用作抗病毒剂的防卫素的制作方法

专利名称：用作抗病毒剂的防卫素的制作方法
相关申请的交叉引用本申请涉及2002年9月20日提交的美国临时专利申请60/412,414、2002年8月23日提交的60/405,595、以及2002年5月31日提交的60/384,428，出于所有目的，在此并入这些专利中的技术以供参考。
背景技术：
本发明涉及应用防卫素抑制病毒，如HIV。本发明还关于鉴定和应用所述试剂(如小型有机分子、抗体、肽、核酸(如反义核酸和核酶))的方法，其能提高天然存在的防卫素的表达或活性，从而抑制细胞中的HIV；同时，还关于将表达曲线和组合物用于诊断、预防和治疗与HIV相关的感染以及相关的疾病状态，如AIDS。
人免疫缺陷病毒(HIV)感染了全球成百上千万的人，据报导，全球范围内，几乎每个国家都预计有4千万成人和儿童生活在HIV/AIDS的阴影中。在2001年，5百万人新感染上了HIV，并且有3百万成人和儿童死于HIV/AIDS。这些患AIDS的人群中有三分之一的年龄在15-24岁(世界健康组织，2001)。然而，在HIV/AIDS的治疗中，目前应用在治疗疗法中的药物呈现出大量的副作用，包括从头痛、腹泻、疲劳、恶心、刺痛感、腹痛、食欲降低到升高肾功能和肝功能等。此外，现有的用于治疗HIV/AIDS的药物需要持久地进行治疗，经常会诱导药物抗性，不能从体内完全根除所述的病毒。
已知CD8+T淋巴细胞在免疫应答对抗HIV-1感染方面具有重要的作用。使用CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)直接杀死感染HIV的细胞在病毒抑制方面是重要的；由CD8+T淋巴细胞分泌的非细胞毒性、可溶性因子也能够在体外抑制HIV的复制，这在15多年前就已经被发现了。这些非细胞毒性的可溶因子最初被Walker以及他的同事描述为抗病毒因子(CAF)，一种由来自于某些HIV-1感染个体的受激CD8+T细胞分泌的扩散性分子。已经证明，CTL依赖的和CAF相关的抗病毒活性都与高的CD8+T细胞数、增进的临床状态以及长期HIV感染后的长期非进展有关。然而，与CTL不同，CAF的抗病毒活性是非细胞毒性的，不受主要组织相关性复合物1分子或细胞-细胞接触的限制。已证明，来自于感染HIV-1的人体内的受激CD8+T淋巴细胞可以分泌大量的CAF，所述感染HIV-1的人临床状态良好，特别是那些被描述为长期非进展的人(LTNP)(Levy等，Immunol.Today，17217，1996，Cao等，N.Engl.J.Med.，332201(1995)，Barker等，Blood，923105(1998)，以及Mackewicz等，J.Clin.Invest.，871462(1991))。相反，来自进展者(即带有明显免疫缺陷的患者)的受激CD8+T细胞不常分泌CAF。1999年有报导称，当应用一种单克隆抗体来消除CD8+T细胞时，猕猴中SIV复制显著增强(X.Jin等，J.Exp.Med.，189991(1999)和J.E.Schmitz等，Science，283857(1999))。CAF类似活性已经在来自SIV感染的恒河猴、非洲绿猴、HIV-1感染的黑猩猩以及一些非感染健康人类的受激CD8+T细胞的上清液中被检测到了(Kannagi等，J.Immunol.1402237(1998)，Ennen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，917207(1994)，Castro等，Cell.Immunol.，132246(1991)，以及Hsueh等，Cell.Immunol.，159271(1994))。
虽然在过去20年付出了极大的努力，CAF的特性仍然是难以理解的(Levy等，Immunol.Today，17217(1996))。许多研究组试图鉴定CAF，但都没有成功。在1995年，Cocchi等指明，受激CD8+T淋巴细胞可以分泌β-趋化因子(RANTES，MIP-1α和MIP-1β)，其能在体外阻滞HIV-1感染(Science，2701811(1995))。然而，观察到它们的抗病毒活性是对抗趋于感染巨噬细胞的病毒分离物，但不对抗趋于感染T细胞系的菌株。这种两分现象后来因β-趋化因子受体CCR5的发现而被解释，其也用作共同受体使HIV-1进入到CD4+T细胞(Deng等，Nature，381661(1996)，Dragic等，Nature，381667(1996)，Choe等，Cell，851135(1996)，Doranz等，Cell，851149(1996)，以及Alkhatib等，Science，2721955(1996))。因而，显然β-趋化因子可以竞争性阻滞应用CCR5作为共同受体的所谓的R5病毒，而不是应用一种变更的共同抗体CXCR4的所谓的X4病毒(Feng等，Science，272872(1996))。从而一种抗病毒态势清楚地将β-趋化因子从CAF中区分开。此外，某些研究继续显示，CAF的活性不会因移除β-趋化因子或基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)而消除，所述SDF-1α是CXCR4的配体，带有特异的单克隆抗体(Barker等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，951725(1998)，Moriuchi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9315341(1996)，以及Lacey等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，949842(1997))。随后其它的细胞因子呈现出可作为可能的CAF候选物，包括巨噬细胞衍生的趋化因子和白细胞介素-16，但是没有一个经受住了时间的考验(Pal等，Science，278695(1997)，以及Baier等，Nature，378563(1995))。
因而，CAF是一种体外抑制HIV复制的因子，并且由来自未进展到AIDS的感染HIV者的受激CD8细胞分泌的量远远高于进展到了AIDS的人。尽管约在1986年就发现了所述因子的存在，从那时起研究者们不断地进行着研究，但没有人能够确定CAF的特性。因此，研究及医学团体无法开发出依赖于个体自身病毒抑制机制(CAF分泌)的抗病毒疗法。
前述可见，需要进行CAF的鉴定，需要开发出可应用于抑制HIV复制和/或感染的新的治疗方法。本发明实现了这些目的，还实现了其它一些需要。
发明概述现在已经发现，防卫素即α-防卫素1、α-防卫素2以及α-防卫素3，对于CAF的抗病毒活性是重要的。已知嗜中性粒细胞能生成α-防卫素，现在发现CD8+细胞也能生成α-防卫素1、2和3。同时也显示，α-防卫素1、2和3能够在体外抑制HIV在CD4+细胞中的复制。此外，已经发现，α-防卫素1与α-防卫素2或α-防卫素1与α-防卫素3的结合应用比单独应用显示出更高的HIV抑制活性。
本发明部分基于发现防卫素(如α-防卫素和β-防卫素)具有抗病毒活性，并且能够用于治疗患者的病毒性疾病。特别的，也发现防卫素(如α-防卫素)与CD8的抗病毒活性特别是抗HIV活性有关。并且，已经发现，两种防卫素的结合(如α-防卫素1与α-防卫素2)与单一的应用相比具有显著的活性增强作用。因此，本发明提供了药物组合物、预防和治疗方法、诊断和预后方法及试剂盒，以及利用防卫素的抗HIV活性的药物筛选方法。
伴随着防卫素被发现与CAF活性相关，本发明提供了防卫素在HIV治疗疗法中的应用。比如，将防卫素预防性或治疗性地给予人体，用于预防或治疗HIV感染。预防性的治疗对于HIV感染高危人群是特别有用的。本发明提供了抑制HIV在人体复制的方法，通过给予人体药物有效量的防卫素，如α-防卫素，优选地，施用至少两种防卫素，如两种α-防卫素。在某些实施方案中，所述防卫素可以是被修饰的形式，如作为融合蛋白的一部分，所述融合蛋白包含防卫素部分以及另一个多肽部分，所述多肽部分在体内可通过如靶向CD4+细胞、促进稳定性或生物利用度等来增强防卫素的效果。本发明还提供了药物组合物，在一种药学上可接受的载体中包含一种或多种防卫素或其修饰形式。在另一个实施方案中，抑制HIV复制的方法涉及向个体施用一种可激活CD8+细胞的组合物，当其被刺激时生成防卫素，如α-防卫素。
在另一个实施方案中，将CD8+细胞先体外后体内(ex vivo)扩展，并检测防卫素的生成。然后，将能够生成防卫素的细胞导入到人体用于预防或治疗。
本发明也提供了涉及防卫素基因治疗的方法。在一个实施方案中，一种包含可编码防卫素或其修饰形式或至少两种防卫素的核苷酸序列的核酸被给予人体。然后所述核酸进入到细胞并被转录和翻译，生成防卫素多肽。此外，所述核苷酸序列可以编码α-防卫素、β-防卫素或它们的修饰形式，或可施用至少编码两种防卫素的核酸。在另一个涉及基因治疗应用的实施方案中，用编码防卫素(如α-防卫素)的核酸先体外后体内转染细胞(如CD8+细胞)，以使被转染的细胞生成防卫素，并将被转染的细胞导入到受试者。
前述以及这里所描述的抑制HIV复制的方法可应用于体外培养的细胞。因此，本发明的方法同时包括体内和体外应用。
长期非进展者比那些AIDS进展者表达明显多量的防卫素如α-防卫素，这可用于测定某人的HIV感染状态。也就是说，通过检测来自某人的样品(如血清、尿液、血液或其它体液)中的防卫素量，测定其高于或低于某一量，可以确定该人的HIV感染状态，确定其是否向AIDS进展。α-防卫素的量高于某一给定量(如，存在于大多数AIDS患者中的平均量)说明其可能保持没有进展到AIDS，当低于所述量时说明其可能进展到了AIDS。可基于所获得的信息制定治疗方案，对于进展者给予更积极的抗HIV治疗。在一个实施例中，从患者中分离CD8+细胞，体外刺激，测定防卫素分泌水平。可选择地，可以检测样品中防卫素mRNA(或cDNA)的量，如α-防卫素mRNA，确定其高于或低于某一量。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于检测一种或多种防卫素的试剂盒。此外，所述试剂盒对于本发明的预后方法是有用的。所述试剂盒通常包含一种底物，含有用于捕获一种或多种防卫素的物质，如衍生化或用抗防卫素抗体可衍生化的微量滴定板或SELDI质谱生物芯片探针；或带有结合防卫素的色谱表面的SELDI质谱生物芯片探针(如，来自Ciphergen Biosystem公司的WCX或IMAC ProteinClip阵列，弗里蒙特，CA)。所述试剂盒也可包括第二标记抗体，用于夹心免疫测定和/或指示，以检测防卫素，将检测到的防卫素量与可能的HIV感染状态预后和/或AIDS发展相关联。
对防卫素抑制HIV复制的认识为找寻调节防卫素活性的化合物提供了指导。因此，本发明提供了药物筛选试验。在这些试验中，将可生成防卫素的细胞(如CD8+细胞)与被测化合物接触，检测该化合物对防卫素的mRNA、多肽生成的影响或生物活性的变化。通过该方法被发现的药物可作为药物施用，用于预防或治疗HIV感染。
本发明还提供了检测可结合到防卫素的多肽的方法。所述多肽可以是涉及防卫素活性机制的配体。所述方法包括将细胞与防卫素接触。然后，将来自细胞的防卫素以及结合到其上的多肽捕获在固相上，并进行检测。在另一个实施方案中，防卫素被固定在固相上，将细胞内容物与之接触，接着进行检测。
在一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含一种防卫素多肽和一种药学上可接受的载体。在一个实施方案中，所述防卫素是一种α-防卫素多肽，选自α-防卫素1、α-防卫素2以及α-防卫素3。
在另一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含一种防卫素多肽和一种药学上可接受的载体，其中，所述组合物包含至少两种α-防卫素多肽，选自α-防卫素1、α-防卫素2以及α-防卫素3。
在另一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含一种防卫素多肽和一种药学上可接受的载体，其中，所述组合物包含至少两种α-防卫素，选自α-防卫素1和α-防卫素2。
在另一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含一种防卫素多肽和一种药学上可接受的载体，其中，所述组合物是一种α-防卫素多肽，并且所述组合物包含α-防卫素1、α-防卫素2以及α-防卫素3。
在另一个方面，本发明提供了一种在人体内治疗HIV感染的方法。所述方法包括给予人体一种防卫素多肽。在一个实施方案中，所述防卫素多肽是一种α-防卫素多肽，选自α-防卫素1、α-防卫素2以及α-防卫素3。在第二个实施方案中，治疗HIV感染的方法还包含施用第二种α-防卫素多肽。所述第二种α-防卫素多肽选自α-防卫素1、α-防卫素2以及α-防卫素3。
在另一个方面，本发明提供了一种在人体内治疗HIV感染的方法，其中，所述方法包括给予人体治疗有效量的α-防卫素1和α-防卫素2。
在另一个方面，本发明提供了一种方法，包含向HIV感染高危个体施用预防量的防卫素多肽。在一个实施方案中，所述防卫素多肽是一种α-防卫素多肽，选自α-防卫素1、α-防卫素2以及α-防卫素3。在第二个实施方案中，所述方法还包含向HIV感染高危个体施用第二种α-防卫素多肽。所述α-防卫素多肽选自α-防卫素1、α-防卫素2以及α-防卫素3。在第三个实施方案中，所述α-防卫素多肽是α-防卫素1和α-防卫素2。
在另一个方面，本发明提供了一种在正在培养的CD4+细胞中抑制HIV感染的方法。所述方法包括将所述细胞与一种防卫素多肽接触的步骤。在一个实施方案中，所述防卫素多肽是一种α-防卫素多肽，选自α-防卫素1、α-防卫素2以及α-防卫素3。在第二个实施方案中，所述方法还包含将细胞与第二种α-防卫素多肽接触，所述α-防卫素选自α-防卫素1、α-防卫素2以及α-防卫素3。
在另一个方面，本发明提供了一种组合物，在一种药学上可接受的载体中包含一种编码第一防卫素多肽的第一核酸。
在另一个方面，本发明提供了一种组合物，在一种药学上可接受的载体中包含一种编码第一防卫素多肽的第一核酸，以及一种编码第二防卫素多肽的第二核酸。在一个实施方案中，所述第一和第二防卫素多肽选自α-防卫素1、α-防卫素2以及α-防卫素3。在第二个实施方案中，所述第一和第二防卫素多肽是α-防卫素1和α-防卫素2。
在另一个方面，本发明提供了一种在人体内抑制HIV感染的方法，包含用一种包含编码防卫素多肽核苷酸序列的核酸转染细胞。
在另一个方面，本发明提供了一种在人体内抑制HIV感染的方法，包含用一种包含编码防卫素多肽核苷酸序列的核酸转染细胞，其中，所述的防卫素多肽是一种α-防卫素多肽，选自α-防卫素1、α-防卫素2以及α-防卫素3。在一个实施方案中，所述细胞是肌细胞。在第二个实施方案中，所述细胞是AC133+或CD34+祖细胞。在第三个实施方案中，所述细胞是AC133+或CD34+祖细胞，且转染先体外后体内进行。
在另一个方面，本发明提供了一种在人体内抑制HIV感染的方法，包含用一种包含编码防卫素多肽核苷酸序列的核酸转染细胞，其中，所述核酸包含一种可诱导性启动子，操作性地连接到所述编码防卫素的核苷酸序列上。
在另一个方面，本发明提供了一种测定个体HIV状态的方法。所述方法包括检测来自所述个体的样品中的α-防卫素的量。在一个实施方案中，所述方法还包含将防卫素的量与至少一种其它指标相关联，所述指标包括HIV感染状态下的CD8+细胞计数、CD4+细胞计数、HIV病毒负载、总T细胞计数。在第二个实施方案中，所述α-防卫素通ELISA或质谱法(如MALDI或SELDI)来检测。在第三个实施方案中，所述α-防卫素选自α-防卫素1、α-防卫素2以及α-防卫素3。
在另一个方面，本发明提供了一种测定个体HIV状态的方法。所述方法包括检测来自所述个体的样品中的α-防卫素mRNA的量，并将该量与HIV感染状态相关联。
在一个实施方案中，所述α-防卫素mRNA选自α-防卫素1mRNA、α-防卫素2mRNA以及α-防卫素3mRNA。
在另一个方面，本发明提供了一种用于测定一种化合物是否在细胞中调节α-防卫素活性方法。所述方法包括将一种可生成α-防卫素的细胞与所述化合物接触，测定所述化合物对于α-防卫素活性的功能性影响。在一个实施方案中，所述细胞选自嗜中性粒细胞、CD8+细胞和上皮细胞。在第二个实施方案中，通过测定防卫素表达水平、细胞增殖或HIV复制来确定所述的功能性影响。在第三个实施方案中，所述化合物是一种小型有机分子。在第四个实施方案中，所述α-防卫素选自α-防卫素1、α-防卫素2以及α-防卫素3。
在另一个方面，本发明提供了一种抑制HIV感染的方法，包含给予人体一种可在细胞中激活防卫素活性的化合物，所述细胞如CD8+细胞。在一个实施方案中，所述化合物通过这里所描述的方法来鉴定，以确定一种化合物是否能够在细胞中调节α-防卫素的活性。
在另一个方面，本发明提供了一种方法，包含将细胞与α-防卫素接触，将固定的抗α-防卫素抗体与细胞溶解产物接触，由此，来自细胞的α-防卫素被结合到固相上，并检测结合到固定的α-防卫素上的蛋白。在一个实施方案中，所述细胞是CD4+细胞、HeLa细胞、HOS细胞或2B4细胞。在第二个实施方案中，所述α-防卫素多肽选自α-防卫素1、α-防卫素2以及α-防卫素3。
在另一个方面，本发明提供了一种方法，包含将细胞与α-防卫素接触，将固定的抗α-防卫素抗体与细胞溶解产物接触，由此，结合到α-防卫素的蛋白被捕获，并检测结合到固定的α-防卫素的蛋白。在一个实施方案中，所述细胞是CD4+细胞、HeLa细胞或HOS细胞。在第二个实施方案中，所述α-防卫素多肽选自α-防卫素1、α-防卫素2以及α-防卫素3。
在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒。所述试剂盒包含一种底物，其中含有可结合抗体的物质；一种抗α-防卫素多肽的抗体；以及将在患者样品中测得的α-防卫素的量与AIDS的预后相关联的指导。在一个实施方案中，所述底物是一种质谱探针。在第二个实施方案中，所述底物是一种微量滴定板。在第三个实施方案中，所述试剂盒还包含一种第二抗体，可特异性抗α-防卫素1、α-防卫素2和α-防卫素3。在第四个实施方案中，所述第二抗体是被标记的。
在另一个方面，本发明提供了另一种试剂盒。所述试剂盒包含一种可结合α-防卫素多肽的底物，以及将在患者样品中测得的α-防卫素的量与AIDS的预后相关联的指导。
在另一个方面，本发明提供了另一种试剂盒，所述试剂盒包含可特异性结合到一种α-防卫素的第一抗体，以及可特异性结合到α-防卫素1、α-防卫素2或α-防卫素3的第二抗体。
在另一个方面，本发明提供了一种α-防卫素融合蛋白，包含第一α-防卫素多肽部分以及可结合CD4+细胞的第二部分。
在另一个方面，本发明提供了一种α-防卫素融合蛋白，包含第一α-防卫素多肽部分以及第二信号肽部分(如TPA信号肽)。
在另一个方面，本发明提供了一种包含编码α-防卫素融合蛋白的核苷酸序列的核酸，所述融合蛋白包含第一α-防卫素部分以及第二信号肽部分(如TPA信号肽)。
在另一个方面，本发明提供了一种α-防卫素融合蛋白，包含第一α-防卫素多肽部分以及能提高体内稳定性或生物利用度的第二部分。
在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含一种PEG化的α-防卫素多肽和一种药学上可接受的载体。
在另一个方面，本发明提供了一种α-防卫素，包含可删除蛋白水解切割位点的氨基酸取代，或可提高防卫素生物利用度和/或生物活性的氨基酸取代。
在另一个方面，本发明提供了一种提高内源性α-防卫素生成的方法，包含给予一种可激活CD8+细胞的组合物。在一个实施方案中，所述组合物包含抗CD3和其它T细胞活化剂。
在另一个方面，本发明提供了一种方法，包括先体外后体内扩展CD8+细胞，检测由CD8+细胞生成的α-防卫素，将所述CD8+细胞给予HLA匹配人群。
在另一个方面，本发明提供了一种方法，包含将一种疫苗以及一种α-防卫素多肽或一种编码α-防卫素的核酸给予人体。
在另一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含一种疫苗以及一种α-防卫素多肽或一种编码α-防卫素的核酸。
在另一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含一种α-防卫素和一种第二治疗剂或试剂。在一个实施方案中，所述第二治疗剂被用于预防或治疗HIV感染。在另一个实施方案中，所述第二治疗剂被用于治疗与HIV感染相关的机会感染。在另一个实施方案中，所述第二治疗剂是蛋白酶抑制剂、非核苷反转录酶抑制剂、核苷反转录酶抑制剂、融合抑制剂、抗逆转录病毒核苷、进入抑制剂、或任何其它对于抑制或治疗HIV感染有效的抗病毒剂。在另一个实施方案中，所述第二治疗剂选自齐多夫定、地达诺新、司他夫定、干扰素、拉米呋啶、阿德福韦、奈韦拉平、地拉韦啶(delaviridine)、洛韦胺、沙奎那韦、茚地那韦、AZT、T20、T22以及T2。在另一个实施方案中，所述的第二治疗剂是一种抗生素或无环鸟苷。在另一个实施方案中，所述的α-防卫素选自α-防卫素1、α-防卫素2以及α-防卫素3。在另一个实施方案中，所述组合物包含两种或多种α-防卫素。在另一个实施方案中，所述的α-防卫素是α-防卫素1、2或3蛋白，编码所述α-防卫素蛋白的核苷酸序列，融合蛋白，或编码所述融合蛋白的核苷酸序列。
在另一个方面，本发明提供了在人体内治疗或预防HIV感染的方法，包含给予人体一种防卫素多肽以及一种第二治疗剂。在一个实施方案中，所述第二治疗剂被应用于预防或治疗HIV感染。在另一个实施方案中，所述第二治疗剂被应用于治疗HIV感染相关的机会感染。在另一个实施方案中，所述第二治疗剂是蛋白酶抑制剂、非核苷反转录抑制剂、核苷反转录抑制剂、融合抑制剂、抗逆转录病毒核苷、进入抑制剂、或任何其它对于抑制或治疗HIV感染有效的抗病毒剂。在另一个实施方案中，所述第二抑制剂选自齐多夫定、地达诺新、司他夫定、干扰素、拉米呋啶、阿德福韦、奈韦拉平、地拉韦啶(delaviridine)、洛韦胺、沙奎那韦、茚地那韦、AZT、T20、T22以及T2。在另一个实施方案中，所述的第二治疗剂是一种抗生素或无环鸟苷。在另一个实施方案中，所述的α-防卫素选自α-防卫素1、α-防卫素2以及α-防卫素3。在另一个实施方案中，所述组合物包含两种或多种α-防卫素。在另一个实施方案中，所述的α-防卫素是α-防卫素蛋白、编码所述α-防卫素蛋白的核苷酸序列、融合蛋白、或编码所述融合蛋白的核苷酸序列。
在另一个方面，本发明提供了一种在正在培养的CD4+细胞中抑制HIV感染的方法，包含将所述细胞与一种防卫素多肽以及一种第二治疗剂或其它治疗剂的组合接触的步骤。在一个实施方案中，所述治疗剂或试剂被应用于治疗或预防HIV感染，在第二个实施方案中，所述治疗剂选自蛋白酶抑制剂、非核苷反转录抑制剂、融合抑制剂、核苷反转录抑制剂、抗逆转录病毒核苷、进入抑制剂、或任何其它对于抑制或治疗HIV感染有效的抗病毒剂。在第三个实施方案中，所述治疗剂选自齐多夫定、地达诺新、司他夫定、干扰素、拉米呋啶、阿德福韦、奈韦拉平、地拉韦啶(delaviridine)、洛韦胺、沙奎那韦、茚地那韦、AZT、T20、T22以及T2。
附图简述

图1来自受激和非受激的CD8T细胞的培养上清代表蛋白质谱图，所述细胞获自两位LTNR，一位正常个体以及一位进展者。在刺激后蛋白峰的上调是明显的，并且它们的质量是标示的。
图22(a)应用包被了抗α-防卫素-1、2、3的抗体的珠，根据蛋白峰识别出人α-防卫素2、1和3的分子质量为3,371.9Da、3,342.5Da、以及3,486.5Da。2(b)应用非串联质谱仪，在胰酶消化后，对独特的1060.50Da的肽片断进行测序(上右)。观察到由撞击诱导的1060.50Da母离子的解离。NCBI和SwissProt数据库的ProteinProspector MS-Tag检索显示，来自α-防卫素-1、2、3的肽片断YGTCIYQGR(突出显示在上左)最匹配1060.50Da的母离子，具有49的Probability Based MowseScore(Matrix Science的Mascot软件)。接下来的最接近匹配(β-半乳糖苷酶前体，76，091Da)的分数却只有17。在该分析中，Mowse分数超过38可认为鉴定阳性或非常同源。
图3(a)在从LTNP-3和LTNP-5培养上清中消除α-防卫素1、2和3之前(固态)和之后(孵育后)，抗X4和R5 HIV-1的抗病毒活性图。病毒分离物的名称如图显示，HIV-1的基因型显示在圆括号中。误差条图指明两个独立实验平均值的标准差。3(b)在不断增加抗α-防卫素1、2和3(左图)抗体的量、或抗α-防卫素1、2和3抗体与抗β-趋化因子抗体组合物(右图)的量的情况下，来自LTNP-3和LTNP-5的受激CD8T细胞的培养上清的抗病毒活性。
图4商业可用的α-防卫素1和2肽(左图)和纯化的α-防卫素1、2和3(右图)的抗HIV-1活性。每张图中位于右下角的非连接符号表示当也加入抗α-防卫素单克隆抗体时(25μg)，最高浓度的α-防卫素的抗病毒活性。
图5在人嗜中性粒细胞以及非受激和受激的CD8T淋巴细胞中，α-防卫素1、2和3的免疫荧光印迹。按照所描述的步骤进行(33)，α-防卫素标记为绿色，CD8蛋白为红色，细胞核为蓝色。
图6用二硫苏糖醇(DTT)还原前和还原后，分子质量/电荷的变化。
图7α-防卫素1和2商用制剂与来自正常个体-2的受激CD8 T细胞上清的α-防卫素的质谱图的比较。
图8从正常人嗜中性粒细胞中纯化得到的α-防卫素1、2和3实际上与那些从受激的CD8T细胞释放的α-防卫素是无法区分的。
图9在受激后的0、1和2天，表达α-防卫素的αβCD8 T细胞的数量。Y轴显示测得的事件数目。
图10已知的来自人、小鼠、大鼠、豚鼠和兔的α-防卫素的比对。
发明详述A.纵览本发明提供了新的组合物、测定法、试剂盒，以及预防、治疗、诊断和预测病毒感染(如HIV感染)、杀死病毒感染细胞(如被HIV感染的细胞)，以及一般地，抑制病毒特别是HIV病毒的复制的方法。本发明部分基于惊人地发现了天然的防卫素在感染HIV疾病的个体中以高的水平存在，所述个体的疾病状态没有进展到AIDS，尽管感染10年但与感染HIV并具有AIDS的人不同，并且天然存在的防卫素在那些虽然长期感染但没有完全发展为AIDS的个体中可阻止HIV的复制。因此，本发明部分基于惊人地发现无论通过外源给药的还是通过内源生成，当防卫素或其片断的水平在个体中提高时，可抑制HIV感染，杀死被HIV感染的细胞和/或阻止HIV感染。
本发明提供了在个体中提高外源性防卫素水平的方法，通过向HIV感染者或HIV感染高危个体施用治疗化合物，如防卫素蛋白(合成的、重组的或天然存在的)、防卫素核酸，以及包含一种或多种防卫素的药物组合物。
本发明还提供了抑制HIV感染或复制的方法，通过提供提高内源防卫素活性的各种方法来实现。比如，本发明提供了用于识别防卫素活性的调节剂的试验。所述防卫素活性的调节剂对于在体内提高内源防卫素以抑制HIV感染和复制是有用的。
本发明还提供了确定感染HIV个体的预后的方法。通过检测个体中内源防卫素的水平(如嗜中性粒细胞中的防卫素水平)，可对个体中的HIV感染是否进展到AIDS作出结论。所述的结论有助于给予药物、治疗策略以及治疗期限的选择。
本发明还提供了包含一种防卫素多肽和一种药学上可接受的载体的组合物，所述药学上可接受的载体用于递送到感染HIV或HIV感染高危的个体。所述组合物可应用于在个体中治疗HIV感染。
本发明还提供了用于诊断和预后个体中HIV感染以及AIDS发展进程的试剂盒。
B.定义在这里，短语“HIV感染相关的病症”或“HIV感染相关的疾病”是指一种具有HIV感染的特征的疾病状态。所述的病症与HIV感染相关，包括但不限于AIDS；Kaposi’s肉瘤；机会感染，如那些由卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)和结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的感染；口腔病害，包括鹅口疮、黏膜白斑病和口腔溃疡；非特异淋巴结病；带状疱疹；血小板减少症；非细菌性脑膜炎；神经疾病，如弓形体病、隐球菌病、CMV感染、原发性CNS淋巴瘤和HIV相关的痴呆；外周神经病发作；以及肌病。
短语“长期非进展者”是指已经感染HIV大约10年或更久的个体，他们具有正常和稳定水平的CD4+T细胞，并且他们没有用抗逆转录病毒疗法治疗过。
如果某人属于一个HIV感染危险性高于总体人群感染危险性的团体，则其属于HIV感染“高危”者。
在测定可调节防卫素多肽活性的化合物的试验中，短语“功能性影响”包括确定一个间接或直接在防卫素影响下的参数，如一种表型或化学的影响，例如提高或降低HIV感染、HIV复制的能力，通过HIV感染细胞显示HIV标记，或细胞(如淋巴细胞，特别是CD4+淋巴细胞)的增殖、凋亡；或如一种物理影响，例如配体结合或配体结合抑制。因而，一种功能性影响包括配体结合活性、细胞增殖能力、HIV感染细胞能力和表达病毒蛋白能力、凋亡、以及酶活性。“功能性影响”包括体外(in vitro)、体内(in vivo)以及先体外后体内(ex vivo)活性。
短语“确定功能性影响”是指试验一种化合物，看其提高还是降低某个间接或直接在防卫素蛋白影响下的参数，如测定物理和化学或表型影响。所述功能性影响可以通过任何本技术领域人员已知的技术进行测定，如测定分光特性的改变(如荧光、吸光率、折射率)；测定流体动力学(如外形)；色谱分析；或蛋白的溶解特性；测定可诱导的标记或蛋白的转录活性；测定结合活性或结合试验，如结合到抗体的能力；测定配体或底物结合活性的改变；测定细胞增殖；测定凋亡；测定病毒蛋白表达；测定病毒复制；测定在血清中的病毒滴度或病毒RNA拷贝数；测定防卫素的蛋白水平或防卫素相关序列的变化；测定RNA稳定性；下游或报导基因表达(CAT，荧光素酶，β-gal，GFP，以及类似物)的识别，如可通过化学发光、荧光、比色反应、抗体结合和可诱导标记来进行。
防卫素多核苷酸和多肽序列的“抑制剂”、“活化剂”和“调节剂”用于指使用防卫素多核苷酸和多肽序列进行体外和体内试验所鉴定的活化、抑制或调节分子。抑制剂是那些部分或全部与阻滞活性、降低、阻止、延迟活性、失活、脱敏、下调活性或下调防卫素蛋白表达相关的化合物，如拮抗剂。活化剂是那些提高、打开、活化、促进、增强活性、敏化、激动、上调防卫素蛋白活性或防卫素表达的化合物，如激动剂。抑制剂、活化剂或调节剂也包括遗传学修饰形式的防卫素蛋白，如改变活性的形式，以及天然存在和合成的配体、拮抗剂、激动剂、抗体、肽、环肽、核酸、反义分子、核酶、小型化学分子以及它们的类似物。所述用于抑制剂和活化剂的试验包括如在体外、在细胞中或细胞膜上表达防卫素蛋白，应用推定的调节剂化合物，然后确定关于活性的功能性影响，如上所述。
经潜在的活化剂、抑制剂或调节剂处理的包含防卫素蛋白的样品或试样被用于与不含活化剂、抑制剂或调节剂的对照样品作比较，检测抑制程度。给予对照样品(没有用抑制剂处理)一个相对的蛋白活性值100％。相对于对照，当所述活性值约为80％、特别为50％、更特别为25-0％时，防卫素的抑制成立。相对于对照(没有用抑制剂处理)，当所述活性值为110％，特别为150％，更特别为200-500％(即比对照高2倍至5倍)，更特别为1000-3000％或更高时，防卫素的活化成立。
这里使用的术语“测试化合物”、“候选药物”或“调节剂”描述任何分子，天然存在的或合成的，如蛋白、寡肽(如长度约5至25个氨基酸，优选长度约10至20个氨基酸或12至18个氨基酸，更优选长度为12、15或18个氨基酸)、小型有机分子、多糖、脂类、脂肪酸、多核苷酸、寡核苷酸等。可以测定所述分子直接或间接调节病毒感染(如HIV感染)的能力。所述测试化合物可以是测试化合物文库的形式，如组合的或随机的文库，提供足够的多样性数据。可任选地，测试化合物可连接到一种融合配偶上，如靶向化合物、拯救(rescue)化合物、二聚化合物、稳定化化合物、定址化合物以及其它功能性结构。常规地，具有有用特性的新的化学实体通过鉴定具有某些所需特性或活性(如抑制活性)的测试化合物(称为“先导化合物”)、创造先导化合物的变体、以及评估所述变体化合物的特性和活性而产生。一般可将高通量筛选(HTS)的方法应用于这种分析。
“小型有机分子”是指一种天然存在或合成的有机分子，其分子量高于约50道尔顿低于约2500道尔顿，优选低于2000道尔顿，更优选在约100至约1000道尔顿之间，更优选在约200至约500道尔顿之间。这里所描述的“小型有机分子”与肽是不同的。
“生物样品”包括组织部件如活组织部件和死组织部件样品，以及为组织学目的而提取的冰冻样品。所述样品包括血液、唾液、组织、培养细胞如初级培养、外植体、转化的细胞、粪便、尿液等。一种生物样品通常获自真核有机体，最优选哺乳动物如黑猩猩或人；牛；狗；猫；啮齿动物如豚鼠、大鼠、小鼠；兔；或鸟类；爬虫类；或鱼。
在两条或多条核酸或多肽序列中，术语“相同的”或百分数“相同的”是指两条或多条序列或亚序列是相同的或具有一定百分比的氨基酸残基或核苷酸是相同的(即当在一个比较窗口或指定区域对比及排列最大一致性时，在某一特定区域(如编码这里所描述的防卫素的核苷酸序列，或这里所描述的防卫素的氨基酸序列)约60％相同，优选65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)，应用BLAST或BLAST2.0序列比较算法进行对比测定，默认参数将在下文描述，或通过人工排列和目视观察(参见如NCBI网站站点)进行。然后，所述序列可称为“实质上相同的”。所述定义也包括具有缺失子和/或插入子的序列，以及那些带有取代物的序列。如下文所要描述的，优选的算法可以计算出缺口及其类似。优选地，相同存在于一段长度至少约25个氨基酸或核苷酸的区域，或更优选地，相同存在于一段长度至少约50-100氨基酸或核苷酸的区域。
在序列比较时，一般用一条序列作为参照序列，将测定序列与之比较。当使用一种序列比较算法时，测定和参考序列被输入到一个计算机，接着指定同位体，在必要时，需要指定序列算法程序参数。优选地，可以应用默认的程序参数，或指定选择性参数。然后，基于程序参数，所述的序列比较算法可计算出测定序列与参考序列相同的百分数。
这里使用的“比较窗口”包括当两条序列被最佳排列后，参照任一数目的临近位置，测定序列与参考序列相比具有相同数目的临近位置，所述数目选自20-600，通常约50-约200，更常见约100-约150。用于比较的序列的排列方法是本领域已知的。最佳的序列排列是可以导出的，如通过Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.，2482(1981)的局部同源算法；通过Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.，48443(1970)的同源排列算法；通过Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，852444(1988)的检索相似点方法；通过这些算法的计算机化执行(Wisconsin Genetics SoftwarePackage中的GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science，Madison博士，WI)，或通过人工排列和目视观察(参见如Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等编，1995增刊))。
一种适于确定序列相同百分数和序列相似性的优选的算法是BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述在Altschul等，Nuc.Acids Res.，253389-3402(1977)以及Altschul等，J.Mol.Biol.，215403-410(1990)。BLAST和BLAST2.0以及这里所描述的参数被用于确定本发明的核酸和蛋白的序列相同百分数。用于进行BLAST分析的软件是公众通过国家生物信息中心(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)得到的。所述算法包括通过鉴定待查询序列中的短词长度W，初次鉴定高分数序列对(HSPs)，当与一个数据库中一个相同长度的词排列时，其匹配或满足一些阳性值低限分数T。T作为临近词分数低限(Altschul等，同上)。这些初始临近词采样数延伸入每一序列方向，直到累积排列分数被提高。用于核苷酸序列的累积分数使用参数M(一对匹配残基的奖励分；总是＞1)以及N(不匹配残基的处罚分，总是＜1)来计算。对于氨基酸序列，使用记分矩阵来计算累积分数。当累积排列分数因数量X而从其最大可实现值下降、因一个或多个阴性分数残基排列的积累使累积分数达到0或更低、或到达了每条序列的末尾时，在每一方向上词采样数的延伸停止。BLAST算法的参数W、T和X确定算法的敏感性和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认的词长(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，并且两条链相似。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用的默认词长为3，期望值(E)为10，并且BLOSUM62记分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8910915(1989))排列(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝4，并且两条链相似。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在这里可交替地用于指氨基酸残基聚合体。所述术语也适用于一个或多个氨基酸残基为天然氨基酸人工化学模拟物的氨基酸聚合体，以及天然存在的氨基酸聚合体和非天然存在的氨基酸聚合体。
术语“氨基酸”是指天然存在和合成的氨基酸，以及具有与天然存在的氨基酸相同功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是那些通过遗传密码子编码的，以及那些后来经过修饰的氨基酸，如羟脯氨酸、γ-羧谷氨酸以及0-磷丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构，即具有一个α碳结合到氢、一个羧基基团、一个氨基基团以及一个R基团的化合物，如高丝氨酸、正亮氨酸、亚砜蛋氨酸(methionine sulfoxide)、甲基锍蛋氨酸。所述类似物具有经修饰的R基团(如正亮氨酸)或经修饰的肽骨架，但保留了与天然存在氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指化学化合物，其具有的结构与氨基酸通常的化学结构是不同的，但是其作用方式和功能与天然存在氨基酸相似。
这里氨基酸可使用通常已知的三字母表示法，也可采用依据IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的一字母表示法。同样的，核苷酸可使用通常被人们所接受的单字母代码。
“保守性改变的变体”同时适用于氨基酸和核苷酸序列。针对特定的核酸序列，保守性改变的变体是指那些编码相同或基本相同的氨基酸序列的核酸，或不编码氨基酸序列的核酸。由于基因代码的简并性，很多功能性相同的核酸编码任一给定的蛋白。比如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码丙氨酸。因而，在任何一个丙氨酸位置上具有一个指定的密码子，该密码子可以被任何其它相应的密码子取代，而不会改变所编码的多肽。所述核酸变异是“沉默变异”，其是保守性改变变异的一种。这里每条编码多肽的核酸序列也包括所述核酸的每条可能的沉默变异。技术人员可认识到，核酸中的每个密码子(除了AUG，其通常是编码蛋氨酸的唯一密码子；以及TGG，其通常是编码色氨酸的唯一密码子)可以被改变，而获得功能性相同的分子。
因此，每个编码多肽的核酸的沉默变异隐含在每条与表达产物相应的序列中，而并非与实际的探针序列相应。
至于氨基酸序列，本领域技术人员可认识到，核酸、肽、多肽或蛋白序列中独特的取代、缺失或插入将变更、增加或删除编码序列中一个氨基酸或低百分率的氨基酸，当用一个化学相似的氨基酸取代某个氨基酸，获得的变更结果称为“保守性改变变体”。提供了功能相似氨基酸的保守取代表格是本领域中公知的。所述保守性改变变体包括而不排除多态变体、种群同族体、以及等位基因。
以下八组中每组包含了互为保守取代物的氨基酸1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天门冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；以及8)半胱氨酸(C)，蛋氨酸(M)(参见如Creighton，Proteins(1984))。
大分子结构如多肽结构可以以不同水平的有机体的方式描述。如需全面讨论有机体的结构，可参见如Alberts等，Molecular Biology of the Cell(第三版，1994)，以及Cantor和Schimmel，Biophysical Chemistry Part IThe Conformation ofBiological Macromolecules(1980)。“一级结构”是指特定的肽的氨基酸序列。“二级结构”是指在多肽中局部有规则的三维结构。这些结构通常被称为区域，如酶区域、细胞外区域、跨膜区域、孔隙区域以及细胞质尾部区域。区域是多肽的一部分，形成多肽上一个紧凑的单位，长度一般为15至350个氨基酸。典型的区域包括具有酶活性的区域，如激酶区域。典型的区域由更少的有机体部分组成，如β-折叠和α-螺旋。“三级结构”是指多肽单体完整的三维结构。“四级结构”是指由独立的三维单位非共价结合形成的三维结构。非均质项也称为能量项。
一种特定的核酸序列也隐含地包括“剪接变体”。类似地，由核酸编码的特定蛋白隐含地包括任何由所述核酸的剪接变体所编码的蛋白。如其名字所表示的，“剪接变体”是基因选择性剪接的产物。在转录后，起始核酸转录子可被剪接，以使不同的(交替的)核酸剪接产物编码不同的多肽。产生剪接变体的机制是不同的，但包括外显子的交替剪接。通过通读(read-through)转录衍生自同一核酸的变更的多肽也包含在本定义中。任何剪接反应的产物，包括所述剪接产物的重组形式都包含在本定义中。
“标记”或“可检测的部分”是一种通过分光镜、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其他物理手段可检测到的组合物。比如，有用的标记包括32P、荧光燃料、电子密度试剂、酶(如在ELISA中一般应用的)、生物素、地高辛、或可检测的半抗原和蛋白，如通过将一种放射标记加入到肽或用于检测与所述肽特异性反应的抗体。
术语“重组体”当被应用于如细胞、核酸、蛋白或载体时，指通过导入异源核酸或蛋白或天然核酸或蛋白的变体而发生了改变，或所述细胞衍生自经过前述改变的细胞。因而，重组细胞可表达天然形式的细胞(没有重组)中没有的基因，或可表达天然基因异常表达、低表达或不表达的基因。重组细胞也可表达天然基因，通过插入调节DNA序列起始这种表达，所述调节序列如启动子或增强子。
术语“异源的”当被应用于核酸相关的部分时，表示所述核酸包含两种或多种在天然状态下并非来自相同种属的亚序列。例如，通常将两条或多条来自不相关的基因的序列排列制成新的功能性核酸，重组地生产核酸，如启动子来自一个来源，而编码区域来自另一个来源。类似地，异源蛋白表示所述蛋白包含两种或多种在天然状态下并非来自相同种属的亚序列(如融合蛋白)。
短语“严紧杂交条件”是指在核酸的混合物中，所述条件下探针将杂交到其靶序列上而不会杂交到其他序列。严紧条件是序列依赖的，并且在不同环境下是不同的。越长的序列在越高的温度下进行杂交。关于核酸杂交更详尽的指导可参考Tijssen，生物化学和分子生物学疫术-核酸探针杂交，“杂交原理概观以及核酸试验策略”(1993)。通常，严紧条件选择在某一给定的离子强度pH下，低于特定序列的热熔点(Tm)约5-10℃。Tm是一个温度(在给定的离子强度、pH和核酸浓度下)，该温度使得均衡状态下50％的探针互补地结合到靶序列上(靶序列过量存在，在Tm，均衡状态下50％的探针被占用)。严紧条件也可通过加入破坏稳定剂如甲酰胺来实现。为了选择性或特异性杂交，阳性信号经过至少两次背景杂交，优选进行10次背景杂交。可行的严紧杂交条件可以是50％甲酰胺，5×SSC，以及1％SDS，在42℃孵育，或5×SSC，1％SDS，在65℃孵育，在65℃、0.2×SSC以及0.1％SDS中洗涤。
如果它们编码的多肽实质上相同的话，在严紧条件下没有相互杂交的核酸仍然是实质上相同的。比如，这发生在当一个拷贝的核酸利用遗传代码所允许的最大密码子简并性被创造出来时。在这种情况下，所述核苷酸通常在中等严紧杂交条件下杂交。可行的“中等严紧杂交条件”包括在37℃，40％甲酰胺缓冲液，1M NaCl、1％SDS下杂交，在45℃、1×SSC下洗涤。阳性杂交经过至少两次背景杂交。普通技术人员将认识到，选择性的杂交和洗涤条件可被用于提供相似的严紧的条件。用于确定杂交参数的其它指导存在于大量的参考文献，如分子生物学最新方案，Ausubel等编。
对于PCR，36℃的温度典型用于低严紧扩增，尽管根据引物长度不同退火温度可以在约32℃-48℃之间不等。对于高严紧PCR扩增，典型的温度为62℃，尽管高严紧退火温度在约50℃-约65℃的范围内，根据引物长度和特异性而不同。高和低严紧扩增的典型的循环条件中包括在90℃-95℃退火30秒-2分钟的阶段，退火阶段持续30秒-2分钟，以及包括延伸阶段，在72℃进行1-2分钟。低和高严紧扩增反应的方案和指导是公开的(如Innis等(1990)，PCR方案，及其方法和应用指导，学术出版社，纽约)。
“抗体”是指包含来自免疫球蛋白基因或其片断的框架区的多肽，特异性结合和识别抗原。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及许多免疫球蛋白可变区基因。轻链分为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，它们依次限定免疫球蛋白的类型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。典型地，抗体中抗原结合区域的结合特异性和亲和力是最关键的。
一种可行的免疫球蛋白(抗体)结构单位包含一种四聚体。每个四聚体有两对相同的多肽链，每对具有一条“轻”链(约25kD)以及一条“重”链(约50-70kD)。每条链的N末端具有一段约100-110或更多个氨基酸的可变区，主要用于抗原的识别。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指这些轻链和重链。
抗体的存在，如可作为完整的免疫球蛋白存在，或作为一些通过不同肽酶消化获得的充分定性的片断存在。因而，比如胃蛋白酶在铰链区二硫键以下进行消化，生成F(ab)’2，自身是轻链的Fab二聚体通过二硫键连接到VH-CH1。在温和条件下断裂位于铰链区的二硫键，可将F(ab)’2降解，从而将F(ab)’2二聚体转变为Fab’单体。Fab’单体是带有部分铰链区的基本Fab(参见基础免疫学(FundamentalImmunology)(Paul编，第三版，1993))。当不同抗体片断以完整的抗体被消化的方式限定时，技术人员应理解，所述片断可通过化学方法或重组DNA方法被重新合成。因此，这里应用的术语抗体也包括通过对完整抗体进行修改、或通过重组DNA技术(如单链Fv)重新合成、或通过噬菌体展示文库鉴定(参见如McCafferty等，Nature，348552-554(1990))所获得的抗体片断。
对于抗体(如重组的、单克隆的或多克隆的抗体)的制备，可应用许多本领域已知的技术(参见如Kohler和Milstein，Nature 256495-497(1975)；Kozbor等，Immunology Today，472(1983)；Cole等，单克隆抗体和癌症治疗(MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy)，77-96页，Alan R.Liss，Inc.(1985)；Coligan，Current Protocols in Immunology(1991)；Harlow和Lane，Antibodies，ALaboratory Manual(1988)；以及Goding，Monoclonal AntibodiesLPriciples andPractice(第二版，1986))。编码抗体的重和轻链的基因可以从细胞中克隆出，如编码一种单克隆抗体的基因可以从杂交瘤中克隆出并用于生成重组单克隆抗体。编码单克隆抗体重和轻链的基因文库也可从杂交瘤或浆细胞中获得。重和轻链基因产物的随机结合生成大量具有不同抗原特异性的抗体(参见如Kuby，免疫学(第三版，1997))。用于制备单链抗体或重组抗体的技术(美国专利号4,946,778，美国专利号4,816,567)适合于生产本发明的抗体多肽。同样，转基因小鼠或其它有机体(如其它哺乳动物)可应用于表达人源化或人抗体(参见如美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016；Marks等Bio/Technology，10779-783(1992)；Lonberg等，Nature，368856-859(1994)；Morrison，Nature368812-13(1994)；Fishwild等，Nature Biotechnology，14845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology，14826(1996)；以及Lonberg和Huszar，Intern.Rev. Immunol.，1363-93(1995))。可选择地，噬菌体展示技术可以应用于鉴定特异性结合到给定抗原的抗体以及异聚Fab片断(参见如McCafferty等，Nature，348552-554(1990)；Marks等，Biotechnology，10779-783(1992))。抗体也可制成双特异的，即能够识别两种不同的抗原(参见如WO93/08829，Traunecker等，EMBOJ.，103655-3659(1991)；以及Suresh等，Methods in Enzymology，121210(1986))。抗体也可以是异源共轭物，如两个共价结合的抗体，或免疫毒素(参见如美国专利号4,676,980，WO91/00360；WO92/200373；以及EP 03089)。
人源化或灵长类化(primatizing)非人抗体的方法是本领域已知的。通常，人源化的抗体被引入一个或多个非人来源的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基经常作为引入残基，典型地被引入可变区域。人源化基本上可根据Winter及其同事的方法进行(参见如Jones等，Nature，321522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，2391534-1536(1988)；以及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2593-596(1992))，通过用啮齿动物CDRs或CDR取代人抗体的相应序列。因此，所述人源化抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其本质上少于整个人可变区被来自非人种属的相应序列取代。实际上，人源化抗体是人抗体，其中一些CDR残基以及可能一些FR残基被来自相似位点的啮齿动物抗体残基所取代。
“嵌合抗体”是一种抗体分子，其中(a)恒定区或其部分被变更、取代或交换，使抗原结合位点(可变区)连接到不同或变更类型的恒定区，效应物和/或核素，或完全不同的分子，给予嵌合抗体新的特性，如酶、毒素、激素、生长因子、药物等；或(b)可变区或其部分被变更、取代或交换，使可变区具有不同或变更的抗原特异性。
在一个实施方案中，所述抗体结合到“效应物”结构上。所速效应物结构可以是任何数量的分子，包括标记结构如放射活性标记或荧光标记，或可以是治疗结构域。在一个方面所述抗体调节蛋白的活性。
当涉及到蛋白或肽时，短语“特异性(或选择性)结合”到抗体或“特异性(或选择性)与…免疫反应”指确定蛋白是否存在的结合反应，经常用在蛋白和其它生物制剂的异质种群中。因而，在指定的免疫试验条件下，特异的抗体以至少两倍于背景结合到一种特定蛋白，更典型地为多于10-100倍背景。在这种条件下，特异结合到抗体要求该抗体经过针对特定蛋白的特异性选择。比如，多克隆抗体提出了可结合防卫素蛋白、多态变体、等位基因、直向同源物，以及保守性改变变体，或剪接变体、或其部分，可进行选择以获得仅仅与防卫素蛋白特异性免疫反应而不与其它蛋白反应的多克隆抗体。所述选择可通过减除与其它分子交叉反应的抗体来实现。可采用许多免疫测定方式来选择可与特定蛋白发生免疫反应的抗体。比如，常规可使用固相ELISA免疫测定来选择可与蛋白发生特异性免疫反应的抗体(参见如Harlow和Lane，Antibodies，A Laboratory Manual(1988)，描述了可用于确定特异免疫反应的免疫测定形式及条件)。
“治疗有效剂量”这里指一种剂量，能在给药个体上产生所需的效应。精确的剂量根据治疗目的而定，并且是本领域技术人员应用已有技术能够确定的(参见如Lieberman，药物剂量方式(1-3卷，1992)；Lloyd，药物配制的技术、科学和工艺(1999)；以及Picker，剂量计算(1999))。在治疗有效量的防卫素用于作为抗HIV剂的情况下，治疗有效量是一个量，所述量必须达到任何表示成功治疗HIV感染的标志，包括任何客观的或主观的标准，如HIV病毒抑制，HIV感染和AIDS症状消失，或患者身体或精神提高。比如，对于一些患者，治疗有效量从1微克每千克体重至1克每千克体重。
C.防卫素制备和纯化1.防卫素防卫素是本领域已知的抗细菌和抗真菌剂(参见美国专利号5,242,902，其授权于Murphy等)。防卫素已经在许多动物中被发现和描述，包括人、豚鼠、大鼠、兔、恒河猴以及小鼠，也存在于植物和昆虫中。
有两种结构类型的哺乳动物防卫素α、β被用于本发明的目的。本申请使用的术语“防卫素”同时包括α和β防卫素，特别是α-防卫素1、α-防卫素2和α-防卫素3。编码所述人防卫素的基因位于单一的染色体区域，8p21-31(Kaiser等，Journalof Leukocyte Biology，68779-784(2000))。在结构上，防卫素是阳性分子，具有空间上分离的疏水和带电区域。已知的防卫素都有一个β折叠结构，6个或8个半胱氨酸残基形成分子内半胱氨酸二硫键。
这里使用的术语“α-防卫素”涉及一种多肽，根据HIV病毒抑制试验(如这里描述的病毒抑制试验)的测定，其生物学活性被判定为具有抗-HIV活性。α-防卫素的长度通常少于100个氨基酸，一般约25-35个氨基酸，其结构中具有6个半胱氨酸，它们在种间是保守的。(所述保守的结构显示在SEQ ID NO3至SEQ ID NO8中，也可参考Liu和Ganz，Genomics，43316-320(1997))；以及美国专利号4,705,777(Lehrer等))。α-防卫素在生理pH时具有净阳电荷，通常这是带阳性电荷的精氨酸产生的。因此，术语“α-防卫素”包含同时具有高半胱氨酸含量和高精氨酸含量的阳性蛋白。在一些实施方案中，α-防卫素被描述为具有六个半胱氨酸以及二至四个精氨酸，它们是基本保守的。半胱氨酸和精氨酸在整个寡肽上是分散的，使得半胱氨酸可进行分子内和分子外、共价和非共价的交联，并且精氨酸在一个宽的pH范围上给予整个分子阳性电荷，使分子高度阳性。例如，在一些实施方案中，α-防卫素包含3个由半胱氨酸形成的二硫键。本发明的α-防卫素也可形成一个二级结构，其中包含一个β发夹构象，比如形成一个β折叠，如三链反平行β折叠(Mandal等，J.Peptide Researsh，5995-104(2002))。术语“α-防卫素”包含天然存在的α-防卫素，即从天然来源分离的多肽；合成的α-防卫素，即化学合成或通过重组DNA技术生产的多肽，具有与天然存在的α-防卫素相同的氨基酸序列；以及α-防卫素类似物，即具有α-防卫素的生物活性的多肽，具有的氨基酸序列并非是天然存在的。所述术语也包含α-防卫素的前-前体蛋白形式，在细胞内经过处理形成具有生物学活性的形式。
α-防卫素在体内多处位置上有表达。然而，发现α-防卫素1-4在多形核嗜中性粒细胞中有突出表达，而α-防卫素5-6在小肠Paneth细胞的分泌颗粒中高度表达。现在已经鉴定出，人α-防卫素1-3可由CD8+T细胞分泌。三种防卫素，即α-防卫素1-3的不同点仅仅在于N末端的一个氨基酸不同(Linzmeier等，FEBS LETT.，321(2-3)267-273(1993)；Palfree等，Mol.Endocrin.，7(2)199-205(1993)；Mallow等，J.Biol.Chem.，271(8)4038-4045(1996)；Mars等，J.Biol.Chem.，270(51)30371-30376；以及Quayle等，Am.J.Pathol.，152(5)1247-1258)。
在某些实施方案中，如前面所定义的，α-防卫素包括多肽、前-前体蛋白、加工蛋白、多态变体、等位基因、以及突变体，它们与如这里所描述的由人α-防卫素核酸所编码的氨基酸序列(如α-防卫素1-6，特别是α-防卫素1-3)相比，具有高于60％的氨基酸序列相同性，如65％、70％、75％、80％、85％、90％，优选地，具有91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％、或更高的氨基酸序列相同性，优选地，在一个至少约15、20、25、30或更多个氨基酸的区域上具有相同性。
在其它一些实施方案中，如前面所描述的，α-防卫素包括多肽、前-前体蛋白、加工蛋白、多态变体、等位基因、突变体、以及种间同源物，它们与如这里所描述的由来自人或其他动物的α-防卫素核酸所编码的氨基酸序列(如兔防卫素1-5，大鼠防卫素1-4和豚鼠)相比，具有高于60％的氨基酸序列相同性，如65％、70％、75％、80％、85％、90％，优选地，具有91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％、或更高的氨基酸序列相同性，优选地，在一个至少约15、20、25、30或更多个氨基酸的区域上具有相同性。
在其他一些实施方案中，如前面所描述的，α-防卫素包括多肽、前-前体蛋白、加工蛋白、多态变体、等位基因、突变体、以及种间同源物，它们与由在Paneth细胞中高度表达的α-防卫素核酸所编码的氨基酸序列(如人α-防卫素5-6，小鼠α-防卫素1、2和1α，以及兔α-防卫素6)相比，具有高于60％的氨基酸序列相同性，如65％、70％、75％、80％、85％、90％，优选地，具有91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％、或更高的氨基酸序列相同性，优选地，在一个至少约15、20、25、30或更多个氨基酸的区域上具有相同性。
选择性地，如前面所描述的，α-防卫素包括具有不多于35个氨基酸的阳性寡肽，具有以下通式的序列Z0-2-(aa1)a-(aa2)b-cys-aa4-cys-arg-aa7-aa8-aa9-cys-aa11-aa12-aa13-glu-arg-aa16-aa17-gly19-cys-aa21-aa22-aa23-gly-aa25-aa26-aa27-aa28-aa29-cys-cys-(aa32)c-w(SEQ ID NO1)，其中，Z(如果存在的话)化学偶联到末端氨基上，它可以是具有1至6个碳原子的酰基(具有0至1个氨基取代基)、具有1至3个碳原子的烷基、或是一个保护基团；a、b和c是各自独立的，它们可以是0或1；写在aa上角的数字定义了所述氨基酸在多肽中的号码，除了aa9，其倾向于存在两个氨基酸，然后使所有后续的号码均上升1号；氨基酸1、7、8、11、13、21、23、25、26和28是脂肪族氨基酸；氨基酸2、4、9、12、16、17、19、22、27、29和32可以是脂肪族氨基酸或芳香族氨基酸；w是末端羟基、氨基或是1至6个氨基酸的肽，在N末端具有一个碱性氨基酸。在一些实施方案中aa1是val或gly；aa2是val、ile、arg、ser、phe、ala或asp；aa4是ala、val、thr或tyr；aa7是arg、lys、gly或ile；aa8是ala、arg、gln、phe或pro；aa9是两个leu、phe、ser或ala；aa11是leu、pro、ser、gly或ile；aa12是pro、asn、lys、phe、ser或ala；aa13是arg、leu、ser或gly；aa16是arg、phe或ala；aa17是ala、ser、ile或tyr；aa19是phe、tyr、asp、ser或thr；aa21是arg、lys、thr或ile；aa22是ile、val或tyr；aa23是arg、asn或gln；aa25是arg、ala或val；aa26是ile、leu或arg；aa27是his、val、phe或trp；aa28是pro、tyr、ala或thr；aa29是leu、arg或phe；aa32是arg、ser、pro或trip；w是0至2个arg。在其它一些实施方案中，取代物如aa1、aa2和aa4是隐藏的，因此它们具有除了天然存在的序列以外的序列，这里称为类似物。
此外，如前面所描述的，α-防卫素包括具有不多于35个氨基酸的阳性寡肽，具有以下通式的序列Z’0-2-val-aa2-cys4-cys-arg-arg-aa8-aa9-cys-aa11-aa12-aa13-glu-arg-arg-aa17-gly-aa19-cys-arg-aa22-arg-gly-arg-aa26-his-aa28-leu-cys-cys-(arg)0-1(SEQ ID NO2)，并且其中，Z’是甲基、乙酰基或是一个氨基酸；氨基酸2、4、8、9、11、17和22是中性氨基酸；氨基酸12和28是杂环氨基酸或中性氨基酸；氨基酸19是芳香族氨基酸或羟基取代的脂肪族氨基酸；氨基酸13和26是脂肪族氨基酸或碱性氨基酸；或具有以下通式的序列Z’0-2-val-aa2-cys-thr-cys-arg-aa7-phe-aa9-cys-gly-aa12-gly-glu-arg-ala-aa17-gly-aa19-cys-thr-aa22-asn-gly-val-arg-his-aa28-leu-cys-cys-arg-(arg)0-1，并且其中aa2和aa12是phe或ser；aa7是arg或gly；aa9是羟基取代或非取代的脂肪族氨基酸；aa17、aa19和aa28是羟基取代的氨基酸；aa22是5至6个碳原子的脂肪族氨基酸；或具有以下通式的序列ala-cys-tyr-cys-arg-ile-pro-ala-cys-ile-ala-asp-gly-glu-arg-arg-tyr-gly-thr-cys-ile-tyr-gln-gly-arg-leu-trp-ala-phe-cys-cys，其中ala和asp表示没有氨基酸或一个所示的氨基酸。在另一个实施方案中，取代物，如aa2、aa7和aa9是隐藏的，因此它们具有除了天然存在的序列以外的序列，这里称为类似物。
已经发现α-防卫素存在于人、兔、豚鼠、大鼠、恒河猴和仓鼠的嗜中性粒细胞以及人和啮齿动物的小肠Paneth细胞中(Daher等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，857327-7331；Lehrer等，Infect.Immun.，111226-1234；Selsted等，Infect.Immun.，552181-2186；Eisenhauer等，Infect.Immun.，572021-2027；Tang等，Infect.Immun.，676139-6144；Mak等，Infect.Immun.，644444-4449；Ganz等，J.Immunol.，1431358-1365；Mallow等，J.Biol.Chem.，2714038-4045；Quellette等，J.Cell.Biol.，1081687-1695；以及Qu等，Infect.Immun.，645161-5165)。
如这里所应用的，术语“人α-防卫素”是指一种多肽，其具有以下氨基酸序列及其等位变体和前-前体蛋白的一种。人α-防卫素1-6的序列如下α-防卫素1(HNP1)ACYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC(SEQ ID NO3)；α-防卫素2(HNP2)CYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC(SEQ ID NO4)；α-防卫素3(HNP3)DCYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC(SEQ ID NO5)；α-防卫素4(HNP4)VCSCRLVFCRRTELRVGNCLIGGVSFTYCCTRV(SEQ ID NO6)；α-防卫素5(HD5)ARATCYCRTGRCATRESLSGVCEISGRLYRLCCR(SEQ ID NO7)；α-防卫素6(HD6)TRAFTCHCRRSCYSTEYSYGTCTVMGINHRFCCL(SEQ ID NO8)。α-防卫素被描述在美国专利号4,705,777(Lehrer等)中。
如这里所应用的，术语“兔α-防卫素”是指一种多肽，其具有以下氨基酸序列及其等位变体和前-前体蛋白的一种。兔α-防卫素1-6的序列如下α-防卫素1(NP1)VVCACRRALCLPR ERRAGFCRIRGRIHPLCCRR(SEQ ID NO9)；α-防卫素2(NP2)VVCACRRALCLPLERRAGFCRIRGRIH PLCCRR(SEQ ID NO10)；α-防卫素3a(NP3a)GICACRRRFCPNSERFSGYCRVNGARYVRCCSRR(SEQID NO11)；α-防卫素3b(NP3b)GRCVCRKQLLCSYRERRIGDCKIRGVRFPFCCPR(SEQ ID NO12)；α-防卫素4(NP4)VSCTCRRFSCGFGERASGSCTVNGVRHTLCCRR(SEQ ID NO1 3)；α-防卫素5(NP5)VFCTCRGFLCGSGERASGSCTINGVRHTLCCRR(SEQ ID NO14)；以及α-防卫素6(NP6)GICACRRRFCLNFEQFSGYCRVNGARYVRCCSRR(SEQ ID NO15)。
如这里所应用的，术语“大鼠α-防卫素”是指一种多肽，其具有以下氨基酸序列及其等位变体和前-前体蛋白的一种。大鼠α-防卫素的序列如下α-防卫素1(RtNP1)VTCYCRRTRCGFRERLSGACGYRGRIYRLCCR(SEQ ID NO16)；α-防卫素2(RtNP2)VTCYCRSTRCGF RERLSGACGYRGRIYRLCCR(SEQ ID NO17)；α-防卫素3(RtNP3)CSCRTSSCRFGERLSGACRLNGRIY RLCC(SEQ ID NO18)；以及α-防卫素4(RtNP4)ACYCRIGACVSGERLTGACGLNGRIYRLCCR(SEQ ID NO19)。
如这里所应用的，术语“小鼠α-防卫素”是指一种多肽，其具有以下氨基酸序列及其等位变体和前-前体蛋白的一种。小鼠α-防卫素的序列如下α-防卫素1(MuCr1)LRDLVCYCRT RGCKRRERMNGTCRKGHLMYTLCCR(SEQID NO20)；α-防卫素2(MuCr2)LRDLVCYCRARGCKGRE RMNGTCRKGHLLYMLCCR(SEQ ID NO21)；以及α-防卫素1α(MuCr1α)LRDLVCYCRTRGCKRRER MNGTCRKGHLMYTLCCR(SEQ ID NO22)。
如这里所应用的，术语β-防卫素涉及一种多肽，根据HIV病毒抑制试验(如这里描述的病毒抑制试验)的测定，被判定为具有抗-HIV活性。β-防卫素的长度通常少于100个氨基酸，一般约32-45个氨基酸，具有保守的半胱氨酸结构和阳性电荷(所述保守的结构显示在SEQ ID NO23至SEQ ID NO24中)。β-防卫素与α-防卫素的不同在于它们特定的氨基酸模式、半胱氨酸间隔、以及二硫键连接(Kaiser等，Leukocyte Biology，68779-784(2000))。与α-防卫素相似，β-防卫素的半胱氨酸在整个寡肽上是分散的，使得半胱氨酸可进行分子内和分子外、共价和非共价的交联。术语“β-防卫素”包含天然存在的β-防卫素，即从天然来源分离的多肽；合成的β-防卫素，即化学合成或通过重组DNA技术生产的多肽，具有与天然存在的β-防卫素相同的氨基酸序列；以及β-防卫素类似物，即具有β-防卫素的生物活性的多肽，具有的氨基酸序列并非是天然存在的。所述术语也包含β-防卫素的前-前体蛋白形式，在细胞内经过处理形成具有生物学活性的形式。
已经发现β-防卫素存在于人、牛、绵羊、小鼠、猪、家禽、昆虫和植物中，尤其在牛气管黏膜、牛嗜中性粒细胞、牛舌头、人嗜中性粒细胞、阴道和肾组织、上皮细胞如皮肤、肾、以及气管-支气管内层(Diamond等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，954596-4600；Selsted等，J.Biol.Chem.，2686641-6648；Singh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9514961-14966；Bensch等，FEBS.Lett.，368331-335；Schonwetter等，Science，3267 1645-1648；以及Lehrer等，Annals New York Academyof Science，228-239)。
在某些实施方案中，如前面所定义的，β-防卫素包括多肽、前-前体蛋白、加工蛋白、多态变体、等位基因、种间同源物、以及突变体，它们与如这里所描述的由β-防卫素核酸所编码的氨基酸序列(如人β-防卫素1或2)相比，具有高于60％的氨基酸序列相同性，如65％、70％、75％、80％、85％、90％，优选地，具有91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％、或更高的氨基酸序列相同性，优选地，在一个至少约15、20、25、30或更多个氨基酸的区域上具有相同性。
如这里所应用的，术语“人β-防卫素”是指一种多肽，，其具有以下氨基酸序列及其等位变体和前-前体蛋白的一种。人β-防卫素1和2的序列如下β-防卫素1(hBD-1)DHYNCVSSGGQCLYSACPIFTKIQGTCYRGKAKCC(SEQ ID NO23)；β-防卫素2(hBD-2)TCLKSGAICHPVFCPRRYKQIGTCGLPGTKCC(SEQ ID NO24)。β-防卫素序列描述于PCT公开号WO 02/22686和Kaiser等，Journal of Leukocyte Biology，68779-784(2000))。
本发明的防卫素可通过功能进行进一步的描述，所述功能包括(1)结合到抗体，如多克隆抗体，其可对应某个免疫原而升高，所述免疫原含有防卫素蛋白和其保守性改变变体的氨基酸序列；(2)在严紧杂交条件下，能与编码防卫素蛋白和其保守性改变变体的核酸序列相应的反义链特异性杂交；或(3)与防卫素核酸具有高于95％，优选地高于96％、97％、98％、99％、或更高的氨基酸序列相同性，优选地，在一个含有至少约25、50、100、200、500、1000或更多个核苷酸序列的区域上具有相同性。如前所述，防卫素多核苷酸或多肽序列通常来自哺乳动物，包括但不限于灵长动物如人；啮齿动物如大鼠、小鼠、仓鼠、牛、猪、马、羊或任何哺乳动物。在一个可行的实施方案中，所述防卫素是人α-防卫素1、2或3。本发明的核酸和蛋白包括天然存在的或重组的分子。本发明的防卫素蛋白具有抗病毒活性。可根据本领域技术人员已知的方法以及这里所描述的方法进行抗病毒试验。
在体内，防卫素以前体的方式被生成，并且从前肽经加工获得成熟肽，通常带有二硫键桥。防卫素前-前肽存在于GenBank登录号NP_525128，AAH27917，CAC85520，CAC85511，AAG02237，CAC03097，AAF73853，NP_066290，NP_005208，NP_001917，NP_001916，NP_004075，CAB65126，AAG22030，AAC69554，AAC51728，AAC50382，AAC33549，AAB59357，AAB49758，AAA52303，AAA35754，以及AAM62424。前-前肽加工成成熟肽的方法描述在Garcia等，Cell Tissue Res.，306(2)257-264(2001)；Harder等，J.Biol.Chem.，276(8)5707-5713(2001)；Jia等，Gene，263(1-2)211-218(2001)；Am.J.Pathol.，152(5)1247-1258(1998)；Daher等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85(19)7327-7331(1998)；Mallow等，J.Biol.Chem.，271(8)4038-4045(1996)；Wilde等，J.Biol.Chem.，264(19)11200-11203(1989)；Gabay等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86(14)5610-5614(1989)；Palfree等，Mol.Endocrinol.，7(2)199-205(1993)；Selsted等，J.Clin.Invest.，76(4)1436-1439(1985)；Mars等，Blood，71(6)1713-1719(1988)；Daher等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85(19)7327-7331(1988)；Sparkes等，Genomics，5(2)240-244(1989)；Bateman等，J.Biol.Chem.，266(12)7524-7530(1991)；Wagner等，Genomics，10(1)114-125(1991)；Valore等，Blood，79(6)1538-1544(1992)；Lehrer等，Annu.Rev.Immunol.，11105-128(1993)；Linzmeier等，FEBS Lett.，321(2-3)267-273(1993)；Harder等，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.，22(6)714-721(2000)；Infect.Immun.，68(1)113-119(2000)；Genomics，43(3)316-320(1997)；Mallow等，J.Biol.Chem.，271(8)4038-4045(1996)；FEBS Lett.，315(2)187-192(1993)；McCray等，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.，16343-349(1997)；Blood，71(6)1713-1719(1988)；Jones等，Biol.Chem.，267(32)23216-23225(1992)；Raj等，FEMS MicrobiologyLetters，2069-18(2002)；Schutte等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2129-2133(2002)；Hoover等，J.Biol.Chem.，276(42)39021-39026；以及Ganz等，Eur.J.Haematol.，44(1)1-8。
在功能上，已知防卫素具有抗细菌和抗真菌的活性，可对抗许多的微生物(Raj等，FEMS Microbiology Letters，2069-18(2002))。带阳性电荷的防卫素能够与带阴性电荷的微生物细胞膜组分发生反应，包括革兰氏阴性菌中的脂多糖、革兰氏阳性菌中的多糖、以及磷脂。已知防卫素可由噬菌白细胞分泌，对抗细菌和真菌。尽管α-防卫素是高度保守的，较小的变化也足以改变不同防卫素的微生物杀灭潜能以及特异性(Mandal等，J.Pept.Res.，59(3)95-104(2002)；Schibli等，J.Biol.Chem.，277(10)8279-89(2002)；Garcia等，Cell Tissue Res.，306(2)257-64；Fellermann等，Eur.J.Gastroentero Hepatol.，13(7)771-776；Kangan等，Toxicology，87(1-3)131-149(1994))。
研究也显示，防卫素在对抗感染和刺激免疫应答方面具有重要的作用。例如，已经证明防卫素(特别是β-防卫素1和2)可以吸引涉及初级和二次免疫应答的未成熟树突细胞以及记忆T细胞(Ganz，Science，286420-421(1999))；Lillard等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96651-656(1999))。在本发明中，已经发现防卫素可作为抗病毒剂对抗HIV，并能应用于治疗和/或预防HIV感染以及其它病毒感染。
如前面所解释的，天然存在的、化学合成的、商业可用的以及重组生产的防卫素多肽可应用在本发明的组合物以及方法中。
已知的天然防卫素多肽被描述在本申请中。可以理解，将来可能会鉴定出其它对于本发明的方法有用的天然防卫素多肽，它们可以是与这里所述的防卫素同种类的，也可以是其它种类的。
从天然存在的来源分离天然存在的防卫素可从任何防卫素来源纯化获得，比如来自骨髓、气管和肠细胞，来自嗜中性粒细胞、多形核白细胞、PBMC或其它噬菌细胞；来自上皮组织和其它表达防卫素的组织(参见如van Wetering等，Am.J.Physiol.272L888(1997)；Chertov等，J.Biol.Chem.，2712935-2940(1996)；以及Raj等，Biochem.J.，347633-641(2000))，以及来自其它表达防卫素的哺乳动物，如大鼠和豚鼠。在一个可行的实施方案中，天然存在的防卫素纯化自嗜中性粒细胞和巨噬骨髓细胞。所述纯化方法包括大规模纯化，如从全血(如来自血库，或从来自急性骨髓性白血病患者的药用废品如冲击-释放分离术中获得)中分离嗜中性粒细胞，应用已知的肽纯化方法进行纯化。例如，多肽可应用色谱法(如反相HPLC)，凝胶渗透、离子交换(如阴离子交换)、尺寸排除、亲和吸附、分隔或逆流分配来纯化。纯化防卫素的方法描述于Raj等，同上；以及Ganz等，J.Clin.Invest.，761427-1435(1985)。
防卫素也可应用已知的细胞培养技术来获得，培养防卫素-生成细胞，并且使用这里所描述的方法分离出防卫素分子。合适的防卫素-生成细胞系包括但不限于用于生成人α-防卫素1-3的CD8+T淋巴细胞、嗜中性粒细胞和骨髓细胞系；用于生成人α-防卫素5-6的肠细胞系；以及用于生成人β-防卫素1-2的内皮细胞系。普通的细胞培养技术可参见Freshney等，Culture of Animal Cells(第三版，1994)。
防卫素分子可能从商业来源获得，如Peptides International、AmericanPeptides和NJ Research公司。
本发明部分依赖于常规的用于基因重组领域的技术。公开有适用于本发明的一般重组方法的基本书籍包括但不限于Sambrook等，Molecular Cloning，A LaboratoryManual(第二版，1989)；Kriegler，Gene Transfer and ExpressionA LaboratoryManual(1990)；以及分子生物学最新方案(Ausubel等编，1994))。
实质上等同于这里所述的氨基酸序列的防卫素核酸，多态变体、直向同源物以及等位基因可以用防卫素核酸探针和寡核苷酸在严紧杂交条件下进行分离。可选择地，可应用表达文库来克隆防卫素蛋白、前-前体蛋白、多态变体、直向同源物以及等位基因，通过检测所表达的同源物与抗血清或纯化的抗人防卫素抗体或其部分的免疫反应性来确定。
为了制备一个cDNA文库，需要选择一种富含防卫素RNA的制备来源，如PBMC、多形核白细胞、嗜中性粒细胞、淋巴母细胞系、以及其它噬菌细胞。所述细胞可以是初级细胞或细胞系。然后通过反转录酶将RNA转换成cDNA，连接到一种重组载体上，并转化入一种重组宿主，进行增殖、筛选核克隆。制备和筛选cDNA的方法是已知的(参见如Gubler等，Gene，25263-269(1983)；Sambrook等，同上；Ausubel等，同上)。
在制备基因组文库时，从组织中抽提DNA，用机械剪切或用酶消化，形成约12-20kb的片断。然后通过梯度离心进行选择，并重新构建入噬菌体λ载体。这些载体和噬菌体在体外(in vitro)组装。通过如Benton和Davis，Science196180-182(1977)所描述的噬菌斑杂交方法来分析重组噬菌体。菌落杂交按照描述在Grunstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，723961-3965(1975)中的方法进行。
分离防卫素核酸、直向同源物、等位基因、突变体、多态变体以及保守性改变变体的一种可选择的方法还结合应用合成的寡核苷酸引物，以及扩增RNA或DNA模板(参见美国专利号4,683,195和4,683,202；PCR方案方法和应用指导(Innis等编，1990))。诸如多聚酶链反应(PCR)和连接酶链反应(LCR)等方法可用于直接从人mRNA、cDNA、基因组文库或cDNA文库中扩增出人防卫素核酸序列。应用这里所提供的序列，可设计变性寡核苷酸来扩增防卫素同源物。可将限制性核酸内切酶位点加入到引物上。例如，多聚酶链反应以及其它体外(in vitro)扩增方法可用于克隆编码所需蛋白的核酸序列；可用于制备用作探针的核酸，在生理样品中检测编码防卫素的mRNA是否存在；或用于其它目的。通过PCR反应扩增的基因可以用琼脂糖凝胶纯化，克隆入相应的载体。
典型地，在转化入原核或真核细胞进行复制和/或表达之前，将用于编码防卫素多肽的基因克隆入中间载体。好些中间载体通常是原核载体，如质粒或穿梭载体。可选择地，可应用同源重组来激活原生的防卫素基因。
3.防卫素多肽的化学合成和纯化由于本发明的防卫素多肽的长度是相对短的，它们可应用许多对于本领域技术人员来说熟悉的化学肽合成技术中的任何一种来制备，包括溶液方法和固相方法，固相合成是优选的方法。化学合成防卫素多肽的合适的方法公开在Raj等，Biochem.J.，347633-641(2000)中，其中的指导引用在此作为参考。
特别地，固相合成中，肽序列的C末端氨基酸被吸附到一种不溶的支持物上，接着依次地将序列中剩余的其它氨基酸添加上去，这是本发明优选的制备防卫素多肽的方法。固相合成技术描述于Barany和Merrifield，Solid-Phase Peptide Synthesis，in The PeptidesAnalysis，Synthesis，Biology(Gross和Meienhofer(编)，学术出版社，纽约，卷2，pp.3-284(1980))；Merrifield等，J.Am Chem.Soc.，852149-2156(1963)；以及Stweart等，Solid-Phase Peptide Synthesis(第二版，Pierce Chem.Co.，Rockford，I11.(1984))。
固相合成从肽的羧基末端(即C-末端)起始，通过偶连一个保护氨基酸，使该保护氨基酸的羧基固定于合适的固相支持物上。所用的固相支持物在本发明中不是关键所在，只要其能够结合羧基基团，并对在肽合成步骤中所用的试剂惰性就可以了。比如，一种起始材料可连接一个氨基保护性氨基酸，通过苯甲基酯连接到氯甲基化或羟甲基化的树脂上，或通过醯胺连接到二苯甲基氨(BHA)或p-甲基二苯甲基胺(MBHA)树脂上。适用于作为固相支持物的材料对于本领域技术人员来说是熟悉的，包括但不限于以下材料卤甲基化树脂，如氯甲基化树脂或溴甲基化树脂；羟甲基化树脂；苯酚树脂，如4-(α-[2，4-二甲氧基苯基]-Fmoc-氨甲基)苯氧基树脂；第三-烷氧羰基-酰肼化的树脂，以及类似物。所述的树脂是商业可用的，它们的制备方法是本领域普通技术人员熟悉的。
本发明的肽的酸形式可以通过固相肽合成步骤来制备，应用苯甲基酯树脂作为固体支持物。相应的醯胺可通过应用二苯甲基胺或甲基二苯甲基胺树脂作为固体支持物来制备。本领域技术人员将意识到，当应用BHA或MBHA树脂时，用无水氢氟酸处理以使多肽从固相支持物上分离，生成具有一个末端氨基基团的多肽。
在偶连反应时，每个在合成中被用到的氨基酸的α-氨基基团都必须被保护，以防止发生涉及反应性α-氨基功能的副反应。某些氨基酸也包含反应性侧链功能基团(如巯基、氨基、羧基、羟基等)，它们也必须用适当的保护基团进行保护，以防止在多肽合成过程中发生在这些位点上的化学反应。保护性基团对于本领域技术人员来说是熟知的，比如参见多肽分析、合成、生物学，卷3在肽合成中保护功能基团(Gross和Meienhofer(编)，学术出版社，纽约(1981))。
在苯甲醚和二甲基硫存在下，通过将不溶性载体或固相支持物在无水的、液体氟化氢(HF)中振荡，从支持物上分离肽并移除保护性基团，该过程在约0℃进行约20至90分钟，优选60分钟；通过发泡溴化氢(HBr)，连续穿过以1mg/10mL悬浮在三氟醋酸(TFA)中的树脂，在室温下持续30至360分钟，主要根据所选择的保护性基团定时间；或，通过将反应柱中用于固相合成的固相支持物与90％三氟乙酸、5％水和5％三乙基硅烷共同孵育30至60秒。也可应用其它苯领域技术人员熟悉的去保护方法。
在已知的天然存在的α-防卫素中存在六个半胱氨酸残基。由半胱氨酸产生的二硫键连接发生在第一个和第六个半胱氨酸之间、第二个和第四个半胱氨酸之间以及第三和第五个半胱氨酸之间。其中，所述的半胱氨酸从肽的N末端至C末端分别编号为一至六。此外，在大多数已知的β-防卫素中存在六个半胱氨酸残基。β-防卫素的半胱氨酸连接发生在第一个和第五个半胱氨酸之间、第二个和第四个半胱氨酸之间以及第三个和第六个半胱氨酸之间，其中，所述的半胱氨酸从肽的N末端至C末端分别编号为一至六。
防卫素分子中半胱氨酸之间二硫键的形成可以用已知的方法实现。比如，在Raj等，同上中，三个分别的硫醇保护基团和一个三阶段处理过程被用于生成二硫键，以最小化不必要的副反应。为了给键的形成提供适当的方向，首先在N末端和C末端的半胱氨酸之间生成一个二硫键桥(参见Hill等，Science，251481-1485，和Pardi等，Biochemistry，3111357-11364)。在其它方法中，六个硫醇基团同步氧化，或进行二阶段处理，生成二硫键(参见Khan，Methods Enzymol.，61339-378和Lauth等，Insect Biochem.Mol.Biol.，281059-1066)。
阳性多肽(即本发明的防卫素多肽)可通过本领域技术人员熟知的肽纯化方法从反应混合物中分离和纯化，如前述的纯化方法。
对本领域技术人员来说，显然可以对本发明的组合物和方法中所用到的防卫素多肽作出很多种改变(如增加、删除或取代)。比如，已经发现，额外的氨基酸可以加入到防卫素多肽的N末端和/或C末端，以提高它们的活性(参见Raj等，Biochem.J.，347633-641(2000))。而且，可以修改防卫素多肽以去除蛋白酶裂解位点(如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶裂解位点)(参见如Selsted等，J.Clin.Invest.，761436-143991985)。典型地，可以用不能被蛋白酶识别的类似氨基酸来取代所述能被蛋白酶识别的氨基酸。由于这种经改变的防卫素多肽可应用于本发明的组合物和方法，因此这种改变(如添加、删除和取代)也落入本发明的范围。
对于本领域的技术人员来说很显然，已知的改变方法也能用于生成活性防卫素多肽，它们中的一个或多个氨基酸与已知天然存在的防卫素多肽不同。可应用这里描述的一种试验方法来测定防卫素的活性。那些具有抗HIV活性的防卫素多肽可被应用于本发明的方法和组合物中。可行的改变方法是定点突变、点错配修复、或寡核苷酸定向突变。
定点突变在本领域中是众所周知的，描述在以下的参考文献中，如Ling等，Anal，Biochem.，254(2)157-178(1997)；Dale等，Methods Mol.Biol.，57369-374(1996)；Smith，Ann.Rev.Genet.，19423-462(1985)；Botstein等，Science，2291193-1201(1985)；Carter，Biochem.J.，2371-7(1986)；以及Kunkel，NucleicAcids & Molecular Biology(Eckstein，F.和Lilley，D.M.J.编，Springer Verlag，柏林(1987))；应用包含尿嘧啶的模板的突变(Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82488-492(1985)；Kunkel等，Methods in Enzymol.，154367-382(1987)；以及Bass等，Science，242240-245(1988))；寡核苷酸定向突变(Methods in Enzymol.，100468-500(1983)；Methods in Enzymol.，154329-350(1987)；Zoller等，NucleicAcids Res.，106487-6500；Zoller等，Methods in Enzymol.，100468-500；以及Zoller等，Methods in Enzymol.，154329-350；硫代磷酸酯-改变的DNA突变(Taylor等，Nucl.Acid.Res.，138749-8764(1985)；Taylor等，Nucl.Acid.Res.，138765-8787(1985)；Nakamaye等，Nucl.Acids Res.，149679-9698(1986)；Sayers等，Nucl.AcidsRes.，16791-802(1988)；以及Sayers等，Nucl.Acids Res.，16803-814(1988))；应用缺口的双股DNA的突变(Kramer等，Nucl.Acids Res.，129441-9456(1984)；Kramer等，Methods in Enzymol.，154350-367(1987)；Kramer等，Nucl.Acids Res.，167207(1988)；以及Fritz等，Nucl.Acids Res.，166987-6999(1988))。
另一种本领域已知的改变方法是定点错配修复，如(Kramer等，Cell，38879-887(1984))，应用修复缺陷宿主菌株的突变(Carter等，Nucl.Acids Res.，134431-4443(1985)；以及Carter，Methods in Enzymol.，154382-403(1987))，删除突变(Eghtedarzadeh等，Nucl.Acids Res.，145115(1986))，限制-选择和限制-纯化(Wells等，Phil.Trans.R.Soc.Lond.，A317415-423(1986))，通过全基因合成的突变(Nambiar等，Science，2231299-1301(1984)；Sakamer等Nucl.AcidsRes.，146361-6372(1988)；Wells等，Gene，34315-323(1985)；以及Grundstrom等，Nucl.Acids Res.，133305-3316(1985))，双链断裂修复(Mandecki(1986)；Arnold，Current Opinion in Biotechnology，4450-455(1993)。“在大肠杆菌(Escherichia coli)质粒中寡核苷酸定向的双链断裂修复一种用于点特异性突变的方法”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，837177-7181)。上述许多方法的更详细的资料可参照酶学方法，卷54，其中也描述了有用的对照标准，用于发现和解决不同突变方法中产生的问题。
寡核苷酸定向突变也可用于在核酸序列中引入位点-特异性突变。这方面技术的例子描述在前述的参考文献中以及这里，如Reihaar-Olson等，Science，24153-57(1988)。类似地，卡式突变也可用于将不同于天然序列的合成寡核苷酸卡替换小区域的双链DNA分子的过程。所述寡核苷酸可包含如完全和/或部分随机的天然序列。
4.重组防卫素的纯化重组防卫素可从任何适当的表达系统中纯化，如下面所描述的。防卫素蛋白可以通过标准技术纯化至基本纯，包括应用如硫酸铵等物质的选择性沉淀法，柱层析法，免疫纯化法以及其它方法(参见如Scopes，Protein PurificationPrinciples andPractice(1982)；美国专利号4,673,641；Ausubel等，同上；以及Sambrook等，同上)。
当进行重组防卫素纯化时，可应用许多种方法。比如，可将具有分子黏附特性的蛋白可逆地融合到防卫素蛋白上；用适当的配体或底物(如抗防卫素抗体或带阴性电荷的底物)将防卫素蛋白选择性吸附到纯化柱上，接着以相对纯的形式从柱上洗下；然后通过酶的作用将融合的蛋白去除；最后，可应用免疫亲和柱纯化防卫素蛋白。重组防卫素蛋白可从任何合适的来源中纯化获得，包括酵母、昆虫、细菌和哺乳动物细胞。
重组蛋白可通过转化的细菌进行大量表达，通常在启动子诱导后产生；但是表达可以是结构性的。用IPTG进行启动子诱导是可诱导性启动子系统的一个例子。根据本领域标准的方法生产细菌。新鲜的或冰冻的细菌细胞被用于分离蛋白。
在细菌中表达的蛋白可形成不溶性聚集体(包涵体)。有些方法适于纯化防卫素蛋白的包涵体。比如，包涵体的纯化包括通过破坏细菌细胞(如将细胞在含50mMTRIS/HCl、pH7.5、50mM NaCl、5mM MgCl2、1mM DDT、0.1mM ATP，以及1mM PMSF的缓冲液中孵育)来抽提、分离和/或纯化包涵体。可通过2-3次穿过French Press来溶解细胞悬浮，用Polytron(Brinkman Instruments)均质化，或在冰上超声降解。溶解细菌的其它可替代方法对于本领域技术人员来说是显而易见的(参见如Sambrook等，同上；Ausubel等，同上)。
如必要，将所述包涵体溶解，将溶解的细胞悬浮液进行离心，去除不需要的不溶物质。通过用适当的缓冲液稀释或透析，形成包涵体的蛋白可被复性。合适的溶剂包括但不限于尿素(约4M-约8M)、甲酰胺(至少约80％，体积/体积)、以及氢氯化胍(约4M-约8M)。一些能够溶解聚集体-形成蛋白的溶剂(比如SDS(十二烷基磺酸钠)、70％蚁酸)不适于应用在这里，因为可能造成蛋白的不可逆变性，使其缺少免疫原性和/或活性。尽管氢氯化胍以及类似试剂是变性剂，其产生的蛋白变性并非是不可逆的，当将所述变性剂移走(比如通过透析)后，蛋白会复性，重新形成具有免疫活性和/或生物学活性的蛋白。其它合适的缓冲液对于本领域技术人员来说是已知的。人防卫素蛋白通过标准的分离技术从其它细菌蛋白中分离，如使用Ni-NTA琼脂糖树脂。
可选择地，从细菌周质中纯化防卫素蛋白也是可能的。在细菌溶解后，当防卫素蛋白被释放到细菌的周质时，细菌的周质片断可通过冷渗压休克以及其它本领域技术人员已知的方法来分离。为了从周质中分离重组蛋白，将细菌细胞离心以形成沉淀。所述沉淀在包含20％蔗糖的缓冲液中重悬。为了溶约10解细胞，将细菌离心并将沉淀物重悬在冰冷的5mM MgSO4中，置于冰上分钟。将细胞悬浮液离心，移出上清备用。通过本领域技术人员已知的标准分离技术，可将存在于上清中的重组蛋白从宿主蛋白中分离。
5.用于纯化重组防卫素蛋白的标准蛋白分离技术a)溶解分离作为初始步骤，特别是当防卫素蛋白混合物很复杂时，初始的盐分离可以从重组蛋白中分离出许多不需要的宿主细胞蛋白。优选的盐是硫酸铵。硫酸铵通过有效地减少蛋白混合物中的水含量来沉淀蛋白。然后蛋白基于各自不同的溶解性而被沉淀，越是疏水的蛋白越容易在低的硫酸铵浓度下沉淀。常用的方法包括在蛋白溶液中加入饱和的硫酸铵，以使硫酸铵的终浓度为20-30％。在该浓度上将能沉淀最多量的疏水蛋白。然后弃去沉淀(除非所需的蛋白是疏水的)，在上清中加入硫酸铵至可沉淀所需蛋白的浓度。然后将沉淀溶解在缓冲液中，如需要可将过量的盐通过透析或过滤移走。其它依赖于蛋白溶解性的方法(如冷乙醇沉淀)是本领域技术人员熟知的，可用于分离复杂的蛋白混合物。
b)尺寸差别过滤可利用防卫素蛋白的分子量来将其与更大的或更小的蛋白分离，在具有不同孔径的膜(如Amicon或Millipore的膜)上超滤。如第一步，使蛋白混合物在具有一定孔径的膜上超滤，所述孔径可使分子量低于所需蛋白的蛋白去除。然后将滞留物在一定孔径的膜上再次超滤，所述孔径可使分子量高于所需蛋白的蛋白去除，重组防卫素蛋白将穿过该膜被滤出。然后可将滤出物进行层析，如下面所描述的。
c)柱层析防卫素蛋白也可基于其大小、净表面电荷、疏水性以及配体亲和力而与其它蛋白分离。此外，可将抗防卫素蛋白的抗体结合到柱基质上，使蛋白被免疫纯化。所有这些方法都是本领域所熟知的。对于本领域人员来说，很显然层析技术可在任何规模下进行，并可使用来自不同厂家的设备(如Pharmacia Biotech)。
D.抑制HIV和病毒感染和复制的方法一“治疗HIV感染和AIDS”如这里所描述的，防卫素蛋白、编码防卫素蛋白的核酸、以及小型有机分子或其片断，提高防卫素活性或表达可抑制HIV，如通过杀死被HIV感染的细胞或通过抑制HIV复制来实现。防卫素可在人体中用于治疗或预防。比如，可应用防卫素来抑制受感染CD4+细胞生成HIV。所述防卫素蛋白、编码防卫素蛋白的核酸、以及小型有机分子可用于使HIV感染者停止向AIDS进展。所述防卫素蛋白、编码防卫素蛋白的核酸、以及小型有机分子也可用于预防，如在接触过或疑为接触过HIV后防止感染或杀死已感染细胞，或防止传播，如通过母婴途径将病毒传播给婴儿。
在本发明的方法中，可应用本领域已知的用于向个体进行核酸和蛋白治疗性给药的方法，来治疗或预防HIV感染，如细胞内转染、基因治疗、用给药媒介物或药学上可接受的载体直接给药、或调节序列以提高内源蛋白的生成。比如，如前面所解释的，本发明第一次证明了CD8+细胞能生成α-防卫素，其以前被认为是由CAF活性引起的。同样地，可通过施用受激的能生成防卫素的CD8+细胞来将防卫素输送到人体。在一种方法中，通过已知的扩展细胞的方法先体外后体内扩展CD8+细胞。然后测定所述细胞培养物能否生成防卫素。其后，将能够生成一定量防卫素的细胞引入到人体。所述细胞可获自所需治疗的人体内，或可选择地，所述细胞可来自其他个体。然而，优选施用的细胞是HLA-匹配的，以避免引起对抗细胞的免疫应答。
可使用检测HIV感染及AIDS进展的标准试验方法来测定受试者对于防卫素治疗是否呈现阳性。比如，在施用防卫素后，监控受试者的T细胞数，T细胞数升高表明受试者是受益于防卫素治疗的。此外，如Levy等，Immunology Today1 7，5223(1996)中所描述的“内源性试验”或“急性感染试验”可被用于检测受试者体内CD8+细胞的抗HIV应答。比如，在急性感染试验中，来自非感染个体的CD4+细胞被急性HIV感染，与来自感染个体的CD8+细胞以不同的CD8+/CD4+细胞比率一起培养。通过测定病毒生成的降低程度来确定抗病毒有效性。通过测定本发明的重组CD8+细胞所引起的病毒生成的降低程度，可进一步确定哪一种本发明的方法在抑制病毒生成方面是最有效的。
如前面所解释的，已经发现防卫素多肽具有抗病毒活性。同样地，可应用防卫素多肽抑制大量的不同病毒，因而，可治疗人体内的许多种病毒感染。防卫素多肽可抑制的病毒包括但不限于DNA病毒、RNA病毒以及反转录病毒。防卫素多肽可抑制的病毒的例子包括但不限于疱疹病毒、肝炎(A、B和C)病毒、流感病毒、POX病毒、Rhino病毒以及HTLV(人T细胞白细胞)病毒(如HTLV 1和2)。基于其抗病毒活性，本领域技术人员可以意识到可被防卫素多肽所抑制的其它病毒)。
1.细胞内转化和基因治疗本发明提供了防卫素蛋白的核苷酸序列，可用于体外和体内转染细胞。这些核酸可被插入到许多已知载体的任何一种中，用于转染靶细胞和有机物，如下面所描述的。核酸在先体外后体内或体内通过载体与靶细胞的相互作用被转染到细胞中。然后核酸在启动子的控制下，表达本发明的蛋白，从而减轻因防卫素基因含量低、缺少、部分失活或不正常表达所造成的影响，由于当与病毒感染相关时，如HIV感染。所述组合物以足以在体内引起治疗反应的量给予患者，一种足够实现该目标的量被定义为“治疗有效剂量或量”。
在另一方面，本发明提供了在人体内抑制HIV感染的方法，包括向细胞中转染包含编码防卫素多肽核苷酸序列的核酸，其中，所述核酸包含一个可诱导性启动子，操作性连接到编码防卫素的核苷酸序列上。在一个实施方案中，来自真核载体的防卫素的表达可应用诱导性启动子来调节，由于是诱导性启动子，表达水平依赖于诱导剂(如四环素或蜕化素)的浓度，通过在启动子中结合入这些试剂的反应因子来调节。通常，仅仅当诱导剂存在时才能获得高水平表达；基本表达水平是最低的。当所需蛋白不利于在真核细胞表达时，选择可诱导性表达载体。其它调节结构，如增强子，可用于提高防卫素多肽的表达。
所述基因治疗方法已经被用于纠正获得性和遗传性缺陷、癌症以及其它许多疾病。在人体表达人造基因的能力使本发明能够预防和/或治疗许多重要的人类疾病，包括许多对其它治疗方法无反应的疾病(如需回顾基因治疗方法，可参见Aderson，Science，256808-813(1992)；Nabel等，TIBTECH，11 211-217(1993)；Mitani等，TIBTECH，11162-166(1993)；Mulligan，Science，926-932(1993)；Dillon，TIBTECH，11167-175(1993)；Miller，Nature，357455-460(1992)；Van Brunt，Biotechnology，6(10)1149-1154(1998)；Vigne，Restorative Neurology and Neuroscience，835-36(1995)；Kremer等，British Medical Bulletin，51(1)31-44(1995)；Haddada等，在微生物学和免疫性近期热点(Doerfler和Bohm编，1995)中；以及Yu等，GeneTherapy，113-26(1994))。
在本发明的另一个方面，防卫素核酸没有通过转染被引入到细胞，取而代之的是一个内源性调节子序列，如启动子或增强子、一种编码或非编码的外源外显子、一种接合供体位点被引入基因组中预先选择的位置，用于与防卫素基因同源重组。应用这些方法，外源提供的表达序列与基因组DNA进行重组，使防卫素能在人的细胞中生成，应用天然存在的内源外显子编码这些蛋白。所述方法描述于美国专利号5,733,746中，该专利已授权于Treco等。
2.药物组合物以及给药药学上可接受的载体部分由所需给药的特定组合物(如核酸、蛋白、调节化合物如小型有机分子或转导细胞)，以及用于该组合物的特定给药方法来决定。本发明所需给药的药物组合物包含蛋白、核酸小型分子、以及类似物。因此，有许多合适的配方都可用于本发明的药物组合物(参见如Remington’s Pharmaceutical，第17版，1989)。可以用任何便利的方式进行给药，如注射、口服、吸入、透皮或直肠给药。
适用于口服给药的制剂可包括(a)液体溶液，如有效量的经包装的核酸悬浮在稀释液中，如水、盐水或PEG 400；(b)胶囊、软囊或片剂，各自包含给定量的活性组分，如液体、固体、颗粒或明胶；(c)选用合适液体的悬浮液；以及(d)合适的乳剂。片剂形式可包括一种或多种乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、磷酸钙、玉米淀粉、土豆淀粉、微晶纤维素、明胶、胶质二氧化硅、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸、以及其他赋形剂、着色剂、填充剂、粘合剂、稀释剂、缓冲剂、湿润剂、防腐剂、调味剂、染料、分解剂、以及药学相容性载体。锭剂形式可包含具有一种味道的活性组分，如蔗糖，并且，锭剂包含在惰性基质上的活性组分，惰性基质如明胶和甘油和阿拉伯树胶乳剂、凝胶、以及类似物，以及本领域已知的活性成分、载体。
所选择的化合物可以单独或与其他适当组分组合的方式制成气雾剂(即它们可被“气雾化”)，以通过吸入的方式给药。气雾剂中可加入加压可接受的推进物，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮以及它们的类似物。
适于肠胃外给药(如通过关节内(在关节中)、静脉内、肌肉、皮内、腹膜内和皮下途径给药)的制剂包括水溶液和非水溶液的等渗无菌注射溶液，其中可包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂以及使制剂与接受者血液等渗的溶质；以及水溶液和非水溶液的无菌悬浮液，其中可包含悬浮剂、增溶剂、增厚剂、稳定剂和防腐剂。在本发明的实践中，比如，组合物可通过静脉灌输、口服、局部、腹膜内、膀胱内或胸内给药。肠胃外给药和静脉内给药是优选的给药方式。制剂可以以单位剂量或多剂量存在于密封的容器中，如安瓿瓶和小瓶。
注射溶液和悬浮液可从前述形式的无菌粉末、颗粒和片剂来制备。用于体内治疗的转导了核酸的细胞也可采用如前所述的静脉内或肠胃外给药。
在多肽化合物的施用中，一个重要因素是确保所述多肽能够穿透细胞质膜或细胞内组件(如细胞核)的膜。细胞膜包含脂蛋白双层膜，其允许小的非离子亲脂性化合物自由穿透，本能地不允许极性化合物、大分子和治疗或诊断剂穿透。然而，蛋白和其他化合物如脂质体具有转运多肽使其穿过细胞膜的能力。
此外，改变多肽的特性是重要的，使多肽降低“粘性”而不形成聚集体或不结合到其它蛋白，或使多肽提高药效(如具有长的半衰期)并更稳定(如在血清中更稳定或便于储存)，如可通过PEG化所述蛋白或将所述蛋白与脂质体或其它结构域偶连。给予蛋白信号肽、前导序列或用于在体内或体外分泌的分泌肽也是重要的。应用一个靶向结构也可使本发明的防卫素多肽特异性靶向到细胞上，比如应用可结合到CD4+细胞的细胞表面分子上的配体，如抗体、配体、受体等。因此，本发明提供了所述防卫素的输送载体，以及带有异源结构域的融合蛋白，所述异源结构域具有稳定化、特异输送或靶向、分泌、提供检测标记等能力。在一个实施方案中，所述融合蛋白包含一个白蛋白结构域和一个防卫素结构域。所述白蛋白结构域至少是白蛋白的一部分(如人白蛋白)，足以延长防卫素的生存期。这种结构在国际PCT公开号WO01/79480，2001年10月5日(Rosen等，“白蛋白融合蛋白”)中有更详细的描述。
例如，“膜置换多肽”具有两性的或疏水的氨基酸亚序列，具有作为膜转运载体的能力。在一个实施方案中，同源结构域蛋白具有穿过细胞膜转运的能力。已发现，最短的同源结构域蛋白Antennapedia的可内化肽是所述蛋白的第三个螺旋，从氨基酸位置43至58(参见如Prochiantz，Current Opinion in neurobiology，6629-634(1996))。发现另一条亚序列，即信号肽的h(疏水)区域，具有相似的细胞膜转运特性(参见如Lin等，J.Biol.Chem.，270(1)14255-14258(1995))。
肽序列的例子包括但不限于HIV转移活化蛋白的11个氨基酸的肽；一20个残基的肽序列，其相应于p16蛋白的氨基酸84-103(参见Fahraeus等，Current Biology，684(1996))；Antennapedia的60氨基酸长同源结构域的第三个螺旋(Derossi等，J.Biol.Chem.，26910444(1994))；信号肽的h区域，如Kaposi成纤维细胞生长因子(K-FGF)的h区域(Lin等，同上)；或来自HSV的VP22转运区域(Elliot等，Cell，88223-233(1997))。其它可提高细胞吸收的合适的化学部分也可化学性连接到本发明的防卫素上。
毒素分子也具有运输多肽穿过细胞膜的能力。这种分子(称为“双体毒素”)经常由至少两部分组成(1)一个转运或结合区域或多肽，以及(2)一个分离的毒素区域或多肽。典型地，转运区域或多肽结合到细胞受体上，然后所述毒素被运输进入细胞。一些细菌毒素，包括产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringen.s)ι毒素、白喉毒素(DT)、假单胞菌(pseudomonas)外毒素A(PE)、百日咳毒素(PT)、炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)毒素、以及百日咳腺苷环化酶(CYA)，已经被尝试用于递送肽到细胞质中，作为内部或氨基末端融合物(Arora等，J.Biol.Chem.，2683334-3341(1993)；Perelle等，Infect.Immun.，615147-5156(1993)；Stenmark等，J.Cell.Biol.，1131025-1032(1991)；Donnelly等，PBAS，903530-3534(1993)；Carbonetti等，Abstr.Annu.Meet.Am.Soc.Microbiol.，95295(1995)；Sebo等，Infect Innum.，633851-3857(1995)；Klimpel等，PNAS U.S.A.，8910277-10281(1992)；Novak等，J.Biol.Chem.，26717186-17193(1992)；以及美国专利号5,602,095、4,892,827和5,608,039)。
所述亚序列可被用于转运防卫素穿过细胞。防卫素可方便地与所述序列融合或衍生化。典型地，转运序列以融合蛋白的一部分来提供。可选择地，可用连接序列来连接防卫素和转运蛋白。可应用任何合适的连接序列，如肽连接序列或其它化学连接序列。
防卫素也可被导入到动物细胞中，优选哺乳动物细胞，通过微粒和脂质体以及脂质体衍生物如免疫脂质体导入。术语“脂质体”是指包含一个或多个共中心排列的脂质双层的运输载体，其中封装了一个水相，水相中通常包含需要输送到细胞的化合物。
脂质体与质膜融合，从而将药物释放到细胞质中。可选择地，脂质体被细胞吞噬或吸收。一旦在内涵体或吞噬体中，脂质体或者被降解或者与细胞膜融合，释放出其内容物。
在现在的借助脂质体的药物递送方法中，脂质体最终变成为可渗透的并释放出封装在内的化合物至靶组织或细胞。对于系统性或组织特异性递送，这可以通过被动的方式来完成，脂质体双层通过体内的不同试剂的作用发生降解。可选择地，活性药物的释放包括应用一种试剂来诱导脂质体运载体中的渗透性改变。可构建脂质体膜，使它们在脂质体膜周围的环境变成酸性后变得不稳定(参见如PNAS，847851(1987)；Biochemistry，28908(1989))。比如，当脂质体被靶细胞内吞时，它们变得不稳定并释放出内容物。所述不稳定化被称为融合。二硫酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)是许多“融合”系统的基础。
所述脂质体通常包含一种被选择的防卫素以及一种脂质组分，如中性和/或阳性脂质，可选择地，包括一种受体识别分子如抗体，结合到预先确定的细胞表面受体或配体(如抗原)上。许多方法可用于制备脂质体，如以下所描述的Szoka等，Ann.Rev.Biophys.bioeng.，9467(1980)；美国专利号4,186,183、4,217,344、4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,744,085、4,837028、4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,744,085、4,837,028、4,946,787；PCT公开号WO91/17424；Deamer等，Biochem.Biophys.Acta.，443629-634(1976)；Fraley等，PNAS，763348-3352(1979)；Hope等，Biochem.Biophys.Acta.，81255-65(1985)；Mayer等，Biochem.Biophys.Acta.，858161-168(1986)；Willians等，PNAS，85242-246(1988)；脂质体(Ostro(编)，1983，第一章)；Hope等，Chem.Phys.Lip.，4089(1986)；Gregoriadis，脂质体技术(1984)以及Lasic，脂质体从物理学到应用(1993))。合适的方法包括比如超声波降解法、挤压法、高压/均质化、微流化、去垢剂透析、钙诱导的小脂质体运载体融合和醚融合，所有这些都是本领域熟知的。
在本发明的某些实施方案中，可以靶向本发明的脂质体，应用对特定细胞型、组织和类似物特异的靶向结构域。引用不同靶向结构域(如配体、受体和单克隆抗体)的脂质体的靶向在以前已经被描述过了(参见如美国专利号4,957,773和4,603,044)。
可应用标准的方法将靶向试剂偶连到脂质体。这些方法通常包括在脂质体中合并入脂质组分，如磷脂醯乙醇胺，其能被活化，用于附着到靶向试剂；或衍生化的亲脂性化合物，如脂质衍生化的博莱霉素。也可构建抗体靶向的脂质体，比如应用合并入蛋白A的脂质体(参见Renneisen等，J.Biol.Chem.，26516337-16342(1990)以及Leonetti等，PNAS，872448-2451(1990))。
在另一个实施方案中，本发明的防卫素多肽可被用作佐剂。更特别地，防卫素多肽可被用作佐剂来推进免疫原性。同样的，防卫素多肽或编码所述防卫素多肽的核酸可被用于与疫苗或其它抗原结合，以提高抗原性应答。
本发明的方法能在受试者中治疗或预防HIV感染。足够实现所述目的防卫素的量定义为“治疗有效量”。防卫素或防卫素制剂的单次或多次给药依赖于所需的剂量和频率以及患者的耐药能力。所述制剂中应含有足够量的活性试剂，即防卫素，以有效地治疗或预防HIV感染和AIDS。
在本发明的上下文中，给予患者的剂量应在一段时间内在患者体内产生足够有益的治疗反应。剂量将由所使用的特定给药方法的效力，施用的组合物如核酸、多肽或小型分子，患者的状况，以及患者的体重和表面面积来决定。剂量的大小也将由存在状态，特征，伴随特定防卫素组合物的给药所产生的任何有害副作用的程度，或特定患者中转导的细胞类型来决定。
在给药时，本发明的组合物以由候选化合物的LD-50、以及在不同浓度上候选化合物的副作用所确定的给药率给药，以施用于体质整体健康的患者来计算。通常，所述剂量的范围为从1μg至100mg每kg体重，从1μg至1mg每kg体重，或从10μg至10mg每kg体重。普通技术人员将理解，其它剂量范围也可能是合适的并可能被发现。比如，一种特定的组合物可能在更高或更低的剂量时更有效。通过应用这里描述的方法来评估受试者，一个熟练的从业者将能够确定受试者是否对治疗产生反应，并将得知如何调节相应的剂量水平。
联合治疗在众多实施方案中，本发明的防卫素蛋白可与其它一种或多种附加化合物或疗法结合给药。比如，可共同施用多种防卫素多肽，或者一种或多种防卫素多肽可与一种或多种治疗化合物连接。在一种实施方案中，其它治疗剂是一种用于预防或治疗HIV感染的治疗剂。在另一种实施方案中，其它治疗剂是一种用于治疗与HIV感染相关的机会感染和/或用于治疗或预防HIV感染的试剂。
用于与本发明的防卫素多肽结合的合适的治疗试剂包括但不限于蛋白酶抑制剂、非核苷反转录酶抑制剂、核苷反转录酶抑制剂、抗逆转录病毒核苷、融合抑制剂、进入抑制剂以及其它对抑制或治疗HIV感染有效的抗病毒剂。合适的治疗剂的进一步的例子包括但不限于齐多夫定、地达诺新、司他夫定、干扰素、拉米呋啶、阿德福韦、奈韦拉平、地拉韦啶(delaviridine)、洛韦胺、沙奎那韦、茚地那韦、AZT、T20、T22以及T2。其它合适的治疗剂包括但不限于抗体或其它抗病毒剂，如阿昔洛韦。在另一个实施方案中，防卫素多肽与可溶形式的HIV共同受体共同给药，如CCR5的CXCR4。自然地，所述共同受体是膜蛋白，包含一个胞外部分、一个跨膜部分和一个胞内部分。它们可通过去除跨膜和胞内部分而制成可溶形式。这些部分可以被重组排除，从而细胞外部分可表达为重组蛋白，单独或融合蛋白的一部分。
其它本领域已知的结合疗法可被用于与本发明的方法相结合。
E.诊断和预后应用本发明的防卫素分子，如核酸和蛋白对于诊断和预后也是有用的。比如，在生物样品(如组织或血清样品)中防卫素水平的提高预示了延迟或非进展到AIDS，或T细胞数低于一定水平，如200。在一个实施方案中，将CD8+细胞分离出来，在体外激活，测量防卫素水平。提高的防卫素水平(如在人组织如嗜中性粒细胞中)与HIV感染的受试者的长期存活有关。因此，通过检测个体中的防卫素水平，可对个体的疾病状态作出判断。如这里所解释的，现在已经发现，与具有低防卫素水平的个体相比，具有提高的防卫素水平的个体不易于进展到AIDS。防卫素水平也可被用于选择和确定抗病毒药物、剂量以及治疗周期。因此，本领域技术人员已知的用于检测核酸和蛋白的方法可用于诊断和预后HIV感染以及向AIDS进展的情况，如PCR、northern和southern印迹，反转录和mRNA扩增、总RNA或多聚A+RNA的分离、点印迹、核酸阵列、western印迹、原位杂交、免疫试验如免疫沉淀、ELISA、蛋白质体学测定、多核苷酸试验技术，以及类似方法。
例如，应用核苷酸探针阵列来检测mRNA分布表达的方法被描述在美国专利号6,040,138、欧洲专利号853,679以及PCT公开号WO97/27317中。所述方法应用可互补到所需mRNA靶系列的探针组。一种mRNA分布或其扩增产物与所述阵列相应，则所需的靶点被鉴定出，并且可任选地，从特异性结合到互补探针的程度进行量化。可任选地，已知与靶点错配的结合可用于测量背景非特异结合，并从与互补探针特异的结合中减除。
因此，在本发明中，编码防卫素蛋白的核酸可与寡核苷酸点阵技术(高密度或低密度(如GeneClipTM))结合应用，来鉴定编码防卫素蛋白的cDNA、直向同源物、等位基因、保守性改变变体、以及多态变体。当被鉴定的同源物被连接到病毒感染的调节剂上时，它们可与GeneClipTM阵列结合应用，作为诊断工具测定生物样品中的疾病，参见如Gunthand等，AIDS Res.Hum.Retroviruses 14869-876(1998)；Kozal等，Nat.Med.2753-759(1996)；Motson等，Anal.Biochem.，224110-106(1995)；Lockhart等，Nat.Biotechnol.141675-1680(1996)；Gingeras等，Genome Res.，8435-448(1998)；Hacia等，Nucleic Aicds Res.，263865-3866(1998)。
1.防卫素多肽的免疫检测在本发明中，除了应用核酸杂交技术来检测防卫素基因和基因表达，免疫测定也可用于检测防卫素蛋白。所述测定对于筛选防卫素的调节剂是有用的，同时也具有治疗和诊断应用。免疫测定可被用于定性地或定量地分析防卫素蛋白。通常可适用的技术的概括可参见Harlow和Lane，AntibodiesA Laboratory Manual(1988)。
可与防卫素蛋白特异性反应的多克隆和单克隆抗体的制备方法是本领域技术人员已知的(参见如Coligan，Current Protocols in Immunology(1991)；Harlow和Lane，同上；Goding，Monoclonal AntibodiesLPriciples and Practice(第二版，1986)；以及Kohler和Milstein，Nature 256495-497(1975))。所述技术包括从存在于噬菌体或类似载体中的重组抗体文库中选择抗体，制备出抗体；以及通过免疫兔或小鼠，制备多克隆和单克隆抗体(参见如Huse等，Science，2461275-1281(1989)；Ward等，Nature，341544-546(1989))。
许多包含防卫素蛋白的一部分的免疫原可被用于制备与防卫素蛋白特异性反应的抗体。比如，如这里所描述的，重组或化学合成的防卫素蛋白或其抗原片断可被分离。如前所述，重组蛋白可在真核或原核细胞中表达，并按照常规的方法纯化。可选择地，从这里所公开的序列获得合成的肽，并偶连到载体蛋白上，可被用作免疫原。天然存在的蛋白也可以纯的或不纯的方式被应用。然后将所述产物注入一种能生成抗体的动物中。既可生成单克隆抗体，也可以生成多克隆抗体，它们可后续用于免疫测定，检测所述的蛋白。
多克隆抗体的制备方法是本领域技术人员已知的。一种小鼠近交系(如BALB/C小鼠)或兔用所述蛋白以及标准的佐剂(如弗氏佐剂)进行免疫，并使用一种标准的免疫方案。动物对免疫原的免疫应答通过提取测定血液来监测，确定与β亚基的反应效价。当获得适当高的抗体效价时，从动物中采集血液，制备抗血清。如果需要，可进一步分离抗血清，使之富含对蛋白有反应性的抗体。
可通过本领域技术人员熟悉的很多技术来获得单克隆抗体。简要地说，从经特定抗原免疫的动物中获得脾细胞，进行永生化，与骨髓瘤细胞融合(参见kohler等，Eur.J.Innunol.，6511-519(1976))。可选择的永生化方法包括用Esptein Barr病毒、致癌基因或逆转录病毒转化，或采用其它本领域已知的方法。筛选从单个永生化细胞生长起来的集落，找出对所述抗原具有所需特异性和亲和力的抗体产物，并且可通过很多技术来提高从所述细胞中生产单克隆抗体的水平，包括注射入脊椎动物的腹膜腔中。可选择地，可根据Huse等，Science，2461275-1281(1989)中所论述的大致方案，通过筛选来自人B细胞的DNA文库，分离出编码单克隆抗体或其结合片段的DNA序列。
收集单克隆抗体和多克隆血清，并在免疫测定中确定其对抗抗原蛋白的效价，例如，可采用固相免疫测定，免疫原被固定在一种固体支持物上。典型地，选择具有104或更高效价的多克隆抗体，应用竞争结合免疫测定，测定其与非防卫素蛋白的交叉反应能力。特定的多克隆抗血清和单克隆抗体通常以至少约0.1mM的Kd结合，更特别地至少约1μM，更优选至少约0.1μM或更佳。也可通过减除其它交叉反应的来自某些物种(如非人哺乳动物)的直向同源物，制备仅对特定防卫素直向同源物(如人防卫素蛋白)特异的抗体。在这种方式下，获得仅仅结合到防卫素蛋白的抗体。
一旦获得了可用的抗防卫素蛋白特异抗体，所述蛋白可以通过许多免疫测定方法来检测。并且，所述抗体可作为防卫素调节剂发挥治疗作用。免疫学和免疫测定方法可参见Basic and Clinical Immunology(Stites和Terr编，第7版，1991)。此外，本发明中的免疫测定方法可在任何以下配置方案中进行，详尽地概括在酶学免疫测定(Maggio编，1980)；以及Harlow和Lane，同上(参见如美国专利号4,366,241；4,376,110；4,517,288；以及4,837,168)。如需参考普通免疫测定方法，也可参见细胞生物学方法细胞生物学中的抗体，第37卷(Asai编，1993)；Basic andClinical Immunology(Stites和Terr编，第7版，1991)。经典的免疫结合测定(或免疫测定)应用一种特异性结合到所选蛋白或抗原(在本发明中指防卫素蛋白或其抗原性亚序列)的抗体。所述抗体(如抗防卫素)可通过任何本领域技术人员熟知的手段来制备，如前面所描述的。
在测定试验中采用的特定标记或检测基团不是本发明的重要方面，只要其不会明显干扰测定所用抗体的特异结合即可。所述检测基团可以是任何具有可检测性物理或化学特性的材料。在免疫测定领域，所述检测标记已经得到了很好的发展，一般情况下，任何在所述方法中有用的标记可被应用于本发明。因此，标记是任何可被分光镜、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段检测到的组合物。在本发明中有用的标记包括磁珠(如DYNABEADSTM)、荧光染料(如异硫氰酸荧光素、Texas红、若丹明以及类似物)、放射标记(如3H、125I、35S、14C以及32P)、酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和其它在ELISA中常用的试剂)、以及比色标记如胶体金、有色气体或塑料珠(如聚苯乙烯、聚丙烯、橡胶等)。
根据本领域熟知的方法，所述标记可直接或间接偶连到所需的免疫测定组分上。如前面所指明的，可以应用许多种标记，标记的选择取决于灵敏度要求、与化合物结合难易程度、稳定性要求、可用的仪器设备、以及处理措施。
非放射性标记经常通过间接的方式附着连接。通常，配体分子(如生物素)共价地结合到所述分子上，然后再结合到另一种分子(如链霉亲和素)上，其本身可被检测或共价地结合到一种信号系统上，如可检测的酶、荧光化合物或化学发光化合物。所述配体以及它们的靶点可被用于与任何合适的识别防卫素蛋白的抗体或识别抗-防卫素的第二抗体结合使用。
所述分子也可直接偶连到信号生成化合物上，如与酶或荧光团。可作为标记的酶主要是水解酶，特别是磷酸酶、酯酶和糖苷酶；或氧化物酶，特别是过氧化物酶。荧光化合物包括荧光素以及它的衍生物、若丹明以及它的衍生物、丹磺酰、7-羟基香豆素等。化学发光化合物包括虫萤光素、2，3-二氢酞嗪二酮，如鲁米诺(luminal)。如需参考可用的标记或信号生成系统，可参见美国专利号4,391,904。
检测标记的方式是本领域技术人员熟知的。比如，当所述标记是一种放射活性标记，检测的方式包括闪光计数或进行自动射线照相获得摄影胶片。当标记是一种荧光标记，可通过用合适的波长激活荧光染料进行检测，并检测获得的荧光。所述荧光可通过视觉观测，或应用电子探测器如电荷耦合装置(CCD)或光电倍增器以及类似仪器来检测。类似地，酶标记可通过应用合适的酶底物，并检测结果获得的反应产物。比色或化学发光标记可简单地通过观察与标记相关的颜色来检测。因此，在很多不同的测定试验中，偶连的金经常呈现粉红色，而很多偶连的珠呈现珠本身的颜色。
一些测定被设计成无需应用经标记的化合物的形式。比如，凝集试验可被用于检测靶抗体的存在。在这种状况下，当试样中包含靶抗体时，抗原包被的颗粒就会发生凝集。应用这种方式，没有组分需要进行标记，靶抗体的存在仅通过简单的目测就可确定。
2.防卫素多肽的SELDI检测除了应用核酸杂交技术和免疫学技术检测防卫素基因表达，表面-增强的激光解吸/电离(SELDI)也可用于检测本发明的防卫素，或用于检测调节或结合到防卫素的化合物。SELDI是指一种解吸/电离气体相离子光谱法(如质谱法)，其中，被分析物被捕获到SELDI探针的表面上，使探针与气相离子光谱仪接触。在“SELDI MS”中，气相离子光谱仪是质谱仪。在一些实施方案中，SELDI包括将被分析物捕获到固相支持物上，如质谱探针表面，用一种可从混合物中捕获靶分析物的吸附剂衍生化。经典地，一种基质材料被应用于所述的被分析物，并且用激光解吸质谱仪来检测被分析物。应用的吸附剂可以是色谱的或生物特异的。SELDI技术描述在美国专利号5,719,060(Hutchens和Yip)以及美国专利号6,225,047(Hutchens和Yip)中。基于SELDI的生物芯片和仪器可获自Ciphergen生物系统公司，CA。
“表面-增强的亲和捕获”或“SEAC”是SELDI的改变形式，涉及应用包含一种吸附表面的探针(一种“SEAC探针”)。“吸附表面”是指一种结合了吸附剂(也称为“捕获试剂”或“亲和试剂”)的表面。吸附剂可以是任何能够结合分析物(如靶多肽或核酸)的材料。“色谱吸附剂”是指一种通常用于色谱分析的材料。色谱吸附剂包括比如离子交换材料、金属鳌合剂(如乙酸腈或乙酰乙酸亚氨)、固定的金属鳌合物、疏水反应吸附剂、亲水反应吸附剂、染料、单生物分子(如核苷酸、氨基酸、单糖和脂肪酸)以及混合形式吸附剂(如疏水吸引/静电排斥吸附剂)。“生物特异吸附剂”是指一种包含生物分子的吸附剂，如包含核酸分子(如适配体)、多肽、多糖、脂质、类固醇或它们的偶连体(如糖蛋白、脂蛋白、醣脂、核酸(如DNA)-蛋白偶连体)。在某些例子中，生物特异吸附剂可以具有大分子结构，如多蛋白复合体、生物膜或病毒。生物特异吸附剂通常具有比色谱吸附剂更高的靶分析物特异性。应用于SELDI的吸附剂的其它例子可参见美国专利6,225,047(Hutchens和Yip，“应用滞留色谱法来生成不同的图谱”，2001年5月1日)。
在一些实施方案中，SEAC探针被给予一种预-活化的表面，其可被改变以获得所需的吸附剂。比如，某些探针被给予一种反应性结构域，能够通过共价键结合生物分子。环氧化物和carbodiimidizole是有用的反应性结构域，可共价连接生物特异性吸附剂，如抗体或细胞受体。
“表面-增强洁净解吸”或“SEND”是SELDI的一种改变形式。涉及应用包含化学结合到探针表面的能量吸附分子的探针(SEND探针)。“能量吸附分子”(EAM)是指能够从一种激光解吸/电离来源吸附能量，然后将能量用于与其接触的分析物分子的解吸/电离分子。所述短语包括应用于MALDI的分子，经常被称为“基质”，并且明显地包括苯乙烯酸衍生物、芥子酸(SPA)、氰基羟基苯乙烯(CHCA)和二羟苯甲酸、阿魏酸、氢苯乙酮衍生物，以及其它。其也包括应用于SELDI的EAM。在某些实施方案中，能量吸附分子被加入一种线性或交叉聚合体，如聚甲基丙烯酸酯。例如，所述组合物可以是α-氰基-4-异丁烯酰氧基肉桂酸(α-cyano-4-methacryloyloxycinnamic acid)和丙烯酸盐共-聚体。在另一个实施方案中，所述组合物是α-氰基-4-异丁烯酰氧基肉桂酸、丙烯酸盐和3-(三甲氧基)甲硅烷基甲基丙烯酸丙脂共聚体。在另一个方面，所述组合物是α-氰基-4-异丁烯酰氧基肉桂酸和十八烷基甲基丙烯酸的共聚体(C18 SEND)。SEND还描述在美国专利号5,719,060以及提交于2002年9月4日的美国专利申请号60/408,225(Kitagawa，“具有能量吸附结构域的单体和多聚体在分析物的解吸/电离中的应用”)中。
“表面-增强的光不稳定附着和释放”或“SEPAR”是SELDI的一种改变形式，涉及具有可附着到表面的结构域的探针的应用，其可共价地结合分析物，然后通过与光接触(如激光)，断裂结构域中的光不稳定键，释放出所述分析物。SPEAR还描述在美国专利号5,719,060中。
“吸附”是指分析物与吸附剂或捕获剂的非共价结合。“洗脱液”或“洗涤溶液”是指一种通常是溶液的试剂，其可用于影响或改变分析物与吸附表面的吸附和/或从表面上移走未吸附的材料。洗脱液的洗脱性质可取决于如pH、离子强度、疏水性、离液程度、洗涤剂强度和温度。“固相支持物”是指一种固体材料，其能与化学结构域如捕获剂、反应结构域或能量吸附类物质衍生化，或附着到其上。可用的固相支持物包括芯片(如探针)、微量滴定板和层析树脂。“芯片”是指一种固相支持物，具有一个平坦的表面，化学结构可附着其上。适用于形成探针接触的芯片也称为“探针”。“生物芯片”是指一种附着了化学结构的探针。经常地，探针的表面包含一种较多的定址位点，每个位点上附着了化学结构。“蛋白芯片”是指一种适用于捕获蛋白的生物芯片。本领域已经报导了许多种蛋白芯片，包括比如由Ciphergen生物系统公司(弗里蒙特，CA)、Packsrd生物科学公司(Meriden CT)、Zyomyx(海达德，CA)以及Phylos(莱克星顿，MA)所生产的蛋白芯片。这些蛋白芯片的例子描述在以下的专利或专利申请中美国专利号6,225,047(Huntchens和Yip，“应用滞留色谱法生成不同图谱”，2001年5月1日)；国际PCT公开号W099/51773(Kuimelis和Wagner等，“可定址的蛋白测定”，1999年10月14日)；美国专利号6,329,209(Wagner等，“蛋白捕获剂及其应用方法的试验”，2001年12月11日)；以及国际PCT公开号WO 00/56934(Englert等，“多孔基质试验”，2000年9月28日)。
在本发明的一个方面，防卫素可以在色谱的或生物特异的SELDI生物芯片上进行检测。已经发现，防卫素在具有阳离子交换表面的SELDI生物芯片(WCX2 ProteinChip点阵，Ciphergen生物系统公司)上可很好地被分辨。所述样品被应用于芯片并可进行孵育以促进吸收。然后将生物芯片在100mM乙酸钠、pH4.5、以及含0.2％Triton-X100的PBS缓冲液中洗涤。蛋白通过质谱仪来检测。α-防卫素呈现三组峰，约在3371D、3443D以及3484D。
可选择地，防卫素可在具有防卫素特异性抗体的SELDI生物芯片上检测。在一个实施方案中，SELDI生物芯片包含一些功能基团，如通过将抗体在生物芯片表面上与反应缓冲液孵育，将carboxodiimizole或环氧化物(如PS10或PS20 ProteinClip点阵，Clihergen Biosystems公司)与抗体衍生化。然后将所述样品施加于芯片表面，孵育以促进结合，并且洗涤。蛋白通过质谱仪来检测。
在被生物芯片捕获后，防卫素(或防卫素调节剂以及结合防卫素的化合物)可应用质谱仪来检测，特别是应用如前所述的SELDI进行检测。在质谱仪中生成的数据起始于由离子检测器检测到离子。典型的激光解吸质谱仪可应用一种在337.1nm的氮激光。一种有用的脉冲宽度约在4毫微秒。通常地，使用的能量输出约为1-25μJ。撞击到检测器的离子生成一种电潜能，然后被一种数字捕获类似物信号的高速时间-点阵记录仪器数字化。Ciphergen的ProteinClip系统提供了一种类似物-到-数字的变换器(ADC)来实现上述功能。所述ADC在规律性分布的间隔时间里将检测器的输出整合为时间-依赖的数据。所述时间间隔通常为一至四毫微秒。此外，最终分析的飞行时间光谱并非代表来自电离能量的单脉冲的信号，而是综合了来自一定数量脉冲的信号，这降低了噪音并且提高了动态范围。然后将所述的飞行时间数据进行数据处理。在Ciphergen的ProteinClip软件中，数据处理通常包括TOF-to-M/Z转化、基线减除、高频率噪音过滤。
TOF-to-M/Z转化包括应用一种算法，将飞行时间转化为质荷比(M/Z)。在该步骤中，信号被从时域转换成质域。也就是说，每个飞行时间被转换为质荷比或M/Z。校准可在内部或外部进行。在内部校准中，被分析的样品中包含一种或多种已知M/Z的分析物。飞行时间的信号峰代表那些测量过的分析物给定的已知的M/Z，基于这些给定的M/Z比率，可计算出参数，获得将飞行时间转换为M/Z的数学函数。在外部校准中，一种将飞行时间转换为M/Z的函数(如通过先前的内部校准中所创造的)被应用于飞行时间光谱，而不使用内部校准。
基线减除通过消除人为的、扰乱光谱的可再生的仪器偏差，提高了数据的质量。其包括应用一种算法计算光谱基线，所述算法考虑了如峰宽等参数。然后从质谱中减除基线。
高频率噪音信号通过应用滤波函数来消除。典型的滤波函数将移动平均函数运用到每个时间-依赖的数据中。在一种改进的方式中，移动平均过滤器是一种可变宽度数字过滤器，其中过滤器的频带宽度作为一个函数而改变，如峰的频带宽度，当飞行时间提高时其也变宽。参见如WO 00/70648，2001年11月23日(Gavin等，“用于飞行时间质谱的宽度可变的数字过滤器”)。
一种计算机可以将结果产生的光谱转化为不同的格式来显示。一种格式被称为“质谱观察或滞留图谱”，可显示一种标准的光谱图，其中所述图谱描述了在任何特定分子量上到达检测器的分析物的量。另一种格式被成为“峰图谱”，仅能从光谱观察中获得峰高和质量信息，生成一种清洁图谱，使几乎相同分子量的分析物可更容易识别。还有另一种格式被称为“电泳样图谱”，基于每一个峰的高度，每一种来自峰的物质可被转化为亮度色标图象，形成一种类似于电泳凝胶的外观。还有另一种格式被称为“3-D覆盖图”，一些光谱可被覆盖，以研究相对峰高度的细微变化。还有另一种格式被称为“差别图谱”，可比较两种或多种光谱，方便地区分出独特的分析物以及在样品间上调或下调的分析物。
分析通常涉及在图谱中进行峰的鉴别，找出一种分析物的代表信号。当然，峰的选择可通过视觉。然而，也可用软件，如用Ciphergen的ProteinClip软件的一部分自动检测峰。通常，所述软件通过鉴定具有高于所选阀值的信号-至-噪音比率的信号、并在峰信号的矩心标记出峰而发挥作用。在一个有用的应用中，比较许多光谱，鉴定出存在于一些所选百分数质谱中相同的峰。所述软件的一种版本集成了所有存在于不同质谱中具有一定质量范围的峰，并且向所有接近质量(M/Z)集群中点的峰指定一种质量(M/Z)。
来自一种或多种光谱的峰数据可被用于进一步的分析，如创建一种电子数据表，每行代表一种特定质量的光谱，每列代表光谱中由质量限定的一种峰，并且每格中包括在特定光谱中的峰的强度。不同的统计或图样识别方法可被应用于所述数据。
F.检测HIV感染的试验在细胞培养物、细胞或整个有机体中病毒的水平可通过本领域已知的手段进行检测。典型地，病毒水平用western印迹或其他免疫测定方法(如ELISA)来测定，或通过进行定量PCR测定。在免疫测定方式中，病毒水平通过检测病毒蛋白(或病毒衣壳)的量来测定，通过确定蛋白结合到免疫反应性试剂(如一种抗体)上的量来定量。在定量PCR中，通过检测PCR扩增产物测得病毒核酸的水平，并将所获的扩增核酸的量与已知参考核酸经扩增获得的扩增产物相比较。
生产多克隆和单克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的，并且许多抗病毒抗体是商业可利用的。参见如Coligan(1991)，Current Protocols in Immunology，Wiley/Greene，NY；以及Harlow和Lane(1989)，AntibodiesA Labora tory Manual，冷泉港实验室出版社NY；Stites等(编)，Basic and Clinical Immunology(第4版)，Lange Medical Publications，Los Altos，CA，以及其中引用的参考文献；Goding(1986)，Monoclonal AntibodiesLPriciples and Practice(第二版)，学术出版社，纽约，NY；以及Kohler和Milstein(1975)，Nature 256495-497。所述技术包括通过从噬菌体或类似载体重组抗体文库中选择抗体，制备抗体。参见Huse等(1989)，Science 2461275-1281；以及Ward等(1989)，Nature 341544-546。特异的单克隆抗体和多克隆抗体以及抗血清通常以KD小于约0.1mM结合，更特别地低于约1μM，更优选地低于约0.01μM或更佳。
经常地，多肽以及它们的相应抗体通过共价地或非共价地连接一种可提供检测信号的底物来标记。许多标记和偶连技术是已知，并被报导在许多科学和专利文献中。合适的标记包括放射核苷酸、酶、底物、辅助因子、抑制剂、荧光结构、化学发光结构、磁性颗粒，以及它们的类似物。指导应用这些标记的专利包括美国专利号3,817,837、3,850,753、3,939,350、3,996345、4,277437、4,275149和4,366,241。
在一个优选类型的实施方案中，当定量本发明中的病毒抑制时测定病毒蛋白，用于检测患者中的病毒(如HIV)。比如，HIV多肽被常规地用于western印迹，以检测在患者血液中的抗HIV抗体，并且相反的实验(用于检测患者血液中的HIV)适合于检测患者血液中含有的HIV病毒。所述试验是已知的，并且存在一种标准的方法，通过该方法测定患者中的HIV-1和HIV-2感染。许多免疫测定方式是已知的并且是可实施的。
一种特定的蛋白可通过许多免疫测定方法来定量，如需参考一般的免疫学和免疫测定方法，可参见Stites和Terr(编)1991，Basic and Clinical Immunology(第7版)。此外，本发明中的免疫测定方法可在任何以下方案中进行，所述方案论述在Maggio编，(1980)，酶学免疫测定，CRC Press，Bica Raton，Florida；Tijan(1985)，“酶免疫测定的实践与原理”，Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology，Elsevier Science Publishers B.V.，Amsterdam；Haelow和Lane，同上；Chan(编)(1987)，ImmunoassayAPractical Guide Academic Press，Orlando，FL；Price和Newman(编)(1991)，Principles and Practice ofImmunoassays，Stockton Press，NY；以及Ngo(编)(1988)，Non isotopicImmunoassays，Plenum Press，NY.。
一种HIV转录子、抗体或多肽优选在生物样品中定量，如患者的细胞或组织样品。在一个优选的实施方案中，HIV多肽抗血清在血清中定量。在另一个优选的实施方案中，HIV核酸在感染的患者中定量，应用衍生自本发明的核酸的基因探针。比如，在一个实施方案中，在生物样品中的HIV核酸通过体外扩增技术(如PCR或LCR)扩增，应用经标记的互补核酸进行检测。
如需要，样品可进行预处理，稀释在适当的缓冲溶液中或进行浓缩。存在许多标准的水性缓冲液，应用许多缓冲液的一种，如磷酸、Tris或类似物，在生理pH值是合适的。细胞分类技术如FACS可选择性地应用于分离特定的细胞，如CD4+细胞，从而定量其中的病毒。
本发明的HIV抗体、多肽和核酸通过任何本领域技术人员熟知的手段进行检测。这些手段包括分析生物化学方法如荧光分光光度法、放射照相术、电泳、毛细电泳、高效液相色谱(HPLC)、薄层层析(TLC)、超扩散色谱，以及类似方法。并且，还有许多免疫学方法如液体或凝胶沉淀反应、免疫扩散(单或双)、免疫电泳、放射免疫测定(RIA)、酶连接的免疫吸收剂试验(ELISA)、免疫荧光试验，以及类似方法。通过已知方法的核酸检测如Southern印迹、northern分析、凝胶电泳、PCR、放射标记、闪光计数，以及亲和层析。
本领域技术人员应认识到，在免疫测定和核酸试验中以及在纯化分析物期间，应该降低非特异性结合。当所述测定涉及一种病毒抗体或其他捕获剂被固定在固体底物上时，需要把非特异性结合到底物上的量降到最低。降低这种非特异性结合的手段是本领域技术人员熟知的。典型地，所述手段包括用蛋白组合物包被底物。特别地，蛋白组合物如牛血清白蛋白(BSA)、脱脂粉状牛奶、以及明胶被广泛地应用.Wesrern印迹分析也可应用于检测和定量样品中多肽或蛋白(包括肽、转录子或酶消化产物)的存在。所述技术通常包含通过凝胶电泳，基于分子量的不同分离样品产物，转移分离的产物至合适的固相支持物上(如硝化纤维素、尼龙或衍生的尼龙)，将样品与标记的可特异性结合到分析物蛋白(抗体或HIV-2多肽)的抗体共同孵育。标记抗体特异地结合到位于固相支持物上的分析物上。这些抗体可直接进行标记，或可选择地，后续应用标记试剂如特异性结合到标记抗体的抗体(如标记的羊抗鼠抗体，该抗体结合的分析物是一种鼠抗体)进行检测。
其他测定方法包括脂质体免疫测定(LIAs)，应用设计成可结合特异分子(如抗体)的脂质体，释放出封装在内的试剂或标记，然后根据标准的技术检测释放的化学物(参见Monroe等，(1986)，Amer.Clin.Prod.Rev.534-41)。
G.本发明的多肽的调节剂的鉴定本发明的多肽的调节剂，即多肽活性、多肽或多核苷酸表达的激动剂或拮抗剂，其对于治疗与HIV感染相关的疾病是有用的，如这里所描述。例如，给药调节剂可用于治疗AIDS患者或防止HIV感染的个体向AIDS进展，以及治疗HIV或AIDS相关的症状。
本发明中优选的调节剂是那些可在蛋白水平上提高防卫素活性的，如通过提高防卫素的半衰期，或通过使前-前防卫素分子获得增强的加工能力，更高效或促进翻译，通过螯合细胞内防卫素的抑制剂，通过防止防卫素降解，提高防卫素的分泌和转运，以及提供防卫素通路中重要的分子。优选的调节剂包括那些在核酸水平上提高防卫素表达的，如防卫素启动子活化物、提高防卫素基因的染色体可接近性的化合物、提高防卫素RNA稳定性和加工性的化合物、以及提高在细胞质或细胞核中防卫素RNA水平的化合物。
1.调节本发明的多肽的试剂可作为防卫素蛋白的调节剂的测试化合物可以是任何小型有机分子、或生物实体，比如一种蛋白(如抗体或肽)、一种糖、一种核酸(如反义寡核苷酸或核酶)或脂质。可选择地，调节剂可以是遗传学改变方式的防卫素蛋白。典型地，测试化合物将是小型有机分子、肽、RNA、反义分子、核酶以及脂质。
尽管最多的是应用那些可溶解在水溶液或有机(特别是基于DMSO的)溶液中的化合物，但在本发明的试验中，本质上任何化学化合物可被作为潜在的调节剂或配体。所述试验被设计成通过自动进行的试验步骤筛选巨大的化学文库，并提供来自任何便利来源的化合物进行试验，其通常是平行运行的(如在自动试验中，在微量滴定板上采取微量滴定的形式)。可以理解，存在许多化学化合物的供给来源，包括Sigma(圣路易斯，MO)、Aldrich(圣路易斯，MO)，Sigma-Aldrich(圣路易斯，MO)，FlukaChemika-Biochemica Analytika(Buchs，Switzerland)，以及类似来源。
2.筛选本发明的多肽的调节剂的方法许多不同的体外和体内筛选方案可被用于在细胞中，特别是在人细胞中，鉴定可调节本发明的多肽的多核苷酸的表达水平或活性的试剂。在普通的方式中，所述筛选方法包括筛选许多试剂，来鉴定出一种可调节本发明的多肽的活性的试剂，如通过结合到多肽、阻止一种抑制剂或活化剂结合到多肽、促进抑制剂或活化剂与多肽的结合、或者活化或抑制多肽的表达。
任何表达本发明的全长多肽或其片段的细胞可被用于鉴定调节剂。在一些实施方案中，所述细胞是真核细胞系(如CHO)，被转化以表达一种异源的本发明的多肽。在一些实施方案中，应用一种表达内源性多肽的细胞(CD4)筛选。在另外的实施方案中，根据抑制HIV复制的能力筛选调节剂。
a)多肽结合试验初步筛选通过筛选能够结合到本发明的多肽的试剂来进行，因为至少一些如此鉴定的试剂很可能是本发明的多肽的调节剂。结合试验对于鉴定内源性可与本发明的多肽反应的蛋白也是有用的。例如，抗体、受体或其他结合本发明的多肽的分子可在结合试验中被鉴定出。
结合试验通常涉及将一种或多种测定试剂与本发明的多肽接触，给予足够的时间使蛋白和测定试剂形成结合复合物。任何形成的复合物可通过应用任何已建立的分析技术被检测到。蛋白结合试验包括但不限于在非变性SDS聚丙烯酰胺凝胶上检测共沉淀或共迁移的方法，以及在Western印迹上检测的共迁移(参见如Bennet J.P.以及Yamamura，H.I.(1985)，在Neurotransmitter Receptor Binding(Yamamura，H.I.等编)中，第61-89页，“神经传递素、激素或药物受体结合方法”)。其他结合试验包括应用质谱仪或NMR技术来鉴定结合到本发明的多肽的分子，或置换标记的底物的方法。利用在这些试验中的本发明的多肽是可被天然表达、克隆或合成的。
在一个实施方案中，运用一种高通量结合试验来鉴定结合到防卫素的分子，其中所述防卫素蛋白或其片段与一种潜在的调节剂接触，孵育适当量的时间，检测和/或定量防卫素和所述分子的结合。在一个实施方案中，所述潜在的调节剂被结合到固相支持物上，然后加上防卫素蛋白。在另一个实施方案中，防卫素蛋白结合到固相支持物上。可应用大量的调节剂，如前所述，包括小型有机分子、肽、抗体和防卫素配体类似物。可应用大量的测定试验来鉴定防卫素调节剂的结合，包括标记的蛋白-蛋白结合试验、电泳淌度移动、免疫测定、酶测定如激酶测定，以及类似方法。在一些情况下，侯选调节剂的结合通过应用竞争结合试验来测定，在潜在的调节剂存在下测定已知配体或底物的结合干扰。调节剂或已知配体或底物都可先进行结合，然后加入竞争物。洗涤防卫素蛋白后，测定调节剂或已知配体或底物的结合干扰。经常地，潜在调节剂或已知配体或底物是经过标记的。在一个实施方案中，所述测定是基于SELDI的测定，采用如前面“2.防卫素多肽的SELDI检测”中所描述的方法，在所述测定中，防卫素/测试化合物对中的一员被结合到一个基于SELDI的芯片(如一种预活化的ProteiClip点阵，获自Ciphergen生物系统公司)的表面，其他成员与生物芯片的表面接触。所述防卫素/测试化合物对之间的结合通过SELDI检测。例如，一种防卫素蛋白可以结合到生物芯片的表面，然后可将测试化合物文库与之接触。洗掉没有结合的分子。然后发生结合的分子通过SELDI检测。
高通量筛选包括提供一种组合的小型有机分子或肽文库，其中包含大量的潜在治疗性化合物(潜在的调节剂或配体化合物)。然后如这里所描述的，用一种或多种测定方法筛选所述“组合的化学文库”或“配体文库”，鉴定那些显示所需特征活性的文库成员(特别是化学类型或小类)。这样鉴定出来的化合物可作为传统的“先导化合物”或自身可用作潜在的或实际的治疗物质。
一种组合的化学文库是不同的化学合成或生物合成的化学物质的集合，通过集合许多化学的“积木”来实现，如试剂。例如，一种线性组合化学文库如多肽文库是通过在任何可能的途径中根据给定的化合物长度(即在多肽化合物中的氨基酸数目)集合一组化学“积木”(氨基酸)来形成的。通过这种化学“积木”的组合，可以合成成百上千万个化学组合物。
制备和筛选组合的化学文库是本领域技术人员熟知的技术。所述的组合的化学文库包括但不限于肽文库(参见如美国专利号5,010,175，Furka，Int.J.Pept.Res.，37487-493(1991)；以及Houghton等，Nature，35484-88(1991))。也可应用其他可生成化学多样性文库的化学物质。所述的化学物质包括但不限于类肽(如PCT公开号WO 91/19735)、编码的肽(如PCT公开号WO93/20242)、随机生物低聚体(如PCT公开号WO92/00091)、苯并二氮(如美国专利号5,288,514)、异化体(diversomer)如乙内酰脲、苯并二氮和二肽(Hobbs等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，906909-6913(1993))、插烯多肽(Hagihara等，J.Amer.Chem.Soc.，1146568(1992))、具有葡萄糖框架的非肽的肽模拟物(Hirschmann等，J.Amer.Chem.Soc.，1149217-9218(1991))、小化合物文库的类似有机综合体(Chen等，J.Amer.Chem.Soc.，1162662(1994)、寡氨基甲酸酯(Cho等，Science，2611303(1993))，和/或肽酰磷酸酯(Campbell等，J.Org.Chem.59658(1994))、核酸文库(参见Ausubel，Berger和Sambrook，all同上)、肽核酸文库(参见如美国专利号5,393,083)、抗体文库(参见如Vaughn等，Nature Biotechnolog，14(3)309-314(1996)和PCT/US96/10287)、碳水化合物文库(参见如Liang等，Science，2741520-1522(1996)和美国专利号5,593,853)、小型有机分子文库(参见如苯并二氮，Baum C&EN，1月18日，第33页(1993)；类异戊二烯，美国专利号5,569,588；噻唑丁酮和metathiazanone，美国专利号5,549,974；吡咯烷，美国专利号5,525,735和5,519,134；吗啉化合物，美国专利号5,506,337；苯并二氮，美国专利号5,288,514等)。
制备组合的文库的设备是商业可购买的(参见如357 MPS，390 MPS，Advanced ChemTech，Louisville KY，Symphony，Rainin，Woburn，MA，433A Applied Biosystems，Foster City，CA，9050 Plus，Millipore，Bedford，MA)。并且，许多组合的文库是自身商业可购买的(参见如ComCenex，普林斯顿，N.J.，Asinex，PA，MartekBiosciences，哥伦比亚，MD等)。
此外，哺乳动物或酵母双杂交方法(参见如Bartel，P.L.等，Methods Enzymol，254241(1995))可被用于鉴定当在同一宿主细胞中时发生反应或结合的多肽或其他分子。
b)多肽活性本发明的多肽的活性可应用许多体外和体内测定来评估，以确定功能、化学和物理影响，如酶活性、细胞增殖(如CD4+淋巴细胞增殖)、HIV复制、HIV蛋白表达、或者配体或底物结合。此外，所述测定可被用于测定本发明的多肽的抑制剂或活化剂。调节剂也可以是本发明的多肽的遗传学改变形式。
所述测定的多肽选自一种具有由这里所描述的登录号或SEQ ID NO1-24所编码的序列的多肽，或其保守性改变变体。可选择地，所述防卫素多肽获自一种真核细胞，并包括氨基酸亚序列，其具有与这里所描述的登录号的氨基酸序列基本相同的序列。通常，氨基酸序列相同性为至少60％，优选至少65％、70％、75％、80％、85％或90％，最优选至少95％。可选择地，所述测定的多肽包含本发明的多肽的一个片段，如细胞外区域、跨膜区域、细胞质区域、配体结合区域、亚基相关区域、活性位点，以及类似结构。本发明的多肽或其一个区域都可共价地连接到一种异源蛋白上，创建一种嵌合蛋白，应用在这里所描述的测定中。
应用本发明的重组或天然存在的多肽可测定多肽的调节剂的活性。所述蛋白可被分离，在细胞中表达，在来自某个细胞的细胞膜上表达，在组织或一种动物中表达，重组的或天然存在的。比如，可应用组织切片、游离细胞如来自表达本发明的多肽的组织的细胞、转化细胞或细胞膜。应用一种这里所述的体外或体内测定来测定调节剂。
结合到本发明的多肽的调节剂、一个区域或嵌合蛋白可在溶液中、在双分子层膜中、附着到固相支持物上、在脂质单体中或在囊泡中进行测定。可应用如分光特性(如荧光、吸光率、折射率)、流体动力学(如外形)、色谱或溶解特性的改变来测定调节剂的结合。
将用潜在的调节剂(如一种“测试化合物”)处理的样品或试验与没有测试化合物的对照样品进行比较，检测调节剂的效力。指定对照样品(未用活化剂或抑制剂处理的)的相对活性值为100。当活性值相对于对照样品约90％，特别为50％、更特别为25-0％时，本发明的多肽的抑制作用成立。当活性值相对于对照为110％，可选择地为150％、200％、300％、400％、500％，或1000-2000％时，防卫素的活化作用成立。
c)表达测定也提供了筛选调节本发明的多核苷酸和多肽表达的化合物的筛选。筛选方法通常包括进行基于细胞的测定，测试化合物与一种或多种表达本发明的多核苷酸或多肽的细胞结合，然后检测表达(转录产物或翻译产物)的提高或降低。测定可以在任何本发明的多核苷酸和多肽的细胞中进行。可以通过许多不同的途径来检测表达。如下文所描述的，本发明的多核苷酸在细胞中的表达水平可通过探测细胞中mRNA的表达来确定，应用一种可特异性与本发明的多核苷酸的转录产物杂交的探针(或其互补核酸)。可通过溶解细胞来进行探测，进行Northern印迹；也可不溶解细胞，应用原位杂交技术进行。可选择地，本发明的多肽可应用免疫性方法来检测，用能够特异性结合到多肽上的抗体来探测细胞溶解产物。
本发明的多核苷酸或多肽的表达或活性的水平可与基线值相比较。基线值可以是对照样品值或是统计值，代表了针对特定群体(如AIDS进展者)或细胞(如没有与调节剂接触的组织培养细胞)，本发明的多核苷酸或多肽的表达水平。合适的用于所述基于细胞的测定的细胞包括初级细胞如PBMCs、淋巴细胞(如CD4+)、嗜中性粒细胞、多形核白细胞，以及其它噬菌细胞核细胞系，如Jurkat细胞、BJAB细胞等。所述防卫素蛋白可以是天然存在的、化学合成的或重组的。
d)动物模型本发明还发现，HIV感染的动物模型也可用于筛选防卫素的调节剂。同样地，也可应用包括基因敲除技术的转基因动物技术，比如，与一种合适的基因靶向载体同源重组，或基因超表达，将引起防卫素蛋白的不表达或提高表达。类似的技术也可应用于制造敲除细胞。
可通过同源重组技术，在小鼠基因组的内源防卫素基因位点插入标记基因或其他异源基因，制备敲除细胞和基因小鼠。所述小鼠也可通过用突变型防卫素基因取代内源防卫素来制备；或通过对内源防卫素进行突变，如将其与致癌物质接触。
将一种DNA结构导入到胚胎干细胞的核中。将包含所述新遗传型的细胞注入宿主小鼠胚胎中，再移植进入受体雌鼠中，一些胚胎发展成嵌合的小鼠，拥有部分来自突变细胞系的生殖细胞。因此，通过繁殖这种嵌合小鼠，可能获得一种包含有导入基因型的新的小鼠(参见如Capecchi等，Science，2441288(1989))。嵌合型打靶小鼠可根据以下文献中的方法制备Hogan等，小鼠胚胎的操作实验指南，冷泉港实验室(1988)；以及畸胎癌核胚胎干细胞实践方法，Robertson编，IRL Press，华盛顿(1987)。
e)固相和溶液高通量测定在本发明的高通量测定中，在一天中可能筛选高达数千的不同调节剂或配体。特别地，可应用微量滴定板的每个孔来进行分离的针对一个潜在调节剂的测定；或者，如果需要观察浓度或孵育时间，可用5-10个孔测定一种调节剂。因此，单块标准的微量滴定板可以测定约100(如96)个调节剂。如果应用了含1536个孔的板，则单块板可以方便地测定从约100至约1500个不同的化合物。每天测定几块不同的板也是可能的；应用本发明的完整的系统，可能筛选高达约6,000-20,000或更多的不同化合物。此外，可应用微流方法进行试剂处理。
特定的分子(如本发明的多肽或多核苷酸，或其调节剂)可直接或间接地结合到固态组合物上，通过共价或非共价的连接方式，如通过一种标签(tag)。所述的标签可以是许多组合物中的任意一种。通常，一种结合到标签的分子(一种标签结合物)被固定在一种固相支持物上，通过标签和标签结合物的相互作用，所述标签分子被附着到固相支持物上。
基于已知的分子相互作用，许多的标签和标签结合物可被应用，这在许多文献中有描述。例如，当标签具有天然的结合物时，如生物素、蛋白A、或蛋白G可被用于连接到适当的标签结合物上(抗生物素蛋白、链霉亲和素、中性链亲和素、免疫球蛋白的Fc区、多聚组氨酸等)上。具有天然结合物的分子(如生物素)以及适当的标记结合物的抗体也被广泛地应用，(参见SIGMA免疫化学1998目录，SIGMA，圣路易斯MO)。
同样地，任何半抗原或抗原性化合物可被用于结合适当的抗体，形成标签/标签结合物对。数千种特定抗体是商业可用的，并且有许多另外的抗体被描述在文献中。例如，在一种普通配置方案中，所述标签是一种第一抗体，标签结合物是一种结合第一抗体的第二抗体。除了抗体-抗原反应，受体-配体反应也适合于作为标签和标签结合物对，如作为细胞膜受体的激动剂和拮抗剂(如细胞受体-配体反应，如c-kit、病毒受体配体、细胞因子受体、趋化因子受体、白细胞介素受体、免疫球蛋白受体和抗体、钙粘素家族、整合素家族、选择素家族，以及类似物。参见如Pigott和Power，The Adhesion Molecule Facts Book I(1993))。同样地，毒素和毒物、病毒决定簇、激素(如鸦片剂、类固醇)、细胞内受体(如其能介导不同小配体的作用，包括类固醇、甲状腺激素、类维生素A和维生素D；以及肽)、药物、凝集素、糖、核酸(线性和环状聚合结构)、低聚糖、蛋白、磷脂以及可与不同细胞受体反应的抗体。
合成的聚合体，如聚氨酯橡胶、聚酯、聚碳酸酯、聚亚安酯、聚酰胺、聚乙烯亚胺、聚芳基硫、聚硅氧烷、聚酰亚胺和聚醋酸酯也可用于形成一种适当的标签或标签结合物。在参考了这里所公开的内容后，本领域技术人员显然清楚，许多其他标签/标签结合物对也是对本发明的测定系统有用的。
普通的连接物如肽、聚醚以及类似物也能用作标签，包括多肽序列，如约5-200个氨基酸的聚-苷氨酸(gly)序列。所述灵活的连接物对于本领域技术人员是已知的。比如，Shearwater Polymers公司(Huntsville，阿拉巴马州)提供的聚(乙烯乙二醇)连接物。可任选地，这些连接物具有酰胺连接、巯基连接或异功能连接。
应用任何可用的现有方法将标签结合物固定到固相底物上。通常通过把底物的所有或部分与一种化学试剂接触，将可与标签结合物反应的化学基团固定到表面，获得衍生化的或功能化的固相底物。比如，适合于附着到长链部分的基团包括胺、羟基、硫醇以及羧基基团。氨烷基硅烷和羟烷基硅烷可被用于功能化许多的表面，如玻璃表面。所述固相生物聚合体阵列在文献中多有描述(参见如Merrifield，J.Am.Chem.Soc.852149-2154(1963)(描述肽的固相合成)；Geysen等，J.Immun.Meth.102259-274(1987)(描述固相组分的合成)；Frank和Doring，Tetrahedron4460316040(1988)(描述在纤维素板上不同肽序列的合成)；Fodor等，Science，251767-777(1991)；Sheldon等，Clinical Chemistry 39(4)718-719(1993)；以及Kozal等，Mature Medicine 2(7)753-759(1996)(都描述生物聚合体固定到固相底物的阵列)。用于将标签结合物固定到底物的非化学途径包括其他常规方法，如加热、用UV辐射进行交联，以及类似方法。
本发明提供了体外测定方法，用于在高通量方式下鉴定可调节本发明的多肽的表达或活性的化合物，如免疫测定方法，如ELISA。因为测定是高度一致的，在一个孔进行选择性对照反应，进行不包括潜在调节剂的反应，对比测定本发明的多肽活性。所述选择性对照反应是合适的，并能提高测定的可靠性。因此，在一些实施方案中，本发明的方法包括所述的对照反应。对于每一种已描述的测定方式，不包括调节剂的“无调节剂”对照反应提供了结合活性的背景水平。
在一些测定中，需要阳性对照。至少两种类型的阳性对照是合适的。首先，将一种已知的本发明的多肽或多核苷酸的活化物与所述测定的样品孵育，结果信号提高，说明本发明的多肽或多核苷酸的表达水平或活性提高了。第二，可加入一种已知的本发明的多肽或多核苷酸的抑制物，结果信号降低，说明本发明的多肽或多核苷酸的表达水平或活性降低了。可以理解，调节剂也可与活化物或抑制物结合，寻找抑制所述提高或降低(由已知的本发明的多肽或多核苷酸的调节剂引起的)的调节剂。
H.与防卫素多肽反应的分子的测定除了提供可用于鉴定防卫素调节剂的测定以外，本发明还提供了用于与防卫素多肽反应的分子的测定。与α-防卫素反应的来自CD4+细胞的分子在α-防卫素的抗病毒活性方面可能是重要的，从而其可能是药物调节的靶点。因此，本发明提供了检测这些分子的试验。所述方法包括将CD4+细胞与α-防卫素接触足够的时间，诱导抗病毒反应，然后从CD4+细胞中或从培养所述细胞的培养介质中捕获可结合α-防卫素的分子。结合到α-防卫素的分子的捕获可以通过间接或直接的方式进行。
在一种直接的方法中，在与α-防卫素接触后，将来自细胞的材料与一种固定的α-防卫素接触，如衍生化的珠或亲和生物芯片(如PtoteinClip阵列)。任何结合α-防卫素的分子将被捕获在固相上。然后，可洗涤固相，移走未结合的材料，将结合到α-防卫素的分子洗脱，通过任何已知的方式进行检测。
在一种间接的方法中，在与α-防卫素接触后，将来自细胞的材料与一种可结合α-防卫素的捕获试剂接触。所述试剂可以是固定的抗α-防卫素抗体或溶液状的抗α-防卫素抗体(其自身可被捕获在固相上)。在这种方式中，任何结合α-防卫素的分子将与α-防卫素一起被捕获。然后，可洗涤固相，移走未结合的材料，将结合到α-防卫素的分子洗脱和检测。
I.试剂盒本发明也提供了检测防卫素的试剂盒。所述试剂盒是有用的，比如可用于诊断或预后测定。试剂盒通常包括一种用于捕获防卫素的固相，适合于固相上捕获的分子的检测。因此，所述固相可以用抗防卫素的抗体衍生化；或者所述试剂盒中包括一种抗体，可通过它来将底物衍生化。所述固相包括微量滴定板、珠，或适于质谱检测的生物芯片，如Ciphergen生物系统公司提供的ProteinClip阵列(如PS1ProteinClip阵列或PS2 ProteinClip阵列。特别有用的试剂盒是包含捕获试剂或检测定剂的试剂盒，用于至少两种不同的防卫素或至少三种不同的防卫素。当用于α-防卫素时，由于序列相同性，可用单种抗体捕获α-防卫素1、2和3。可采用质谱来区别这些α-防卫素，它们可因质量不同而被区分开；或可采用三明治免疫测定，应用特异性结合到α-防卫素的氨基末端的抗体。所述试剂盒也可包括用于在样品中检测和定量防卫素的使用指导，以及将检测到的量与预后或HIV感染状态相关联的指导。
实施例提供以下的实施例用于举例证明，而并非限制本发明所要求的权项。
实施例I材料和方法制备CD8+T细胞以及受激的培养上清。从2个长期生存者中采集静脉血样，所述长期生存者尽管感染HIV-1超过13年(携带CD4和病毒)，但仍然保持健康。也从4个HIV-1感染进展者(抗病毒治疗前)中采集血样(携带CD4和病毒)，以及从15个未感染的正常个体中采集血样。然后通过标准Ficoll/Hypaque梯度离心分离外周血单核细胞(PBMC)。应用包被了抗CD8单克隆抗体(Dynal，Lake Success，NY)的磁珠，通过阳性选择将CD8+T细胞从PBMC细胞中分离。然后通过Detach-a-Bead(Dynal)将磁珠从细胞中移走。通过所述步骤获得的细胞的纯度＞99.5％，由FACS来判定纯度。将CD8+T细胞置于潮湿的CO2培养箱中，37℃下刺激3天，与0.1μg/ml的抗CD3抗体(12F6)(由MIT的Johnson馈赠)和5μl/ml的抗CD28抗体(Becton Dickinson)共同孵育，同时还有等量的异源照射的PBMC置于无血清的RPMI1640培养基中(Cellgro)，添加重组IL-2(20U/ml)、青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)。收集培养上清，在3000rpm下离心5分钟除去杂质，并存放在-80℃备用。
细胞培养上清的ProtenClip阵列分析。每种ProteinClip阵列具有独特的化学(离子的、疏水的、亲水的等)或生物(抗体、受体、DNA等)特性，用于从复合混合物中选择性捕获蛋白/肽。最初被用于我们的实验的很多类型的ProteinClip阵列，包括弱阳离子交换(WCX2)、强阴离子交换(SAX2)、固定化金属亲和捕获(IMAC-3)和反相H4(Ciphergen)。WCX2阵列最后被选择用于整个研究，因为它在从培养上清中检测蛋白/肽类型时具有高的再现性。特别地，将100μl的培养上清与等体积的结合缓冲液(100mM NaAc，PH4.5；0.2％Triton X-100溶于PBS中)混合。然后将混合物通过一种生物处理器(Ciphergen)施用于WCX2，并在4℃孵育过夜，并进行恒定的水平摇动。通过用结合缓冲液(50mM NaAc，PH4.5；0.1％Triton X-100溶于PBS中)洗涤3次，将没有结合的蛋白/肽移走，这些都在相同的温度和摇动条件下进行。然后将WCX2阵列从生物处理器上解下，在1mM HEPES(pH4.5)中冲洗30秒，风干。在干燥后，在芯片表面加上3，5-二甲氧-4-羟基苯乙烯酸(SPA)溶于50％乙腈和0.5％三氟乙酸的饱和溶液。SPA作为一种能量吸收分子，用于由表面-增强的激光解吸/电离(SELDI)飞行时间质谱(Ciphergen)的检测的蛋白/肽的捕获。然后所述阵列被置于Ciphergen Protein Biological System II(PBSII)，从氮激光(337nm)生成和激发毫微秒激光脉冲，冲击在SPA和蛋白/肽混合物中。应用在激光强度220-240上平均80个激光射击点(laser shots)生成蛋白/肽的质谱。根据由精氨酸8-血管加压素(ARG-8-Vasopressin)(1,084,3Da)、生长激素抑制素(Somatostatin)(1,637.9)、牛胰岛素β链(3,495.9Da)、人胰岛素(5,807.7)、以及水蛭素(7,033.6Da)(Ciphergen)校准的客观蛋白/肽标准，确定每种被捕获在阵列表面的蛋白/肽的质荷率(M/Z)。
应用抗体-包被的珠的蛋白鉴定伴随着SELDI ProteinClip分析。根据制造方的说明，将Dynal珠用人嗜中性粒细胞(α)防卫素特异的抗体或人噬菌体炎症蛋白(MIP)1α特异的抗体包被。简要地说，将人嗜中性粒细胞防卫素1-3(D21，HyCult生物技术)特异的生物素化的抗体与溶解在PBS(包含0.1％Tween 20)中的Biotin-Binder Dynabeads(Dynal)混合，在室温下旋转30分钟。用包含0.1％Tween 20的PBS洗涤3次，去除没有结合的抗体。并且，通过在4℃旋转过夜，人MIP-1α特异的抗体(R&D系统)被直接偶连到存在于0.1M Borate缓冲液(pH7.0-7.5)中的Dynabeads M-450 Epoxy(Dynal)上。在孵育15-30分钟后，加入0.5％BSA，确保抗体的最佳定位。然后将抗体-包被的珠用包含0.1％BSA(pH7.4)的PBS洗涤3次。每107个珠，需要约2-5μg的每种抗体。然后将抗体-包被的珠(约4×107)单独地与200μl来自受激CD8+T细胞的培养上清混合，其中还存在0.01％溴化十六碳烷基三甲铵(CETAB，Sigma，圣路易斯，MO)，并且在4℃旋转过夜。然后通过磁铁，将抗原-抗体复合物包被的珠从上清中移走，将剩余的上清施用于WCX2阵列，通过如前所述的SELDI进行分析。
制备用于抗病毒测定的来自受激CD8+T细胞的富含的和缺失的细胞培养上清，通过Qq-TQF进行蛋白鉴定。将BioSepra Q-HyperD柱(Ciphergen)平衡处理，用包含10％乙腈(CAN)和0.1％三氟乙酸(TFA)的50mM Tris HCl(pH8.0)洗涤。为了富集推定的α-防卫素肽，将培养上清与含50％乙腈的50mM Tris HCl(pH8.0)混合，施加到柱上。收集流出液，在相同的缓冲液中稀释5倍，直接施加到BioSepra Reverse PhaseC18柱上。用含0.1％TFA和逐步升高量的ACN(从30％、40％、50％、60％以及最后到80％)的50mM Tris HCl(pH8.0)洗脱结合的蛋白/肽。
应用Micromass Q-TQF II进行蛋白鉴定。从BioSepra Reverse Phase C18柱上洗脱的部分中含有50％CAN和0.1％TFA。通过加入10％v/v的100mM重碳酸铵缓冲液(pH8.0)中和TFA，然后通过真空离心抽气机浓缩中性的洗出液，在室温下进行30分钟，直至溶液达到约25毫微微摩尔蛋白/肽每微升。然后经浓缩的材料用含5mM DDT的50mM Tris HCl(pH8.6-9)在90℃还原5分钟，但不进行烷化。经还原的混合物冷却到室温，用0.6μg/μl的胰蛋白酶在40℃消化2小时，然后在冰上终止。所有的上述反应在惰性氩的存在下进行。然后将胰蛋白酶消化的产物直接施加到CiphergenNP-20阵列上，通过Ciphergen PCI-1000 ProteinClipInterface，用MicromassQ-TQF II进行蛋白鉴定。
病毒抑制试验。同时应用假型单环病毒和可复制型HIV-1病毒菌株进行病毒抑制试验，所述菌株分离自感染HIV-1的患者的CEM174细胞系和/或PBMC。CEM174细胞系已经被构建成可同时表达HIV-1共同受体CXCR4和CCR5的形式。通过共转染荧光素酶-受体病毒骨架PNL4-3 LucR-E-和JR-FL或HXB2外壳表达载体进入人胚胎肾细胞系293T，生成假型病毒。2天后收集包含病毒的上清，应用标准的方案(ref)定量上清中的p24抗原水平。然后将上清取出，并储存在-80℃备用。对于应用假型单环病毒的病毒抑制试验，感染前，在96孔板的每个孔中放置2×105CEM174细胞。在人嗜中性粒细胞防卫素1或2(American Peptide公司，桑尼维尔，CA)之一或同时存在下，在每孔中加入5毫微克的p24单环JR-FL或HXB2报告病毒。为了研究可能的抑制机制，加入人嗜中性粒细胞防卫素或来自受激LTNP CD8+T细胞的培养上清，可与病毒同时加入或在感染一段时间后加入。本实验中还包括加入病毒进入抑制剂T-20和非核苷反转录酶抑制剂UC-781，用于评估在病毒生命周期中每个阶段的时间。在感染起始后3天，用PBS洗涤细胞，在50μl荧光素酶细胞溶解缓冲液(Promega)中溶解，进行一次冰冻-解冻过程来提高检测灵敏度。在3,000rpm简单离心10分钟，应用Promega Luciferase Assay System和光度计(Dynex Technologic公司)测定25μl细胞溶解产物的荧光素酶活性。
对于应用可复制型病毒的病毒抑制试验，先将PBMC用浓度为20μg/ml的PHA刺激3天。96孔板上，在存在人嗜中性粒细胞防卫素1或2之一或全部下，每孔加入约2×105个细胞，每种病毒具有100组织培养感染剂量(TCID50)。在一些实验中，也包括来自受激LTNP CD8+T细胞的培养上清。在37℃感染2小时后，通过PBS洗涤，移走上清中剩余的病毒。加入包含相同浓度的人嗜中性粒细胞防卫素或来自受激LTNP CD8+T细胞的培养上清的新鲜介质。在感染后第0、3和7天，用标准的方案测定上清中的p24抗原水平。在病毒生产高峰时间，一般在起始感染后第7天，通过对比有或没有抑制剂的上清中的p24水平计算抑制百分数。
结果一系列由LTNP和正常人的CD8+细胞分泌的小型蛋白的鉴定。从来自3个LTNP、4个AIDS进展者以及15个正常对照的受激和非受激的CD8T淋巴细胞培养物中收集上清溶液。每种样品在PriteinClipSystem(Ciphergen生物系统公司，费瑞蒙，CA)上进行分析，其是基于化学改变的阵列表面的集成，采用表面-增强的激光解吸/电离(SELDI)飞行时间(TOF)质谱(MS)检测。选择所述技术是因为其具有高分辨能力、高再现性、易于使用，以及毫微微摩尔水平的敏感性。如图1a所示，2个LTNP和1个正常对照的代表蛋白的质谱显示，受激和非受激的CD8上清相比，峰的方式明显不同。在受激的培养中，发现一簇两个或三个峰的情况，在3,371.9Da、3,442.5Da和3,486.5Da上。该簇分子在来自3个LNTP和(15个中的)11个正常个体的受激的CD8 T淋巴细胞培养物中被检测到，但在来自4个进展者的受激的培养物中都没有找到(图1a)。一个独特的峰在7,815.0Da上，后来鉴定为MIP-1α，也在来自2个LTNP的受激的样品中被检测到。尽管观察到许多8,000-200,000Da的峰，但没有在三类受试者的受激或非受激CD8培养物中发现明显的差异(数据未显示)。特别地，没有高于8,000Da的峰保持与CAF活性的存在相关联。
为了进一步定性在3,300和3,500Da之间的峰，从来自LTNP受试者-3(LTNP-3)和正常对照受试者-2(正常个体-2)的受激CD8 T细胞的培养上清中富集所述的蛋白。然后所述富集的材料用二硫苏糖醇(DTT)、丙烯醯胺或碘代乙酰胺处理，探测在该簇峰的每种蛋白中二硫键的存在。然后将处理后的材料直接施加到Ciphergen NP-20阵列上，用SELDI-TOF-MS测定。下表1中显示了在正常个体-2的经DTT还原的材料中发现的三个峰的分子质量的改变。在还原后每个峰增加了～6Da(图6)，证明在该簇中的每种蛋白包含三个内部二硫键桥，由于每个二硫键断裂后，DTT还原可加上两个氢原子，形成两个自由的巯基基团。此外，对于在来自LTNP-3的培养上清中检测到的峰，用丙烯醯胺或碘代乙酰胺还原和烷化可分别增加～434Da或349Da。根据丙烯醯胺(m.w.71)和碘代乙酰胺(m.w.57)的分子质量，观察到的质量增加是由6个丙烯醯胺或碘代乙酰胺分子通过6个自由巯基基团添加到每个蛋白上而构成的。该结果进一步证明了每个蛋白中有三个分子内二硫键桥。
表1.在还原±烷化之前[-]和之后[+]分子质量(m/z)的变化
n/d未检测鉴定作为人α-防卫素1、2和3的蛋白簇。通过检索蛋白数据库(NCBI和Swiss-Pro)，寻找与刺激后上调的峰具有相似分子质量的蛋白，发现分别与人嗜中性粒细胞(α)防卫素相对应的具有平均分子质量3,371.9Da、3,442.5Da和3,486.5Da的成对的或三个一对的峰主要是由人嗜中性粒细胞制造的肽抗生素(Ganz等，J.Clin.Invest.，761427(1985)，Selsted等，J.Clin.Invest.，761436(1985)；Daher等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，857327(1988))。此外，已知所述每一种多肽包含三个内在二硫键(Lehrer等，Curr.Opin.Immun.，1496(2002))。7,815.ODa的峰相应于人MIP-1α。并且，以前已经证明，约10％的种群会缺少防卫素3(Mars等，J.Bio.Chem.，27030371(1995))，这就恰恰证明了为什么一些研究受试者显示两个峰，而其它一些显示三个峰，这种现象同时存在于LTNP和正常个体(图1)。为了测定这种假设，用人α-防卫素1、2和3特异的抗体包被Dynal珠，与来自受激CD8+细胞的上清共同孵育，然后移走磁珠。简要地，将生物素化的人α-防卫素1、2和3特异的单克隆抗体(克隆D21，HyCult Biotechnology，Norwood，MA)与Biotin-Binder Dynabeads(Dynal)在包含0.1％Tween 20的PBS中混合，在室温下旋转30分钟。用包含0.1％Tween 20的PBS洗涤3次，移走未结合的抗体。分离地，在0.1M硼酸缓冲液(pH7.0-7.5)中，将人-MIP-1α特异的单克隆抗体(R&D系统，明尼阿波利斯，MN)直接连接到Dynabeads M-450 Epoxy(Dynal)上，在4℃旋转过夜。在孵育后15-30分钟，加入0.5％BSA，以确保抗体达到最佳的定位。然后将抗体包被的磁珠用包含0.1％BSA的PBS(pH7.4)洗涤3次。每107个珠使用2-5μg每种抗体。接着在0.01％十六烷基三甲基溴化铵(Sigma，圣路易斯，MO)存在下，将抗体包被的珠(约4×107)与200μl的来自受激CD8+T细胞的培养上清混合，在4℃旋转过夜。然后用Detach-a-Bead磁铁(Dynal)，将所述抗原-抗体复合物包被的珠从上清中移出，将剩余的上清施加到WCX2阵列上，如前所述用SELDI-TOF-MS分析。通过与那些来自上清的抗体包被的磁珠孵育并最后移走，同时从上清中去除两个或三个峰，可以解释成对的或三个一对的峰是否真正属于人α-防卫素家族。用一种抗防卫素1、2、3抗体预处理消除了在3,300至3,500Da(图2a)范围内的蛋白簇，而不会明显影响其它有用的峰。与抗MIP-1α预孵育没有影响有用的峰，但却导致在7815.0Da的峰的移动。这些实验清楚地证明，在来自LTNP和正常个体的CD8+T细胞受激后发生上调的二或三峰蛋白簇是人α-防卫素家族的成员。β-趋化因子MIP-1α在刺激后也发生上调，这与以前的报导相一致。
应用Micromass Qq-TOF MS-MS进行蛋白峰的低MW簇的蛋白测序。为了进一步证明所述结论，前面用于还原和烷化实验的富集的材料用胰蛋白酶消化，并通过串联质谱进行分析。与没有所述蛋白簇的对照比较，来自LTNP-3和正常个体-2的胰蛋白酶消化的材料获得一条独特的1060.50Da(图2b，上右插入图)片段。通过在MS-MS撞击细胞中撞击-诱导的离解，所述独特的片段被进一步选择和片段化成更小的离子。然后，七个通过所述方式(图2b)形成的离子被用在蛋白搜索引擎(参见图2b的插图说明)中，寻找所述1060.50Da母离子的假设片段。所述检索获得了一个与人α-防卫素1、2和3的胰蛋白酶消化片段理想的且明确的匹配。实际上，所述的肽在这三种分子中是保守的，精确地与来自氨基酸位点16-24位的序列YGTCIYQGR相符(图2b)。蛋白测序证明在来自LTNP和正常个体的CD8 T细胞受激后发生上调的蛋白簇是人α-防卫素家族的成员。
人α-防卫素1、2和3引起了CAF的HIV-1抑制活性，而并非因为β趋化因子。为了评估α-防卫素1、2和3对于总体CAF活性的相对作用，用前面所述的特异性抗体包被的珠或亲和柱(来自克隆21的生物素化的单克隆抗体(HyCultBiotechnology)被用于从培养上清中去除α-防卫素1、2和3，根据生产方的指导，应用HiTrap亲和柱进行(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ))，选择性去除来自LTNP-3和LTNP-5的受激CD8+T细胞的培养上清中的所述分子。图3a对比了在α-防卫素1、2和3去除前和去除后，对抗X4和R5 HIV的抗病毒活性(两次实验的平均)，包括来自不同基因型的菌株。如前面所描述的方法进行病毒抑制测定。在去除前，培养上清能够抑制所有被测定X4病毒的约50-60％的复制，不考虑基因型。然而在去除后，抗X4病毒的抑制作用完全消失了，表明α-防卫素1、2和3引起了几乎所有(如果不是全部的话)的CAF抗X4病毒抑制活性。对于R5病毒，在移走了α-防卫素以后，抗HIV-1活性平均降低了约40％(图3a)。
同时也发现，在浓度为10μM时，α-防卫素1和2能够抑制约15-30％的每种病毒的复制。然而，当以类似的浓度同时加入α-防卫素1和2时，抑制百分数升高到70％，证明这两种防卫素之间存在着增效效应。此外，通过α-防卫素的每种病毒的抑制都是剂量依赖的。
然后，通过向上清液中加入一种抗α-防卫素1、2和3的抗体，检测CAF活性是否能够以剂量依赖的方式被中和，并且，共同加入或不加入β趋化因子抗体。随着抗α-防卫素抗体浓度的提高，来自LTNP-3和LTNP-5的CD8上清的抗HIV-1活性降低(图3b)。当抗体浓度达到25μg/ml时，对于所有被测定的X4病毒，CAF的抑制活性实际上消失了，而类似量的对照抗体没有影响(数据未显示)。通过加入增加量的α-防卫素抗体，抗R5病毒的抑制活性也降低了，尽管影响没有如在X4病毒中所观察到的那样强烈(图3b)。为了研究剩余的对抗R5病毒的活性是否由β趋化因子所引起，将来自LTNP-3和LTNP-5的培养上清用增加量的抗MIP-1α、MIP-1β和RANTES抗体混合物(1∶1∶1)处理，同时用固定浓度(25μg/ml)的α-防卫素抗体处理。在使用最高抗体浓度时，抗三种R5分离物的剩余抗病毒活性几乎完全被中和(图3b，右边图)，而一种对照抗体的加入具有最小的影响(数据未显示)。总体来说，这些结果证明α-防卫素1、2和3引起了受激CD8+T淋巴细胞培养上清中将近所有的抗HIV-1活性，而并非是因为β趋化因子。
合成和纯化的人α-防卫素可以在体外抑制HIV-1的复制。接着我们将把注意点集中到检测合成或纯化形式的α-防卫素的体外抗HIV-1活性。两种产物是商业可购买的α-防卫素1和2(American Peptide公司，桑尼维尔，CA)。随着两种合成α-防卫素混合物(1∶1)浓度的增加，观察到对抗HIV-1的6个分离物的提高程度的抑制(图4)，不管病毒的显型和基因型。混合物的50％抑制浓度在约11-24μM。当混合物的抗病毒能力不高时，应该注意这些商业产品是不纯的，如SELDI-TOF-MS(图7)所示的。与由受激的CD8+T细胞生成的α-防卫素相比，除了正确的分子质量的峰以外，商业产品还包含一些蛋白峰。而且，即使是具有接近正确的分子质量的峰，仍然不能保证形成正确的二硫键桥。因而，为了确认商业α-防卫素制品的抗HIV-1活性的特异性，重复用这些肽进行病毒抑制试验，并在一种抗α-防卫素抗体存在下进行。图4(左边图)显示所述抗体真正充分地中和了商业肽的抗-HIV-1活性。所述结果证明抗病毒作用并非由商业制品中非特异的杂质介导的；取而代之的，在成分中的活性部分是由抗α-防卫素抗体识别的。也检测了从正常人(36，39)嗜中性粒细胞纯化获得的α-防卫素1、2和3的抗HIV-1活性。所述制品包含α-防卫素峰，其本质上不能被质谱仪与那些从来自LTNP-5的CD8 T细胞上清中发现的α-防卫素区分开来(图8)。在体外也能抑制HIV-1的复制，但是具有的IC50为约0.5-2.2μM(图4，右边图)，证明纯化的α-防卫素的抗HIV-1能力高于商业产品的10-20倍。纯化的人嗜中性粒细胞α-防卫素的抗病毒活性也会因加入α-防卫素特异的抗体而降低或消除。
小部分CD8 T细胞表达α-防卫素1、2和3。从一些正常的血供体纯化得到的嗜中性粒细胞和CD8 T细胞通过免疫荧光进行研究，研究α-防卫素1、2和3在细胞内的表达。一部分未受刺激的CD8 T淋巴细胞的细胞质小颗粒中携带这些分子，但是在量上明显少于在嗜中性粒细胞中的含量(图5)。一旦刺激，一些CD8 T细胞似乎失去了所述α-防卫素阳性颗粒，可能是因为分泌到培养上清中去了。非常小的一部分CD8 T细胞被活化，表达更高量的α-防卫素(图5；位于最右边的细胞)。
通过流式细胞术分析，约2.3％的未刺激αβCD8 T淋巴细胞表达可评估水平的α-防卫素(图9)。在刺激1天后，一些所述包含α-防卫素的细胞中不能再检测到α-防卫素。然而，与免疫荧光结果相一致，在刺激后两天，相当多的表达更高量α-防卫素的CD8 T细胞(21.1％)出现了。所述α-防卫素阳性的CD8细胞主要为没有γδ或NK标记的αβCD8 T细胞。这些发现还证明，CD8 T细胞真正携带和分泌α-防卫素1、2和3，在先天和后天的免疫系统之间建立了另一个联系。
实施例II该实施例证明，在感染HIV的患者血清中α-防卫素水平可作为预后的标记。
采取一种研究，来确定在感染HIV患者的血浆中α-防卫素的表达水平是否是不同的。收集患者的血浆，通过SELDI和标准ELISA(HNP1-3 ELISA，Cell Science)来测定防卫素，来自正常个体的血浆(汇集的，定购自Sigma)被用作阳性对照。对21位患者中的每一位，在两个时间点上测定防卫素在起始HAART治疗之前以及在起始HAART治疗后正好一年。所有患者的病毒负载在刚开始时是可测量的，在HAART治疗一年后无法测出。在HAART治疗之前和之后，他们的T细胞数(CD4和CD8)是已知的。表2总结了所述结果。
所述研究发现，防卫素在未感染的对照人血浆中以6.2-7ng/ml的浓度存在，在21位感染HIV的个体中只有33％(7/21)可检测到。在7位可检测到防卫素的患者中，3位具有低的起始病毒负载，暗示了随着病毒负载的提高，防卫素的生产受到影响。尽管事实上他们的病毒负载在一年后无法检测到并且他们的CD4和CD8数是正常的，7位患者中的4位在研究起始时具有可检测到的防卫素水平，在起始HAART治疗一年后部分或全部地失去了表达。
1位患者在研究起始时无法检测到防卫素水平，但在HAART治疗期间，当他的CD4数增加3倍后，可检测到正常人的约1/3水平的防卫素。另有2位患者在HAART治疗之前和之后都具有低的防卫素水平(也是未感染个体的约1/3水平)。
这些结果证明，在感染HIV的个体中，α-防卫素水平在血浆中的水平比未感染的个体低。这确证了体外发现的防卫素可终止病毒复制、并由正常对照和长期非进展者(LTNP)的CD8 T细胞分泌，而不是由来自AIDS患者的CD8细胞分泌的。
表2
应理解，这里描述的实施例和实施方案都只用于举例证明的目的，对于本领域的技术人员来说，根据这些内容可以作出不同的修改和变化，它们都包括在本申请的意愿和范围内，以及包括在附加的权利要求范围内。这里引用的所有出版物、专利和专利申请以它们的全部作为参考加入本文，用于所有目的。
权利要求
1.一种组合物，所述组合物包含防卫素多肽和药学上可接受的载体。
2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述防卫素多肽是α-防卫素多肽。
3.如权利要求2所述的组合物，其中，所述的α-防卫素多肽选自α-防卫素1、α-防卫素2和α-防卫素3。
4.如权利要求1所述的组合物，包含至少两种α-防卫素多肽。
5.如权利要求4所述的组合物，包含α-防卫素1和α-防卫素2。
6.如权利要求4所述的组合物，包含α-防卫素1、α-防卫素2和α-防卫素3。
7.一种在人体内治疗HIV感染的方法，所述方法包括给予人体一种防卫素多肽。
8.如权利要求7所述的方法，还包括给予人体一种防卫素多肽和一种第二治疗剂。
9.如权利要求7所述的方法，其中，所述防卫素多肽是一种选自α-防卫素1、α-防卫素2和α-防卫素3的α-防卫素多肽。
10.如权利要求7所述的方法，还包括施用一种选自α-防卫素1、α-防卫素2和α-防卫素3的第二α-防卫素多肽。
11.如权利要求9所述的方法，其中，所述α-防卫素多肽是α-防卫素1和α-防卫素2。
12.一种向HIV感染高危人体施用预防量的防卫素多肽的方法。
13.如权利要求11所述的方法，其中，所述防卫素多肽是一种选自α-防卫素1、α-防卫素2和α-防卫素3的α-防卫素。
14.如权利要求11所述的方法，还包括施用一种选自α-防卫素1、α-防卫素2和α-防卫素3的第二α-防卫素多肽。
15.如权利要求13所述的方法，其中，所述α-防卫素多肽是α-防卫素1和α-防卫素2。
16.一种抑制HIV感染培养中的CD4+细胞的方法，所述方法包括将所述细胞与一种防卫素多肽接触的步骤。
17.如权利要求15所述的方法，其中，所述防卫素多肽是一种选自α-防卫素1、α-防卫素2和α-防卫素3的α-防卫素多肽。
18.如权利要求15所述的方法，还包括施用一种选自α-防卫素1、α-防卫素2和α-防卫素3的第二α-防卫素多肽。
19.一种组合物，所述组合物含有包含于药学上可接受的载体中的编码第一防卫素多肽的第一核酸。
20.如权利要求18所述的组合物，还包含编码第二防卫素多肽的第二核酸。
21.如权利要求19所述的组合物，其中，所述防卫素多肽是一种选自α-防卫素1、α-防卫素2和α-防卫素3的α-防卫素多肽。
22.如权利要求20所述的方法，其中，所述α-防卫素多肽是α-防卫素1和α-防卫素2。
23.一种在人体内抑制HIV感染的方法，所述方法包括在体内用一种包含编码防卫素多肽核苷酸序列的核酸转染细胞；或者，在体外用一种包含编码防卫素多肽核苷酸序列的核酸转染细胞，并将细胞给予所述的人。
24.如权利要求22所述的方法，其中，所述防卫素多肽是选自α-防卫素1、α-防卫素2和α-防卫素3的α-防卫素多肽。
25.如权利要求22所述的方法，其中，所述细胞是肌细胞。
26.如权利要求22所述的方法，其中，所述细胞是AC133+或CD34+祖细胞。
27.如权利要求22所述的方法，其中，所述转染在先体外后体内进行。
28.如权利要求22所述的方法，其中，所述核酸包含一种操作性连接到编码防卫素多肽核苷酸序列的可诱导的启动子。
29.一种确定个体的HIV感染状态的方法，所述方法包括a)在来自个体的样品中检测α-防卫素的量；以及b)将获得的量与HIV感染状态相关联。
30.如权利要求28所述的方法，还包括将防卫素的量和至少一种其他指标与HIV感染状态相关联，所述计数器选自CD8+细胞计数、CD4+细胞计数、HIV病毒负载和总T细胞计数。
31.如权利要求28所述的方法，其中，所述α-防卫素通过ELISA或SELDI检测。
32.如权利要求28所述的方法，其中，所述α-防卫素多肽选自α-防卫素1、α-防卫素2和α-防卫素3。
33.一种确定个体HIV感染状态的方法，所述方法包括a)在来自个体的样品中检测α-防卫素mRNA的量；以及b)将获得的量与HIV感染状态相关联。
34.如权利要求32所述的方法，其中，所述α-防卫素多肽选自α-防卫素1、α-防卫素2和α-防卫素3。
35.一种用于确定一种化合物是否能够调节细胞中α-防卫素活性的方法，所述方法包括a)将α-防卫素-生成细胞与所述化合物接触；以及b)确定所述化合物对于α-防卫素活性的功能性影响。
36.如权利要求34所述的方法，其中，所述细胞选自嗜中性粒细胞、CD8+细胞和上皮细胞。
37.如权利要求34所述的方法，其中，所述功能性影响通过检测防卫素的表达水平、细胞增殖或HIV复制来确定。
38.如权利要求34所述的方法，其中，所述化合物是一种小型有机分子。
39.如权利要求34所述的方法，其中，所述α-防卫素多肽选自α-防卫素1、α-防卫素2和α-防卫素3。
40.一种在人体内抑制HIV感染的方法，所述方法包括给予所述人体一种用权利要求35所述方法鉴定的化合物以增加α-防卫素的活性。
41.一种方法，所述方法包含a)将一种细胞与α-防卫素接触；b)将一种抗-α-防卫素抗体与所述细胞的溶解产物接触；c)在b)步骤之前或之后，将抗-α-防卫素抗体固定到固相上，以使来自细胞的α-防卫素结合到固相上；以及d)检测结合到固定的α-防卫素上的蛋白。
42.一种方法，所述包含a)将一种细胞与α-防卫素接触；b)将一种α-防卫素与所述细胞的溶解产物接触；c)在b)步骤之前或之后，将所述α-防卫素固定到固相上，以使结合到α-防卫素的蛋白被捕获；以及d)检测结合到固定的α-防卫素上的蛋白。
43.如权利要求40或41所述的方法，其中，所述细胞是CD4+细胞、Hela细胞或HOS细胞。
44.如权利要求40或41所述的方法，其中，所述α-防卫素多肽选自α-防卫素1、α-防卫素2和α-防卫素3。
45.一种试剂盒，其包含(a)一种可结合抗体的底物；(b)一种抗α-防卫素多肽的抗体；以及(c)将在患者样品中检测到的α-防卫素的量与预后AIDS发展相关联的指导。
46.如权利要求44所述的试剂盒，其中，所述底物是一种质谱探针。
47.如权利要求44所述的试剂盒，其中，所述底物是一种微量滴定板。
48.如权利要求44所述的试剂盒，还包含一种特异性抗α-防卫素1、α-防卫素2或α-防卫素3的第二抗体。
49.如权利要求44所述的试剂盒，其中，所述第二抗体是标记的。
50.一种试剂盒，其包含(a)一种可结合α-防卫素多肽的底物；以及(b)将在患者样品中检测到的α-防卫素的量与预后AIDS发展相关联的指导。
51.一种试剂盒，其包含一种可特异性结合一种α-防卫素的第一抗体，以及一种可特异性结合α-防卫素1、α-防卫素2或α-防卫素3的第二抗体。
52.一种α-防卫素融合蛋白，其包含一个第一α-防卫素多肽部分和一个结合CD4的第二部分。
53.一种α-防卫素融合蛋白，其包含一个第一α-防卫素多肽部分和一个第二信号肽部分。
54.如权利要求53所述的α-防卫素融合蛋白，其中，所述第二信号肽部分是TPA信号肽。
55.一种核酸，其包含编码权利要求52所述多肽的核苷酸序列。
56.一种α-防卫素融合蛋白，其包含一个第一α-防卫素多肽部分和一个可在体内提高蛋白质稳定性或生物利用度的第二部分。
57.一种药物组合物，其包含PEG化的α-防卫素和药学上可接受的载体。
58.一种α-防卫素类似物，其包含可删除蛋白水解切割位点的氨基酸取代。
59.一种提高内源性α-防卫素生产的方法，所述方法包括施用一种可激活CD8+细胞的组合物。
60.如权利要求59所述的方法，其中，所述组合物包含抗-CD3。
61.一种方法，所述方法包括a)先体外后体内扩展CD8+细胞；b)检测CD8+细胞的α-防卫素生产；以及c)向HLA匹配人群施用所述扩展的CD8+细胞。
62.一种方法，所述方法包括给予人体一种疫苗以及一种α-防卫素多肽或编码α-防卫素的核酸。
63.一种组合物，其包含一种疫苗和一种α-防卫素多肽或编码α-防卫素的核酸。
64.一种组合物，其包含一种α-防卫素多肽以及一种第二治疗剂。
全文摘要
本发明涉及用防卫素抑制病毒，如HIV。本发明还涉及鉴定和使用试剂的方法，包括小分子化学组合物、抗体、肽、核酸、反义核酸和核酶，其能提高天然存在的防卫素的表达或活性，从而抑制细胞中的HIV；同时，还涉及将表达曲线和组合物应用于诊断和预防，并且治疗与HIV相关的感染以及相关的疾病状态如AIDS。
文档编号A61K35/14GK1688324SQ03818321
公开日2005年10月26日 申请日期2003年5月30日 优先权日2002年5月31日
发明者L·张, D·D·何, R·E·卡弗里, E·A·戴尔马索, J·梅 申请人:赛弗根生物系统股份有限公司, 亚伦戴蒙艾滋病研究中心