专利名称：亚氨基糖衍生物在抑制离子通道活性中的应用的制作方法
相关申请的交叉引用本申请要求于2002年9月23日申请的美国临时申请顺序号60/412,560的优先权，所述临时申请通过引用全部结合到本文中。
背景丙型肝炎病毒(HCV)是具有晚期肝硬化和肝细胞癌的显著危险的慢性肝炎的主要原因(参见Di Bisceglie，A.M.，(1997)Hepatology 26(3增刊1)345-385)。HCV属于黄病毒科(Flaviviridae)，该科由三个属组成黄病毒(flavivirus)、瘟病毒(pestivirus)和嗜肝病毒(hepacivirus)。当缺乏合适的小动物模型和可靠的体外感染性测定用于HCV时，先用一种相关的瘟病毒即牛病毒性腹泻病毒(BVDV)，初步测试潜在的抗病毒药物。已经采用BVDV体外感染性测定证明，含有葡萄糖类似物1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇(也称为脱氧野尻霉素(deoxynojirimycin)或“DNJ”)或者半乳糖类似物1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-半乳糖醇(也称为脱氧半乳糖野尻霉素(deoxygalactonojirimycin)或“DGJ”)的烷基化亚氨基糖衍生物是有效的抗病毒抑制剂(参见Durantel，D.等，(2001)J. Virol.75(19)8987-98)。
DNJ衍生物至少是部分抗病毒抑制剂，因为它们抑制ERα-葡糖苷酶I和II。这些酶去除形成N聚糖前体部分的三个葡萄糖残基，所述前体被整个地转移给ER中的新生糖蛋白。ERα-葡糖苷酶的抑制阻止含N联寡糖的单葡萄糖基化糖蛋白的形成，并且阻止含N联寡糖的单葡萄糖基化糖蛋白随后与驻留在ER中的陪伴分子钙联接蛋白和钙网蛋白的相互作用(参见Bergeron，J.J.等，(1994)TrendsBiochem.Sci.19(3)第124-8页；Peterson，JR.等，(1995)Mol.Biol.Cell6(9)1173-84)。对于包括BVDV包膜糖蛋白和HCV包膜糖蛋白在内的许多宿主编码的和病毒编码的糖蛋白的适当折叠来说，钙联接蛋白相互作用是至关重要的(参见Branza-Nichita，N.等，(2001)J Virol.75(8)3527-36；Choukhi，A.等，(1998)J. Virol.，1998 72(5)3851-8)。BVDV包膜糖蛋白的错折叠会降低病毒粒子从感染细胞中的分泌。
先前实验已经显示，长链烷基衍生物N-壬基-DNJ(NN-DNJ)的抗病毒效果比短链烷基衍生物N-丁基-DNJ(NB-DNJ)更显著，尽管后者在细胞中达到更有效的ERα-葡糖苷酶抑制(参见Durantel，D.等，(2001)J. Virol.75(19)8987-98)。另外，不被识别ERα-葡糖苷酶的长链烷基DGJ-衍生物和不抑制ERα-葡糖苷酶的长链烷基DGJ-衍生物也显示出有效的抗病毒活性。因此，ER α-葡糖苷酶抑制与观察到的抗病毒效果没有直接关系，排除了它作为单独的抗病毒机制。
其它的作用机制显然与烷基侧链长度有关，因为短链N-丁基-DGJ(NB-DGJ)没有显示出抗病毒活性，而长链烷基衍生物NN-DGJ却是有效的抑制剂。然而，这与烷基化亚氨基糖衍生物的两亲性去垢剂样效应并无关系，因为在体外BVDV感染性测定中，结构类似的去垢剂n-辛基葡萄糖苷(n-OG)和n-壬基葡萄糖苷都不是抗病毒剂(参见Durantel，D.等，(2001)J.Virol.75(19)8987-98)。药物处理影响病毒膜糖蛋白的二聚作用并且改变了BVDV病毒粒子分泌的膜糖蛋白组成，但并不影响病毒RNA复制，也不影响病毒蛋白质合成。
因其ERα-葡糖苷酶抑制活性，无论是长链还是短链烷基DNJ-衍生物都对登革病毒(DENV)和日本脑炎病毒(JEV)等黄病毒具有抗病毒性(参见Courageot，M.P.等，(2000)J Virol.74(1)564-72；Wu，S.F.等，(2002)J.Virol.，76(8)3596-604)。相比之下，DGJ-衍生物没有显示出针对黄病毒的抗病毒活性，但长链烷基DGJ-衍生物却是有效的瘟病毒抑制剂。与更密切相关的瘟病毒和嗜肝病毒不同，黄病毒不含p7或类似的小跨膜蛋白。同样，DNJ-衍生物和DGJ-衍生物可通过抑制p7或类似蛋白，抑制病毒复制。
HCV正链RNA基因组编码一种约3000个氨基酸残基的多蛋白前体。该多蛋白通过病毒蛋白酶和细胞蛋白酶进行共翻译和翻译后加工，以产生成熟的结构蛋白和非结构蛋白C、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B(有关综述参见Reed，K.E.和C.M.Rice，(2000)Curr.Top.Microbiol Immunol 242第55-84页)，以及来自多蛋白N-端区的核糖体移码的潜在的F蛋白(参见Xu，Z.等，(2001)EMBO J.20(14)第3840-8页)。尽管在翻译过程中或紧接着在翻译后，有效完成了多蛋白前体的大多数切割，但是在E2/p7和p7/NS2位点的切割却是延迟的，导致产生E2-p7-NS2前体。此外，在E2和p7间的加工是不完全的，导致E2-p7以及E2和p7的产生(参见Lin，C.等，(1994)J. Virol.68(8)第5063-73页；Mizushima，H.等，(1994)J.Virol.68(10)第6215-22页)。
因为没有可用的HCV复制的细胞培养模型，所以，有关HCV复制的信息都是通过使用BVDV细胞培养模型而来。同样，有关p7的大多数功能性数据是从BVDV p7(一种与HCV p7非常类似的70个氨基酸的蛋白)的研究中获得。通过将突变引入到感染性BVDV的cDNA克隆，已经得到有关BVDV p7的功能性数据。完整p7基因的一个符合读框的缺失并不影响BVDV RNA复制，但却导致产生非感染性病毒粒子。然而，可通过补充p7，产生感染性病毒粒子(参见Harada，T.，N.Tautz和H.J.Thiel，(2000)J.Virol.74(20)9498-506)，这表明瘟病毒p7对感染性子代病毒的产生是必要的。
HCV p7蛋白是63个氨基酸的肽，其已显示出是两次跨膜的多境起源的膜蛋白，并且其N-端和C-端朝向胞外环境(参见Carrere-Kremer，S.等，(2002)J.Virol.76(8)3720-30)。同样，p7蛋白已显示出包括两个跨膜结构域。其N-端跨膜结构域包括从大约位置10到大约位置32的氨基酸，而其C-端跨膜结构域包括从大约位置36到大约位置58的氨基酸。尽管在所有HCV病毒株中这两个跨膜结构域的氨基酸有所不同，但对于已报道的病毒株来说，跨膜结构域的大部分氨基酸(通常约大于70％)是疏水性氨基酸，其特征为F、I、W、Y、L、V、M、P、C和A。这两个跨膜结构域通过三个非疏水性氨基酸(K或R、G、R或K)连接，p7的共有序列是ALENLVVLNAASAAGTHGILWFLVFFCAAWYVKGRLVPGATYSLLGLWPLLLLLLALPQRAYA(SEQ ID NO.1)(参见Carrere-Kremer，S.等，(2002)J.Virol.76(8)3720-30)。
亚基因组复制子的研究已经显示，HCV p7对基因组复制并不是必须的(参见Lohmann，V.等，(1999)Science 285(5424)第110-3页；Pietschmann，T.等，(2001)J.Virol.75(3)第1252-64页)，但是其在产生感染性病毒中的作用尚不清楚。已表明HCV p7是一组称为病毒通道蛋白(viroporin)的小蛋白的推定成员，这类蛋白介导阳离子穿透膜并且对于病毒粒子的释放或成熟来说是重要的。对于某些病毒通道蛋白，已经显示跨膜结构域足以形成膜通道(参见Duff，K.C.和R.H.Ashley，(1992)Virology 190(1)第485-9页；Fischer，W.B.等，(2001)Eur.Biophys.J.30(6)第416-20页)。
概述一个实施方案涉及用于治疗HCV感染的方法，即给予有需要的患者(特别是人)有效抑制HCV p7蛋白活性的亚氨基糖衍生化合物。用于所述方法的化合物能有效抑制HCV p7蛋白透化膜的能力。在最广泛的方面，所述化合物由下式I或II表示 I II其中每个R11、R11′、R12、R12′、R13、R13′、R14、R14′、R15、R15′、R31、R31′、R32、R32′、R33、R33′、R34和R34′各自独立选自-H；-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直链或支链C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直链或支链C1-6烷氧基；芳氧基；芳烷氧基；-(亚烷基)氧基(烷基)；-CN；-NO2；-COOH；-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺酰基；(C1-6烷基)磺酰基；芳基磺酰基；氨磺酰基，(C1-6烷基)氨磺酰基；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺酰胺基；芳基磺酰胺基；-NHNH2；-NHOH；芳基；和杂芳基，其中每个取代基可以相同或不同。
R2和R4为各自独立选自以下的取代基直链C7-18烷基、取代的C1-18烷基、支链C3-18烷基、C2-18烯基和炔基和芳烷基。每个直链C7-18烷基、支链C3-18烷基、C2-18烯基和炔基和芳烷基可任选被取代，且取代的C1-18烷基被一个或多个独立选自以下的取代基取代-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直链或支链C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直链或支链C1-6烷氧基，芳氧基；芳烷氧基；-CN；-NO2；-COOH；-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺酰基；(C1-6烷基)磺酰基；芳基磺酰基；氨磺酰基，(C1-6烷基)氨磺酰基；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺酰胺基；芳基磺酰胺基；-NHNH2；和-NHOH，其中所选的取代基可以相同或不同。特别合适的取代基包括壬基、7-氧杂壬基和10-氧杂十一烷基，而特别需要的化合物包括N-壬基脱氧野尻霉素(NN-DNJ)、N-壬基脱氧半乳糖野尻霉素(NN-DGJ)、N-7-氧杂壬基-6-甲基脱氧半乳糖野尻霉素(即N-7-氧杂壬基-6-脱氧-DGJ、N-7-氧杂壬基-1，6-二脱氧半乳糖野尻霉素或N-7-氧杂壬基-甲基-DGJ)和N-10-氧杂十一烷基-1，6-二脱氧半乳糖野尻霉素(即N-10-氧杂十一烷基-6-甲基脱氧半乳糖野尻霉素、N-10-氧杂十一烷基-甲基-DGJ、N-10-氧杂十一烷基-6-脱氧-DGJ、(2R，3S，4R，5S)-1-(9-甲氧基壬基)-2-甲基-3，4，5-哌啶三醇、(2R，3R)-2，3-二羟基丁二酸酯(1∶1)或SP240)。
可将一种或多种所述化合物包装成用于治疗HCV感染的试剂盒。该试剂盒可包括治疗HCV感染的说明书以及给予所述化合物的用具。
另一个实施方案涉及用于筛选能抑制HCV p7活性的化合物的方法。具体地讲，可根据化合物是否抑制p7或p7变体透化膜的能力进行筛选。在这样的方法中，需要使用人工膜系统或细菌系统。
附图简述
图1A显示大肠杆菌(E.coli)Rosetta gami(DE3)pLacl细胞的生长曲线。在指定时间内(诱导后的小时)监测非转化细胞(A)、pTriEx1.1转化的细胞(B)和pTiEx1.1 p7转化的细胞(C)的光密度(OD600nm)。显示了未诱导细胞(○)和加入1mM IPTG诱导的细胞(□)的生长曲线。图1B显示，在指定时间内由非转化大肠杆菌Rosetta gami(DE3)pLacl细胞(A)、pTriEx1.1转化的细胞(B)和pTiEx1.1 p7转化的细胞(C)释放的[3H]-尿苷。显示了未诱导细胞(○)和加入1mM IPTG诱导的细胞(□)的生长曲线。
图2显示合成HCV p7的Tris-tricine凝胶电泳分析。凝胶经银染色(左图)或转移到膜上，随后用链霉抗生物素探测(右图)。
图3A显示将合成HCV p7重组到BLM中的通道记录。直线表示闭合状态。图3B显示，数据收集约30分钟后记录的电流曲线。图3C显示，如图3A所示，在+100mV膜电位记录到的电流曲线柱状图。
图4显示短链(NB-DNJ，NB-DGJ)和长链(NN-DNJ，NN-DGJ)烷基亚氨基糖衍生物对BLM中p7通道信号的影响。钳制电位稳定维持在+100mV，加入亚氨基糖衍生物直至指定的终浓度。
图5显示N7-氧杂壬基-6-脱氧-DGJ(或者称为N7-氧杂壬基-甲基-DGJ)对BLM中p7通道信号的影响。钳制电位稳定维持在+100mV，加入N7-氧杂壬基-6-脱氧-DGJ直至指定的终浓度。
图6显示归一化总电流曲线和标准偏差对药物浓度绘制的曲线示意图。对于NN-DNJ(方形)和NN-DGJ(菱形)，数据代表4秒钟的3个代表性的曲线片段的平均值，而对于N7-氧杂壬基-6-脱氧-DGJ(三角)，数据代表30秒钟的3个代表性的曲线片段的平均值。按照公式“总电流”＝1/(1+([药物]/Kapp)，由数据S拟合推导出近似结合常数(Kapp)为对于NN-DNJ，Kapp＝45.2(±10.7)μM；对于NN-DGJ，Kapp＝110.4(±19.9)μM；对于N7-氧杂壬基-6-脱氧-DGJ，Kapp＝114.2(±18.3)μM。
图7显示SP240(即N-10-氧杂十一烷基-1，6-二脱氧半乳糖野尻霉素)对BLM中p7通道信号的影响。
定义除非另有说明，本文所用的术语“烷基”是指含有一个或多个碳原子的直链和支链烷基，包括例如甲基、乙基、丁基和壬基。
本文所用的术语“芳基”是指苯环等单环芳基，或者茚满基、萘基或芴基等苯并稠合芳基。
本文所用的术语“杂芳基”是指含有一个或多个杂原子的芳族化合物。实例包括吡啶基、呋喃基和噻吩基或含有一个或多个杂原子的苯并稠合芳族化合物，例如吲哚基或喹啉基。
本文所用的术语“杂原子”是指N、O、S等非碳原子。
本文所用的术语“环烷基”是指含有3、4、5、6、7或8个碳的碳环，包括例如环丙基和环己基。
除非另有说明，本文所用的术语“烷氧基”是指含有一个或多个碳原子的直链或支链烷氧基，包括例如甲氧基和乙氧基。
本文所用的术语“烯基”是指含有一个或多个双键的直链或支链烷基，例如乙烯基和丙烯基。
本文所用的术语“芳烷基”是指被苄基和苯乙基等芳基取代的烷基。
本文所用的术语“炔基”是指含有一个或多个三键的直链或支链烷基，例如乙炔基和丙炔基。
本文所用的术语“芳氧基”是指-OH基团中的氢原子被芳基取代而产生的取代基，包括例如苯氧基。
本文所用的术语“芳烷氧基”是指被芳基取代的烷氧基，例如2-苯基乙氧基。
本文所用的术语“烷基氨基”是指被一个烷基取代的氨基，例如甲氨基(-NHCH3)和乙氨基(-NHCH2CH3)。
本文所用的术语“二烷基氨基”是指被两个烷基取代的氨基，例如二甲氨基(-N(CH3)2)和二乙氨基(-N(CH2CH3)2)。
本文所用的术语“DNG”是指1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇或“脱氧野尻霉素”。
本文所用的术语“DGJ”是指1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-半乳糖醇或“脱氧半乳糖野尻霉素”。
本文所用的术语“BLM”是指“黑脂膜”。
优选实施方案的详述在所公开的方法中使用的化合物，作为HCV p7的抑制剂是有效的。在最广泛的方面，所述化合物由下式I或II表示 I II在一方面，所述方法设计给予式I化合物。每个R11、R11′、R12、R12′、R13、R13′、R14、R14′、R15和R15′各自独立选自-H；-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直链或支链C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直链或支链C1-6烷氧基；芳氧基；芳烷氧基；-(亚烷基)氧基(烷基)；-CN；-NO2；-COOH；-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺酰基；(C1-6烷基)磺酰基；芳基磺酰基；氨磺酰基，(C1-6烷基)氨磺酰基；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺酰胺基；芳基磺酰胺基；-NHNH2；-NHOH；芳基；和杂芳基。每个取代基可以相同或不同。
在一个优选的实施方案中，R11、R11′、R12、R12′、R13、R13′、R14、R14′、R15和R15′中的至少一个为羟甲基(-CH2OH)。或者，R11、R11′、R12、R12′、R13、R13′、R14、R14′、R15和R15′中的至少一个为羟基(-OH)。最优选的实施方案设计R11、R11′、R12、R12′、R13、R13′、R14、R14′、R15和R15′中的至少两个选自-CH3、-CH2OH和-OH。
R2为选自以下的取代基直链C7-18烷基、取代的C1-18烷基、支链C3-18烷基、C2-18烯基和炔基和芳烷基。每个直链C7-18烷基、支链C3-18烷基、C2-18烯基和炔基和芳烷基可任选被取代，且所述取代的C1-18烷基被一个或多个独立选自以下的基团取代-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直链或支链C1-6烷基、C2-6烯基和炔基；芳烷基；直链或支链C1-6烷氧基，芳氧基；芳烷氧基；-CN；-NO2；-COOH；-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺酰基；(C1-6烷基)磺酰基；芳基磺酰基；氨磺酰基，(C1-6烷基)氨磺酰基；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺酰胺基；芳基磺酰胺基；-NHNH2；和-NHOH。
优选R2为直链C7-18烷基、支链C3-18烷基或取代的C1-18烷基。更优选R2为直链C7-11烷基、支链C7-11烷基、取代的C7-11烷基或被C1-6烷氧基取代的直链或支链C1-18烷基。R2的直链C7-11烷基取代基的实例包括庚基、辛基和壬基。R2的取代烷基的实例为7-氧杂壬基(-CH2(CH2)5-O-CH2CH3)。最优选R2为正壬基、7-氧杂壬基或10-氧杂十一烷基。
在式I的某些实施方案中，所述化合物可以由下式之一来表示
上式中每个环碳原子的立体化学可以与其它环碳原子的立体化学各不相同。更优选所述化合物具有一个下表1给出的结构式
表1
更优选所述化合物具有一个以下结构式 再更优选R2为壬基、7-氧杂壬基或10-氧杂十一烷基，最优选的化合物包括N-壬基脱氧野尻霉素(NN-DNJ)、N-壬基脱氧半乳糖野尻霉素(NN-DGJ)、N-7-氧杂壬基-6-甲基脱氧半乳糖野尻霉素(即N-7-氧杂壬基-6-脱氧-DGJ、N-7-氧杂壬基-1，6，-二脱氧半乳糖野尻霉素或N-7-氧杂壬基-甲基-DGJ)和N-10-氧杂十一烷基-1，6-二脱氧半乳糖野尻霉素(即N-10-氧杂十一烷基-6-甲基脱氧半乳糖野尻霉素、N-10-氧杂十一烷基-甲基-DGJ、N-10-氧杂十一烷基-6-脱氧-DGJ、(2R，3S，4R，5S)-1-(9-甲氧基壬基)-2-甲基-3，4，5-哌啶三醇、(2R，3R)-2，3-二羟基丁二酸酯(1∶1)或SP240)和它们的异构体，例如 所公开方法的另一方面设计给予式II化合物。每个R31、R31′、R32、R32′、R33、R33′、R34和R34′各自独立选自-H；-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直链或支链C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直链或支链C1-6烷氧基；芳氧基；芳烷氧基；-(亚烷基)氧基(烷基)；-CN；-NO2；-COOH；-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺酰基；(C1-6烷基)磺酰基；芳基磺酰基；氨磺酰基，(C1-6烷基)氨磺酰基；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺酰胺基；芳基磺酰胺基；-NHNH2；-NHOH；芳基；和杂芳基。每个取代基可以相同或不同。
在一个优选的实施方案中，R31、R31′、R32、R32′、R33、R33′、R34和R34′中的至少一个为羟甲基(-CH2OH)。或者，R11、R11′、R12、R12′、R13、R13′、R14、R14′、R15和R15′中的至少一个为羟基(-OH)。最优选的实施方案设计R11、R11′、R12、R12′、R13、R13′、R14、R14′、R15和R15′中的至少两个选自-CH3、-CH2OH和-OH。
在式II中，R4为选自以下的取代基直链C7-18烷基、取代的C1-18烷基、支链C3-18烷基、C2-18烯基和炔基和芳烷基。每个直链C7-18烷基、支链C3-18烷基、C2-18烯基和炔基和芳烷基可任选被取代，且每个取代的C1-18烷基被一个或多个独立选自以下的基团取代-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直链或支链C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直链或支链C1-6烷氧基，芳氧基；芳烷氧基；-CN；-NO2；-COOH；-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺酰基；(C1-6烷基)磺酰基；芳基磺酰基；氨磺酰基，(C1-6烷基)氨磺酰基；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺酰胺基；芳基磺酰胺基；-NHNH2；和-NHOH。
优选R4为直链C7-18烷基、支链C3-18烷基或取代的C1-18烷基。更优选R4为直链C7-11烷基、支链C7-11烷基、取代的C7-11烷基或被C1-6烷氧基取代的直链或支链C1-18烷基。R4的直链C7-11烷基取代基的实例包括庚基、辛基和壬基。R4的取代烷基的实例为7-氧杂壬基(-CH2(CH2)5-O-CH2CH3)。最优选R4为n-壬基、7-氧杂壬基或10-十一烷基。
在一个实施方案中，公开了用于治疗HCV感染的方法，所述方法包括使HCV p7蛋白或者包含p7蛋白的膜组分与一种或多种抑制p7蛋白活性的化合物接触。本发明人已表明p7蛋白增加膜的通透性，类似于膜通道蛋白的功能。另外，本发明人已表明特定化合物能抑制p7透化膜的能力。然而，所公开的方法设计本文公开的化合物也可抑制p7蛋白的其它活性。
所选化合物可通过与p7蛋白的相互作用，抑制该蛋白的一种或多种活性。在这种情况下，如具体结合测定所示，需要选择与p7蛋白结合且其表观结合常数不大于约Kapp＝130μM(即Kapp＝114.2(±18.3)μM)的化合物。或者，如具体通透性测定所示，可能需要选择能阻断p7蛋白透化膜的能力的化合物，当所述化合物浓度不大于约180μM时。
当所选化合物抑制p7透化膜的能力时，所述化合物可阻止p7形成通道，或者在通道形成后所述化合物可阻断该通道(即作为通道阻断剂)。或者，所述化合物可通过与一种或多种膜组分(例如磷脂)相互作用而改变膜流动性或局部特性，抑制p7蛋白。因此，所述化合物可抑制p7形成功能性膜通道的能力。
在又一个实施方案中，提供用于筛选有效抑制HCV p7活性的潜在抗病毒药的方法。通常，所述方法包括将p7或p7变体掺入到膜系统中并观察通透性增加，例如通过采用标准方法记录跨膜电流。然后将试验化合物加入到膜系统中，以测定所述化合物是否抑制p7透化膜的能力。理想的化合物在不超过约180μM的浓度下可完全阻断p7透化膜的能力。
黑脂膜(“BLM”)可用于所述方法，但也可采用其它膜系统。黑脂膜是本领域众所周知的，BLM通常用于研究膜通透性，例如在由通道形成蛋白介导时(参见Duff，K.C.和R.H.Ashley，(1992)Virology 190(1)第485-9页)。
当选定用于观察p7活性的合适膜系统后，可以将p7掺入到所述膜中，以形成含p7的膜。可从其中p7蛋白显示出增加选定膜通透性的任何HCV病毒株中选取p7蛋白。例如，可选定来自HCV-H病毒株的p7蛋白(即ALENLVILNAASLAGTHGLVSFLVFFCFAWYLKGRWVPGAVYALYGMWPLLLLLLALPQRAYA(SEQ ID NO.1))，或者可选定来自另一病毒株的p7蛋白。可能需要使用p7共有序列，所述共有序列是通过比较已报道的p7蛋白的氨基酸序列而获得，或者可能需要选择来自特定HCV分化体(例如分化体1)的p7蛋白。
在筛选方法的另一个实施方案中，可能需要使用所选p7蛋白的变体，如果所述变体是功能性的话(例如当采用本领域已知方法测定时，所述变体显示出透化所选的膜)。可能的变体包括融合、缺失和/或突变或取代。例如，可能需要产生生物素酰化p7蛋白，用于所述方法。在另一个实例中，可能需要至少使用显示出透化所选膜的p7或p7衍生物的部分(例如选定的p7蛋白或变体可证明在BLM中电导水平不小于约60pS(即86±22pS))。也可能需要在选定的p7氨基酸序列中产生突变。当产生突变时，可能需要根据HCV病毒株之间的比较，保持给定位置上氨基酸的一定特性。例如，对来自不同HCV株p7序列的比较已显示出某些氨基酸位置的特性可以是“疏水性”、“中性”或“亲水性”(参见Carrere-Kremer，S.等，(2002)J.Virol.76(8)3720-30)。“疏水性氨基酸”可属于F、I、W、Y、L、V、M、P、C和A。
选定的p7蛋白或变体可以人工合成，或者在细菌细胞或真核细胞等合适的生物系统中表达。当所述蛋白掺入到选定的膜系统中后，可以通过测定所述蛋白是否证明活性(例如引起通透性增加或细胞活力下降)，来测定膜通透性。可以使试验化合物与所述蛋白和/或含p7的膜组分接触，以测定所述化合物是否抑制所述蛋白的活性。在所述方法中，可以在p7掺入到膜之前和/或之后，使试验化合物与p7和/或含p7的膜组分接触。
在一个实施方案中，可能需要使用亚氨基糖衍生物作为筛选方法中的试验化合物。具体地讲，可能需要使用本文所述的DGJ烷基化衍生物或DNJ烷基化衍生物作为试验化合物。特别需要烷基化亚氨基糖N-壬基脱氧野尻霉素(NN-DNJ)、N-壬基脱氧半乳糖野尻霉素(NN-DGJ)、N-7-氧杂壬基-6-甲基脱氧半乳糖野尻霉素(即N-7-氧杂壬基-6-脱氧-DGJ、N-7-氧杂壬基-1，6-二脱氧半乳糖野尻霉素或N-7-氧杂壬基-甲基-DGJ)和N-10-氧杂十一烷基-1，6-二脱氧半乳糖野尻霉素(即N-10-氧杂十一烷基-6-甲基脱氧半乳糖野尻霉素、N-10-氧杂十一烷基-甲基-DGJ、N-10-氧杂十一烷基-6-脱氧-DGJ、(2R，3S，4R，5S)-1-(9-甲氧基壬基)-2-甲基-3，4，5-哌啶三醇、(2R，3R)-2，3-二羟基丁二酸酯(1∶1)或SP240)的衍生物和/或它们的异构体。
在另一个实施方案中，可能需要使用已显示出与p7或其它膜组分相互作用的、作为所述方法中的试验化合物的化合物或其衍生物(例如已显示出在体外与p7相互作用的化合物)。在又一个实施方案中，可能需要使用已显示出破坏由p7或其它蛋白形成的通道的化合物，和/或已知是由p7或其它蛋白形成的通道的阻断剂的化合物，或其衍生物，作为所述方法中的试验化合物。例如，已知金刚烷胺是甲型流感病毒M2通道的通道阻断剂(参见Hay，A.J.等，(1985)EMBO J.4(11)第3021-4页；Duff，K.C.和R.H.Ashley，(1992)Virology 190(1)第485-9页；Sunstrom，N.A.等，(1996)J. Membr.Biol.150(2)第127-32页；Fischer，W.B.等，(2001)Eur.Biophys.J.30(6)第416-20页)。近来，其他人已表明，p7形成离子通道，该通道被金刚烷胺阻断(参见Griffin等，FEBS Letters，2003，Jan.20；535(1-3)34-8)。因此，可能需要使用金刚烷胺或其衍生物作为所述方法中的试验化合物。
在一个实施方案中，当细菌细胞膜通透性增加可导致细胞生长被抑制时，诱导型细菌系统可用于观察通透性。例如，在合适的细菌系统中，可以从诱导型启动子表达p7或其变体，以确定所述细胞是否表现出细胞生长的抑制。或者，在诱导p7表达之前，可以通过用[3H]-尿苷等放射性分子标记细胞，来证实通透性的增加。在诱导p7表达之后，可以通过测定释放到培养基中的[3H]-尿苷，来评价通透性。可以将试验化合物给予所述细菌，以测定所述化合物是否抑制细胞生长和/或所述化合物是否抑制[3H]-尿苷释放到培养基中。
化合物的制备可以用市售的亚氨基化合物作为原料，制备用于本文所述方法的化合物。市售来源包括Sigma，St.Louis，MO；Cambridge ResearchBiochemicals，Norwich，Cheshire，United Kingdom；和Toronto ResearchChemicals，Ontario，Canada。
或者，可以通过本领域技术人员已知的合成方法合成本发明的化合物。例如，各种脱氧野尻霉素(DNJ)衍生物的合成描述于美国专利第5,622,972；5,200,523；5,043,273；4,944,572；4,246,345；4,266,025；4,405,714；和4,806,650号，以及美国申请顺序号10/031,145。本文所述其它亚氨基糖化合物是已知的，并且可以通过以下美国专利给出的方法来制备第4,861,892；4,894,388；4,910,310；4,996,329；5,011,929；5,013,842；5,017,704；5,580,884；5,286,877；5,100,797；和6,291,657号。
药用组合物当需要以药用组合物或药物形式给予所述化合物时，本文公开的化合物可以配制成供各种给药方式用。技术和制剂通常可在以下文献中找到REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES(第18版)，MackPublishing Co.(1990)。
所述药物可以适合于通过任何合适途径给药，例如通过口服(包括口腔含化或舌下)、直肠、鼻腔、局部(包括口腔含化、舌下或经皮)或胃肠外(包括皮下、肌内、静脉内或皮内)途径，虽然优选口服给药。所述组合物可以通过药学领域已知的任何方法来制备，例如通过在无菌条件下将活性成分与载体混合在一起。
对于本领域普通技术人员来说，药学上可接受的盐通常是众所周知的，可以包括但不限于以下实例乙酸盐、苯磺酸盐(benzenesulfonate)、苯磺酸盐(besylate)、苯甲酸盐、碳酸氢盐、酒石酸氢盐、溴化物、依地酸钙、樟磺酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、依地酸盐、乙二磺酸盐、依托酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、乙醇酰氨苯胂酸盐、己基间苯二酚酸盐、海巴明、氢溴酸盐、盐酸盐、羟萘酸盐、碘化物、依西酸盐、乳酸盐、乳二糖酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、双羟萘酸盐(恩波酸盐)、泛酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐、聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、碱式乙酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、单宁酸盐、酒石酸盐或茶氯酸盐。其它药学上可接受的盐可以在例如以下文献中找到REMINGTON′S PHARMACEUTICALSCIENCES(第18版)，参见上文。
优选的药学上可接受的盐包括例如乙酸盐、苯甲酸盐、溴化物、碳酸盐、柠檬酸盐、葡糖酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、萘磺酸盐、双羟萘酸盐(恩波酸盐)、磷酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐或酒石酸盐。
对于注射来说，所述化合物和药物可以配制在水溶液中，最好是在Hank氏溶液、Ringer氏溶液等生理上相容的缓冲液中，或者在生理盐水缓冲液中。对于所述经粘膜给药，在制剂中使用适合于待穿透屏障的渗透剂。所述渗透剂是本领域众所周知的。
采用药学上可接受的载体，将本文公开的化合物配制成用于所述方法实践的适合于系统给药的制剂，这包括在所述方法的范围之内。适当选用载体和合适的生产管理，本方法的组合物、特别是配制成溶液剂的本方法组合物可以通过胃肠外给药，例如通过静脉内注射。采用本领域众所周知的药学上可接受的载体，可以容易地将所述化合物配制成适合于口服给药的制剂。所述载体使所述方法的化合物能够配制成片剂、丸剂、胶囊剂、液体制剂、凝胶剂、糖浆剂、膏剂、混悬剂等，用于口服给予待治疗的患者。
适用于本方法的药用组合物包括如下组合物其中含有达到其预定目的有效量的活性成分。本领域技术人员能够适当地确定有效量，尤其是根据本文所提供的详细的公开内容。
除了活性成分之外，这些药用组合物可含有合适的药学上可接受的载体，所述载体包括便于将所述活性化合物加工成药学上可使用的制剂的赋形剂和辅料。配制成用于口服给药的制剂可以呈片剂、锭剂、胶囊剂或溶液剂的形式。
本文所述的药物以及用于本文所提供的方法中的药物可包括一种或多种以下成分防腐剂、增溶剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、香味剂、盐、缓冲剂、包衣剂或抗氧化剂。它们也可含有除所述化合物和/或本文所述药物之外的治疗活性药物。通过将活性化合物与固体赋形剂混合，任选研磨所得混合物，并且如果需要在加入合适的辅料后，加工颗粒状混合物，以得到片心或锭心，可以获得供口服用的药物制剂。具体地讲，合适的赋形剂是填充剂，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基-纤维素、羧甲基-纤维素钠(CMC)和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP聚维酮碘)。如果需要，可以加入崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐，例如海藻酸钠。
可用于口服的药物制剂包括由明胶制成的锁口型(push-fit)胶囊以及由明胶和增塑剂(例如甘油或山梨醇)制成的密封软胶囊。锁口型胶囊可含有活性成分以及乳糖等填充剂、淀粉等粘合剂和/或滑石粉或硬脂酸镁等润滑剂，任选稳定剂。在软胶囊剂中，活性化合物可以溶于或悬浮于合适的液体例如脂肪油、液状石蜡或液体聚乙二醇(PEG)中。另外，可以加入稳定剂。
给药途径下面将会更详细考虑不同的给药途径a.口服给药适合于口服给药的药物可以是胶囊剂或片剂；散剂或颗粒剂；溶液剂、糖浆剂或混悬剂(在水或非水液体中)；食用泡沫剂(foams)或泡沫剂(whips)；或乳剂。
片剂或硬明胶胶囊剂可以包含乳糖、玉米淀粉或其衍生物、硬脂酸或其盐。
软明胶胶囊剂可以包含植物油、蜡、油脂、半固体或液体多元醇等。
溶液剂和糖浆剂可包含水、多元醇和糖。对于制备混悬剂来说，可以使用油(例如植物油)，以提供水包油或油包水混悬剂。
b.经皮给药适于经皮给药的药物可以是设计在一段较长时间内与受体皮肤保持密切接触的透气型贴剂(discrete patch)。例如，可通过离子导入法，给予贴剂中的活性成分(离子导入法描述于PharmaceuticalResearch，3(6)318(1986))。
c.局部给药适于局部给药的药物可以是软膏剂、乳膏剂、混悬洗剂、散剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油剂。
对于眼部感染或口腔和皮肤等其它外部组织感染来说，最好使用局部软膏剂或乳膏剂。当配制软膏剂时，可以将活性成分与石蜡或水混溶性软膏基质混合。或者，可以将活性成分与水包油基质或油包水基质一起配制成乳膏剂。
适于眼部局部给药的药物包括滴眼剂。此时，活性成分可溶解或悬浮在合适载体例如水性溶剂中。
适于口腔局部给药的药物包括糖锭剂、软锭剂和漱口剂。
d.直肠给药适于直肠给药的药物可以是栓剂或灌肠剂。
e.鼻腔给药使用固体载体的适于鼻腔给药的药物包括粗粉(例如粒径范围在20-500微米)。这可以以吸入的方式给药，即从靠近鼻子的盛有粉剂的容器中通过鼻腔快速吸入。
使用液体载体的适于鼻腔给药的组合物包括鼻腔喷雾剂或滴鼻剂。这些可包含活性成分的水性或油性溶液剂。
适于通过吸入给药的药物包括微粒粉剂或雾剂，它们可由不同种类的仪器产生，例如加压的气溶胶、喷雾器或吹药器。可以制造这些仪器，以便提供预先确定的活性成分的剂量。
f.胃肠外给药适于胃肠外给药的药物包括水性和非水性无菌注射溶液剂或混悬剂。它们可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和赋予组合物与预定受体的血液基本等渗的溶质。所述组合物中可以存在的其它成分包括例如水、乙醇、多元醇、甘油和植物油。适于胃肠外给药的组合物可以呈单剂量或多剂量容器形式，例如密封的安瓿和小瓶，并且可以在冷冻-干燥(冻干)条件下贮存，只需在临用前加入无菌液体载体例如无菌注射用水即可。可从无菌粉针剂、颗粒剂和片剂制备临用注射溶液剂。
g.剂量可通过常规试验，容易地确定剂量，并且在主治医生或临床医生的监控下进行。确定合适剂量的指导原则是给予合适而有效且无毒或可接受毒性的材料剂量(参见例如Fingl等，(1975)ThePharmacological Basis of Therapeutics，第1章，第1页)。对于NN-DNJ或类似化合物，预计成人日剂量可以在0.1mg-5g活性药物的范围内，可以在3mg-2400mg范围内，最好在5mg-800mg范围内，更优选在15mg-400mg，最优选15mg-100mg。每天可以给予单次日剂量，或者每天给予2次、3次或更多次剂量。
以下实施例仅仅用来说明上述方法；它们并不是用来以任何方式限制本发明范围的。
实施例1.诱导p7在细菌中表达下面一组实验证明，可诱导p7在细菌中表达。本实验可用于确定p7或p7变体是否能透化膜。实验也显示出p7的表达导致细胞生长的停止，此外，p7的表达导致放射性标记尿苷的释放。
实施例1.1.材料与方法p7表达质粒的构建。采用标准克隆方法，通过DNA操作构建重组质粒。通过聚合酶链式反应(PCR)，使用作为模板的编码质粒pTM1/CE1E2p7的HCV 1a株的cDNA(AF009606)(由J.Dubuisson友好提供)，扩增HCV p7的编码区。使用以下2个寡核苷酸引物进行PCR反应引物1，AAGCGCCCATGGCTTTGGAGAACCTCGTAATAC(SEQ ID NO.2)和引物2，ATTGAATTCTTAGTGATGGTGATGGTGATGGTGGTGGTATGCCCGCTGAGGCAAC(SEQ ID NO.3)。引物1和引物2分别编码p7的5′端区和3′端区。为了在5′端产生NcoI限制位点，在3′端产生EcoRI限制位点，将下划线序列引入引物中。纯化所得PCR产物，用NcoI和EcoRI限制酶(Roche)消化，并与事先已用NcoI和EcoRI消化的pTriEx1.1表达载体(Novagen)连接。连接混合物用于转化感受态大肠杆菌R.gami(DE3)pLacl细胞(CN Biosciences)。含有重组质粒的细菌克隆在含有50μg/ml羧苄西林(Sigma)的培养基中扩增。分离质粒DNA，进行限制性分析，并且使用用于T7启动子的引物和引物2进行测序，以便排除在PCR反应中引入突变的可能性。所分离的含p7质粒命名为pTriEx1.1p7。
诱导p7在细菌中表达。在37℃，在50μg/ml羧苄西林存在下，将含有pTriEx1.1或pTriEx1.1 p7质粒的大肠杆菌R.gami(DE3)pLacl细胞的单菌落在LB培养基中振荡培养，直到它们的OD600nm达到0.5为止。将3ml这样的起始培养物加入到含有50μg/ml羧苄西林和0.4％葡萄糖的100ml LB培养基中，并将细胞在同样条件下培养。当细胞的OD600nm达到0.5-0.7时，通过加入1mM异丙基硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)(Roche)诱导p7表达，并通过监测OD600n跟踪它们的进一步生长。未转化细菌(没有pTriEx1.1质粒)在没有羧苄西林时生长。
细菌细胞释放[3H]-尿苷。如上所述培养细菌，但是这次是在2μCi/ml[3H]-尿苷(Amersham，UK)存在下培养，直到它们的OD600nm达到0.5为止。然后沉淀细胞，用PBS洗涤3次并重悬浮在25ml生长培养基中。15分钟后，通过加入1mM IPTG诱导p7表达。诱导后，在不同时间取出0.5ml试样，将细胞通过离心沉淀，上清液与3.5mlUltima Gold闪烁混合剂(Packard，UK)混合，使用Beckman LS 3801闪烁计数器，通过闪烁计数测定释放到培养基中的放射性。
实施例1.1.结果诱导p7在细菌中表达。为了评价HCV p7对膜通透性的影响，使用受严格控制的T7 lac启动子调节的IPTG诱导型系统，让p7在大肠杆菌Rosetta gami(DE3)pLacl细胞中表达(参见Dubendorff，J.W.和F.W.Studier，(1991)J. Mol.Biol.219(1)第45-59页)。Rosetta gami(DE3)pLacl细胞携带处于lacUV5启动子控制之下的染色体拷贝T7RNA聚合酶，并且从pLacl质粒提供足够的lac阻抑物，以保证在未诱导状态下的严格性表达(参见Studier，F.W.和B.A.Moffatt，(1986)J.Mol.Biol.189(1)第113-30页)。用IPTG诱导后，通过监测不同时间的细胞密度，跟踪p7表达对宿主细胞的影响。IPTG的加入对非转化细胞(图A，上图)和pTriEx1.1转化的细胞(图B，上图)没有影响，然而p7的表达导致细胞群体生长的停止(图1C，上图)，很可能是因为在大肠杆菌细胞膜上形成孔。
为了分析化合物从表达HCV p7的细菌内流出，给重组克隆加载放射性标记的尿苷，并在诱导后测定不同时间点的放射性的释放(图1，下图)。在非转化细胞或携带亲代质粒的克隆中没有观察到显著流出[3H]-尿苷(图1A和图B，下图)。在诱导p7合成2小时后，表达p7的细胞开始向培养基中释放[3H]-尿苷。在4小时的监测周期中，[3H]-尿苷的释放增加(图1C)，表明p7诱导外细胞膜的通透性。
实施例2.合成的p7掺入到BLM中下面一组实验证明，根据通道记录测定，合成的p7可增加BLM的通透性。实验也显示出长链烷基亚氨基糖衍生物抑制p7活性。
实施例2.1.材料与方法.
肽的合成和产物质量控制。由英国的Albachem合成N-端加有生物素-标记的50mg相当于p7(HCV H株)的肽(生物素-ALENLVILNAASLAGTHGLVSFLVFFCFAWYLKGRWVPGAVYALYGMWPLLLLLLALPQRAYA(SEQ ID NO.4))。使用基体辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS)分析p7肽将p7蛋白溶于40％乙腈中，得到含有1mg/ml肽的溶液。将1μl该溶液试样与1μl含有16mM辛基-葡糖苷溶液的饱和α-氰基-4-羟基肉桂酸的95∶5乙腈/水(v/v)溶液混合。将该混合物试样(1μl)置于质谱仪靶中并让其风干。用胰蛋白酶自溶物对测得的质量进行外标。用TofSpec 2E质谱仪(Micromass，Wythenshawe，Manchester，UK)，在反射模式下操作，记录质谱。源电压、提取电压和聚焦电压分别为20000V、19950V和16000V。所有数据都运用Mass Lynx版本3.2软件进行分析。按照MALDI质谱分析，观察到对应于全长p7肽的峰，即在m/z 7247.8。
为了测定全长肽的纯度，使用以下方法的修改版本，将所述肽再进行Tris-Tricine凝胶电泳Schgger和yon Jagow，(1987)Anal.Biochem.，166(2)第368-79页。简而言之，将溶于40％乙腈/水(500μg/ml)的p7(5μg)在Tricine样品缓冲液中加样到凝胶(8×10cm2)上，所述凝胶由分离胶(20.18％T，0.83％C)、间隔胶(11.44％T，0.34％C)和浓缩胶(10.9％T，0.32％C)组成，其中T是单体(丙烯酰胺和双丙烯酰胺)浓度的总百分数，而C是相对于T来说的交联剂浓度的百分数。在30V恒压下进行凝胶电泳，直到样品完全进入浓缩胶后，将电压升至110V。
通过银染色和蛋白质印迹分析凝胶。对于银染色，将凝胶在50％甲醇中洗涤10分钟，然后在5％甲醇中洗涤10分钟。然后将凝胶在40μM DTT溶液中孵育10分钟，然后用水冲洗并在0.1％AgNO3水溶液中孵育10分钟。随后用水洗涤3次，共10秒钟，然后加入显影液(7.5g NaCO3，125μl甲醛的250ml水)。通过加入固体一水柠檬酸，终止显影过程。将凝胶用水冲洗并浸泡在35％乙醇/2％甘油中，然后干燥。
对于蛋白质印迹分析，用半干电印迹仪(2小时，40mA)(Merek)，将凝胶上的蛋白在转移缓冲液(24mM Tris碱，192mM甘氨酸，20％甲醇)中转移到Immobilon P膜(Amersham，UK)上。将该膜在含有3％牛奶的PBS-0.1％Tween中封闭过夜，然后在室温下与辣根过氧化物酶偶联的链霉抗生物素(1μg/ml的PBS-0.1％Tween，1％牛奶)一起孵育3小时。然后在PBS-0.1％Tween、1％牛奶中洗涤2次，然后按照制造商的说明书，用ECL检测系统(Amersham，UK)进行显影。
银染色凝胶和蛋白质印迹两者都显示出预期分子量的一种主要种类(图2)，表明至少部分加样的蛋白含有全长生物素酰化p7蛋白。然而，因为以前曾观察到有和没有尿素的凝胶之间分辨率的差异，所以在没有尿素情况下重新分析化学合成的p7。虽然链霉抗生物素探测的蛋白质印迹显示全长生物素酰化p7的存在，但是在银染色凝胶上观察到约为一半表观分子量的额外的宽条带，所述条带占总p7的50％-60％。该宽条带相当于通过质谱观察到的来自较小的非生物素酰化p7的种类，其质量理论上相当于含有N-端跨膜结构域的p7片段。因为已证明难以从p7的截短形式分离出全长p7，所以随后将其混合物用于在黑脂膜中进行通道记录。
黑脂膜(BLM)中的通道记录。制备BLM以研究膜动力学，是本领域众所周知的。在聚四氟乙烯薄膜(厚度约25μm，Yellow SpringsInstruments，Ohio，USA)中，形成的BLM跨越椭圆形小孔，其长轴直径约为100μm(参见Montal，M.和P.Mueller，(1972)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69(12)第3561-6页)。将40μl脂质混合物(1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(POPE)∶1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)(4∶1(w/w))溶于戊烷(5mg/ml)中，并铺在水性面下相的上面(0.5M KCl，5mM HEPES，1mM CaCl2，pH 7.4)。这使得约0.2mg脂质沉积在聚四氟乙烯薄膜的每一面上。让溶剂蒸发10分钟后，通过提高聚四氟乙烯膜孔上方小室的缓冲液水平，形成BLM。形成稳定的BLM后，从200倍过量贮液，将HCV p7蛋白(溶于乙醇)加入到接地的水性面下相(双层每边小室中的体积2ml)，反面小室达到终浓度约为50μM。时间延迟约10分钟后，出现记录。用Axopatch 1 D放大器，在5kHz频率下记录电流。数据用50Hz的截止频率进行过滤，然后用软件Origin 5.0进行分析。或在正面或在反面加入药物(来自NN-DNJ(Synergy Pharmaceuticals)、NN-DGJ(Toronto Research Chemicals)和N7-氧杂壬基-6-脱氧-DGJ(United Therapeutics Inc.)的10mM贮液，以及来自NB-DNJ(Sigma)和NB-DGJ的100mM贮液)。通过向测试室中序贯加入等体积，来增加药物浓度。加入药物约1分钟后，在+100mV记录数据达约3分钟。
实施例2.2.结果将p7掺入到BLM中。根据记录跨BLM通道信号的测定，将p7加入到缓冲液小室增加BLM通透性。在-100mV，通道电导水平上升至2nS(图3A)。在+50mV所测最小平均电导水平约为86±22pS(表1)。
表1
表1p7的电导水平。数据来自图3A的记录，表示为平均值±平均值的标准误，如括号内所示。根据1秒时间段的记录来计算平均值。
*来自1秒时间段的平均值和标准差**从目测曲线确定数值特定电导水平的寿命范围从几百毫秒到几分钟。稳定的长期持续的电导状态以约100pS(和100pS的倍数)的间隔变化，表明形成相对稳定的通道，其电导约为100pS。记录的波动可显示亚电导状态的存在。图3B中显示了在+100mV进行记录的柱状图的实例。延长对同一样品的测量，导致增加的噪声水平，这最终排除了对特定电导水平的设定(图3C)。在一些实验中，将p7插入到BLM中，产生脉冲样活性(例如图4，左上图)。
对含有生物素-p7蛋白的膜进行链霉抗生物素金染色，随后通过透射电镜术检测该复合物，表明生物素-p7蛋白象通道(数据未显示)，正如对生物合成-合成HCV p7所报道的一样(参见Griffin等，FEBSLetters，2003年1月20日；535(1-3)34-8)。(另见Pavlovic等，PNAS 2003年5月13日；100(10)6104-8)。
无论是包括跨膜结构域I(″TMD I″)(例如ALENLVILNAASLAGTHGLVSFLVFFCFAWYLK(SEQ ID NO.5))的肽还是包括跨膜结构域II(″TMD II″)(例如GRWVPGAVYALYGMWPLLLLLLALPQRAYA(SEQ ID NO.6))的肽加入到BLM中，都不能独自形成通道，对其测定表明，缺乏通道信号(数据未显示)。甚至将这两个结构域加入到BLM中，也不形成通道(数据未显示)。
将药物浓度逐渐增加的亚氨基糖衍生物加入到膜一侧的缓冲液中，测定它们对p7诱导的通道活性的效应。对于短链烷基衍生物NB-DGJ和NB-DNJ，p7通道活性保持不变(图4，上图)。同样，高达3.0mM的N-辛基葡糖苷对通道活性也没有影响(数据未显示)。然而，加入更多的长链烷基衍生物NN-DGJ、NN-DNJ和N7-氧杂壬基-6-脱氧-DGJ，导致对p7通道信号的剂量依赖性抑制(图4，下图和图5)。从所得归一化总电流曲线的曲线示意图和它们各自的S拟合(图6)，推导出近似结合常数为对于NN-DGJ，Kapp＝110.4(±19.9)μM，对于NN-DNJ，Kapp＝45.2(±10.7)μM，对于N7-氧杂壬基-6-脱氧-DGJ，Kapp＝114.2(±18.3)μM。对于NN-DGJ，在约140μM观察到通道活性被完全阻断，而对于NN-DNJ在105μM、对于N7-氧杂壬基-6-脱氧-DGJ在180μM观察到通道活性被完全阻断。在增加任何药物浓度时，没有观察到漏电流。
同样，加入更多的长链烷基衍生物SP240(即N-10-氧杂十一烷基-1，6-二脱氧半乳糖野尻霉素)，导致对p7通道信号的剂量依赖性抑制(图7)。对于SP240，在约100μM观察到通道活性被完全阻断。
本说明书引用的所有专利和其它参考文献都预示着本发明所属领域技术人员的技术水平，并且通过引用包括任何表格和附图在内的全部内容结合到本文中，其程度与每篇参考文献各自通过引用全部结合到本文中一样。
本领域技术人员将容易理解，可以适当地修改本发明以获得结果和所提到的优势以及固有的优势。作为代表性的优选实施方案的本文所述方法、变化和化合物/组合物都是示例性的，并不是为了限制本发明的范围。对于本领域技术人员来说，那些改变和其它用途全都包括在本发明中。
对本领域技术人员显而易见的是，可以在不偏离本发明的范围和精神的情况下，对在此公开的本发明进行不同的取代和修改。例如，可以利用各种不同的结合对，以及各种不同的治疗药和诊断药。因此，所述额外的实施方案都包括在本发明的范围之内。
在缺乏本文未具体公开的任何要素和限制的情况下，可以适宜地实施本文说明性地描述的本发明。因此，例如，在各种情况下，术语“包括”、“基本由...组成”和“由...组成”中的任一个都可以用其它两个术语来替换。所用的术语和短语可用作描述性而不是限制性的术语和短语，而且不会在使用所述术语和短语时排除任何等同的所示、所述的特征或其部分，但是人们知道，在本发明范围内可以进行不同的修改。因此，人们应理解，尽管已经通过优选实施方案具体公开了本发明，但是本领域技术人员也可采用本文公开构思的任选特征、修改和变化，并且所述修改和变化被认为是在本发明的范围之内。
另外，当按照马库什化合物或其它分类的替代化合物描述本发明的特征或方面时，本领域技术人员将会知道，也因此按照马库什化合物或其它化合物的任何各个成员或成员亚类来描述本发明。
另外，除非有相反的说明，当实施方案中提供各种数值时，采用任何2个不同数值作为范围的端点来描述额外的实施方案。其范围也包括在本发明的范围之内。
权利要求
1.一种治疗丙型肝炎病毒(HCV)感染的方法，所述方法包括给予有需要的患者选自式I化合物或式II化合物、其相关异构体、药学上可接受的盐和溶剂合物的化合物 其中每个取代基R11、R11′、R12、R12′、R13、R13′、R14、R14′、R15、R15′、R31、R31′、R32、R32′、R33、R33′、R34和R34′各自独立选自-H；-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直链或支链C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直链或支链C1-6烷氧基；芳氧基；芳烷氧基；-(亚烷基)氧基(烷基)；-CN；-NO2；-COOH，-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺酰基；(C1-6烷基)磺酰基；芳基磺酰基；氨磺酰基，(C1-6烷基)氨磺酰基；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺酰胺基；芳基磺酰胺基；-NHNH2；-NHOH；芳基；和杂芳基，其中每个取代基可以相同或不同；其中每个烷基、烯基、炔基、芳基和杂芳基部分可任选被一个或多个独立选自以下的基团取代-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直链或支链C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直链或支链C1-6烷氧基；芳氧基；芳烷氧基；-(亚烷基)氧基(烷基)；-CN，-NO2，-COOH，-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺酰基；(C1-6烷基)磺酰基；芳基磺酰基；氨磺酰基，(C1-6烷基)氨磺酰基；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺酰胺基；芳基磺酰胺基；-NHNH2；和-NHOH；且R2和R4为各自独立选自以下的取代基直链C7-18烷基、取代的C1-18烷基、支链C3-18烷基、C2-18烯基和炔基和芳烷基；其中每个直链C7-18烷基、支链C3-18烷基、C2-18烯基和炔基和芳烷基可任选被取代，且每个取代的C1-18烷基被一个或多个独立选自以下的基团取代-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直链或支链C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直链或支链C1- 6烷氧基，芳氧基；芳烷氧基；-CN，-NO2，-COOH，-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺酰基；(C1-6烷基)磺酰基；芳基磺酰基；氨磺酰基，(C1-6烷基)氨磺酰基；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺酰胺基；芳基磺酰胺基；-NHNH2；和-NHOH。
2.权利要求1的方法，所述方法还包括使HCV p7蛋白和含有p7蛋白的膜组分中的一个或它们两个与所述化合物接触。
3.权利要求1的方法，其中所述化合物是式I化合物。
4.权利要求3的方法，其中R11、R11′、R12、R12′、R13、R13′、R14、R14′、R15和R15′中的至少一个为-CH2OH。
5.权利要求3的方法，其中R11、R11′、R12、R12′、R13、R13′、R14、R14′、R15和R15′中的至少一个为-OH。
6.权利要求3的方法，其中R2为直链C7-18烷基、支链C3-18烷基或取代的C1-18烷基。
7.权利要求6的方法，其中R2为直链C7-11烷基、支链C7-11烷基或取代的C7-11烷基。
8.权利要求3的方法，其中R11、R11′、R12、R12′、R13、R13′、R14、R14′、R15和R15′中的至少两个选自-CH3、-CH2OH和-OH。
9.权利要求8的方法，其中所述化合物是选自以下的化合物 相关异构体及其混合物。
10.权利要求9的方法，其中所述化合物是选自下表给出的化合物
11.权利要求1的方法，其中所述化合物是选自以下的化合物及其混合物
12.权利要求11的方法，其中R2为直链C7-18烷基、支链C3-18烷基或取代的C1-18烷基。
13.权利要求11的方法，其中R2为直链C7-11烷基、支链C7-11烷基或取代的C7-11烷基。
14.权利要求11的方法，其中R2为直链C7-18烷基。
15.权利要求14的方法，其中R2为直链C7-11烷基。
16.权利要求15的方法，其中R2为正壬基。
17.权利要求11的方法，其中R2为被C1-6烷氧基取代的直链或支链C1-18烷基。
18.权利要求17的方法，其中R2为7-氧杂壬基。
19.权利要求17的方法，其中R2为10-十一烷基。
20.权利要求1的方法，其中所述化合物是N-壬基-DNJ。
21.权利要求1的方法，其中所述化合物是N-壬基-DGJ。
22.权利要求1的方法，其中所述化合物是N-7-氧杂壬基-6-脱氧-DGJ。
23.权利要求1的方法，其中所述化合物是N-10-氧杂十一烷基-甲基-DGJ。
24.权利要求1的方法，其中所述化合物是式II化合物。
25.权利要求24的方法，其中R31、R31′、R32、R32′、R33、R33′、R34和R34′中的至少一个为-CH2OH。
26.权利要求24的方法，其中R31、R31′、R32、R32′、R33、R33′、R34和R34′中的至少一个为-OH。
27.权利要求24的方法，其中R31、R31′、R32、R32′、R33、R33′、R34和R34′中的至少两个选自-CH3、-CH2OH和-OH。
28.权利要求27的方法，其中R4为直链C7-18烷基、支链C3-18烷基或取代的C1-18烷基。
29.权利要求27的方法，其中R4为直链C7-11烷基、支链C7-11烷基或取代的C7-11烷基。
30.权利要求27的方法，其中R4为被C1-6烷氧基取代的直链或支链C1-18烷基。
31.权利要求27的方法，其中R4为正壬基。
32.权利要求27的方法，其中R4为7-氧杂壬基。
33.权利要求27的方法，其中R4为10-氧杂十一烷基。
34.权利要求2的方法，其中含有p7蛋白的膜相对于不含p7蛋白的膜来说具有增加的通透性，并且所述化合物降低增加的通透性。
35.权利要求34的方法，其中所述化合物抑制通道的形成。
36.权利要求34的方法，其中所述化合物是通道阻断剂。
37.权利要求1的方法，其中所述患者是人。
38.一种用于筛选潜在HCV抗病毒药的方法，所述方法包括将p7蛋白和变体中的至少一个掺入到膜中，以产生含有p7的膜，其中所述含有p7的膜相对于不含p7的膜来说具有增加的通透性；使含有p7的膜的一种或多种组分与试验化合物接触；将其中一种或多种组分已经接触试验化合物的含有p7的膜的通透性与其中没有组分接触试验化合物的含有p7的膜的通透性进行比较。
39.权利要求38的方法，其中所述p7蛋白选自HCV分化体1的成员。
40.权利要求38的方法，其中所述p7蛋白包含氨基酸序列ALENLVILNAASLAGTHGLVSFLVFFCFAWYLKGRWVPGAVYALYGMWPLLLLLLALPQRAYA(SEQ ID NO.1)
41.权利要求38的方法，其中所述p7变体包含至少一个跨膜结构域。
42.权利要求41的方法，其中所述p7变体包含至少一个从所选p7蛋白的大约位置10到大约位置32的氨基酸序列，以及从大约位置36到大约位置58的氨基酸序列。
43.权利要求41的方法，其中所述跨膜结构域中大于约70％的氨基酸是以下成员F、I、W、Y、L、V、M、P、C和A。
44.权利要求38的方法，其中所述p7变体包含生物素酰化p7蛋白。
45.权利要求38的方法，其中使所述p7蛋白与试验化合物接触。
46.权利要求38的方法，其中通过记录跨膜电流来比较通透性。
47.权利要求38的方法，其中所述膜包括黑脂膜。
48.权利要求38的方法，其中所述试验化合物抑制通道的形成。
49.权利要求38的方法，其中所述试验化合物是通道阻断剂。
50.权利要求38的方法，其中所述试验化合物选自式I化合物或式II化合物、其相关异构体、药学上可接受的盐和溶剂合物 其中每个取代基R11、R11′、R12、R12′、R13、R13′、R14、R14′、R15、R15′、R31、R31′、R32、R32′、R33、R33′、R34和R34′各自独立选自-H；-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直链或支链C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直链或支链C1-6烷氧基；芳氧基；芳烷氧基；-(亚烷基)氧基(烷基)；-CN；-NO2；-COOH；-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺酰基；(C1-6烷基)磺酰基；芳基磺酰基；氨磺酰基，(C1-6烷基)氨磺酰基；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺酰胺基；芳基磺酰胺基；-NHNH2；-NHOH；芳基；和杂芳基；其中每个取代基可以相同或不同；其中每个烷基、烯基、炔基、芳基和杂芳基部分可任选被一个或多个独立选自以下的基团取代-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直链或支链C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直链或支链C1-6烷氧基；芳氧基；芳烷氧基；-(亚烷基)氧基(烷基)；-CN，-NO2，-COOH，-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺酰基；(C1-6烷基)磺酰基；芳基磺酰基；氨磺酰基，(C1-6烷基)氨磺酰基；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺酰胺基；芳基磺酰胺基；-NHNH2；和-NHOH；且R2和R4为各自独立选自以下的取代基直链C7-18烷基、取代的C1-18烷基、支链C3-18烷基、C2-18烯基和炔基和芳烷基；其中每个直链C7-18烷基、支链C3-18烷基、C2-18烯基和炔基和芳烷基可任选被取代，且每个取代的C1-18烷基被一个或多个独立选自以下的基团取代-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直链或支链C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直链或支链C1- 6烷氧基，芳氧基；芳烷氧基；-CN，-NO2，-COOH，-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺酰基；(C1-6烷基)磺酰基；芳基磺酰基；氨磺酰基，(C1-6烷基)氨磺酰基；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺酰胺基；芳基磺酰胺基；-NHNH2；和-NHOH。
51.权利要求38的方法，其中所述试验化合物是金刚烷胺或其衍生物。
52.一种用于治疗丙型肝炎病毒(HCV)感染的试剂盒，所述试剂盒包括(A)式I化合物或式II化合物、其相关异构体、药学上可接受的盐或溶剂合物 其中每个取代基R11、R11′、R12、R12＇、R13、R13′、R14、R14′、R15、R15′、R31、R31′、R32、R32′、R33、R33′、R34和R34′各自独立选自-H；-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直链或支链C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直链或支链C1-6烷氧基；芳氧基；芳烷氧基；-(亚烷基)氧基(烷基)；-CN；-NO2；-COOH，-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺酰基；(C1-6烷基)磺酰基；芳基磺酰基；氨磺酰基，(C1-6烷基)氨磺酰基；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺酰胺基；芳基磺酰胺基；-NHNH2；-NHOH；芳基；和杂芳基，其中每个取代基可以相同或不同；其中每个烷基、烯基、炔基、芳基和杂芳基部分可任选被一个或多个独立选自以下的基团取代-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直链或支链C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直链或支链C1-6烷氧基，芳氧基；芳烷氧基；-(亚烷基)氧基(烷基)；-CN，-NO2，-COOH，-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺酰基；(C1-6烷基)磺酰基；芳基磺酰基；氨磺酰基，(C1-6烷基)氨磺酰基；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺酰胺基；芳基磺酰胺基；-NHNH2；和-NHOH；且R2和R4为各自独立选自以下的取代基直链C7-18烷基、取代的C1-18烷基、支链C3-18烷基、C2-18烯基和炔基和芳烷基；其中每个直链C7-18烷基、支链C3-18烷基、C2-18烯基和炔基和芳烷基可任选被取代，且每个取代的C1-18烷基被一个或多个独立选自以下的基团取代-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直链或支链C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直链或支链C1-6烷氧基，芳氧基；芳烷氧基；-CN，-NO2，-COOH，-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺酰基；(C1-6烷基)磺酰基；芳基磺酰基；氨磺酰基，(C1-6烷基)氨磺酰基；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺酰胺基；芳基磺酰胺基；-NHNH2；和-NHOH；和(B)用于治疗HCV感染的说明书。
53.一种式I化合物或式II化合物、其相关异构体、药学上可接受的盐或溶剂合物的组合物 其中每个取代基R11、R11′、R12、R12′、R13、R13′、R14、R14′、R15、R15′、R31、R31′、R32、R32′、R33、R33′、R34和R34′各自独立选自-H；-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直链或支链C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直链或支链C1-6烷氧基；芳氧基；芳烷氧基；-(亚烷基)氧基(烷基)；-CN；-NO2；-COOH，-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺酰基；(C1-6烷基)磺酰基；芳基磺酰基；氨磺酰基，(C1-6烷基)氨磺酰基；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺酰胺基；芳基磺酰胺基；-NHNH2；-NHOH；芳基；和杂芳基，其中每个取代基可以相同或不同；其中每个烷基、烯基、炔基、芳基和杂芳基部分可任选被一个或多个独立选自以下的基团取代-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直链或支链C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直链或支链C1-6烷氧基；芳氧基；芳烷氧基；-(亚烷基)氧基(烷基)；-CN，-NO2，-COOH，-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺酰基；(C1-6烷基)磺酰基；芳基磺酰基；氨磺酰基，(C1-6烷基)氨磺酰基；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺酰胺基；芳基磺酰胺基；-NHNH2；和-NHOH；且R2和R4为10-氧杂十一烷基。
全文摘要
公开了通过给予有效抑制丙型肝炎病毒(HCV)p7蛋白活性的亚氨基糖衍生化合物而治疗HCV感染的方法和试剂盒，以及用于筛选抑制p7蛋白或其变体活性的化合物的方法。所公开的N－取代亚氨基化合物及其药用组合物抑制HCV p7透化膜的能力。特别有效的化合物是衍生自N－烷基化哌啶的亚氨基糖。也公开了用于筛选潜在HCV抗病毒药的方法。
文档编号A61K31/40GK1694696SQ03825200
公开日2005年11月9日 申请日期2003年9月23日 优先权日2002年9月23日
发明者尼科尔·齐特兹曼, 雷蒙德·德韦克 申请人:牛津大学校委会