA基序·pA:pU，(Sigma，批号22K4068)；·pI:pC，(Sigma，批号52K4047)；和·pA，(Sigma，批号22K4022)。
方法1.在含有10％FCS的培养基中添加10ng/ml PMA之后，让THP-1细胞进行分化。
2.轻柔洗涤细胞，并且添加不含FCS的培养基(HL-1)，以3-100μg/ml的浓度在贴壁THP-1细胞顶部添加处理剂(RNA基序和对照)。
3.温育24小时之后，收集细胞上清液，并且通过ELISA测定IL-12和TNFα浓度。
实施例26表示两种不同的合成RNA基序以表明了与不同受体的相互作用的方式结合人THP-1单核细胞。
在室温下，将THP-1细胞与不同量的未标记过的合成RNA一起温育15分钟。然后，添加标记过的pA:pU，在4℃下温育30分钟，洗涤细胞，并且通过FACS分析进行荧光定量。图15A-15B中的结果是以相当于的大细胞亚型(A)和总的细胞群体(B)形式表示的柱状图。在每个图上示出了染色的细胞的百分比。
图15A-15B中的结果表示未标记过的pA:pU，而不是未标记过的pI:pC能够竞争标记过的pA:pU与人THP-1单核细胞的结合，均在大细胞亚型和整个群体的水平上。
材料1.ULYSIS核酸荧光标记(Molecular Probes，目录号U-21650)。
2.RNA基序·pA:pU，(Sigma，批号22K4068)；·pI:pC，(Sigma，批号52K4047)；3.Detoxi-Gel柱(Pierce，目录号20344)。
方法聚腺苷酸-聚尿苷酸(pA:pU)的I标记在用Detoxi-Gel柱除掉内毒素之后，利用ULYSIS核酸标记系统，用Alexa Fluor 488荧光染料标记pA:pU。
简单地讲·在-70℃下用乙酸钠和乙醇沉淀pA:pU；·对pA:pU进行加热变性，并且在90℃下用Alexa Fluor 488试剂标记；和·终止所述反应，并且对标记过的pA:pU进行乙醇沉淀。
II细胞处理以2×106细胞/ml的密度悬浮THP-1细胞；将50μl上述悬浮液(5×104细胞)放入12×75mm试管中；以20或100μg/ml的浓度，将未标记过的pA:pU或pI:pC添加到THP-1细胞中，并且温育15分钟；以100μg/ml的浓度添加ULYSIS标记过的pA:pU，在冰上温育30分钟。
洗涤THP-1细胞一次，并且悬浮在FACS缓冲液中，然后进行流式细胞分析，以便测定不同处理群体之间的相对荧光差异。
实施例27表示在使用之前佐剂合成RNA如何制备和纯化，以便发挥最大效果。
总的合成RNA材料是通过有机合成的标准方法获得的。然后，将所述材料溶解在无内毒素的无菌盐水中，通过除内毒素柱，直到LPS的浓度低于0.005EU/μg。LPS的测定是通过标准Limulus测定进行的。随后，通过用特定孔度的滤膜实施一系列离心步骤，分级分离所述材料(参见图16)。
有用的级份包括大小小于20至最大100bp的合成RNA。在纯化之后，测定所述材料，并且通过标准测定确认分光光度测定法(OD260nm)；凝胶电泳；通过Limulus测定进行内毒素定量；在人THP-1细胞上的生物活性(参见实施例25)。
实施例28出人意料地表示选定的合成RNA化合物的不同级份，根据大小具有不同的生物学活性。
将分化的人THP-1单核细胞与不同浓度的合成RNA(pA:pU，按照实施例27所述披露的方法分级分离)一起温育24小时，并且收集上清液。使用BioSource International试剂盒(Camarillo，CA)，通过ELISA测定TNF-α的浓度。所述结果在图17中表示为每种培养条件下的pg/ml(浓度)。
图17在示出的结果表明选定的合成RNA化合物的较小分子量的级份在由人单核THP-1细胞生产细胞因子方面具有较高的生物学活性。
实施例29.就抗-RNA抗体的产生而言，选定的合成RNA基序出人意料地具有不同的免疫特征。
通过腹膜内和皮下[i.p.+s.c.]途径，用50μg+50μg的hIgG和合成RNA(pI:pC或pA:pU)免疫BALB/c小鼠，并且在1周之后制备血清样品。作为对照，使用了用存在于盐水中的hIgG注射过的小鼠。通过ELISA测定针对pA:pU，pI:pC，pA和hIgG的抗-hIgG，和dsRNA IgG抗体滴度。简单地讲，用抗原(10μg/ml的hIgG或合成RNAs)对孔进行包被，并且用SeaBlock(Pierce，Rockford，IL，目录号37527)封闭。在室温下，将血清和支气管灌洗液的系列稀释液温育至少2小时。在洗涤之后，用与碱性磷酸酶(Sigma，目录号A7434)偶联的抗-小鼠IgG抗体对所述测定进行显影，然后添加底物(pNPP，Sigma，目录号N2765)，并且通过使用装有SoftMax软件的自动化微量滴定板读数仪(Molecular Devices，ThermoMax)测定。
图18中的结果表示为终点滴度的平均值±SEM(n＝3/组)。图18中的结果表示pI:pC，而不是pA:pU诱导了针对它自身的抗体应答，具有针对其他RNA基序的交叉反应成分。
实施例30.用重组IgG体内加载APC，只有在满足其他条件时才能导致Tc1型MHC I类应答的产生。
通过皮下途径，用与50μg选定的合成RNA(pA:pU或pI:pC)混合的50μg的重组IgG-NP(Kd)(参见图31A-31D)(NP肽是A型流感病毒的受到保护的和保守的表位)免疫BALB/c小鼠。作为对照，使用了未接触过抗原的小鼠或仅用重组IgG免疫的小鼠。在免疫接种3周之后，通过ELISPOT分析按照以下方法测定T细胞应答在4℃下，将ELISPOT平板(Millipore，Molsheim，France)与存在于无菌PBS(50μl/孔)中的纯化的抗-细胞因子Abs(对于抗-IL4，4μg/ml，对于抗-IFNγ，8μg/ml，购自BD Pharmingen)一起温育过夜。次日，用DMEM培养基洗涤平板2次，并且，在37℃下，用200μl/孔的含有FBS的完全DMEM封闭1小时。用脾脏制备单细胞悬浮液，裂解红细胞，洗涤细胞，计数，并且以5×105/孔的密度与NP 147-155肽或仅仅与培养基一起温育，以便评估背景。在37℃下，5％CO2中温育平板72小时。3天之后，用PBS-tween20 0.05％(洗涤缓冲液)洗涤平板5次，并且在4℃下以100μl/孔的用量，与存在于PBS-tween200.05％-FBS 0.1％(ELISPOT缓冲液)中的2μg/ml的生物素化的抗-细胞因子Abs一起温育过夜。
次日，用洗涤缓冲液洗涤平板5次，并且用在ELISPOT缓冲液中以1∶1000的比例稀释的链霉抗生物素-HRP温育1小时。用3-氨基-9-乙基咔唑底物(Sigma，St.Luis，MO)对所述反应进行显影，并且通过用自来水洗涤所述平板两次，终止反应。然后，让所述平板在室温下干燥24小时。
数据是使用装有ImagePro-Plus软件(Media Cybernetics，SilverSpring，MD)的自动化系统(Navitar，Rochester，NY)获得的。测定产生细胞因子的T细胞与NP肽(NP肽是A型流感病毒的保护性和保守的表位)反应的频率，并且针对用于刺激的肽的量表示。图19中的结果表示为三次重复的平均值±SEM(n＝3小鼠/组)。
施用具有NP MHC I类-限制的表位的重组IgG，导致了Tc2免疫的产生，但是没有产生Tc1应答，这意味着具有特异性共刺激特征的I类-肽复合物的体内形成。图19中的结果表示在IgG介导的MHC I类-限制的表位(dsRNA1是pA:pU且dsRNA2是pI:pC)送递之后，共同使用选定的合成RNAs促进了IL-2和IFN-γ的有效诱导。
实施例31通过同时操纵通过FcγR进行的APC加载和通过RNA受体进行的激活，实现MHC I类肽的有效形成和所得到的T细胞应答的指导。
从未接触过抗原的BALBc小鼠体内分离脾APC，并且在有或没有50μg/ml选定的合成dsRNA(pA:pU)的条件下用1μg NP肽，或50μg重组IgG-NP(Kd)在离体脉冲过夜。洗涤所述细胞，并且通过皮下和腹膜内注射，给未接触过抗原的BALB/c小鼠施用等量的5×106细胞。3周之后，按照以下方法，通过ELISPOT分析测定所述应答在4℃下，将ELISPOT平板(Millipore，Molsheim，France)与存在于无菌PBS(50μl/孔)中的纯化的抗-细胞因子Abs(抗-IL4，4μg/ml，抗-IFNγ，8μg/ml，购自BD Pharmingen)一起温育过夜。次日，用DMEM培养基洗涤平板2次，并且在37℃下，以200μl/孔的用量用含有FBS的完全DMEM封闭。用脾制备单细胞悬浮液，裂解红细胞，洗涤细胞，计数，并且以5×105/孔的用量与30μg/ml，10μg/ml，或3μg/ml NP肽或仅仅与培养基一起温育，以便评估背景水平。在37℃下，在5％CO2中温育平板72小时。3天之后，用PBS-tween20 0.05％(洗涤缓冲液)洗涤平板5次，在4℃下，以100μl/孔的用量，用存在于PBS-tween20 0.05％-FBS 0.1％(ELISPOT缓冲液)中的浓度为2μg/ml的生物素化的抗-细胞因子Abs温育过夜。次日，用洗涤缓冲液洗涤平板5次，并且用在ELISPOT缓冲液中以1∶1000的比例稀释的链霉抗生物素-HRP温育1小时。用3-氨基-9-乙基咔唑底物(Sigma，St.Luis，MO)对所述反应进行显影，并且通过用自来水洗涤所述平板两次，终止反应。然后，让所述平板在室温下干燥24小时。
数据是使用装有ImagePro-Plus软件(Media Cybernetics，SilverSpring，MD)的自动化系统(Navitar，Rochester，NY)获得的。图20中的结果表示为细胞因子产生针对用于离体刺激的肽浓度的斑点形成集落的频率(平均值±SEM，n＝3小鼠/组)。另外，对于IFN-γ和IL-4(任意单位)来说，将平均面积/集落与用于刺激的肽的浓度进行作图。
图20中的结果表明，与使用肽本身相比，通过重组IgG对APC进行离体加载，在形成MHC I类-肽复合物和产生Tc应答方面更有效。另外，在通过IgG/FcγR进行的表位送递之后仅有的MHC I类-肽复合物形成，导致了产生IL-4而不是IFN-γ的Tc2细胞的形成。用选定的合成RNA同时处理APC，导致了T细胞谱拓宽到产生IFN-γ的Tc1细胞。
实施例32表示用IgG-肽和选定的共刺激基序共同激发，在病毒感染之后导致了MHC I类-限制的T细胞的更有效的二次扩增。
用重组IgG-NP(Kd)，pA:pU分别或组合注射BALB/c小鼠(50μg/注射)。作为对照，使用了未接触过抗原的小鼠。在处理3周之后，用104TCID50的A/WSN/32H1N1流感病毒，通过呼吸道感染所述小鼠。感染之后4天，通过ELISPOT分析测定脾脏中的T细胞特征，然后按照以下方法用NP肽进行离体刺激在4℃下，将ELISPOT平板(Millipore，Molsheim，France)与存在于无菌PBS(50μl/孔)中的纯化的抗-细胞因子Abs(抗-IL4，4μg/ml，抗-IFNγ，8μg/ml，购自BD Pharmingen)一起温育过夜。次日，用DMEM培养基洗涤平板2次，并且在37℃下，以200μl/孔的用量，用含有FBS的完全DMEM封闭。用脾制备单细胞悬浮液，裂解红细胞，洗涤细胞，计数，并且以5×105/孔的用量与20μg/ml NP肽或仅仅与培养基一起温育，以便评估背景水平。在37℃下，在5％CO2中温育平板72小时。3天之后，用PBS-tween20 0.05％(洗涤缓冲液)洗涤平板5次，在4℃下，100μl/孔的用量，用存在于PBS-tween20 0.05％-FBS 0.1％(ELISPOT缓冲液)中的浓度为2μg/ml的生物素化的抗-细胞因子Abs温育过夜。次日，用洗涤缓冲液洗涤平板5次，并且用在ELISPOT缓冲液中以1∶1000的比例稀释的链霉抗生物素-HRP温育1小时。用3-氨基-9-乙基咔唑底物(Sigma，St.Luis，MO)对所述反应进行显影，并且通过用自来水洗涤所述平板两次，终止反应。然后，让所述平板在室温下干燥24小时。
数据是使用装有ImagePro-Plus软件(Media Cybernetics，SilverSpring，MD)的自动化系统(Navitar，Rochester，NY)获得的。图22中的结果表示为产生NP-特异性MHC I类-限制的T细胞形成细胞因子的集落的频率(平均值±SEM，n＝4小鼠/组)。
图21中的结果表明，在共同施用选定的合成RNA时，IgG介导的I类限制的表位的送递在激发I类限制的Tc1应答方面最有效。在流感病毒感染之后，所述受激发的前体迅速扩增。
实施例33表示共同施用选定的RNA基序和插IgG主链内的肽表位，能最有效激发识别MHC I类-限制的表位的细胞毒性淋巴细胞。
按照前面的实施例披露的方法用重组IgG-NP(Kd)免疫和侵袭BALBc小鼠，并且在流感病毒感染之后4天处死。制备脾细胞，5百万/ml的密度悬浮在HL-1培养基中，并且，在存在5U/ml重组IL-2的条件下，与10μg/ml的NP 147-155肽共同温育5天。合并来自4只小鼠/组的脾细胞，并且在烧瓶中温育。
在扩增之后，通过Ficoll梯度离心回收活的细胞，洗涤，并且在有或没有NP肽(20μg/ml)的条件下，以各种数量与固定数量的sp20靶细胞一起在V底平板上温育5小时。在对平板进行离心之后，收获上清液，并且通过使用Promega试剂盒(目录号G1780)测定LDH的浓度。结果表示为在不同E∶T比例(效应物与靶细胞比例)下的百分特异性裂解。
图22表示抗-病毒细胞毒性T细胞的有效激发，需要用通过IgG送递的I类限制的表位进行APC的有效体内加载，以及通过选定的合成RNA基序，即pA:pU进行合适的指导。
实施例34表示用具有病毒MHC I类-限制的表位的IgG，和选定的合成RNA基序接种，提供了对用原型病毒感染性侵袭的保护作用。
通过皮下注射，用50μg的重组IgG-NP(Kd)和50μg的选定的合成RNA(pA:pU)免疫BALB/c小鼠。免疫之后3周，以104TCID50的标准传染性WSN流感病毒侵袭小鼠，并且在5天之后处死。通过MDCK血细胞凝集测定，按照以下方法在肺匀浆物中滴定肺病毒第一天，以2×104/孔/200μl的密度将MDCK细胞铺板到96孔平板上，并且在37℃下，在5％CO2中温育24小时。次日，将25μl的肺匀浆物在DMEM培养基中的10倍稀释液，放置在短时胰蛋白酶化的MDCK平板上温育(1分钟)，重复3次，并且在37℃下温育。1小时之后，添加1751的DMEM完全培养基，并且在37℃下，在5％CO2中温育平板48小时。两天后，采用鸡红细胞进行血细胞凝集抑制，所述鸡红细胞在室温下与来自MDCK平板的细胞培养物上清液一起温育30分钟，结果表示为肺部病毒总数的平均值±SEM(n＝4小鼠/组)。作为对照，使用未免疫的小鼠。
图23的结果表明，用具有病毒I类限制的表位的重组IgG和选定的合成RNA基序一起免疫，导致了能够在感染性侵袭之后限制病毒复制的免疫应答的激发。
实施例35.图24表示用于测定基于Ig-肽的分子效力的肿瘤模型。
业已将Balb-c小鼠(Kd限制的)用于建立肿瘤模型。肿瘤细胞(1百万-1千5百万，存在于100μL中)通常注射在胁腹(参见上部照片中的箭头)。首先，通过触诊病变部位检测原发肿瘤(即，在注射部位)，然后通过用卡尺测定肿瘤尺寸进行定量。在一系列的实验中，将小鼠骨髓瘤细胞系(SP2/0)，未转染过的细胞或稳定转染过的能表达异源蛋白(在重链的CDR3区表达不同表位肽的重组IgG或完整的NP蛋白)的细胞，用于在所述小鼠体内诱导肿瘤。异源蛋白在SP2/0细胞中的表达，提供了用于在免疫感受态小鼠体内测定各种抗肿瘤策略的特异性肿瘤相关的抗原(TAA)。通常，未处理过的小鼠在注射1周之后产生了可触知的原发性实体瘤，它在随后的4周时间导致了病态和死亡。对注射过的小鼠进行的身体检查发现了转移病变(参见图24)。培养来自原发肿瘤组织的Sp2/0细胞，以及从携带肿瘤的小鼠体内取出的脾(数据未发表)。用重组IgG-表达质粒稳定转染SP2/0细胞，除了导入重链的CDR3区的特殊表位序列，例如，MHCI限制的NP表位(氨基酸147-155)之外，所述质粒都是相同的。SP2/0细胞还可以用含有受CMV启动子控制的编码WSN病毒的完整NP蛋白的序列的质粒稳定地转染。所有转染过的细胞系都在与野生型SP2/0细胞相同的框架上产生了原发肿瘤。
该肿瘤模型被扩展到包括腺癌细胞系(4T1，ATCC CRL-2539，Kd限制的)，以前业已证实其能在Balb-c小鼠中诱导转移瘤。所述4T-1细胞系与上文所述SP/0系类似。将1百万-1千5百万4T-1细胞注射到Balb-c小鼠胁腹，在类似于注射SP2/0细胞的时间框架内，产生了可触知的原发肿瘤，并最终导致死亡。死后从各种器官中收集的组织表明，可以从脾，肺以及原发肿瘤中回收4T-1(未示出)。按照上述方法，用NP-表达质粒稳定地转染4T-1细胞。与SP2/0细胞一样，4T-1细胞的转染不会影响肿瘤的生长过程和疾病的致死性。
实施例36通过使用重组IgG内的肿瘤相关的T细胞表位和选定的共刺激RNA基序证实了在临床诊断之后，对肿瘤的成功控制和治疗。
用能稳定表达在重链(IgNP)的CDR3区中具有MHC I(Kd)NP表位肽的重组IgG的SP2/0细胞(1.5千万，存在于100μL体积中)注射Balb/c小鼠。在注射7天之后，所有小鼠都有可触知的肿瘤，并且将所述小鼠随机分成3组共刺激基序(即，由聚pApU组成的dsRNA)自身；纯化的IgTAA蛋白(IgNP)；这两者。处理时间用箭头表示，并且每次注射包括50μg标明的化合物。发生转移疾病并且死亡的小鼠在所述附图中用″D″表示。
所述数据表示dsRNA(共刺激基序)和IgTAA(IgNP)的组合在治疗开始时具有原发性肿瘤的所有小鼠体内都产生了明显的保护反应。尽管用单独的任意一种化合物处理的小鼠都会发病，100％的用两种化合物处理的小鼠在处理开始3周之后仍然活着，并且，在为了测定T细胞应答而将它们处死时，它们处于良好的临床状况。以上结果表明，用TAA体内加载APC(通过由APC的Fc受体摄取IgNP而实现)，不足以有效地产生抗-肿瘤应答。由采用与pA:pU dsRNA组合的IgNP处理的小鼠表现的肿瘤排斥和存活，突出了共刺激在用肿瘤相关抗原治疗肿瘤方面发挥的重要作用。
总之，图25中的结果表明，用肿瘤相关的抗原对APC进行有效的体内加载，同时通过选定的合成RNA基序激活，是有效控制肿瘤生长和诱导肿瘤排斥所必须的，并且是足够的。
实施例37.本实施例在肿瘤细胞的亚致死接种情况下，表明对肿瘤抗原的次最佳应答，可以通过用IgG主链内的肽表位和共刺激基序进行校正。
用能稳定表达在重链的CDR3中包括WSN病毒核蛋白的MHC I(Kd)表位(氨基酸147-155)的重组IgG(IgNP)的SP2/0细胞注射Balb/c小鼠。所述细胞接种物是每只小鼠1百万细胞(存在于100μL体积中)。观察所述小鼠，直到在注射部位检测到可触知的肿瘤。此时，测定所述肿瘤，并且不对其中的8只小鼠进行处理，而其余6只每周用纯化的IgTAA(即，纯化的IgNP，2mg/kg)和dsRNA(pApU，4mg/kg)进行肿瘤内注射。每周对所述肿瘤进行测定。
图26的图片A表示在8只小鼠中，有6只中诱导的肿瘤进展并最终死亡，这些小鼠中的2只完全自发地排斥了所述肿瘤。图41的图片B表示每周3次用IgNP/dsRNA(通过箭头表示)治疗，在6只小鼠中的4只中刺激了完全肿瘤排斥，并且在另一只中产生了明显消退。
在图26的图片A和B中的结果表明，肿瘤相关的抗原对APC进行有效的体内加载，并且通过选定的合成RNA一起激活，可以诱导针对肿瘤相关抗原的有效的免疫应答。
实施例38表明用IgG主链中的表位和共刺激性合成RNA一起治疗携带肿瘤的小鼠，导致了肿瘤浸润性淋巴细胞的激活状态的恢复。
用1千万表达NP-Kd表位的sp20转染瘤，注射2只BALB/c小鼠。在形成肿瘤之后，用存在于盐水中的50μg选定的dsRNA基序(pApU)和50μg″IgNP″-重组IgG-NP(Kd)对一只小鼠进行肿瘤内注射。24小时之后处死所述小鼠，切除肿瘤，用胶原酶消化，通过70μm的滤膜过滤，并且在Ficoll梯度上分离活细胞。用抗TCR，CD25的mAbs或同种型对照对细胞进行染色，并且通过FACS分析进行评估。结果以柱形图形式表示，并且标明了染色的细胞的百分比。
材料SP20细胞系(ATCC)；2只BALB/c小鼠(Harland Sprague Dawley)；Falcon 70微米滤膜(Becton Dickinson，目录号352350)；胶原酶(Sigma，目录号C-9891)；BSA，级份V(Sigma，目录号A-4503)；胶原酶缓冲液0.225gm BSA+0.00625gm，存在于50ml RPMI中；Ficoll-hypaque(1.077，Amersham，目录号17-1440-02)；FACS缓冲液1％胎牛血清+0.1％叠氮化物，存在于PBS中；抗体均购自BD Pharmingen；和，流式细胞计FACSCalibur(Becton Dickinson)。
方法肿瘤细胞分离和FACS分析提前6周按照上述方法进行肿瘤诱导；从BALB/c小鼠中分离肿瘤；用无菌剪刀剪碎肿瘤，并且添加10ml胶原酶缓冲液；在37℃下，温育40分钟；用3ml的注射器柱塞强制肿瘤通过70μm Falcon滤膜进入50ml试管中，同时用RPMI洗涤；洗涤1次，并且重新悬浮在4ml热RPMI缓冲液中；将等体积的细胞悬浮液铺放在Ficoll上，在室温下，以2000RPM的速度离心15分钟；分离层，并且用HL-1缓冲液洗涤1次，并且以2×106/ml的密度重新悬浮在FACS缓冲液中，并且进行流式细胞术分析；将其余的细胞用于ELISPOT分析；将细胞以50μl/管的用量放入12×75mm试管，并且用FITC标记过的抗-小鼠抗体染色，2μg/管加上1μl/管小鼠血清·同种型对照；
·抗-CD40；·抗-CD8；·抗-CD4；·抗-CD25；·抗-TCRγδ；·抗-TCRβ；在冰上温育30分钟；和，用FACS缓冲液洗涤1次，并且重新悬浮在300μl FACS缓冲液中。
图27中的结果表示，具有T细胞受体标记TCRβ的肿瘤浸润性淋巴细胞，在用具有肿瘤相关表位的重组免疫球蛋白和选定的合成dsRNA基序一起处理时，获得了激活标记CD25的表达。
实施例39表明用IgG主链中的肽表位和选定的共刺激分子成功地治疗携带肿瘤的小鼠与除了Tc2之外还包括Tc1的Tc的特定分化模式相关。
处死在如实施例37所述的用具有肿瘤相关表位的重组Ig和选定的合成dsRNA基序一起处理之后能够成功地排斥肿瘤的小鼠，并且通过ELISPOT分析测定针对肿瘤相关表位的T细胞应答。在4℃下，将ELISPOT平板(Millipore，Molsheim，France)与存在于无菌PBS(50μl/孔)中的纯化的抗-细胞因子Abs(抗-IL2和抗-IL4，4μg/ml，抗-IFNγ，8μg/ml，购自BD Pharmingen)一起温育过夜。次日，用DMEM培养基洗涤平板2次，并且在37℃下，以200μl/孔的含有FBS的完全DMEM进行封闭。
用脾制备单细胞悬浮液，裂解红细胞，洗涤细胞，计数，并且以5×105/孔的用量与各种浓度的NP肽一起温育。在37℃下，在5％CO2中温育平板72小时。3天之后，用PBS-tween20 0.05％(洗涤缓冲液)洗涤平板5次，并且在4℃下，以100μl/孔的用量，用存在于PBS-tween20 0.05％-FBS 0.1％(ELISPOT缓冲液)中的浓度为2βg/ml的生物素化的抗-细胞因子Abs温育过夜。次日，用洗涤缓冲液洗涤平板5次，并且用在ELISPOT缓冲液中以1∶1000的比例稀释的链霉抗生物素-HRP温育1小时。用3-氨基-9-乙基咔唑底物(Sigma，St.Luis，MO)对所述反应进行显影，并且通过用自来水洗涤所述平板两次，终止反应。然后，让所述平板在室温下干燥24小时。
数据是使用装有ImagePro-Plus软件(Media Cybernetics，SilverSpring，MD)的自动化系统(Navitar，Rochester，NY)获得的。结果表示为相当于IL-4，IL-2和IFN-γ的斑点形成集落的数量(平均值±SEM)。作为对照，我们使用了未处理的小鼠，它们不能排斥肿瘤(n＝4/组)。
图28中的结果表明，能成功地排斥肿瘤的治疗过的小鼠产生了针对治疗性Ig上的肿瘤相关表位的Tc1应答，以及Tc2免疫。相反，不能排斥肿瘤的小鼠只产生了Tc2免疫。
实施例40表明在用IgG主链中的T细胞表位和选定的共刺激基序一起治疗携带肿瘤的小鼠之后，有效的记忆应答的诱导。
按照实施例37所披露的方法，通过注射具有TAA的重组Ig和选定的合成RNA基序治疗携带表达NP-KdTAA的肿瘤的sp2/0小鼠。在肿瘤排斥之后，通过对侧地皮下注射表达NP-Kd表位的1千5百万个SP2/0细胞侵袭所述小鼠。同时，4只对照的未接触过抗原的小鼠同样注射致瘤的/致死剂量的相同类型的细胞。监测所述肿瘤的发展和大小，并且表示为直径(mm)与从刺激开始的时间。
图29中的结果表明通过所标明的治疗成功地诱导了肿瘤排斥，然后能有效预防相同肿瘤的随后侵袭，表明产生了有效的免疫记忆。
实施例41表明令人吃惊的是，通过具有TAA的IgG和共刺激剂诱导的肿瘤排斥，导致了对多种缺乏TAA的肿瘤变体或具有TAA的变体的交叉保护作用。
对实施例40所述能避免同源侵袭的小鼠，用1千5百万代表缺乏TAA(缺少抗原变体)的相同肿瘤细胞或具有缺乏NP-Kd表位的TAA变体的肿瘤细胞进行连续刺激。另外，作为对照，用不同类型的肿瘤细胞系(4T-1腺癌)侵袭小鼠，在图30A所附的表中示出。在每一种情况下，都包括未接触过抗原的对照。
通过ELISPOT分析，使用TAA(NP-Kd肽)，HA(MHC II类-限制的肽)，或来自细胞裂解液的蛋白提取物刺激的脾细胞悬浮液，评估了免受多种肿瘤变体侵袭的小鼠的T细胞免疫状态。在4℃下，将ELISPOT平板(Millipore，Molsheim，France)与存在于无菌PBS(50μl/孔)中的纯化的抗-细胞因子Abs(抗-IL2和抗-IL4，4μg/ml，抗-IFNγ，8μg/ml，购自BD Pharmingen)一起温育过夜。次日，用DMEM培养基洗涤平板2次，并且在37℃下，以200μl/孔的用量，用含有FBS的完全DMEM封闭。
用脾制备单细胞悬浮液，裂解红细胞，洗涤细胞，计数，并且以5×105/孔的用量与各种浓度的抗原一起温育。在37℃下，在5％CO2中培养温育72小时。3天之后，用PBS-tween20 0.05％(洗涤缓冲液)洗涤平板5次，并且在4℃下，以100μl/孔的用量，用存在于PBS-tween20 0.05％-FBS 0.1％(ELISPOT缓冲液)中的浓度为2βg/ml的生物素化的抗-细胞因子Abs温育过夜。次日，用洗涤缓冲液洗涤平板5次，并且用在ELISPOT缓冲液中1∶1000的比例稀释的链霉抗生物素-HRP温育1小时。用3-氨基-9-乙基咔唑底物(Sigma，St.Luis，MO)对所述反应进行显影，并且通过用自来水洗涤所述平板两次，终止反应。然后，让所述平板在室温下干燥24小时。
数据是使用装有ImagePro-Plus软件(Media Cybernetics，SilverSpring，MD)的自动化系统(Navitar，Rochester，NY)获得的。结果表示为相当于IL-4，IL-2和IFN-γ的斑点形成集落的数量(平均值±SEM)。作为对照，使用了不能排斥肿瘤的未处理的小鼠(n＝4/组)。作为对照，包括未接触过抗原的小鼠。结果是以细胞因子生产细胞/器官的数量(平均值±SEM)形式表示的(n＝3/组)。
图30A-30B(包括图30A中的表)中的结果表明，在导致肿瘤排斥的标明的治疗之后出现的免疫，导致了对抗原变体的侵袭的避免，并且与细胞因子生产细胞的总体扩增相关。这表明通过推荐的方法，将抗-肿瘤淋巴细胞的所有组成成分拓宽到不是由免疫治疗分子携带的肿瘤相关的抗原。
权利要求书(按照条约第19条的修改)1.一种增强受试者中对抗原的T细胞应答的方法，包括给所述受试者施用由双链RNA组成的组合物。
2.如权利要求1的方法，还包括与所述抗原共同施用所述组合物。
3.如权利要求1的方法，其中，所述抗原是在给所述受试者施用双链RNA之后施用或接触的。
4.如权利要求1的方法，其中，所述双链RNA由聚腺嘌呤和聚尿嘧啶组成。
5.如权利要求1的方法，其中，所述双链RNA由聚鸟嘌呤和聚胞嘧啶组成。
6.如权利要求1的方法，其中，所述方法能增强对所述抗原的Th1应答。
7.如权利要求1的方法，其中，所述方法能增强对所述抗原的Tc1应答。
8.一种防止对非传染性抗原的高区耐受的方法，包括一起施用所述非传染性抗原和由聚腺嘌呤和聚尿嘧啶或聚肌苷和聚胞嘧啶组成的双链RNA组合物。
9.如权利要求8的方法，其中，所述方法能防止T细胞无反应性。
10.如权利要求8的方法，其中，所述抗原是病毒。
11.如权利要求8的方法，其中，所述dsRNA是pA:pU。
12.一种用于增强对抗原的T细胞应答的组合物，包括由聚腺嘌呤和聚尿嘧啶组成的dsRNA序列。
13.如权利要求12的组合物，其中，所述组合物还包括抗原。
14.如权利要求12的组合物，其中，所述抗原是在可以药用的载体中施用的。
15.如权利要求12的组合物，其中，所述抗原是在免疫球蛋白中施用的。
16.如权利要求12的组合物，其中，所述可以药用的是IgG。
17.如权利要求12的组合物，其中，所述抗原是肿瘤相关表位。
18.如权利要求13的组合物，其中，所述抗原是病毒。
19.如权利要求12的组合物，其中，所述抗原是肿瘤相关的T细胞表位。
20.一种用于在受试者中增强对抗原的T细胞应答的组合物，包括由聚肌苷和聚-半胞嘧啶组成的dsRNA序列。
21.如权利要求20的组合物，其中，所述组合物还包括抗原。
权利要求
1.一种增强对抗原的免疫应答的方法，包括施用由双链RNA组成的组合物。
2.如权利要求1的方法，还包括与所述抗原共同施用所述组合物。
3.如权利要求1的方法，其中，所述双链RNA由聚腺嘌呤和聚尿嘧啶组成。
4.如权利要求1的方法，其中，所述双链RNA由聚鸟嘌呤和聚胞嘧啶组成。
5.如权利要求1的方法，其中，所述方法能增强Thl和Tcl细胞应答。
6.如权利要求1的方法，其中，所述方法能增强B细胞对抗原的应答。
7.一种防止对非传染性抗原的高区耐受的方法，包括一起施用所述非传染性抗原和由聚腺嘌呤和聚尿嘧啶或聚肌苷和聚胞嘧啶组成的双链RNA组合物。
8.如权利要求7的方法，其中，所述方法能预防B细胞无反应性。
9.如权利要求7的方法，其中，所述抗原是病毒。
10.如权利要求7的方法，其中，所述dsRNA是pApU。
11.一种用于增强对抗原的免疫应答的组合物，包括由聚腺嘌呤和聚尿嘧啶组成的dsRNA序列。
12.如权利要求11的组合物，其中，所述组合物还包括抗原。
13.如权利要求11的组合物，其中，所述抗原是在可以药用的载体中施用的。
14.如权利要求11的组合物，其中，所述抗原是在免疫球蛋白中施用的。
15.如权利要求11的组合物，其中，所述可以药用的是IgG。
16.如权利要求11的组合物，其中，所述抗原是肿瘤相关表位。
17.如权利要求12的组合物，其中，所述抗原是病毒。
18.如权利要求11的组合物，其中，所述抗原是肿瘤相关的T细胞表位。
19.一种用于增强对抗原的免疫应答的组合物，包括由聚肌苷和聚-半胞嘧啶组成的dsRNA序列。
20.如权利要求19的组合物，其中，所述组合物还包括抗原。
全文摘要
本申请涉及非编码RNA基序，它在与抗原组合或不与抗原组合的情况下被用于诱导、增强或调节包括B细胞和T细胞成分的免疫应答。
文档编号A61K48/00GK1780848SQ03810917
公开日2006年5月31日 申请日期2003年3月14日 优先权日2002年3月15日
发明者A·I·博特, 王立林, L·德拉玛丽, D·史密斯, B·菲利普斯 申请人:阿斯特拉尔公司