卡诺拉蛋白分离物组合物的制作方法

专利名称：卡诺拉蛋白分离物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及卡诺拉(canola)蛋白分离物组合物和上述组合物的各个蛋白质组分。
背景技术：
卡诺拉蛋白分离物可由卡诺拉油籽粗粉制得。在共同未决的2001年5月4日提交的美国专利申请号60/288,415、2001年10月5日提交的60/326,987、2001年11月7日提交的60/331,066、2001年11月26日提交的60/333,494、2002年4月24日提交的60/374,801以及2002年5月3日提交的10/137,391中描述了一种从卡诺拉油籽粗粉中生产卡诺拉蛋白分离物的方法，该蛋白分离物的蛋白质含量为至少100％重量(N×6.25)，上述专利均指定了受让人，其公开内容在此均引入作为参考。该方法包括多步骤工序，其包含用盐溶液浸提卡诺拉油籽粗粉，将所得蛋白质水溶液与油籽粗粉残渣分离，利用选择性的膜技术在保持离子强度基本恒定的同时，将蛋白质水溶液的蛋白质浓度增加到至少约200g/L，将所得的浓缩的蛋白质水溶液稀释于冷却水中，导致形成蛋白质微粒，沉降蛋白质微粒，形成无定形、稠密的粘胶质面筋样蛋白质微粒团(PMM)，并从上清液中回收蛋白质微粒团，其蛋白质含量为至少约100％重量，以Kjeldahl氮(N)×6.25测定。在此处提到的蛋白质含量是以干重为基准测定的。回收的PMM可被干燥。
在上述方法的一个实施方案中以及特别是如专利申请号60/326,987、60/331,066、60/333,494、60/374,801和10/137,391中所描述的，处理来自PMM沉降步骤的上清液，以从湿的PMM和上清液中回收含有干燥蛋白的蛋白分离物。该工艺是通过最初用超滤膜浓缩上清液，然后将浓缩的上清液与湿PMM混合并干燥该混合物而完成的。所得的卡诺拉蛋白分离物具有至少约90％重量蛋白质(N×6.25)的高纯度，优选至少约100％重量蛋白质(N×6.25)。
在上述方法的另一个实施方案中以及特别是如专利申请60/333,494、60/374,801和10/137,391所描述的，处理来自PMM沉降步骤的上清液，以从上清液中回收蛋白质。该工艺是通过最初用超滤膜浓缩上清液并干燥浓缩物完成的。所得的卡诺拉蛋白分离物具有至少约90％重量蛋白质(N×6.25)，优选至少约100％重量蛋白质(N×6.25)的高纯度。
上述美国专利申请所描述的工艺实质上是成批处理工艺。在2001年11月20日提交的共同未决的美国专利申请60/331,646、2002年5月30日提交的60/383,809和2002年11月19日提交的10/298,678中描述了一种生产卡诺拉蛋白分离物的连续方法，上述专利均指定了受让人，其公开内容在此均引入作为参考。根据上述专利，将卡诺拉油籽粗粉连续与盐溶液混合，通过管道输送所得的混合物，同时从卡诺拉油籽粗粉中浸提出蛋白质而形成蛋白质水溶液，将蛋白质水溶液与卡诺拉油籽粗粉残渣连续分离，连续地输送蛋白质水溶液使其通过选择性膜操作以使在保持离子强度基本恒定的同时，将蛋白质水溶液中的蛋白质含量增加到至少约200g/L，将所得的浓缩蛋白质溶液与冷却水连续混合，导致形成蛋白质微粒，并且使蛋白质微粒连续沉降，同时让上清液连续地溢出，直至在沉降器中积累得到所需量的PMM。从沉降器中转移出PMM并干燥。该PMM的蛋白质含量至少约为90％重量，以Kjeldahl氮(N)×6.25测定，优选至少约100％重量(N×6.25)。
如上述美国专利申请号60/326,987、60/331,066、60/333,494、60/374,801和10/137,391所述，可以处理溢出的上清液，从中回收得到卡诺拉蛋白分离物。
已知卡诺拉油籽含有约10-30％重量的蛋白质并且已鉴定出多种不同的蛋白质组分。根据不同的沉降系数区分这些蛋白质。已知并鉴定的蛋白质包括被称为cruciferin 12S球蛋白和被称为napin的2S贮存蛋白质。
卡诺拉也被称为菜籽或油籽油菜。
发明概述除了12S和2S蛋白质外，我们还发现上述分离卡诺拉蛋白分离物的方法生产出了相当数量的一种7S蛋白质，该蛋白质是一种新蛋白质。因此，本发明一方面提供了一种分离并纯化的卡诺拉7S蛋白质。
目前，我们还发现来自蛋白质微粒团的卡诺拉蛋白分离物与来自上清液的卡诺拉蛋白分离物之间的12S、7S和2S蛋白质的相对比例存在差异，上述卡诺拉蛋白分离物由上述方法制备。特别是发现来自PMM的卡诺拉蛋白分离物具有的蛋白质含量至少为约90％重量(N×6.25)，优选至少为约100％重量，其蛋白质组分的含量为约60-98％重量的7S蛋白质、约1-15％重量的12S蛋白质和约0-25％重量的2S蛋白质。相反地，来自上清液的卡诺拉蛋白分离物具有的蛋白质含量至少为约90％重量(N×6.25)，优选至少为约100％重量，其蛋白质组分的含量为约0-5％重量的12S蛋白质、约5-40％重量的7S蛋白质和约60-95％重量的2S蛋白质。
来自PMM的卡诺拉蛋白分离物的蛋白质组分的含量优选为约88-98％重量的7S蛋白质、约1-10％重量的12S蛋白质和约0-6％重量的2S蛋白质，而来自上清液的卡诺拉蛋白分离物的蛋白质组分的含量优选为约70-95％重量的2S蛋白质、约5-30％重量的7S蛋白质和约0-2％重量的12S蛋白质。
因此上述两种卡诺拉蛋白分离物的蛋白质组分的分布非常不同。对于来自PMM的卡诺拉蛋白分离物，主要的蛋白质种类是7S蛋白质，而对于来自上清液的卡诺拉蛋白分离物，主要的蛋白质种类是2S蛋白质。这种差异导致在卡诺拉蛋白分离物应用环境中出现不同的性能。
不同的蛋白质含量分布使得可以提供卡诺拉蛋白分离物的组合物，其中根据具体的应用以任何所需的比例混合这两种不同的卡诺拉蛋白分离物，得到介于来自PMM的蛋白分离物和来自上清液的蛋白分离物的2S/7S/12S蛋白质分布之间的任何所需的2S/7S/12S蛋白质分布。
来自上清液的蛋白分离物是新的卡诺拉蛋白分离物。因此，本发明的另一方面是提供了一种卡诺拉蛋白分离物，其蛋白质含量至少为约90％重量，优选至少为约100％重量，以干重为基准并且以Kjeldahl氮转换率N×6.25测定，并且其所呈现的蛋白质分布为约60-95％重量的2S蛋白质、约5-40％重量的7S蛋白质和约0-5％重量的12S蛋白质。优选地，来自上清液的卡诺拉蛋白分离物所呈现的蛋白质分布为约70-95％重量的2S蛋白质、约5-30％重量的7S蛋白质和约0-2％重量的12S蛋白质。
来自PMM的卡诺拉蛋白分离物产物以任何所需的比例与任何所需比例的来自上清液的卡诺拉蛋白分离物产物混合，所得的组合物含有所需比例的2S、7S和12S卡诺拉蛋白质，该组合物是一种新的卡诺拉蛋白分离物组合物。因此，另一方面，本发明提供了一种卡诺拉蛋白分离物组合物，其含有(1)第一种卡诺拉蛋白分离物，其蛋白质含量为至少约90％重量，优选至少为约100％重量，以干重为基准并且以Kjeldahl氮转换率N×6.25测定，并且其所呈现的蛋白质分布为约60-98％重量的7S蛋白质、约1-15％重量的12S蛋白质和约0-25％重量的2S蛋白质，和(2)第二种卡诺拉蛋白分离物，其蛋白质含量为至少为约90％重量，优选至少为约100％重量，以干重为基准并且以Kjeldahl氮转换率N×6.25测定，并且其所呈现的蛋白质分布为约60-95％重量的2S蛋白质、约5-40％重量的7S蛋白质和约0-5％重量的12S蛋白质。
优选地，第一种卡诺拉蛋白分离物所呈现的蛋白质分布为约88-98％重量的7S蛋白质、约1-10％重量的12S蛋白质和约0-6％重量的2S蛋白质。优选地，第二种卡诺拉蛋白分离物呈现本文所述的新卡诺拉蛋白分离物的优选的蛋白质分布。
改变具体来自PMM的卡诺拉蛋白分离物和/或具体来自上清液的卡诺拉蛋白分离物的12S/7S/2S蛋白质比例可以通过改变从卡诺拉油籽粗粉生产各个卡诺拉蛋白分离物的工艺条件而实现。
已经分离、纯化并表征了卡诺拉蛋白分离物的各组分。利用任何常规方法的从如上述方法获得的分别来自PMM和上清液的卡诺拉蛋白分离物中分离出单个的蛋白质，其中可以根据大小差异将蛋白质混合物分离，优选通过制备型高压液相色谱(HPLC)，随后通过超滤减少洗脱液体积和通过透析减少残余的溶解的盐浓度。干燥已透析的物质，分离出的纯蛋白质。
从含有选自2S、7S和12S中的至少两种的不同卡诺拉蛋白质混合物的卡诺拉蛋白分离物，包括本文所述的来自PMM的卡诺拉蛋白分离物和来自上清液的卡诺拉蛋白分离物中分离和纯化单个的卡诺拉蛋白质的方法构成了本发明的另一个方面。
通常2S蛋白质从来自上清液的卡诺拉蛋白分离物中分离和纯化，而7S和12S蛋白质通常从蛋白质的微粒团中分离和纯化。经MALDI-MS测定，2S蛋白质的分子量为约14kDa，经MALDI-MS测定，7S蛋白质的分子量为约145kDa，经MALDI-MS测定，12S蛋白质的分子量为约290kDa。
7S和12S蛋白质具有非常相似的氨基酸分布并且由许多相同的亚基组成，每个亚基含有大约413个氨基酸。7S蛋白质含有大约1240个氨基酸，而12S蛋白质含有大约2480个氨基酸。2S蛋白质具有与7S和12S蛋白质差异相当大的氨基酸分布，并且含有大约120个氨基酸。在下面的实施例中给出了所得到的氨基酸分布。
通过提供单个的分离并纯化的2S、7S和12S卡诺拉蛋白质，使得可以生产7S蛋白质与12S和/或2S蛋白质的不同混合比例的组合物，从而提供了在纯化的蛋白质的应用中具有独特的功能性的组合物。上述组合物构成了本发明的另一方面。
根据本文中的方法生产的卡诺拉蛋白分离物可用于蛋白分离物的常规应用领域，比如加工食品的蛋白质营养强化剂、油的乳化剂、焙烤食品的成形剂和夹带气体的产品的起泡剂。此外，卡诺拉蛋白分离物可以形成蛋白质纤维用于肉类似物中，可以用作蛋白替代物或在将蛋白用作粘合剂的食品中用作补充剂。卡诺拉蛋白分离物可用作营养增补剂。卡诺拉蛋白分离物还可用于宠物食物、动物饲料、工业和化妆品应用，以及个人护理用品。单个的分离并且纯化的蛋白质可以有相似的用途。
附图简介

图1是根据本发明的一个实施方案生产具有不同的蛋白质分布的卡诺拉蛋白分离物的方法的示意流程图。
图2是根据本发明的另一个实施方案生产具有不同的蛋白质分布的卡诺拉蛋白分离物的连续方法的示意流程图。
图3-5是低温粗粉提取物的分析HPLC色图谱；和图6和7包含了为了收集单个的2S、7S和12S卡诺拉蛋白质的七次连续的制备HPLC的重叠图谱。
发明详述通过上述美国专利申请中描述的成批处理方法或连续处理方法或半连续处理方法可以从卡诺拉油籽粗粉中分别分离出来自PMM的卡诺拉蛋白分离物和来自上清液的卡诺拉蛋白分离物。
提供卡诺拉蛋白分离物的方法的初始步骤包括溶解卡诺拉油籽粗粉中的蛋白质类物质。从卡诺拉油籽粗粉中回收的蛋白质类物质可以是天然存在于卡诺拉油籽或其它油籽中的蛋白质，或者该蛋白质类物质可以是经基因操作改性的，但具有天然蛋白质的典型的疏水性和极性特性的蛋白质。卡诺拉粗粉可以是来自从卡诺拉油籽脱去卡诺拉油的并且含有不同量的未变性蛋白质，例如经过了热的己烷浸提或冷油挤压处理所得的蛋白质的任何卡诺拉粗粉。从卡诺拉油籽脱去卡诺拉油通常作为分离的操作由本文中所述的蛋白分离物回收方法进行。
蛋白质的溶出最有效地是通过使用食品级的盐溶液来完成，因为盐的存在可以增加可溶解的蛋白质从油籽粗粉中分离。当卡诺拉蛋白分离物用于非食品应用时，可以使用非食品级的化学品。虽然可以使用其它的盐如氯化钾，但通常盐是氯化钠。盐溶液的离子强度至少约为0.10，优选至少约为0.15，如此可以有效地溶出相当含量的蛋白质。随着盐溶液的离子强度的逐渐增加，从油籽中溶出的蛋白质的程度也一起增多直至达到最高值。接下来，无论怎样增高离子强度，将不再增加溶出的蛋白质的总量。使溶出的蛋白质的量达到最大值时所需要的食品级盐溶液的离子强度，取决于所选用的盐和油籽粗粉。
考虑到随着离子强度的增高，在使蛋白质沉淀下来的过程中需要更大的稀释度，所以一般优选离子强度低于约0.8，更优选约为0.15-0.6。
在成批处理方法中，至少在约5℃的温度下用盐溶解蛋白质，优选温度最高达约35℃，优选同时搅拌以缩短溶解时间，一般耗时约10-60分钟。优选溶解步骤从油籽粗粉中基本上尽可能多地浸提出蛋白质，从而获得整体上的高产率。
确定约5℃作为下限温度是因为低于该温度时溶解作用十分缓慢，不切实际，而确定约35℃作为上限温度是因为在成批处理方式中在较高温度水平进行处理是不经济的。
在连续处理方法中，从卡诺拉油籽粗粉中浸提蛋白质可以按照能从卡诺拉油籽粗粉中连续浸提蛋白质的任何方式进行。在一个实施方案中，将卡诺拉油籽粗粉和食品级盐溶液连续地混合，并且让所得的混合物以某一流速流过具有某一长度的导管或管道，以使其滞留时间足以按照本文中的参数进行所需浸提。在上述连续工艺中，盐溶解步骤起效迅速，约10分钟，优选溶解步骤从卡诺拉油籽粗粉中基本上尽可能多地浸提出蛋白质。连续工艺中的溶解优选在升高的温度下进行，优选高于约35℃，一般达到约65℃。
盐水溶液和卡诺拉油籽粗粉的天然pH介于约5-6.8之间，由此可以通过微团途径得到蛋白分离物，这些将在后文中详细介绍。
当处于或者接近pH范围的极限时，通过微团途径只能部分地生成蛋白分离物，较之其它取值范围内的pH，其产率要低。因此，优选约5.3-6.2的弱酸性pH值。
在浸提步骤中，可以使用任何方便的酸，通常为盐酸，或碱，通常为氢氧化钠，将盐溶液的pH调节到约5-6.8范围内的任何想要的值。
在溶解步骤中，食品级盐溶液中的油籽粗粉浓度可以在较大为范围内变化。一般其浓度范围为约5-15％w/v(重量/体积)。
在盐水溶液浸提蛋白质的步骤中，还有溶出卡诺拉粗粉中脂肪的附带作用，这将导致水相中出现脂肪。
来自浸提步骤的蛋白质溶液的蛋白质浓度一般为约5-40g/L，优选为约10-30g/L。
由浸提步骤得到的水相随后以任何便利的方式从卡诺拉粗粉残渣中分离，比如利用真空过滤，随后经离心和/或过滤除去粗粉残渣。分离出来的粗粉残渣可先行干燥后再经处理。
通过将活性炭粉末或其它色素吸附剂与分离所得的蛋白质水溶液混合并随后除去这些吸附剂，便利地通过过滤得到蛋白质溶液，可以使最终蛋白分离物的颜色在浅色和较少黄色方面有所改进。渗滤也可用于除去色素。
上述色素去除步骤可以在任何方便的条件下进行，一般在分离所得的蛋白质水溶液的环境温度下使用任何适宜的色素吸附剂。就活性炭粉末而言，用量为约0.025-5％w/v，优选为约0.05-2％w/v。
如美国专利号5,844,086和6,005,076中所描述，卡诺拉油籽粗粉含有相当量的脂肪，上述专利均指定了受让人，其公开内容在此均引入作为参考，因而在分离所得的蛋白质水溶液和下述讨论的浓缩蛋白质水溶液中可以进行所述的脱脂步骤。当要进行颜色改进步骤时，该步骤可以在第一次脱脂步骤后进行。
作为盐水溶液浸提油籽粗粉的替代方案是仅用水浸提，虽然仅用水浸提油籽粗粉所得的蛋白质少于用盐水溶液。当采用该替代方案时，在除去油籽粗粉残渣后向蛋白质溶液中加入上述讨论浓度的盐，以在下述浓缩步骤期间维持溶液中的蛋白质。当进行脱色步骤和/或第一次脱脂步骤时，一般在上述操作完成后加入盐。
另一替代方法是用具有超过约pH6.8的相对高pH值的食品级盐溶液浸提油籽粗粉，一般高达约pH9.9。可以使用任何方便的食品级碱，比如氢氧化钠水溶液将食品级盐溶液的pH调节到碱性值。可替换地，油籽粗粉可以用相对低pH值低于约pH5，一般低至约pH3的盐溶液进行浸提。当采用该替代方案时，由浸提油籽粗粉步骤得到的水相随后以任何便利的方式从卡诺拉粗粉残渣中分离，比如利用真空过滤，随后经离心和/或过滤除去粗粉残渣。分离出来的粗粉残渣可先行干燥后再经处理。
在进行下述的其它工序之前，将由高或低pH浸提步骤所得的蛋白质水溶液的pH调节到上述约5-6.8范围内，优选约5.3-6.2。可以使用任何方便的酸，如盐酸，或碱，如氢氧化钠来调节pH。
而后将蛋白质水溶液浓缩，以增高蛋白质浓度，同时维持溶液的离子强度基本上恒定。经过上述浓缩，浓缩蛋白质溶液的蛋白质浓度至少为约200g/L，优选为约250g/L。
按照与成批或连续操作相一致的任何方便的方式进行浓缩步骤，例如利用任何方便的选择性膜技术，比如利用膜如中空纤维膜或螺旋缠绕膜进行超滤或渗滤，根据不同的膜材料和构造，该膜具有适宜的截止分子量，如约3000-50,000道尔顿，并且对于连续操作，将其尺寸定到蛋白质水溶液通过该膜时能获得所需的浓缩程度。
浓缩步骤可以在任何方便的温度下进行，一般为约20℃-60℃，并且在一定时间内达到所需的浓缩程度。温度及其它条件在一定程度上取决于浓缩所使用的膜设备和所需的溶液中蛋白质的浓度。
在该步骤中，就作为干燥的蛋白分离物回收的浸提蛋白质的比例而言，将蛋白质溶液浓缩为大于约200g/L浓度的浓缩物不仅使该方法的产率增加到大于约40％，优选大于约80％的水平，而且降低了干燥后的最终蛋白分离物中的盐浓度。控制蛋白分离物盐浓度的能力对于蛋白分离物的应用是很重要的，因为盐浓度的变化会影响特定食物应用的功能性和感官性。
众所周知，超滤和相似的选择性膜技术允许低分子量物质通过而阻止高分子量物质通过。低分子量物质不仅包括盐的各种离子，而且还包括从原料中浸提出来的低分子量物质，比如碳水化合物、色素和抗营养因子，以及任何低分子量形式的蛋白质。通常根据不同的膜材料和构造，选择好膜的截止分子量，以保证保留住溶液中相当比例的蛋白质，同时排除污染物。
根据浓缩步骤所处的温度，可以将浓缩蛋白质溶液加热到至少约20℃，并最高到60℃，优选为约25℃-40℃，以降低浓缩蛋白质溶液的粘度而有利于随后的稀释步骤和微粒形成。浓缩的蛋白质溶液不能被加热到超过使浓缩蛋白质溶液不能通过用冷却水稀释形成微粒的温度。如果需要，可以对浓缩的蛋白质溶液进行如上述美国专利号5,844,086和6,005,076中所述的进一步脱脂操作。
随后，经过浓缩步骤和任选的脱脂步骤而得到的浓缩蛋白质溶液通过与冷却水混合而进行稀释，冷却水的体积应达到所需的稀释度，以实现微粒的形成。根据通过微粒途径获得的所需卡诺拉蛋白质比例和从上清液中获得的比例，改变浓缩的蛋白质溶液的稀释度。一般，在较高的稀释水平下，水相中保持有较高比例的卡诺拉蛋白质。
当需要通过微粒途径获得最高比例的蛋白质时，将浓缩的蛋白质溶液稀释约15倍或更少，优选约10倍或更少。
与浓缩的蛋白质溶液混合的冷却水的温度低于约15℃，一般为约3℃-15℃，优选低于约10℃，因为在所用的稀释倍数下，在较低的温度下可以提高蛋白质微粒团形式的蛋白分离物的产率。
在成批操作中，将浓缩的蛋白质溶液分批加入到静体的如上讨论的所需体积的冷却水中。稀释浓缩的蛋白质溶液以及随之的离子强度减少导致高度密集的蛋白分子的云状团形成微粒状的分散的蛋白质微粒。在成批处理工艺中，蛋白质微粒在冷却水体中沉降以形成聚集的、凝聚而稠密的无定形面筋样蛋白质微粒团(PMM)。并且例如可以借助离心进行沉降。上述诱导的沉降可以减少蛋白质微粒团的含水量，由此一般使含水量从占总微粒团的约70％重量-95％重量降低到约50％重量-80％重量。这样，降低蛋白质微粒团的含水量的同时还降低了微粒团中被吸附的盐含量，从而降低了干燥的蛋白分离物的盐含量。
另外，可以通过连续地将浓缩的蛋白质溶液输入T形管的一个入口，同时稀释水流入T形管的另一个入口，使它们在管中混合连续地进行稀释操作。稀释水以足以获得所需稀释度的流速流入T形管。
浓缩的蛋白质溶液和稀释水在管道中混合，引发蛋白质微粒形成，并且该混合物从T形管出口连续地流入沉降器中，当其充满沉降器时，上清液从沉降器中溢出。优选，混合物以能最小化液体湍流的方式流入沉降器中的液体中。
在连续工艺中，蛋白质微粒在沉降器中沉积以形成聚集的、凝聚而稠密的无定形面筋样蛋白质微粒团(PMM)，并且该工艺可以连续地进行直至在沉降器底部积累到所需量的PMM，随之积累的PMM从沉降器除去。
与上述美国专利中所述的任何已知的现有技术中蛋白分离物的生产方法相比，结合使用将蛋白质溶液浓缩为蛋白质含量至少为约200g/L的处理参数和使稀释倍数低于约15可以导致就从原始粗粉浸提物中的蛋白质微粒团形式的蛋白质回收率而言，更高的产率，通常是相当高的产率，以及就蛋白质含量而言获得更纯的蛋白分离物。
与成批处理相比，通过利用连续方法回收卡诺拉蛋白分离物，可以显著地缩短浸提相同的蛋白水平所需的初始蛋白质浸提步骤的时间，以及在高很多的温度下进行浸提步骤。此外，在连续的操作过程中污染的机会比成批处理的少，从而产品的纯度较高并且该方法可以在更简单的设备中进行。
例如可以通过从沉降物中倾析出残余的水相或通过离心的方法将沉降的分离物从残余的水相或上清液中分离。PMM可在湿态应用，或通过任何方便的技术例如喷雾干燥、冷冻干燥或真空锅干燥，干燥得到干品。干燥的PMM具有超过约90％重量的高蛋白质含量，通常至少约100％的重量蛋白质(用Kjeldahl N×6.25计算)，并且基本上没有变性(根据差示扫描量热法测定)。当应用上述美国专利5,844,086和6,005,076的方法时，这种从含有脂肪的油籽粗粉里分离得到的干燥PMM还含有较低的脂肪残存量，可以低于约1％重量。
来自PMM的卡诺拉蛋白分离物主要含有7S卡诺拉蛋白质以及较少量的12S卡诺拉蛋白质和任选的少量的2S卡诺拉蛋白质。一般，PMM含有约60-98％重量的7S蛋白质，约1-15％重量的12S蛋白质约0-25％重量的2S蛋白质。
优选地，PMM含有约88-98％重量的7S蛋白质，约1-10％重量的12S蛋白质约0-6％重量的2S蛋白质。
通过PMM形成以及沉降步骤得到的上清液含有相当量的在稀释步骤中未沉降的卡诺拉蛋白质，并且可以处理该上清液以回收其中的蛋白质。在除去PMM后，浓缩来自稀释步骤的上清液，增加其中的蛋白质浓度。上述浓缩可利用任何方便的选择性膜技术进行，例如使用膜进行超滤，该膜具有适宜的截止分子量，可以允许低分子量物质，包括盐以及从蛋白质原料中浸提出来的其它非蛋白质类的低分子量物质通过该膜，同时将卡诺拉蛋白质保留在溶液中。根据不同的膜材料和构造，可以使用截止分子量为约3000-约10,000道尔顿的超滤膜。
这样，浓缩上清液的同时还降低了回收蛋白分离物所需干燥的液体体积。在干燥前，上清液经浓缩后蛋白质浓度一般为约100-400g/L，优选为约200-300g/L。上述浓缩操作可以按照上述蛋白质溶液的浓缩步骤以分批处理的方式或连续操作的方式进行。
通过任何方便的技术，例如喷雾干燥、冷冻干燥或真空筒干燥，干燥浓缩上清液得到干品，从而提供了另一种卡诺拉蛋白分离物。该另一种卡诺拉蛋白分离物具有超过约90％重量的高蛋白质含量，通常至少约100％重量蛋白质(用Kjeldahl N×6.25计算)，并且基本上没有变性(根据差示扫描量热法测定)。
干燥的上清液主要含有2S卡诺拉蛋白质以及较少量的7S卡诺拉蛋白质和任选少量的12S卡诺拉蛋白质。一般，来自上清液的卡诺拉蛋白分离物含有约60-95％重量的2S蛋白质，
约5-40％重量的7S蛋白质，约0-5％重量的l2S蛋白质。
优选地，来自上清液的卡诺拉蛋白分离物含有约70-95％重量的2S蛋白质，约5-30％重量的7S蛋白质，约0-2％重量的12S蛋白质。
如果需要，在利用任何便利的技术干燥所得混合蛋白流之前，可将至少一部分湿PMM和至少一部分浓缩的上清液混合，得到根据本发明的混合卡诺拉蛋白分离物组合物。可选择蛋白质类物质相互混合的相对比例，从而得到具有所需2S/7S/12S蛋白质分布的最终卡诺拉蛋白分离物组合物。另外，干燥的蛋白分离物可以任何需要的比例混合，以在混合物中获得任何需要的特定的2S/7S/12S蛋白质分布，从而提供根据本发明的组合物。混合的卡诺拉蛋白分离物组合物具有超过约90％重量的高蛋白质含量，通常至少为约100％重量(用Kjeldahl N×6.25计算)，并且基本上没有变性(根据差示扫描量热法测定)。
在另一替代方法中，仅仅部分浓缩上清液与仅仅部分PMM混合，并且干燥所得的混合物，浓缩上清液的残渣可以像PMM的任何残渣那样干燥。另外，干燥的PMM和干燥的上清液可以按如上讨论的任何需要的相对比例混合干燥。
按照该方式进行操作，可以回收得到许多卡诺拉蛋白分离物，它们可以是干燥的PMM、干燥的上清液和来自PMM的卡诺拉蛋白分离物与来自上清液的卡诺拉蛋白分离物的各种重量比例的干燥混合物，该重量比例一般为5∶95-95∶5，这可根据组合物中2S/7S/12S蛋白质的不同比例实现不同功能性和营养性的需求。
作为将浓缩蛋白质溶液稀释到冷却水中并如上所述处理所得沉淀和上清液的替代方案，可以通过透析浓缩蛋白质溶液以减少其中的盐含量，从浓缩的蛋白质溶液中回收蛋白质。浓缩的蛋白质溶液的盐含量的减少导致透析袋中蛋白质微粒的形成。透析后，如上所述沉降蛋白质微粒，收集并干燥。如上所述处理来自蛋白质微粒沉降步骤的上清液，进一步回收其中的蛋白质。可替代地，可以直接干燥透析袋中的内容物。当需要小规模实验量的蛋白质时，后一种替代方法是有用的。
可以通过任何便利的分析技术比如分析分离技术来测定任何指定的蛋白分离物的各个蛋白质的相对质量。这些技术中最常用的是在柱中使用选择性介质，它能根据大小进行分离。对于应用凝胶渗透色谱(GPC)，使用的是球形凝胶材料。当施加压力时，如在高压液相色谱(HPLC)中，那么使用的是刚性介质。后一种技术还被称为大小排阻色谱(SEC)。利用上述技术得到的如上所述制备的卡诺拉蛋白分离物样品的结果包括在下面的实施例中。
质谱(MS)方法可用于鉴定和分析蛋白质样品，包括所述的卡诺拉2S、7S和12S蛋白质。在电喷雾离子化(ESI)质谱中，蛋白质被低能量电子轰击并且检测由碰撞形成的带电碎片或物质。特别是，可以使用基质辅助的激光解吸附离子化(MALDI)质谱仪，其中存在用于分析干燥的材料样品的激光汽化，该样品含有特定分子基质。该基质含有相容的小分子量的有机分子，它能在分析时充分保护生物高聚物从而减少激光撞击能量产生的离子化物质的数量。
从上述蛋白分离物样品得到的数据提示2S蛋白质对ESI-MS的电子轰击不稳定，并易于断裂为许多多肽碎片，它包括4kDa、10kDa和21kDa物质。但是，使用MALDI-MS可以产生完整的2S片断，其分子量接近14,000道尔顿。
来自PMM的蛋白分离物中的7S蛋白质还产生大量的亚10kDa碎片，这提示分子对ESI-MS的电子轰击不稳定。此外，在分析来自PMM的卡诺拉蛋白分离物的7S蛋白质时鉴定出21kDa物质，但在分析来自上清液的卡诺拉蛋白分离物的7S蛋白质时却不存在该物质。
对来自PMM的卡诺拉蛋白分离物的7S蛋白质的ESI-MS分析还显示了分子量从126kDa到166kDa的六种蛋白质，而来自上清液的卡诺拉蛋白分离物的7S蛋白质却在167kDa显示一个大物质。
上述MALDI-MS分析结果显示2S蛋白质的分子量在13,960-14,250道尔顿之间，并且其对弱酸处理有相当的抗性。7S和12S蛋白质含有48,200-48,400道尔顿的基本亚基的相同构件。7S蛋白质具有三个亚基，分子量约为145,000道尔顿，而12S蛋白质含有6个亚基，混合分子量为约290,000道尔顿。酸解7S和12S蛋白质没有产生2S蛋白质并且产生几乎同样的结果，这证实这两种球蛋白来自相同的亚基。
通过任何常规的方法，包括用于较少量蛋白质分析的高压液相色谱(HPLC)和用于较大量的制备型HPLC，从各个蛋白分离物中分离纯化出单独的2S、7S和12S蛋白质。可以使用基于分子量的获得组分的其它方法。一般，从来自上清液的卡诺拉蛋白分离物中分离纯化出2S蛋白质，而从来自PMM的卡诺拉蛋白分离物中分离纯化出7S和12S蛋白质。例如用盐溶液溶解卡诺拉蛋白分离物，然后通过HPLC柱。HPLC分离的蛋白质包含于含有一种蛋白质的洗脱液部分中，通常用超滤来减少洗脱液的体积，随后透析蛋白分离物以减少蛋白质中残留的盐含量。可以干燥已透析的物质而得到干燥的分离且纯化的单个卡诺拉蛋白质。
优选实施方案的描述参看图1，它示意性地图示了制备卡诺拉蛋白分离物的成批处理方法的流程图。卡诺拉油籽粗粉和含水浸提介质经管道10加入浸提器12中，在浸提器中浸提油籽粗粉，形成蛋白质水溶液。蛋白质水溶液和油籽粗粉残渣的悬浮液经管道14送入真空过滤带16，以分离油籽粗粉残渣，该残渣经管道18排出。随后蛋白质水溶液经管道20被送入净化操作室22，蛋白质水溶液在其中离心和过滤以除去细粉，并通过管道24回收细粉。
将净化过的蛋白质水溶液经管道26泵送通过超滤膜28，从而产生作为保留物存在于管道30中的浓缩蛋白质溶液，同时渗透物经管道32回收。浓缩蛋白质溶液被送入含有冷却水的沉降罐34中，通过管道36加入冷却水。在沉降罐34中形成的蛋白质微粒团经管道38除去，并通过喷雾干燥器40得到干燥的卡诺拉蛋白分离物42。
将上清液经管道44从沉降罐34中除去，并且泵送通过超滤膜46，得到作为保留物存在于管道48中的浓缩蛋白质溶液，同时渗透物经管道50被除去。浓缩蛋白质溶液通过喷雾干燥器52得到另一种干燥的卡诺拉蛋白分离物54。
可替换地，在混合物被喷雾干燥器40干燥之前，管道48中的浓缩蛋白质溶液可经管道56输送与蛋白质微粒团混合。
参看图2，它示意性地图示了制备卡诺拉蛋白分离物的连续方法的流程图。卡诺拉油籽粗粉和含水浸提介质分别经管道110和112加入搅拌器114，油籽粗粉和含水浸提介质在其中混合并且混合物经管道116送入混合管118中。在混合管118中，浸提油籽粗粉并且得到蛋白质水溶液。将蛋白质水溶液和油籽粗粉残渣的悬浮液经管道120送入真空过滤带122，以分离油籽粗粉残渣，该残渣经管道124排出。随后将蛋白质水溶液经管道126送入净化操作室128，将蛋白质水溶液在其中离心和过滤以除去细粉，并通过管道130回收细粉。
净化过的蛋白质水溶液经管道132泵送通过超滤膜134，确定膜尺寸使得能获得所需的蛋白质水溶液浓缩程度，从而产生作为保留物存在于管道136中的浓缩蛋白质溶液，同时渗透物经管道138被回收。浓缩蛋白质溶液被送入混合三通管140的入口，同时冷却水经管道142也被送入其中，冷却水的体积足以获得所需的稀释度。所得溶液经管道144流入沉降罐146中以使蛋白质微粒团沉降。在沉降罐146中沉降的蛋白质微粒团不时地经管道148除去，并通过喷雾干燥器150得到干燥的卡诺拉蛋白分离物152。
将上清液经管道154从沉降罐中除去，并且泵送通过超滤膜152，得到作为保留物存在于管道158中的浓缩的蛋白质溶液，同时渗透物经管道160被除去。浓缩的蛋白质溶液通过喷雾干燥器162得到另一种干燥的卡诺拉蛋白分离物164。
可替换地，在混合物被喷雾干燥器150干燥前，管道158中的浓缩蛋白质溶液可以经管道166输送与蛋白质微粒团混合。
实施例实施例1本实施例说明了该方法适于提供本发明的卡诺拉蛋白分离物。
在环境温度下，将‘a’kg商购卡诺拉粗粉加入‘b’L 0.15M的NaCl溶液中，搅拌30分钟得到蛋白质含量为‘c’g/L的蛋白质水溶液。除去卡诺拉粗粉残渣并在真空过滤带上洗涤。所得蛋白质溶液经离心净化，获得蛋白质含量为‘e’g/L的‘d’L净化的蛋白质溶液。
‘f’L蛋白质浸提液等分样品经超滤系统浓缩，体积减少为‘g’L，所使用膜的截止分子量为‘h’道尔顿。所得浓缩蛋白质溶液的蛋白质含量为‘i’g/L。
在‘j’℃下，浓缩溶液被4℃水稀释‘k’倍。立即形成白云状并开始沉降。除去上层稀释水并从沉降罐底部回收沉淀的粘稠团块(PMM)，浸提蛋白质的产率为‘1’％重量。干燥的来自PMM的蛋白质的蛋白质含量为‘m’％(N×6.25)d.b.(使用Leco FP528氮测定仪测定氮的百分含量)。经产品起名为‘n’。
在下表I中列出了五种来自PMM的卡诺拉蛋白分离物的参数‘a’至‘n’
表I
除去的稀释水经利用截止分子量为‘o’道尔顿的膜的超滤系统减少体积，使蛋白质浓度为‘p’g/L。干燥浓缩物。加上从上清液回收的蛋白质，总共回收的蛋白质为‘q’％重量。形成的干燥蛋白质的蛋白质含量为‘r’％重量(N×6.25)d.b.。
产品被起名为‘s’。在下表II中列出了五种来自上清液的卡诺拉蛋白分离物的参数‘o’至‘s’
表II
实施例2本实施例说明了对实施例1中来自PMM和来自上清液的卡诺拉蛋白分离物的分析。
在配有100cm柱和Sephacryl 300 HR介质(Sephacryl 300 HR是葡聚糖聚合物，它用亚甲基双丙烯酰胺进行了交联，这使得可以分离10,000-1,500,000道尔顿大小的球蛋白)的Gradi-Frac(PharmaciaAmersham)蛋白质分离器上洗脱一系列的标准蛋白质源，以测定每种组分的保留时间(RT)，在A280nm处测定，流速为1.0mL/min。调节了pH并含有叠氮化钠作为抗菌剂的盐水溶液用作柱溶剂。将洗脱液收集于放在自动样品固定盘上的试管中，每个试管装5mL液体。根据峰面积计算相关的蛋白质组分，通过最大峰高乘以半峰宽得到峰面积。
采用与Gradi-Frac系统相同的BioRad蛋白质标准品，使用300×7.8mm BioSep S3000大小排阻色谱(SEC)柱运行分析型的Varian高压液相色谱柱(HPLC)，该排阻色谱柱装有直径为5微米、孔径为290的亲水键合的硅胶刚性载体介质，能分离5,000-700,000道尔顿大小的球蛋白。BioRad蛋白质包括了17,000道尔顿(肌肉球蛋白)至670,000道尔顿(甲状腺球蛋白)的蛋白质，并添加了维生素B12作为1,350道尔顿的低分子量标记。在280nm和洗脱速率为1.0mL/min的条件下测定每个组分。调节了pH并含有叠氮化钠作为抗菌剂的盐水溶液用作柱溶剂以及用于溶解干样品。经UV检测后丢弃洗脱液，因为每次操作所需的样品不超过50微升。HPLC Prostar系统自动计算保留时间和峰面积并打印出总结报告。
在上述每种柱上分析如实施例1所述制备的BW-AL-017-B14-02A-C300和BW-AL017-B20-02A-C300来自PMM的卡诺拉蛋白分离物和来自上清液的卡诺拉蛋白分离物。将峰面积转化为每个峰的百分数。计算各次测试的所有峰，然后分别再计算三种主要的蛋白质组分12S、7S和2S。
此外，用由BioRad标准品测得的标准曲线来计算三种蛋白质组分12S、7S和2S的大约分子量，它们由GPC和HPLC得到。Gradi-Frac系统比HPLC系统更具可变性，这是由于较大的样品体积(1毫升∶25微升)和柱直径，手工计算Gradi-Frac结果和操作时间差异(25分钟(HPLC)5小时(Gradi-Frac))。此外，Gradi-Frac系统使用体积作为蛋白质保留的量度而HPLC使用时间作为蛋白质的量度。
在下表III和IV中所示的数据变化反映了上述差异。统计学上HPLC比Gradi-Frac系统更好(较低的可变性)。但Gradi-Frac系统具有能提供可被进一步测试的单独的样品组分(例如使用质谱)的优点，这与HPLC系统不同。
所得结果列于下表中，表III是针对来自PMM的卡诺拉蛋白分离物(CPI)的，表IV是针对来自上清液的卡诺拉蛋白分离物(CPI)的。
表III
基于含有动物蛋白质的BioRad GPC标准的分子量计算。
表IV
基于含有动物蛋白质的BioRad GPC标准的分子量计算。
从表III中所给出的数据可以看出，来自PMM的样品含有大量的7S蛋白质和较少百分比的2S和12S蛋白质。
从表IV可以看出，上清液的卡诺拉蛋白分离物基本上不含有12S蛋白质，而主要的蛋白质是2S蛋白质，还存在一些7S蛋白质。
计算出的12S和7S蛋白质的HPLC分子量较低而2S蛋白质的HPLC分子量较高。这种明显的差异部分地是由于难以用手工精确地标定出GPC的峰的最大值。
GPC计算的12S分子量为385,000道尔顿，这高于文献中报道的卡诺拉cruciferin的分子量300,000-310,000道尔顿。GPC和HPLC计算的7S的分子量相似并接近约为150,000道尔顿的报道值。HPLC估算的2S的分子量高于GPC的平均值，并且它们均低于napin的报道值14,000道尔顿。
从上述数据值可以看出，测试样品中的来自PMM的卡诺拉蛋白分离物含有82-89％(由GPC测定)和94％(由HPLC测定)的7S蛋白质。如上所述，HPLC方法更快捷并且被认为比GPC更精确。根据三种蛋白质组分的面积，认为来自PMM的样品含有约88-98％重量的7S蛋白质，约1-10％重量的12S蛋白质约0-6％重量的2S蛋白质。
类似地，对于来自上清液的样品，根据三种蛋白质组分的面积，认为该类样品合有约70-95％重量的2S蛋白质，约5-30％重量的7S蛋白质，约0-2％重量的12S蛋白质。
所使用的术语“蛋白质组分”是指在HPLC(或GPC)保留时间内的峰面积，根据可接受的GPC/HPLC蛋白质标准品比如购自BioRad，得到上述范围内的计算分子量。这些峰可以含有其它成分，但只要它们在目标分子量可接受的范围内存在，则它们的存在是无关紧要的。
根据该实施例所含的信息，可以接受的分子量为12S300,000-360,000道尔顿7S125,000-160,000道尔顿2S9,000-15,000道尔顿实施例3该实施例显示了一些参数对蛋白质浸提的影响。
在第一组试验中，为了除去残余溶剂，在100℃下低温烘烤卡诺拉油籽粗粉。然后在室温下将已烘烤的50g卡诺拉油籽粗粉样品(LT粗粉)加入500ml 0.05M或0.10M的NaCl溶液中并搅拌15分钟。在5000×g下离心所得淤浆10分钟以完全浸提粗粉。
在第二组试验中，首先在加热板式搅拌器上加热500ml没加盐的水到60℃，然后加入已在100℃下低温烘烤除去残余溶剂的50g卡诺拉油籽粗粉，并在维持60℃的同时搅拌15分钟。通过在5000×g下离心10分钟从耗尽的粗粉中分离出浸提物。
测定了上述试验所得各种蛋白质水溶液的蛋白质浓度，并列于下表V中表V浸提物中的蛋白质浓度(％重量)
由表V的蛋白质浓度数据确定了粗粉的蛋白质可提取度，将该数据列于表VI中表VI蛋白质可提取度(％重量)*
*表示浸提的蛋白质的量占粗粉中的总蛋白质量的百分比。
在实施例2所述的每种HPLC和SEC柱上测试如该实施例所述制备的浸提样品。将峰面积转化为每个峰的百分数。计算各次测试的所有峰，然后分别再计算三种主要的蛋白质组分12S、7S和2S。所得结果表示在图2-4的图谱数据中。
每个色图谱所显示了代表7S卡诺拉蛋白质组分的明显峰以及代表12S卡诺拉蛋白质组分的小凸起。2S卡诺拉蛋白质组分的峰存在于浸提物的其它成分的峰之中。图谱末端的较低的分子量峰没有被完全确定，但可能对应于非蛋白质的含氮化合物，比如短肽和游离氨基酸，以及其它粗粉成分如酚类化合物、硫甙和肌醇六磷酸。
实施例4该实施例阐述了对卡诺拉蛋白分离物样品的分析。
用如实施例2所述对喷雾干燥的卡诺拉蛋白分离物样品进行凝胶渗透色谱处理，这些样品来自按照实施例1所述制备的批次BW-AL017-D29-C200和BW-AL017-D29-C300，获得四种蛋白质组分，将其标记为2S、＞2S、7S和125，2S和可能的＞2S组分代表小的水溶性的白蛋白，以及7S和12S蛋白质代表更疏水的、较少水溶性的球蛋白。
用MALDI质谱分析这些组分和经弱酸处理的样品，并得出下述结果2S组分MALDI-MS分析显示分子量接近14,000道尔顿。观测到峰顶分裂的一个窄频带峰，主要的尖峰在13,960道尔顿和14,250道尔顿之间，相差了2-3个氨基酸，这提示为不同的蛋白质同功酶。
在5％乙酸中酸处理2S组分24小时，没有出现截止分子量下限值为8,000道尔顿的任何较小多肽物质，这提示2S蛋白质对弱酸化有抗性。
＞2S组分对该物质的MS扫描显示了约在13,950-13,990道尔顿处的小峰，这归属为2S蛋白质，以及在13,380-13,410道尔顿的未知来源的主峰。该组分还含有在17,160-17,260道尔顿之间的明显但较低强度的峰，也是未知来源的峰。
在5％乙酸中酸处理后一种组分24小时，仅在13,400道尔顿处的主峰减少，并在约7,000-8,000道尔顿处出现了一些次要成分，这可能是水解产物。2S峰没有表现出减小。
7S组分
对该物质的MS扫描显示了最明显的峰出现在48,150道尔顿和49,950道尔顿之间，主峰在约48,400+/-100道尔顿处。出现了一较低强度且较宽的峰，其分别在约95,940道尔顿和97,7150道尔顿处出现两个尖峰，这提示存在少量的含有两个亚基的蛋白质。在实施例2中进行的分析提示7S蛋白质的分子量约为150,000道尔顿，而这里所作的MALDI分析指示了约为145,000道尔顿的稍低的分子量。
在主要的＞2S组分的峰面积中，在13,420道尔顿而不是在14,000道尔顿出现了次要成分。主要的三重峰出现在16,975道尔顿和17,905道尔顿之间。这些峰可能是来自蛋白质亚基中的主要多肽并且也存在于＞2S组分而非2S组分中。
用1％乙酸酸处理7S组分24小时，残留下在48,310道尔顿处的完整的主要物质和在45,750道尔顿处的较小峰(可能失去了一个小的多肽)。在16,310道尔顿、22,710道尔顿和24,070道尔顿处出现了新的峰，这可能代表水解产物。
用20％的甲酸进一步酸处理7S组分。处理1小时后进行扫描并且在三天后再次用甲酸处理。
处理1小时后，在约26,300道尔顿出现新物质，大约在5％乙酸处理时观测到其它峰。处理3天导致主要亚基(48,260道尔顿)的峰强度降低，并且在16,315道尔顿和17,850道尔顿处出现主峰。
在9,000道尔顿以下扫描发现了在4,490道尔顿、5,720道尔顿、6,530道尔顿、7,030道尔顿和7,330道尔顿处的六个峰的特征谱图，然而在第三天4,490道尔顿的峰明显增加。
12S组分对12S组分进行的MALDI-MS分析产生了中心在48,150道尔顿和48,200道尔顿之间主峰，它代表主要的蛋白质亚基。低场主峰出现在94,960道尔顿，并在64,620道尔顿、77,540道尔顿、126,990道尔顿和143,280道尔顿处出现了其它较低的峰。对于大的分子量峰没有精确地确定，仅能近似地测定其确定其真实的分子量。低场主峰在接近于两倍亚基分子量处，而143,280道尔顿的宽峰在接近于三倍亚基分子量处。
其它明显的峰出现在约13,400道尔顿、16,4000道尔顿、17,900道尔顿和29,000-29,700道尔顿处，这可能是一些组成蛋白质亚基的多肽。
用5％乙酸酸处理12S组分24小时，产生的谱图与7S组分几乎相同并如上所述。三天后用20％甲酸处理，失去了在48,100道尔顿处的亚基而出现了17,900道尔顿的物质。
在9,000道尔顿以下的扫描图谱与20％甲酸酸解1小时后的几乎相同，具有在4,480道尔顿、5,730道尔顿、6,510道尔顿、6,650道尔顿、7,020道尔顿和7,310道尔顿处的六个峰。与7S组分结果不同的是，在第3天甲酸处理后4,480道尔顿的峰没有明显的增大。
根据该实施例报道的MALDI-MS分析结果，可以得出以下结论(a)2S蛋白质的分子量在13,960-14,250道尔顿之间，与公开的接近14,000道尔顿的结果相符，并且2S蛋白质对弱酸处理具有相当的抗性。
(b)7S和12S蛋白质是由在48,200-48,400道尔顿范围内的基本亚基的相同构件构成的。7S蛋白质具有三个亚基的分子量或具有约145,000道尔顿的分子量，而12S蛋白质含有6个亚基，其组合分子量为约290,000道尔顿。这些值低于实施例2中通过GPL和HPLC SEC分子量计算基于动物标准品测得的结果。
(c)酸解7S和12S蛋白质没有产生2S蛋白质。
(d)对这两种球蛋白的酸解的结果几乎相同，这证实了上述两种蛋白质来自同样的亚基。
实施例5该实施例阐述了制备型高压液相色谱(HPLC)。
使用Varian制备型高压液相色谱系统(prep-HPLC)分离卡诺拉蛋白质，使用300×21.20mm Phenomenex BioSep S3000大小排阻色谱(SEC)主柱，其装有直径为5微米、孔径为290的亲水键合的硅胶刚性载体介质。在主柱的前端连有可更换的预柱，其装有同样的填料并且大小为60×21.20mm。
在280nm下检测每种分析物，洗脱速率在6mL/分钟-8mL/分钟之间。在上述流速下没有超过柱压上限1,000psi。含有叠氮化钠的作为抗菌剂的盐水溶液用作柱子的流动相并用于溶解干燥的卡诺拉蛋白质样品。将洗脱液收集于Varian Model 701型组分收集仪中。根据样品的不同，运行时间为12分钟-15分钟。
对于占蛋白分离物干重的2.0％至3.0％之间的样品浓度，样品注射体积为1.0-1.5mL，或每次注射20mg-45mg固体。根据样品类型和浓度，柱载量可以超过1.5mL。先搅拌样品30分钟，然后在10,000rpm离心20分钟。然后让上清液真空滤过最小孔径为0.45微米的膜。
虽然该系统可以24小时连续地运转，但通常不这样操作，因为每天需要涉及乙腈水溶液的清洗步骤来除去柱中的杂质。虽然如此，通常每天可以运行80-100次，收集到0.5-1.2克被分析物。
从来自PMM和来自上清液的卡诺拉蛋白分离物制备样品，蛋白分离物包括下述如实施例1制备的BW-AL-017-D29-02A-C200、BW--AL021-I24-02A-C200、BW-AL021-I30-02A-C200、BW-AL-017-D29-02A-C300、BW-AL021-I24-02A-C300和BW-AL021-I30-02A-C300。
PMM(C300)样品用于收集7S和12S蛋白质，而来自上清液(C200)的样品主要用于收集2S。将组分的等分用Varian分析型SEC-HPLC检测纯度。洗脱液的蛋白质浓度一般低于0.3％重量(N×6.25)或在280nm下低于2.0的吸收单位，并且通过电导率测定，盐含量通常在0.5％重量NaCl-0.7％重量NaCl之间。
实施例6该实施例阐述了对实施例5中收集的组分的超滤和透析。
超滤以及随后的透析均可减少大量的洗脱液体积和高的盐蛋白质比例。来自实施例5中所述的Varian制备型HPLC系统的稀释洗脱液在两个Amicon 8000系列的超滤搅拌池单元中浓缩，每个单元的额定最大容量为400mL。
每个单元装有具有选择性的截止分子量的76mm直径的膜。对于2S蛋白质，所用的膜包括具有再生纤维素的Ultracel Amicon YM1 UF膜(1,000 NMWL(常规分子量截止限)，#13342)和具有再生纤维素的Ultracel Amicon YM10 UF膜(10,000 NMWL，#13642)。
对于较大的7S和12S球蛋白，使用较高NMWL的膜Biomax PBQKUF膜(聚乙烯砜(PES)，50,000 NMWL，#PBQK 07610)或Biomax PBHKUF膜(PES，100,000 NMWL，#PBHK 07610)。
较高NMWL膜导致保留的蛋白质(被称为保留物)出现一些损失，还除去了较低分子量的与蛋白质微弱相连的杂质。较高的截止NMWL还减少了UF的操作时间。通常1,200ml的HPLC样品在两个UF设备上的运行时间为4-5小时。
在常规运行中，将样品加入每个单元中至325mL的刻线处。在搅拌下，液面水平升高到到约375mL。密封设备并加压到60psi，同时搅拌样品。当单元中的保留物降低到约100mL时，释放压力并且向每个设备中再加入样品。该过程连续直至加入全部样品。每个池中的最终保留物被浓缩到75-100mL。
从每个设备中除去洗脱液(称为渗透物)并根据电导率测定盐浓度。通过用紫外-可见光UltraSpec 1000E分光光度计在1cm池中测定的280nm处的吸收值来确定相对的蛋白质含量。计算质量平衡，得出UF膜的使用效率。如实施例2所述，用分析型SEC-HPLC检测UF渗透物和最终保留样品的纯度。
将超滤保留物倒入Spectra/Por 7透析膜(1,000MWCO(截止分子量)，24.2mm直径，#132104)中。每个管被分隔为约300mm。然后将装满的膜放在含有RO水的密封的4升容器中。在透析样品从管中转移出之前换两次RO水，然后将透析样品放于平底盘中于-65℃下冷冻。根据电导率，最终的盐浓度一般低于0.1％重量。
然后将冷冻的样品放于Virtis SRCX-15冻干机中。根据所含的水量，改变干燥时间。从平底盘上取下干燥样品并在分析前称重。
实施例7该实施例阐明了氨基酸分析。
分析了按照实施例5和6所述制备的各个经超滤、透析和冻干的卡诺拉蛋白质2S、7S和12S的氨基酸成分。2S样品来自卡诺拉蛋白分离物AL021-I30-02A C200，而7S和12S蛋白质来自卡诺拉蛋白分离物AL017-D29-02A C300。
氨基酸分析列于下表VII
表VII
注示(1)“游离”氨基酸分子量。
(2)聚合的氨基酸的平均分子量。
表VII中给出的值代表基于每100克干重的氨基酸克数。即使在超滤后，12S样品仍含有残余的盐，这是由于与7S和2S样品相比，该样品中的总氨基酸重量低。将该数据调节为以100g氨基酸为基准，修订的数据显示在下表VIII中
表VIII
e＝11种必需氨基酸aa＝氨基酸*谷氨酸和天冬氨酸通常被酰胺化为谷氨酰胺和天冬酰胺。
从表VIII中可以看出，白蛋白2S蛋白质在不同氨基酸的相对含量方面与球蛋白7S和12S存在差异。虽然列出的大多数氨基酸均存在明显差异，但主要的差异出现在天冬氨酸、谷氨酸、胱氨酸、赖氨酸和脯氨酸。经比较，7S和12S的氨基酸分布几乎相同，并且确实在本测试的标准偏差内。谷氨酸的质量包括谷氨酰胺，并且天冬氨酸的质量包括天冬酰胺。在酸解中谷氨酰胺和天冬酰胺均被脱去了氨基，从而检测到氨基酸。
表VII包括各个氨基酸的分子量。结合单独的质量，给出了2S、7S和12S的“游离”氨基酸的平均分子量，它们均刚好低于135道尔顿。由于蛋白质是脱水氨基酸的生物聚合物(每个多肽除了一个末端氨基酸之外，每个氨基酸均减去一分子水)，还给出了脱水重量的平均分子量。尽管这两种类型的蛋白质之间存在差异，但平均聚合氨基酸分子量几乎相同，约为117道尔顿。这意谓着由MALDI-MS测定的分子量为14kDa的2S含有大约120个氨基酸，由MALDI-MS测定的分子量为145kDa的7S含有大约1,240个氨基酸，12S含有该数量的两倍，即2,480个氨基酸。每个7S/12S亚基含有约413个氨基酸。
表VIII还显示了不能由人体合成的必需氨基酸。这两种蛋白质的11种必需氨基酸的总量十分相似。一种氨基酸的减少被另一种必需氨基酸的增加所平衡。2S中的赖氨酸约是7S和12S中含量的两倍。但是，球蛋白具有较高的芳香族必需氨基酸-酪氨酸和苯丙氨酸总含量，并且除了蛋氨酸和胱氨酸之外，一般来说脂肪族疏水必需氨基酸含量较高。
根据Gibb’s自由能值确定表VIII中氨基酸的疏水性，表示为KJ/100g氨基酸。Gibb’s自由能值列于《食品化学》第三版，由Fennema，Marcel Dekker，New York出版，1996年，330页中。这两种蛋白质无论在疏水性的总重量或是在总能量上基本上没有差异，但是疏水性还取决于多肽的构向而不仅仅是单个氨基酸的化学结构。总之，根据Mieth等人(下表IX)对油籽蛋白质的综述，球蛋白的等电点在接近中性的pH(7.2)处，而2S的等电点高于pH9.0。2S的分子量非常小，而7S和12S明显较大，具有更多的可抵抗水合的潜在的疏水内部区域。
通过计算生物聚合物中氨基酸残基的数量，可以将氨基酸组分转化为氨基酸残基。如前所述，根据MALDI-MS分析，2S含有大约120个氨基酸残基，而7S含有约1,240个氨基酸残基，12S含有约2,480个氨基酸残基。
下表IX将上述氨基酸分析结果转化为2S的氨基酸，并且将该结果与公开的氨基酸残基范围进行了比较。
表IX
e＝11种必需氨基酸 aa＝氨基酸MALDI-MS数据显示2S分子量为约14,000道尔顿，即120个聚合氨基酸。
*谷氨酸和天冬氨酸大多数被酰胺化。
1Monsalve等人，J.Experimental Botany，第41卷，第222期，89-94页，1990年1月。
2Mieth等人，Die Nahrung，27，7，1983，675-697页。
该转化值与公开的结果非常一致。近年来，Monsalve等人(1990，按照表IX)和Gehrig等人，Proc.Nat1.Acad.Sci.USA，第93卷，3647-3652页，1996年4月和Ericson等人，J.Biological Chem.，第261卷，第31期，14576-14581页，1986年11月的文章给出了关于2S和前体分子pro-Napin的详细信息，包括实际的氨基酸序列。
各个氨基酸包括在表IX中的公开文件给出的范围内。列出范围是由于油籽种类的变化，以及还可能由于实验工作报道的较少的水解损失。
虽然关于cruciferin(12S)的报道较少，但是关于该球形卡诺拉蛋白质的已知内容与我们目前的发现很好地吻合。在表X中将氨基酸分析数据转化为氨基酸残基，并与12S蛋白质的公开范围比较。
表X
7S和12S的平均(脱水)分子量计算为116.8道尔顿。
MALDI-MS结果显示7S分子量为145kDa，12S蛋白质为290kDa(实施例4)。因此，7S含有约1,240个氨基酸残基，12S含有其两倍，即约2,480个氨基酸残基。
1Mieth等人，Die Nahrung，27，7，1983，675-697页。
公开的信息来自Mieth等人的对油籽蛋白质的综述(1983年)。该参考文献列出了具体氨基酸残基的范围。本文中给出的数据普遍地与上述给出的范围一致。
作者(Mieth等人)指出12S分子含有6个主要的亚基，每个亚基含有两个分子量约为18,000道尔顿和31,000道尔顿的多肽。该信息也与实施例4给出的MALDI-MS数据一致。
内容总结综上所述，本发明提供了具有独特的2S、7S和12S蛋白质分布的新颖卡诺拉蛋白分离物组合物，还提供了单个的分离纯化的蛋白质。在本发明范围内还可能进行各种改变。
权利要求
1.一种卡诺拉蛋白分离物，其蛋白质含量至少为约90％重量，以干重为基准并且以Kjeldahl氮转换率N×6.25测定，并且其呈现的蛋白质分布为约60-95％重量的2S蛋白质，约5-40％重量的7S蛋白质，和约0-5％重量的12S蛋白质。
2.权利要求1的蛋白分离物，其呈现的蛋白质分布为约70-95％重量的2S蛋白质，约5-30％重量的7S蛋白质，和约0-2％重量的12S蛋白质。
3.权利要求2的蛋白分离物，其蛋白质含量至少为约100％重量。
4.一种卡诺拉蛋白分离物的组合物，其含有(1)第一种卡诺拉蛋白分离物，其蛋白质含量至少为约90％重量，以干重为基准并且以Kjeldahl氮转换率N×6.25测定，并且其呈现的蛋白质分布为约60-98％重量的7S蛋白质，约1-15％重量的12S蛋白质，和约0-25％重量的2S蛋白质，和(2)第二种卡诺拉蛋白分离物，其蛋白质含量至少为约90％重量，以干重为基准并且以Kjeldahl氮转换率N×6.25测定，并且其呈现的蛋白质分布为约60-95％重量的2S蛋白质，约5-40％重量的7S蛋白质，和约0-5％重量的12S蛋白质。
5.权利要求4的组合物，其中在所述的组合物中，所述的第一种卡诺拉蛋白分离物和所述的第二种卡诺拉蛋白分离物以约5∶95-95∶5的重量比存在。
6.权利要求5的组合物，其中所述的第一种卡诺拉蛋白分离物呈现的蛋白质分布为约88-98％重量的7S蛋白质，约1-10％重量的12S蛋白质，和约0-6％重量的2S蛋白质。
7.权利要求6的组合物，其中所述第一种卡诺拉蛋白分离物的蛋白质含量至少为约100％重量。
8.权利要求5的组合物，其中所述第二种卡诺拉蛋白分离物呈现的蛋白质分布为约70-95％重量的2S蛋白质，约5-30％重量的7S蛋白质，和约0-2％重量的12S蛋白质。
9.权利要求8的组合物，其中所述的第二种卡诺拉蛋白分离物的蛋白质含量至少约100％重量。
10.分离并纯化的7S卡诺拉蛋白质。
11.权利要求10的蛋白质，根据MALDI-MS测定其分子量为约145kDa。
12.权利要求11的蛋白质，其含有三个亚基，每个亚基约有413个氨基酸。
13.权利要求12的蛋白质，其具有基本上如表VII或表VIII所列出的氨基酸分析。
14.权利要求10的蛋白质，它是从卡诺拉蛋白质微粒团中分离并纯化得到的。
15.权利要求14的蛋白质，其中所述的蛋白质微粒团是通过在弱酸条件下稀释从卡诺拉油籽粗粉中浸提得到的浓缩的蛋白质的盐水溶液形成的。
16.一种组合物，其含有分离纯化的7S卡诺拉蛋白质与至少另外一种选自2S和12S卡诺拉蛋白质中的分离纯化的卡诺拉蛋白分离物的混合物。
17.一种从含有选自2S、7S和12S中至少两种不同的卡诺拉蛋白质混合物的卡诺拉蛋白分离物中分离纯化单个的卡诺拉蛋白质的方法，其包括提供所述的卡诺拉蛋白分离物，其蛋白质含量至少为约90％重量，以干重为基准并且以Kjeldahl氮转换率N×6.25测定，溶解该卡诺拉蛋白分离物，用制备型的高压液相色谱或等效的方法处理所得的蛋白质溶液，基于分子大小分离蛋白质，收集含有单个所选卡诺拉蛋白质的洗脱液组分，超滤所选组分以减少洗脱液体积，透析浓缩的洗脱液以除去溶解的物质，并且干燥透析产物以回收单个的卡诺拉蛋白质。
18.权利要求17的方法，其中所述的卡诺拉蛋白分离物呈现的蛋白质分布为约60-98％重量的7S蛋白质，约1-15％重量的12S蛋白质，和约0-25％重量的2S蛋白质。
19.权利要求18的方法，其中所述的卡诺拉蛋白分离物呈现的蛋白质分布为约88-98％重量的7S蛋白质，约1-10％重量的12S蛋白质，和约0-6％重量的2S蛋白质。
20.权利要求18的方法，其中所述的卡诺拉蛋白分离物被分离纯化为7S和/或12S蛋白质。
21.权利要求17的方法，其中所述的卡诺拉蛋白分离物呈现的蛋白质分布为约60-95％重量的2S蛋白质，约5-30％重量的7S蛋白质，和约0-2％重量的12S蛋白质。
22.权利要求21的方法，其中所述的卡诺拉蛋白分离物呈现的蛋白质分布为约70-95％重量的2S蛋白质，约5-30％重量的7S蛋白质，和约0-2％重量的12S蛋白质。
23.权利要求21的方法，其中所述卡诺拉蛋白分离物被分离纯化为2S蛋白质。
全文摘要
随同新的卡诺拉蛋白质一起，提供了一种新的卡诺拉蛋白分离物。该新的卡诺拉蛋白分离物是从生产卡诺拉蛋白质微粒团的上清液中得到的，并且主要含有2S蛋白质。来自PMM的卡诺拉蛋白分离物主要含有7S蛋白质。还提供了卡诺拉蛋白分离物的组合物。
文档编号A61K8/97GK1658763SQ03812721
公开日2005年8月24日 申请日期2003年4月15日 优先权日2002年4月15日
发明者J·洛吉伊, R·米拉诺瓦 申请人:伯康营养科学(Mb)公司