专利名称：包含寡肽和醚化环糊精的液体制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及式I的寡肽的水性药物制剂，其包含寡肽和在水中的溶解度大于1.8mg/ml水的醚化β-环糊精，还涉及该水性药物制剂的制备方法。
本发明的制剂中存在的寡肽是式I的环肽环状-(n-Arg-nGly-nAsp-nD-nE)其中D和E各自相互独立地表示Gly、Ala、β-Ala、Asn、Asp、Asp(OR)、Arg、Cha、Cys、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Lys(Ac)、Lys(AcNH2)、Lys(AcSH)、Met、Nal、Nle、Orn、Phe、4-Hal-Phe、homoPhe、Phg、Pro、Pya、Ser、Thr、Tia、Tic、Trp、Tyr或Val，其中所述的氨基酸残基也可以是衍生化的形式，R表示含1-18个碳原子的烷基，Hal表示F、Cl、Br或I，Ac表示含1-10个碳原子的烷酰基、含7-11个碳原子的芳酰基或含8-12个碳原子的芳烷酰基，n表示相应的氨基酸残基的α-氨基官能团上的氢原子或烷基R、苄基或含7-18个碳原子的芳烷基，条件是至少一个氨基酸残基具有表示R的取代基n，并且如果它们是具有光学活性的氨基酸和氨基酸衍生物的残基，则包括D和L构型，及其生理可接受的盐。
式I的寡肽在EP 0770622 A2中有描述。关于式I中存在的氨基酸和取代基的含义以及肽的制备，以该说明书作为参考。
式I的寡肽是整联蛋白抑制剂，特别是可抑制β3-或β5-整联蛋白受体与内源性配体的相互作用。该化合物不仅具有拮抗整联蛋白αvβ3、αvβ5、αvβ6和αIIβ3受体的活性，而且还具有拮抗αvβ1和αvβ8受体的活性。对αvβ3和αvβ6受体的阻断作用在此处尤为重要。此处应特别提及的是它们可防止内源性配体纤维蛋白原对αvβ3受体的兴奋作用。
所述的相互作用特别是可导致对血管生成的抑制作用，这使得所述寡肽适合用于癌症治疗。此处应特别提及的是寡肽西仑吉肽，其是环五肽，化学名称为环状-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-NMe-Val)。西仑吉肽用于治疗癌症疾病已进入II期临床试验。
与其它肽类似，式I的寡肽也优选以水溶液形式经胃肠外施用。因此，为了将其用于治疗，必须制备该寡肽的水溶液。用于该目的的寡肽水溶液应满足特殊的治疗要求，特别是它们应包含治疗所需量的活性成分并具有足够长的贮存期。
治疗肿瘤疾病需要经胃肠外施用较大量的活性成分。由于它们的肽结构，寡肽具有较好的水溶性。但是，治疗所需的较大量的活性成分导致需经胃肠外施用的活性成分溶液的体积较大。这时就不能简单地进行注射，而必须输注给药。
西仑吉肽例如在生理盐水溶液中的饱和溶解度为约19mg/ml，因此，对于治疗应用，可以将其溶解在生理盐水溶液中以15mg/ml的浓度安全地经胃肠外施用。如果例如需要用剂量为1500mg的西仑吉肽进行治疗，则需施用的体积为100ml。该数量级的体积不能简单地进行注射，而必须输注给药，很不方便。
为了降低待施用的各活性成分溶液的体积，需要增加各水溶液中的活性成分含量。与其它肽类似，寡肽的溶解度取决于各溶剂的pH。因此，一种适宜的提高溶解度的方法特别是调整水性溶剂的pH使得在该值下寡肽具有更高的溶解度。然而，达到该目的所需的pH值不在生理范围内，而这一点对于胃肠外施用是至关重要的。此外，与生理pH相差很大的pH通常会加速多肽在水溶液中的降解，这就意味着该类溶液也不具有足够长的贮存期。
大量旨在提高寡肽溶解度的尝试均未达到预期的成功。例如，通过加入生理可耐受的有机溶剂如乙醇或丙二醇来提高西仑吉肽的溶解度的尝试就未获得成功。加入表面活性剂如聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor)和聚山梨酯80同样未能明显提高西仑吉肽的溶解度。尽管柠檬酸、磷酸盐缓冲液和表面活性剂的混合物能使西仑吉肽的溶解度提高，但这些溶液在贮存过程中不稳定。
EP 0149197披露称环糊精醚能提高略溶于水的药物在水中的溶解度。据称此时形成了包合物，药物进入环糊精环状体系的疏水性空穴中。药物能进入空穴的一个先决条件是它们也适合于该空穴。因此，药物还必须不超过某一空间体积。EP 0149197中所提及的所有药物均是低分子量化合物，且在水中的溶解度低。相比之下，此处所述的活性成分是肽，其在水中具有较好的溶解度，另外，其分子量较高因此空间体积较大。
因此，本发明的目的是提供一种适于胃肠外施用、式I的寡肽在其中的含量增加的水性制剂。该制剂不应包含任何毒理学上不可接受的辅剂，并且应在较长时间内保持稳定。
令人惊奇的是，已经发现了满足这些要求的制剂，其为溶液形式，除式I的寡肽之外，其还包含在水中的溶解度大于1.8mg/ml的β-环糊精醚。
本发明的制剂可以在冰箱温度(2-8℃)下、甚至在室温(25℃，相对湿度60％)下稳定贮存至少6个月。令人惊奇的是，本发明的制剂还可以在升高的温度和空气湿度水平下稳定贮存，例如在30℃，相对湿度60％条件下可贮存3个月，在40℃和相对湿度75％条件下可贮存4周。
β-环糊精是一种包含7个葡萄糖单元的α-1，4-键合的环状寡糖，在室温下其在水中的饱和溶解度为1.8mg/ml。β-环糊精的每个葡萄糖(酐)单元均在2-、3-和6-位上含有游离羟基，其中的每一个均可以被醚化。如果将葡萄糖单元上的所有或部分游离羟基用含有一个或多个极性基团、即在水中容易溶解的基团的烷基如例如羟烷基进行醚化，则可形成较纯β-环糊精水溶性提高的醚化β-环糊精。可提高水溶性的适宜的羟烷基是例如羟乙基或羟丙基，可通过使β-环糊精与相应的环氧烷如环氧乙烷或环氧丙烷反应将其引入β-环糊精中。所述的醚取代基优选为羟乙基和/或羟丙基。
水性药物制剂优选包含部分醚化的β-环糊精，即其中仅有部分葡糖酐单元的羟基是醚化形式的β-环糊精。
根据相对于β-环糊精的用于醚化的环氧烷的量，可形成具有不同取代度的醚化β-环糊精。基于醚取代的取代度在下文用摩尔取代度(MS)表达，其表示每摩尔葡萄糖(酐)单元所用的环氧烷的摩尔量。
根据本发明，水性药物制剂中存在的部分醚化的β-环糊精的摩尔取代度为0.2至10。优选摩尔取代度为0.2至2、特别优选摩尔取代度为0.5至0.8、且非常特别优选摩尔取代度为约0.58至0.73的醚化β-环糊精。
本发明的水溶液中存在的寡肽可以是以上通式I所涵盖的任何一种寡肽。水性药物制剂中存在的寡肽优选为环状-(NMeArg-Gly-Asp-D-Phe-Val)、环状-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)、环状-(Arg-NMeGly-Asp-DPhe-Val)、环状-(Arg-Gly-NMeAsp-DPhe-Val)或环状-(Arg-Gly-Asp-NMeDPhe-Val)。特别优选存在西仑吉肽。正如以上已提及的那样，西仑吉肽的化学名称为环状-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-NMe-Val)。
如果由于寡肽和环糊精的渗透压特性导致水性制剂不等张，则还可以存在建立等张性所需量的等张调节剂，优选生理可耐受的盐，如例如氯化钠或氯化钾，或生理可耐受的多元醇或糖，如例如葡萄糖或甘油或甘露醇。
此外，本发明的水性制剂还可以包含其它生理可耐受的辅剂，如例如抗氧剂如抗坏血酸或谷胱甘肽、防腐剂如苯酚、间甲酚、尼泊金甲酯或尼泊金丙酯、氯代丁醇、硫柳汞或苯扎氯铵，或其它稳定剂、赋形剂和增溶剂，如聚乙二醇(PEG)，例如PEG 3000、3350、4000或6000或右旋糖酐。
另外，本发明的水性制剂可以包含缓冲剂，原则上可以使用所有适于将pH调整至所需值的、生理可耐受的物质。所述的任何缓冲物质的浓度为5mmol/l至50mmol/l，优选10至20mmol/l。优选的缓冲剂是柠檬酸盐缓冲剂或磷酸盐缓冲剂。适宜的磷酸盐缓冲剂是磷酸的单-和/或二-钠和钾盐的溶液，如磷酸氢二钠或磷酸二氢钾，以及钠盐和钾盐的混合物，如例如磷酸氢二钠和磷酸二氢钾的混合物。
有利的是，水性制剂的pH为5至8，优选pH为5.6至7.4，特别优选pH为6至7.2。重量克分子渗透浓度优选为250至350mOsmol/kg。因此，水性制剂可基本无痛感地经静脉内或动脉内直接施用。
根据本发明的一项优选实施方案，该水性药物制剂包含20至120mg/ml的西仑吉肽和以重量计15至25％的摩尔取代度为0.5至0.8的羟丙基-β-环糊精。
根据本发明的一项特别优选的实施方案，该水性药物制剂包含约80mg/ml的西仑吉肽和以重量计约20％的摩尔取代度为约0.58至0.73的2-羟丙基-β-环糊精。
该水性制剂可通过将制剂中所含的物质依次溶解在水中来制备。有利的方法是首先将环糊精醚溶解在水中，之后加入寡肽以及任何其它辅剂。因此，本发明还涉及制备本发明的水性药物制剂的方法，其特征在于首先将β-环糊精醚溶解在水中，之后加入活性成分以及任何其它辅剂。
如果必要，将包含特定寡肽、β-环糊精醚和任何其它辅剂的溶液的pH调至5至8。然后将溶液进行无菌过滤。
实施例用于非限制性地阐述本发明。
实施例1以西仑吉肽为例的寡肽的饱和溶解度为了测定饱和溶解度，将寡肽在每种情况下所述的溶剂中、于室温下搅拌1小时。结果如表1所示。
表1
*80mg西仑吉肽在20％2-羟丙基-β-环糊精中的pH7.02结果显示寡肽在水中的饱和溶解度并不因加入醇类乙醇和丙二醇而提高，反而下降。相比之下，酸性范围的各种缓冲剂混合物却能显著提高饱和溶解度。如果向提高寡肽溶解度的酸性溶液中加入表面活性剂，不会使溶解度进一步显著提高。如果不向酸性溶液中加入表面活性剂而是加入甘油，或者除了加入表面活性剂外还加入甘油，甚至观察到溶解度下降。
实施例2选自实施例1的对寡肽具有高的饱和溶解度的组合物的稳定性将选出的西仑吉肽在其中具有高的饱和溶解度的组合物于25℃，相对湿度60％以及40℃，相对湿度75％的条件下贮存8周和26周，并在开始时(初始)和贮存期后用高压液相色谱(HPLC-UV)分析它们的西仑吉肽含量。结果如表2所示。
表2
*表1中的配方**表1的附加配方西仑吉肽浓度为60mg/ml的制剂均不具有足够的稳定性。与纯缓冲溶液相比，加入聚氧乙烯蓖麻油RH 40或聚山梨酯80VS也未产生更好的稳定性。包含15mg/ml西仑吉肽的三种供试制剂显示出显著更佳的稳定性，其中等张NaCl溶液最稳定。
实施例3加入β-环糊精醚后寡肽的饱和溶解度类似于实施例1，以西仑吉肽为例，测定了加入β-环糊精醚(MS 0.63)对寡肽的饱和溶解度的影响。结果如表3所示。
表3
结果显示通过加入β-环糊精醚可显著提高西仑吉肽的溶解度。与实施例1中所试验的添加物不同，溶解度的增加与β-环糊精醚的浓度成正比。
实施例4包含以下组分的水性制剂200mg 2-羟丙基-β-环糊精(MS 0.63)80mg 西仑吉肽注射用水加至1ml搅拌下将所述量的2-羟丙基-β-环糊精溶解在约90％所述量的注射用水中，加入所述量的寡肽，得到澄清溶液后，加入剩余溶剂。将得到的溶液进行无菌过滤，分装至6ml的小瓶中，每个小瓶含2ml溶液，用塞子密封并压盖。
实施例5包含在等张盐水溶液和在β-环糊精醚溶液中的寡肽的制剂的稳定性对比研究用实施例4的制剂和用类似方法制备的包含在等张盐水溶液(0.9％NaCl)中的15mg/ml西仑吉肽的制剂进行稳定性研究。为此，将水性制剂在各种温度下贮存一定的时间并用适宜的分析方法进行分析。对于在水溶液中的寡肽，可能的不稳定性主要表现在形成重排和水解产物。就西仑吉肽而言，分解产物也带有相同的发色团，与起始原料类似，可用HPLC-UV进行测定。结果如表4至6所示。
表4在2-8℃下26周的稳定性数据
*杂质1的限度为最高2％。
表5在25℃/相对湿度60％下26周的稳定性数据
表6在30℃/相对湿度60％下26周的稳定性数据
尽管实施例3的制剂中存在的寡肽浓度比在等张盐水溶液中的制剂高5倍多，但实施例3的包含β-环糊精醚的制剂具有与在等张盐水溶液中的制剂相似的稳定性。
分析检测方法外观如欧洲药典所述，借助于黑色墙映衬下的光源对所制备的制剂目测进行微粒检查。
西仑吉肽的含量和纯度测定用HPLC-UV方法在215nm波长下进行含量和纯度测定。用RP 18相进行分离。所用的洗脱液为pH3.6的缓冲液，其由以相同比例与乙腈混合的磷酸二氢钠和磷酸组成。用添加不同比例乙腈的洗脱液进行梯度洗脱。
权利要求
1.寡肽的水性药物制剂，其包含式I的寡肽环状-(n-Arg-nGly-nAsp-nD-nE) (I)其中D和E各自相互独立地表示Gly、Ala、β-Ala、Asn、Asp、Asp(OR)、Arg、Cha、Cys、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Lys(Ac)、Lys(AcNH2)、Lys(AcSH)、Met、Nal、Nle、Orn、Phe、4-Hal-Phe、homoPhe、Phg、Pro、Pya、Ser、Thr、Tia、Tic、Trp、Tyr或Val，其中所述的氨基酸残基也可以是衍生化的形式，R表示含1-18个碳原子的烷基，Hal表示F、Cl、Br、I，Ac表示含1-10个碳原子的烷酰基、含7-11个碳原子的芳酰基或含8-12个碳原子的芳烷酰基，n表示相应的氨基酸残基的α-氨基官能团上的氢原子或烷基R、苄基或含7-18个碳原子的芳烷基，条件是至少一个氨基酸残基具有表示R的取代基n，并且如果它们是具有光学活性的氨基酸和氨基酸衍生物的残基，则包括D和L构型，及其生理可接受的盐，还包含在水中的溶解度大于1.8mg/ml水的醚化β-环糊精。
2.权利要求1的水性药物制剂，其特征在于所述的醚化β-环糊精为部分醚化的β-环糊精。
3.权利要求1或2的水性药物制剂，其特征在于醚化β-环糊精中的醚取代基为羟乙基和/或羟丙基。
4.权利要求1至3中一项或多项的水性药物制剂，其特征在于醚化β-环糊精的摩尔取代度为0.2至10。
5.权利要求4的水性药物制剂，其特征在于部分醚化的β-环糊精基于醚取代基的摩尔取代度为0.2至2。
6.权利要求4的水性药物制剂，其特征在于部分醚化的β-环糊精基于醚取代基的摩尔取代度为0.5至0.8。
7.权利要求1至6中一项或多项的水性药物制剂，其特征在于寡肽为西仑吉肽。
8.权利要求1至7中一项或多项的水性药物制剂，其特征在于还存在建立等张性所需量的等张调节剂。
9.权利要求1至8中一项或多项的水性药物制剂，其特征在于其pH为5至8，优选其pH为5.6至7.4。
10.权利要求9的水性药物制剂，其特征在于其pH为6至7.2。
11.权利要求1至10中一项或多项的水性药物制剂，其特征在于其包含20至120mg/ml的西仑吉肽以及以重量计15至25％的摩尔取代度为0.5至0.8的羟丙基-β-环糊精。
12.权利要求11的水性药物制剂，其特征在于其包含约80mg/ml的西仑吉肽以及以重量计约20％的摩尔取代度为约0.58至0.73的羟丙基-β-环糊精。
13.制备权利要求1至12中一项或多项的水性药物制剂的方法，其特征在于首先将β-环糊精醚溶解在水中，然后加入活性成分和任何其它辅剂。
全文摘要
本发明涉及一种寡肽的水性药物制剂，其包含式I、即环状－(n－Arg－nGly－nAsp－nD－nE)的寡肽以及在水中的溶解度大于1.8mg/ml水的部分醚化的β－环糊精，还涉及该水性药物制剂的制备方法。
文档编号A61K38/00GK1662250SQ03814927
公开日2005年8月31日 申请日期2003年5月19日 优先权日2002年6月24日
发明者H·林登布拉特, H-P·措贝尔 申请人:默克专利有限公司