专利名称：用于处理伤口的含血浆或血清的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及将血浆或血清作为用于处理伤口的试剂的用途。更具体的说，本发明涉及用于处理伤口的含血浆或血清的药物组合物，以及通过将所述组合物应用于伤口处使受伤部位周围的组织环境正常化而有效处理伤口的方法。
背景技术：
早期对伤口处理的研究 将重点放在密切检查细胞阶段的功能上，即炎性细胞和血小板的作用[Allgower M.和Hulliger L.，Surgery，47603，1960；Dicoreto P.E.和Browen-Pope D.F.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，801919，(1983)；和Houck J.C.等人，Biochem.Pharmacol.，172081，(1968)]。
近年来，促进组织生长的生长因子已经用于处理诸如慢性溃疡等伤口。这些生长因子刺激有丝分裂，即诸如成纤维细胞等细胞的增殖。生长因子还刺激血管发生，导致新血管的向内生长。此外，生长因子还刺激胶原蛋白和胞外基质蛋白质的合成(L.Greenhalgh，J.Trauma，41159，1996)。
已经发现细胞因子是与伤口愈合有关的生长因子。这些细胞因子的代表性实例包括由角质细胞和成纤维细胞产生且促进上皮细胞生长的碱性纤维生长因子；由血小板和内皮细胞及其它细胞类型产生且促进表皮生长因子(EGF)相关性上皮细胞异常增殖的血小板衍生生长因子(PDGF)；由成纤维细胞和血小板产生并促进结缔组织生长的转化生长因子-β(TGF-β)；在唾液腺刺激性腺体中产生且促进上皮细胞增殖的上皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子(FGF)；以及由巨噬细胞和上皮细胞产生并促进上皮细胞生长和移动的白介素-1。Becaplermin是经过遗传改造的重组PDGF，作为Johnson & Johnson公司的局部制剂，是用于处理伤口的商品化试剂，商标是Regranex。EP 0 575 484 B1公开了包含PDGF和地塞米松且用于哺乳动物组织再生和修复的药物组合物。美国专利号5,981,606公开了包含TGF-β且用于处理伤口的药物组合物。WO 96/30038公开了包含TGF-β和纤维酸以及抗氧化剂且用于伤口愈合的药物组合物。美国专利号5,183,805公开了包含EGF且具有组织再生效果的药物组合物。日本专利号05070365和美国专利号6,165,978公开了包含FGF的伤口愈合制剂。
还有报导说利用透明质酸作为活性试剂的制剂有效治疗皮肤溃疡(参阅美国专利号5,897,880)。包含透明质酸钠的制剂由LAM制药公司销售，商品名是IPN Wound Gel。
还有报导说局部应用的纤连蛋白(在血浆中发现的糖蛋白)用于提高角膜损伤(Nishida，Larch Opthalmology，1011046，1983)和腿部溃疡(Wysocki等，Arch.Dermatol.，124175，1988)的伤口愈合速度。
尽管这些处理使某些患者的局部伤口缓减，但是它们需要较长的愈合时间，而且未能展示出对这些治疗的最适应答。当伤口，尤其是慢性皮肤溃疡，转变成严重的临床症状时，已做了很多努力去寻找有效治疗伤口的方法。造成伤口愈合不良的根本原因是复杂的，而且至今对此知之甚少。
因此，需要开发新的和改进的处理伤口的方法。本发明制剂的单独使用或与多种已知治疗剂的联合使用克服了现阶段的限制。
发明概述本发明的发明人已令人惊奇的发现，血浆或血清在伤口的处理中非常有效。我们发现，局部损伤的伤口在施用本发明含血浆或血清的制剂后几天内愈合。我们更惊奇的发现，损伤严重的大面积伤口在施用本发明含血浆或血清的制剂后几周内(大约2-6周)可以愈合。这些发现展示了在治疗应答和愈合时间上都比目前所用或至今所报道的常规疗法或其它疗法有非常显著的改善。
一方面，本发明提供了用于伤口愈合的药物组合物，它包含与药用载体相联合的药物有效量的血浆或血清。
另一方面，本发明提供了处理受试者伤口的方法，包括将含有药物有效量的血浆或血清的药物组合物施用于需要这种治疗的受试者伤口处。
附图简述
图1A是对照组大鼠受伤组织在用蒸馏水处理后第7天的照片(三色染色，用100X放大倍数进行观察)。
图1B是试验组大鼠受伤组织在用依照本发明的液态人血浆处理后第7天的照片(三色染色，用100X放大倍数进行观察)。
图2A是对照组大鼠受伤组织在受伤后未经任何处理的第7天的照片(三色染色，用100X放大倍数进行观察)。
图2B是试验组大鼠受伤组织在用依照本发明的粉状人血浆处理后第7天的照片(三色染色，用100X放大倍数进行观察)。
图3A是对照组大鼠受伤组织在单独使用水溶性软膏基质处理后第7天的照片(三色染色，用100X放大倍数进行观察)。
图3B是试验组大鼠受伤组织在用依照本发明的含人血浆的软膏处理后第7天的照片(三色染色，用100X放大倍数进行观察)。
图4A是对照组大鼠受伤组织在受伤后未经任何处理的第7天的照片(三色染色，用100X放大倍数进行观察)。
图4B是试验组大鼠受伤组织在用依照本发明的粉状胎牛血清(FBS)处理后第7天的照片(三色染色，用200X放大倍数进行观察)。
图5A是对照组大鼠受伤组织在单独使用水溶性软膏基质处理后第7天的照片(三色染色，用100X放大倍数进行观察)。
图5B是试验组大鼠受伤组织在用依照本发明的含FBS的软膏处理后第7天的照片(三色染色，用100X放大倍数进行观察)。
图6A是对照组大鼠受伤组织在用PDGF软膏(Regranex0.01％)处理后第7天的照片(三色染色，用200X放大倍数进行观察)。
图6B是试验组大鼠受伤组织在用依照本发明的含FBS的软膏处理后第7天的照片(三色染色，用200X放大倍数进行观察)。
图7是具有足够深度的伤口的大鼠腹部在用PDGF软膏和依照本发明的含人血浆的软膏处理后第4天和第7天的照片。
图8是二级烧伤在用依照本发明的含FBS的软膏处理后的第1天、第2天、和第4天的照片。
图9显示了依照本发明的一个或多个实施方案处理慢性伤口的流程。
发明详述本发明通常涉及对处理伤口有用的血浆或血清的使用。在依照本发明的药物组合物中用作活性试剂的血浆或血清对于处理伤口是高度有效的。
伤口即活体受伤状态，包括构成活体内外表面的组织切割或破损的病理状态，例如皮肤、肌肉、神经组织、骨、软组织、内部器官、和脉管组织。代表性的伤口包括但不限于挫伤或擦伤、未愈合的外伤伤口、辐射造成的组织损伤、擦破、坏疽、撕裂伤、撕脱、刺伤、枪击伤口、切割、烧伤、冻伤、皮肤溃疡、皮肤干燥病、皮肤角化病、破损、破裂、皮炎、脚癣病、手术伤口、血管病引起的伤口、角膜损伤、疮诸如褥疮性溃疡(pressure sore)和褥疮(bed sore)、糖尿病和循环不畅相关疾病的糖尿病性皮肤糜烂、慢性溃疡、整形手术后的缝合处、脊柱创伤、妇科伤口、化学损伤、和痤疮。活体的任何受损或受伤部分都属于伤口的定义之内。在这方面，依照本发明的含血浆或血清的组合物可用于修补、替换、减轻、加速、促进、治愈、和/或治疗任何受损或受伤组织。
在本发明组合物中用作活性成分的血浆通常指将诸如血细胞和细胞碎片的物质由血液中分离后残留的淡黄色液体部分。血浆的成分在本领域是众所周知的(Philip Westerman，Plasma Proteins，第VII-1至VIII-13，2002年9月17日；和Wendy Y.Craig等人，Plasma Proteins Pocket Guide，Foundation for Blood Research-每一篇完整收入本文作为参考)。血清也有详细的定义，通常称为不含纤维蛋白原和其它凝结因子的血浆。
本发明组合物中所用血浆或血清的来源包括人和哺乳动物物种，例如灵长类动物、啮齿类动物、和诸如绵羊、山羊、猪、马、狗和牛等牲畜。
本发明中所用的血浆或血清可以使用如离心、沉淀、和过滤的常规方法很容易的由血液中获取。在适于血细胞和细胞碎片沉淀的任何条件下进行离心，如以大约3000rpm离心大约10分钟。此条件足以基本清除所有的细胞碎片(血小板)以及红血球和白血球。
上清液血浆可以通过标准技术很容易的与离心后的细胞分离开来。这种分离可以使用过滤使上清液血浆通过合适的滤器来实现。滤器包括蛋白质可以完全穿透的微孔膜。
血浆或血清可以是新鲜的液态血浆，或者是通过全血离心或沉淀获得的液态制剂。此外，已知血浆或血清在使用前以多种形式保存，包括新鲜冷冻制品、冷凝制品、冻干制品、或浓缩制品。所有这些形式的血浆或血清都可用于本发明。新鲜冷冻血浆是通过将血液以约2800rpm离心15分钟分离清除血细胞和细胞碎片并将剩余液体部分于约-18℃至-40℃的温度冷冻而获得的。离心是在采集血液后6小时内进行。使用时，在大约30℃至37℃的温水中融化新鲜冷冻血浆。
冷凝血浆是通过将一个单位的新鲜冷冻血浆于4℃解冻形成白色沉淀物(冷的沉淀蛋白质)(包括大量的因子，诸如VIIIC、纤维蛋白原、XIII、和纤连蛋白)、分离形成的沉淀物、并将其于大约-18℃至-40℃的温度重新冷冻而获得。使用时，将冷凝制品在1℃至6℃温度的冰箱中放置过夜使其融化。可以将它置于大约4℃的水浴中使其融化得更快。浓缩血浆是通过由全血分离血浆、将分离得到的血浆与诸如dextranomer、交联葡聚糖、dextramine、聚丙烯酰胺、BIO-GEL P、硅胶、沸石、DEBRISAN、交联琼脂糖、淀粉、和海藻酸胶等增稠剂混合以使其浓缩、并清除剩余的增稠剂而获得的。
在本发明的某一实施方案中，用于本发明的血浆或血清可以是商品化的，例如购自血库的粉剂制品。这些制品衍生自经过测试不会引发抗原-抗体反应的个人血浆单位，例如对乙肝表面抗原(HBsAg)的抗体和丙肝(HCV)抗体无反应性且对HIV-1和HIV-2病毒的抗体呈阴性。用于制备这些制品的所有血浆或血清单位都证明不含病原体。
为了降低传播传染物的潜在风险，可以用有机溶剂/去污剂混合物处理制品，例如三(正-丁基)/磷酸盐/聚山梨醇酯80设计用于灭活诸如HIV、乙肝、和HCV等包膜病毒。可以通过另外进行纳米过滤步骤来增强病毒的灭活和清除效果。
在另一个实施方案中，可以通过纯化来制备血浆或血清制品，即，使用溶剂去污剂和纳米过滤，或者将液态血浆部分进行巴氏灭菌。或者，可以纯化全血。由此得到的血浆或血清部分可以通过加热、冻干、或其它合适的干燥技术而制成粉剂。只是举例而言，将血浆在低-40℃的温度冷冻干燥数天(如大约7天)。可以使用本领域技术人员知道的任何常规技术和参数。
在本发明的另一个实施方案中，血浆或血清可以是除了粉剂之外的片剂。片剂是通过将血浆或血清置于合适的模板中并使其脱水而产生的。在又一个实施方案中，可以通过将增稠剂或载体掺入血浆或血清部分来提供具有机械强度和/或物理完整性的片剂。
在本发明的一个优选实施方案中，将血浆或血清调至酸性pH。我们发现酸化的血液或血清具有比弱碱性血浆或血清优越的伤口愈合功效。优选的是，血浆或血清具有大约3.5-6.5的酸性pH值。可以使用药用无机或有机酸来酸化血浆或血清。药用无机酸的例子包括但不限于盐酸、硝酸、硫酸、和磷酸。药用有机酸的例子包括但不限于甲酸、乙酸、三氟乙酸、邻苯二甲酸、富马酸、草酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、苯磺酸、和对-甲苯磺酸。
依照本发明，液态或粉剂形式的血浆或血清可以直接施用于伤口，即喷撒在伤口处。片剂形式的血浆可以敷在伤口处，然后适当包扎以保护伤口并防止活性成分的愈合作用减少。任何商品化或常规的伤口敷料都可用于本发明。商品化伤口敷料的例子包括但不限于Compeel、Duoderm、Tagaderm、和Opsite。
联合药用载体且包含药物有效量的血浆或血清的组合物可以通过制药学领域的已知方法配制成多种形式。施用形式包括但不限于常规剂量形式的外用制剂，如液态涂剂、喷雾剂、洗液、乳膏、凝胶、糊剂、擦剂、软膏、气雾剂、粉剂、和经皮吸收剂。用于制备可施用组合物的现行方法对于本领域熟练技术人员而言是已知的或显然的，而且在出版物中有更详细的描述，诸如Remington’s Pharmaceutical Science，第15版，1975年，Mack出版公司，伊斯顿，宾夕法尼亚18042(第87章Blaug，Seymour)，将其内容收入本文作为参考。
在本发明的外用制剂中，可以根据剂量形式选择合适的载体，包括但不限于碳氢化合物，诸如凡士林、液体石蜡、和塑化碳氢化合物凝胶(plastibase)；动物和植物油，诸如中等链长脂肪酸甘油三酯、猪油、固体脂肪、和可可油；高级脂肪酸及其醇和酯，诸如硬脂酸、十六醇、十八烷醇、和棕榈酸异丙基；水溶性基质，诸如Macrogol(聚乙二醇)、1，3-丁二醇、甘油、明胶、白糖、和糖醇；乳化剂，诸如甘油脂肪酸酯、硬脂酸聚烃氧基、和聚氧乙烯/或固化蓖麻油；增稠剂，诸如丙烯酸酯和海藻酸钠；推进剂，诸如液化石油气和二氧化碳；以及防腐剂，诸如对羟苯甲酸酯。本发明的外用制剂可以通过本领域熟练技术人员众所周知的方法用上述载体制备。除了所述载体以外，如果需要，还可以使用诸如稳定剂、色素、着色剂、pH调节剂、稀释剂、表面活性剂、和抗氧化剂等添加剂。本发明的外用制剂还可以通过常规方法施用于局部伤口处。
依照本发明的外用制剂还可用于附着在固体支持物上，诸如伤口覆盖释放层。附着是通过用血浆或血清组分饱和固体支持物并随后将组分脱水而实现的。在本发明的一个实施方案中，首先用附着层包被固体支持物以改进血浆或血清对固体支持物的附着。例示性附着材料包括聚丙烯酸酯和氰基丙烯酸酯。这种制剂有许多商品化产品，包括Smith & Nephew有限公司的在穿孔塑料膜上具有非附着性伤口覆盖释放层的绷带；Johnson &Johnson公司的薄条、小块、斑点、和热塑料带形式的BAND-AID；Kendall公司(Colgate-Palmolive公司的分部)的CURITY和CURAD(“无痛”型绷带)；和American White Cross Labs公司的STIK-TITE(弹性带)。
在一个实施方案中，依照本发明的药物组合物可以配制成液体涂剂制剂，即将粉剂血浆或血清与生理盐水以固定的体积比混合，并将由此产生的混合物的pH值调至3.5-6.5的范围内。在另一个实施方案中，依照本发明的药物组合物可以配制成软膏制剂，即将粉剂血浆或血清与水溶性软膏基质混合，并向由此产生的混合物中添加生理盐水。优选的是，将软膏的pH值调节至3.5-6.5的范围内。
依照本发明，可以使用诸如凝胶或微球体等药用载体来促进伤口的愈合。用作一种或多种药用或化妆用活性物质的载体的多种微球体聚合物描述于美国专利号5,264,207、WO 2000/24378、WO 96/13164、和WO 94/13333，将其内容完整收入本文作为参考。
本发明的药物组合物可用于处理哺乳动物的多种伤口。尤其是，本发明的组合物对于处理非愈合性溃疡是有效的，包括由于感染、恶性肿瘤、大动脉血管功能不全、小动脉血管功能不全、深部静脉堵塞或功能不全、表面静脉功能不全(静脉曲张)、淋巴管阻塞、内循环功能不全、血液异常、胶原血管病、辐射性皮炎、营养原因等等造成的那些溃疡。
可以用本发明的药物组合物处理的具体病症包括辐射性溃疡。放疗(例如在癌症治疗中)常常导致非愈合性皮肤溃疡。这些溃疡因受辐射组织中的循环不良而对常规疗法反应较差，因此常常用低强度激光照射进行处理。辐射性溃疡对于依照本发明的含血浆或血清的组合物的处理反应良好。在本发明的一个实施方案中，将1g剂量的含5％(以重量计)血浆或血清的组合物施用于5cm2表面区域，厚度为大约1.5-2密耳。
本发明的组合物中所包含的血浆或血清的药物有效量指使伤口部位周围的多种细胞激活物质和异常细胞正常化并促进伤口愈合的量。正如本领域技术人员应理解的，根据所处理伤口的类型、所处理伤口的部位、施用的频率和时间、施用的途径和形式、所处理伤口的严重程度、赋形剂的类型、和其它因素，量可能发生变化。
通常，每份剂量施用2-5％(以重量计)的粉剂血浆或血清。施用频率的范围可以是每天两次至每周一次。在一个具体实施方案中，每天用0.01-0.1g/cm2本发明药物组合物处理全面深度缺陷伤口(fullthickness defect wounds)，优选0.02-0.09g/cm2，更优选0.02-0.07g/cm2。
图9显示了用于治疗慢性非愈合性伤口的例示性流程100。如图9步骤110所示，评估缺陷伤口以确定用本发明活性成分进行处理的适合性。这种处理适于全面深度缺陷伤口，诸如糖尿病性溃疡、辐射性溃疡、褥疮、三度烧伤、和其它组织坏疽。这种处理还适于部分深度缺陷伤口(partialthickness defect wounds)，诸如二级烧伤、辐射性皮炎、和擦皮术中受损的组织。
一旦缺陷伤口经鉴定适于依照本发明进行处理，培养伤口(步骤120)以确定是否存在感染。如果需要，清除伤口组织。第4期溃疡需要清创；某些溃疡还需要更深入的手术。当溃疡充满脓液和坏死碎片时，应用dextranomer珠或其它亲水聚合物可能促进组织清除而无需手术。应当开始用镊子和剪刀进行坏死组织的保守性清除。某些清除术可以通过用1.5％过氧化氢清洗伤口来完成。用水进行湿敷(尤其是旋涡水浴)将有助于清除。清除坏死组织后的肉芽形成可能满足覆盖小面积的皮肤移植的要求。
当培养结果是阳性时，因感染而处理伤口(步骤140)。在血浆或血清处理前可以施用含抗生素的湿敷(步骤145)，或者联合抗生素施用含粉剂血浆或血清的制剂(步骤148)。例示性抗生素包括但不限于青霉素酶抗性青霉素或头孢菌素。
当培养结果是阴性时(步骤150)，无需施加抗生素，用本发明的粉剂血浆或血清处理伤口(步骤155)。
在本文所公开的多种制剂之任一种中，将粉剂血浆或血清施用于伤口，并用常规伤口敷料包扎伤口，诸如Compeel、Duoderm、Tagaderm、或Opsite伤口敷料。根据待施用的血浆或血清的量以及由药用载体释放血浆或血清的期望特性，间隔1-5天更换敷料，也可以间隔3-4天进行更换。根据下方组织的受损程度，在短至4天的时间内可观察到部分深度缺陷伤口的愈合，而在短至2-4周的时间内可观察到全面深度缺陷伤口的愈合。
本发明通过下面的实施例得到了更具体的例示。提供下面的实施例是为了例示而非限制本发明。
实施例实施例1液态血浆的制备将证实不含病原体，包括HIV、HCV和乙肝的人新鲜冷冻血浆制品(韩国国家红十字会中央血液中心，汉城，韩国)于30℃解冻，然后以10∶1的体积比与生理盐水混合。边搅动边添加1N HCl或1N NaOH，将由此产生的混合物的pH值调至5.5以提供期望的液态血浆。pH值是使用Orion pH计测量的。
将剩余的血浆制品在冻干瓶、管形瓶、容器或托盘、或其它贮存瓶中冷藏。
实施例2粉剂形式冻干血浆的制备将证实不含病原体，包括HIV、HCV、和乙肝的人新鲜冷冻血浆制品(韩国国家红十字会中央血液中心，汉城，韩国)于30℃解冻。将500ml由此产生的液体血浆置于冻干瓶中，然后于-80℃(低温冰箱，Forma Science公司，俄亥俄州，美国)冷冻8小时。将冷冻瓶安置到冷冻干燥/冻干系统(Labconco Corporation，堪萨斯城，密苏里州，美国)上，并于-48℃冻干7天。所有处理都是在无菌条件下进行的。由500ml液态血浆得到大约30g冻干的血浆粉剂。
实施例3软膏制剂的制备将5g如实施例2中所述制备的血浆粉剂与95g水溶性软膏基质(SAM-A基质，SAM-A Pharmaceutical Ind.有限公司，汉城，韩国)混合。
在由此产生的混合物中边搅动边添加适当量的生理盐水以提供期望的软膏。基于1g基质，软膏基质由下述物质组成38mg鲸蜡、116mg硬脂醇、38mg聚乙二醇4000、192mg浓缩甘油、23mg十六醇、适当量的纯水、9mg月桂基磺酸钠、0.87mg对羟苯甲酸乙基、和0.12mg对羟苯甲酸丁基。
实施例4pH调好的软膏的制备将5g如实施例2中所述制备的血浆粉剂与95g水溶性软膏基质(SAM-A基质，SAM-A Pharmaceutical Ind.有限公司，汉城，韩国)混合。在由此产生的混合物中添加适当量的生理盐水以提供软膏。在软膏中边搅动边添加1N HCl或1N NaOH以提供pH值5.5的软膏。pH是使用Orion pH计测量的。
实施例5粉剂形式冻干血浆的制备将500ml内毒素容量不超过0.1ng/mg且血红蛋白容量不超过30ng/100ml的胎牛血清(FBS，Biofluidsnc公司，罗克维尔，马里兰州，美国)置于冻干瓶中，然后于-80℃温度(低温冰箱，Forma Science公司，俄亥俄州，美国)冷冻6小时。将冷冻瓶安置在冷冻干燥/冻干系统(Labconco Corporation，堪萨斯城，密苏里州，美国)上，并于-48℃温度下冻干7天以提供期望的冻干血浆粉剂。所有处理都是在无菌条件下进行的。
实施例6软膏的制备将5g如实施例5中所述制备的血浆粉剂与95g水溶性软膏基质(SAM-APharmaceutical Ind.有限公司，汉城，韩国)混合。在由此产生的混合物中添加适当量的生理盐水以生成软膏。在软膏中边搅动边添加1N HCl或1N NaOH以提供pH5.5的期望软膏。pH是使用Orion pH计测量的。
实施例7凝胶的制备将5份重量如实施例2中所述制备的血浆粉剂与95份重量的乳剂混合，乳剂由38mg Carbopol ETD 2020、116mg甘油、38mg丙二醇、192mg三乙醇胺、和适当量的纯水组成，以提供pH5.8-6.0的透明凝胶。CarbopolETD 2020是丙烯酸酯和C10-30烷基丙烯酸酯交联聚合物的混合物。
试验实施例1人液态血浆的伤口愈合作用将如实施例1中所制备的依照本发明的人液态血浆施用于全面深度缺陷伤口以进行组织学研究，看它是否促进伤口处的肉芽组织形成。此试验中使用了10只体重300-350mg的成年白色Sprague-Dawley大鼠。
将动物腹部完全去毛，并造成大小为10mm×10mm的全面深度缺陷伤口。在两个上肢附近分别造成两个伤口。同样的，在两个下肢附近分别造成两个伤口。在左侧上下肢处的两个伤口上敷以大小为10mm×10mm且用0.3ml液态血浆pH5.5浸湿的两层纱布。作为对照，在右侧上下肢处的两个伤口上分别敷以大小为10mm×10mm且用0.3ml蒸馏水浸湿的两层纱布。然后在上面放置包扎薄膜(Tagaderm，3M)，将所有四个边用5/0尼龙缝合线缝合使其不会在试验阶段分离。
在试验后的第7天，取出伤口组织。将活检样品在10％中性缓冲福尔马林中固定24小时，并用石蜡包埋。将石蜡包埋的活检样品切成厚度4μm的切片。将切片用苏木精-伊红和Masson氏三色进行染色以显现结缔组织。根据使用图像分析软件(Image专业版3.0，Microsoft)以100×放大倍数获得的显微镜观察结果，测量所产生肉芽组织的宽度。
还测量了只具有新形成血管的肉芽组织层的厚度。新形成血管是那些由组织基部长到上层的血管，即组织中纵向切片的血管。
在切片厚度不均一的情况中，取具有数值列表中间值厚度的那些切片。通过Student’s t检验法对所得到的数值进行统计学分析。
结果显示，试验组的肉芽组织显著比对照组厚。
三色染色揭示了试验组具有很紧密的沉积胶原纤维，而对照组则显示薄胶原纤维的松散分布。在试验组中，在基底部和上层之间建立了密集的肉芽组织新血管，指示肉芽组织生长活跃。相反，对照组则显示只在肉芽组织的基底部发现了一些新血管，指示肉芽组织的活跃发育仍未开始。见图1A和1B。
在显微镜下以40x放大倍数测量肉芽组织的厚度。使用Student’st-检验法对结果进行统计学分析(p＜0.05)。试验组显示168.62μm±16.06，与对照组的59.44μm±14.42显著不同(p＜0.01)。数值表述成平均值±标准偏差(SD)。
试验实施例2人血浆粉剂的伤口愈合作用将如实施例2中所制备的依照本发明的人血浆粉剂施用于全面深度缺陷伤口以进行组织学研究，看它是否促进伤口处的肉芽组织形成。
依照上文试验实施例1中所述的相同方式，在10只成年白色大鼠上造成全面深度缺陷伤口。用0.05g人血浆粉剂处理左侧上下肢的两个伤口。作为对照，右侧的两个伤口不进行处理。然后在纱布区域上面放置包扎薄膜(Tagaderm，3M)，将所有四个边用5/0尼龙缝合线缝合使其不会在试验阶段分离。
在试验后的第7天，依照上文试验实施例1中所述的相同方式，制备染色的肉芽组织切片，随后对其厚度进行组织学观察和测量。结果显示，试验组的肉芽组织显著比对照组厚。
在三色染色中，虽然对照组显示松散分布的薄胶原纤维，但是试验组显示紧密的沉积胶原纤维。试验组肉芽组织中的新血管发育与上文试验实施例1的情况相似，即在基底部和上层之间建立了密集的新血管。见图2A和2B。
在显微镜下以100x放大倍数测量肉芽组织的厚度。使用Student’st-检验法对结果进行统计学分析(p＜0.05)。试验组显示151.62μm±14.24，与对照组的44.24μm±14.32显著不同(p＜0.01)。数值表述成平均值±标准偏差(SD)。
试验实施例3含人血浆的软膏的伤口愈合作用将如实施例3中所制备的依照本发明的含人血浆的软膏施用于全面深度缺陷伤口以进行组织学研究，看它是否促进伤口处的肉芽组织形成。
依照上文试验实施例1中所述的相同方式，在10只成年白色大鼠上造成全面深度缺陷伤口。用0.3g本发明软膏处理左侧上下肢的两个伤口。作为对照，用0.3g SAM-A基质(SAM-A Pharmaceutical Ind.有限公司，汉城，韩国)处理右侧的两个伤口。然后在纱布区域上面放置包扎薄膜(Tagaderm，3M)，将所有四个边用5/0尼龙缝合线缝合使其不会在试验阶段分离。
在试验后的第7天，依照上文试验实施例1中所述的相同方式，制备染色的肉芽组织切片，随后对其厚度进行组织学观察和测量。结果显示，试验组的肉芽组织显著比对照组厚。
在三色染色中，虽然对照组显示松散分布的薄胶原纤维，但是试验组显示紧密的沉积胶原纤维。试验组肉芽组织中的新血管发育与上文试验实施例1的情况相似，即在基底部和上层之间建立了密集的新血管。见图3A和3B。
在显微镜下以100x放大倍数测量肉芽组织的厚度。使用Student’st-检验法对结果进行统计学分析(p＜0.05)。试验组显示164.50μm±17.64，与对照组的54.54μm±10.02显著不同(p＜0.01)。数值表述成平均值±标准偏差(SD)。
试验实施例4和5含胎牛血清的软膏和粉剂的伤口愈合作用为了研究来自非人动物的血浆的伤口愈合作用而进行这些试验。在20只成年白色大鼠腹部造成全面深度缺陷伤口。依照上文试验实施例2中所述的相同方式，用上文实施例5中制备的胎牛血清粉剂处理第一组10只动物。依照上文试验实施例3中所述的相同方式，用上文实施例6中制备的胎牛血清粉剂处理第二组10只动物。
在试验后的第7天，依照上文试验实施例2和3中所述的相同方式，制备染色的肉芽组织切片，随后对其厚度进行组织学观察和测量。结果显示，试验组的肉芽组织显著比对照组厚。
在三色染色中，虽然对照组显示松散分布的薄胶原纤维，但是试验组显示紧密的沉积胶原纤维。试验组肉芽组织中的新血管发育与上文试验实施例2和3的情况相似，即在基底部和上层之间建立了密集的新血管。见图4A、4B、5A和5B。
在显微镜下以100x放大倍数测量肉芽组织的厚度。使用Student’st-检验法对结果进行统计学分析(p＜0.05)。对于胎牛血清粉剂，试验组显示152.62μm±20.86，与对照组的41.20μm±7.44显著不同(p＜0.01)。
对于含胎牛血清的软膏，试验组显示168.62μm±19.26，与对照组的58.62μm±7.62显著不同(p＜0.01)。
数值表述成平均值±标准偏差(SD)。
试验实施例6含胎牛血清的软膏与PDGF软膏之间伤口愈合作用的比较在此试验中，将依照本发明如上文实施例6中所制备的含胎牛血清的软膏的伤口愈合作用与FDA最初批准作为伤口愈合剂的Regranex(PDGF软膏，Johnson & Johnson)的伤口愈合作用进行比较。
依照上文试验实施例3中所述的相同方式，在10只成年白色大鼠上造成全面深度缺陷伤口，只是沿着腹部中线额外造成两个全面深度缺陷伤口。用0.3g本发明软膏处理左侧上下肢的两个伤口，用0.3g Regranex处理右侧上下肢的两个伤口。作为对照，用SAM-A基质(SAM-APharmaceutical Ind.有限公司，汉城，韩国)处理腹部中线的两个伤口。
在试验后的第7天，依照上文试验实施例2中所述的相同方式，制备染色的肉芽组织切片，随后对其厚度进行组织学观察和检测。结果显示，Regranex处理组的肉芽组织比对照组厚，但比试验组薄。此外，Regranex处理组的肉芽组织不紧密。
三色染色揭示了Regranex处理组只产生较少的胶原纤维，与对照组没有差别。相反，试验组则显示与正常真皮一样厚的紧密沉积的胶原纤维，而且分布均匀。对于肉芽组织的新血管而言，Regranex处理组只显示较少的纵向生长血管。相反，试验组显示在基底部和上层之间建立了密集的肉芽组织新血管。见图6A和6B。
在显微镜下以200x放大倍数测量肉芽组织的厚度。使用Student’st-检验法对结果进行统计学分析(p＜0.05)。试验组显示168.62μm±13.41，与Regranex处理组的81.82μm±18.01显著不同(p＜0.01)。数值表述成平均值±标准偏差(SD)。
试验实施例7含人血浆的软膏与PDGF软膏之间伤口愈合作用的比较在此试验中，将依照本发明如上文实施例3中所制备的含人血浆的软膏的伤口愈合作用与Regranex(PDGF软膏，Johnson & Johnson)的伤口愈合作用进行比较。在成年白色大鼠的腹部造成4个全面深度缺陷伤口。作为对照，第一个上部伤口不用任何制剂进行处理，但是进行很好的保护。用0.3g Regranex处理第二个伤口。分别用0.3g含人血浆的软膏分别处理第三个和第四个伤口。
与第一个未处理的伤口和第二个用Regranex处理的伤口相比，用含人血浆的软膏处理的第三个和第四个伤口愈合得更快。图7显示了在开始治疗后第4天和第11天伤口部位的照片。可以看出用血浆处理的伤口(标记为Healadex)在第4天显示愈合开始，而且在第11天伤口几乎愈合。
试验实施例8此试验证实了依照本发明如上文实施例6中所制备的含FBS的软膏对大伤口的愈合作用。用本发明的含FBS的软膏处理二级烧伤(部分深度缺陷伤口)。图8显示了治疗后第1天、第2天、和第4天的愈合程度。在治疗后第4天观察到伤口完全愈合。
权利要求
1.一种用于处理伤口的药物组合物，其包含药物有效量的血浆或血清作为活性剂。
2.依照权利要求1的药物组合物，其中pH在3.5-6.6的范围内。
3.依照权利要求1的药物组合物，其中所述活性剂衍生自牲畜。
4.依照权利要求1的药物组合物，其中它被局部给药。
5.依照权利要求1的药物组合物，其为乳膏，软膏，凝胶，液体，或贴剂形式。
6.依照权利要求1的药物组合物，其中所述伤口包括挫伤或擦伤、未愈合的外伤伤口、辐射造成的损伤、擦破、骨坏疽、裂口、撕裂、刺伤、枪击伤口、切割、烧伤、冻疮、皮肤溃疡、皮肤干燥病、皮肤角化病、破损、破裂、皮炎、皮肤真菌引起的疼痛、外科手术或血管病引起的伤口、角膜损伤、褥疮性溃疡、褥疮、与糖尿病有关的某些病症诸如糖尿病型皮肤病和与循环不畅有关的某些病症、慢性溃疡、整形手术后的缝合处、脊柱创伤、妇科伤口、化学损伤、和痤疮。
全文摘要
本发明涉及用于处理伤口的含血浆或血清的药物组合物，以及通过将所述组合物应用于伤口处使该部位周围的组织环境正常化而有效处理伤口的方法。
文档编号A61K35/16GK1668317SQ03816396
公开日2005年9月14日 申请日期2003年5月9日 优先权日2002年5月9日
发明者李相烨, 张京喜, 琴其昌, 柳来春, 刘元敏, 李津 申请人:医学基因公司