专利名称：组织工程复合皮肤及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种组织工程复合皮肤以及该复合皮肤的制备方法。
背景技术：
皮肤覆盖于身体的表面，是人体最大的器官之一，具有屏障、保护、调节体温及感觉功能，还是人体免疫系统的重要组成部分。但烧伤等原因造成的皮肤缺损，不仅使患者外观丑陋，而且相关组织和器官的功能也受到严重影响。因此，寻找皮肤替代物成为临床上迫切需要解决的问题。
目前已有不少商品化的皮肤替代物问世，包括表皮替代物、真皮替代物和复合皮肤替代物，简单分述如下自体表皮替代物可提供大面积的创面覆盖，重建表皮，阻止水分丢失和微生物污染。Epicel是其中的代表。已商品化的人工真皮包括Alloderm，Dermagraft，Integra，Biobrane等，但多为同种异体来源或合成材料，仅起到真皮重建和提供表皮爬行所需基质的作用。复合皮肤替代物包括表皮和真皮，可修复皮肤的全层缺损，重建表皮和真皮。较成熟的一个上市产品就是Apligraf，其表皮层来自新生儿包皮的角质形成细胞，真皮层由来自新生儿包皮的成纤维细胞、牛跟腱I型胶原及血清、各种添加剂等形成的凝胶。中国专利申请第91109937.9号，第01107099.4号、及第02139398.2号也分别揭示了复合人工皮肤的制造方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有表皮及真皮双层结构的复合皮肤，用于皮肤缺损的永久修复。
本发明的另一目的在于提供上述复合皮肤的制备方法。
本发明复合皮肤的制备方法包括如下步骤取包皮环切术废弃的包皮，或体表任何部位皮肤，分离表皮和真皮，分别收获角质形成细胞和成纤维细胞。后者直接在培养皿中培养。表皮干细胞的制备有两种方法(1)经过IV型胶原(或其它细胞外基质，如层粘连蛋白(laminin)和纤维粘连蛋白(fibronectin)等)的差速粘附试验及克隆形成试验筛选；(2)通过流式细胞仪(FACS)(或用磁珠分离方法MACS)分选出β1整合素高表达的细胞获得表皮干细胞。
获得复合皮肤可采用两种方法(1)将可降解吸收的PGA(聚羟基乙酸)膜片(所采用的生物支架材料，除PGA外，还包括脱细胞真皮基质、胶原凝胶、聚乳酸(PLA)等。)，放置在具有通透性膜的小支架上，在其上接种成纤维细胞。1-3周后再在表面接种表皮干细胞，形成复合皮肤，气-液界面共同培养。(2)另一方案与上基本相似，仅将接种表皮干细胞变为接种由表皮干细胞形成的膜片，形成复合皮肤，气-液界面共同培养。
用上述方法可形成有活性的组织工程复合皮肤，该复合皮肤表皮是复层的，由表皮干细胞不断生长增殖、分化形成。真皮层由支架材料和成纤维细胞及其分泌的基质组成。本发明所制备的组织工程复合皮肤具有表皮及真皮双层结构，可以直接覆盖创面，修复皮肤缺损。
图1为表皮干细胞经培养形成的膜片的照片。
图2为组织学显示表皮膜片的截面图。
图3为组织工程复合皮肤修复全层皮肤缺损2周后，HE染色(苏木精-伊红染色)的结果图。
具体实施例方式
本发明组织工程复合皮肤的制备方法包括如下步骤一、表皮干细胞的分离1、取材取手术切除的小儿包皮，或任何体表皮肤。
2、分离表皮用剪刀仔细剪去皮下脂肪组织及部分真皮，并修剪成0.5×1cm2大小，用无钙镁PBS(磷酸盐缓冲液)漂洗两次，表皮面朝上浸于0.25％中性蛋白酶中，4℃过夜。
3、收集角质形成细胞过夜消化后，用镊子将表皮与真皮撕开。表皮用0.05％胰蛋白酶-0.53mM EDTA(乙二胺四乙酸)在37℃消化5-30分钟，含10％胎牛血清培养基终止消化。用150目不锈钢滤网过滤，1000转/分(r/min)离心5分钟，弃去上清液，加入培养液10ml，混匀，台盼蓝染色计数。
4、表皮干细胞分离方法一将计数后的角质形成细胞悬液加入IV型胶原(或其它细胞外基质如层粘连蛋白(laminin)和纤维粘连蛋白(fibronectin)等)包被的培养皿中，静置20分钟后，吸弃未粘附的悬浮细胞，用刮勺刮下已粘附的细胞，以100-1000/皿密度接种于培养皿中，10天后挑选形成大克隆的细胞，即表皮干细胞。
方法二将计数后的角质形成细胞悬液，经整合素β1荧光抗体标记处理后，用FACS(或MACS)分选出其中高表达整合素β1的一组细胞，即表皮干细胞，在以人成纤维细胞制备的饲养层上体外培养。二、表皮干细胞的培养1、饲养层的制备根据生长融合情况，人真皮成纤维细胞(或小鼠3T3细胞)用5-10μg/ml丝裂霉素1-5小时处理(或钴60照射处理)，再用无钙镁PBS冲洗三次，备用。
2、培养基DMEM与Ham’s F12培养液按3∶1配置，含10％胎牛血清。添加表皮细胞生长因子，胰岛素，腺嘌呤，氢化考的松，霍乱毒素等。
3、原代培养计数后的表皮干细胞悬液，以0.5-1×106/75cm2密度接种在预置饲养层的培养皿中，加入上述培养基，在37℃，5％CO2，100％相对湿度的培养箱中培养，2-3天换液一次。
4、传代培养当细胞生长到60％-75％融合时，吸弃培养基，无钙镁PBS冲洗一次，0.02％EDTA预处理1-3分钟，再用0.05％胰蛋白酶-0.53mM EDTA 37℃消化2-3分钟，加入含10％胎牛血清的培养液中止消化，刮下细胞至离心管中，1000r/min离心5分钟。弃去上清液，加入培养液10ml，混匀，计数，按1∶3的比例传代培养。2-3日换液一次，直到60％-75％融合时，再次传代。
三、真皮成纤维细胞的分离与培养1、收集成纤维细胞将撕去表皮后的真皮剪成碎块，用0.1％的I型胶原酶在37℃消化2-4小时，经150目不锈钢滤网过滤，以1000r/min离心5分钟，弃去上清液，加入无钙镁PBS清洗3次。加入含10％胎牛血清的DMEM培养液10ml，混匀，台盼蓝染色计数。
2、原代培养单细胞悬液按0.5×106/75cm2密度接种培养皿，用含10％胎牛血清的DMEM培养液，在37℃，5％CO2，100％相对湿度的培养箱中培养，2-3天换液一次。
3、传代培养当细胞生长60％-75％融合时，吸弃培养液，用10ml无钙镁PBS冲洗一次，经0.25％胰蛋白酶消化2-3分钟，加入含10％胎牛血清的DMEM培养液终止消化，刮下细胞至离心管中，1000r/min离心5分钟。弃去上清液，加入含10％胎牛血清的DMEM培养液10ml，混匀，计数，按1∶3-5的比例传代培养。2-3日换液一次，直到细胞至60％-75％融合时，再次传代。
四、构建组织工程复合皮肤1、成纤维细胞—生物材料复合物适当大小的PGA置于具有通透性膜的小支架上，将用上述方法分离培养的真皮成纤维细胞以10-20×106/ml的浓度接种在上面。加入含10％胎牛血清的DMEM培养液，2-3天换液一次，体外培养1-3周。
2、复合皮肤的构建方案一收集上述两种方法分离培养的表皮干细胞，以0.2-5×106/cm2的密度将其接种在成纤维细胞—生物材料复合物表面，3-4天后，再采用如图3所示的气—液界面培养10-14天。
方案二上述两种方法分离培养的表皮干细胞，完全融合后再继续培养3-7天，用中性蛋白酶消化，形成表皮膜片。如图1所示为表皮干细胞经培养形成的膜片，图2显示表皮膜片是复层的，基底层为表皮干细胞，表达相应的干细胞标记物。上面数层(具体层数与体外培养时间长短相关)为已分化的角质形成细胞，表达相应的分化标记物。将膜片覆盖在成纤维细胞-生物材料复合物表面，3-4天后，再采用气-液界面培养1-2周。
图3显示组织工程复合皮肤修复裸鼠全层皮肤缺损后2周，HE染色后的图片。显示具有和正常人体皮肤相似的组织结构特征，但不具备毛囊、皮脂腺、汗腺等皮肤附属器，也不含有黑素细胞、朗格汉斯细胞、梅克尔细胞等。
本发明与其它有关专利如中国专利申请第91109937.9号、第01107099.4号及第02139398.2号，最大的差异在于表皮所采用的种子细胞是高浓度的表皮干细胞。表皮干细胞属慢周期细胞，具有无限的增殖潜能，它维持皮肤的终生自我更新。以此为表皮的种子细胞构建的组织工程皮肤复合物，可达到永久覆盖创面的目的。
权利要求
1.一种具有活细胞的组织工程复合皮肤，包括表皮层和真皮层，其特征在于以表皮干细胞为表皮层的种子细胞。
2.如权利要求1所述的组织工程复合皮肤，其特征在于表皮层是复层的，由表皮干细胞不断生长增殖、分化形成，包括由表皮干细胞形成的基底层和位于基底层上面的由已分化的角质形成细胞构成的数层组织；真皮层由聚羟基乙酸等支架材料和成纤维细胞及其分泌的基质组成。
3.如权利要求2所述的组织工程复合皮肤，其特征在于表皮干细胞或由其形成的膜片接种在成纤维细胞一聚羟基乙酸的表面。
4.如权利要求2所述的组织工程复合皮肤，其特征在于所采用的生物支架材料，除聚羟基乙酸外，还包括脱细胞真皮基质、胶原基质凝胶、聚乳酸(PLA)等。
5.一种组织工程复合皮肤的制备方法，其包括如下步骤一、分离并培养表皮干细胞；二、分离并培养真皮成纤维；三、构建组织工程复合皮肤将可降解吸收的PGA膜片，放置在具有通透性膜的小支架上，在其上接种成纤维细胞，再在表面接种表皮干细胞或由表皮干细胞形成的膜片，形成复合皮肤，气—液界面共同培养。
6.如权利要求书5所述的制备方法，其特征在于构建组织工程复合皮肤的具体步骤为1)适当大小的PGA置于具有通透性膜的小支架上，将分离培养的真皮成纤维细胞以10-20×106/ml的浓度接种其上；加入含10％胎牛血清的DMEM培养液，2-3天换液一次，体外培养1-3周，制得成纤维细胞—生物材料复合物；2)收集分离培养的表皮干细胞，以0.2-5×106/cm2的密度将其接种在成纤维细胞—生物材料复合物表面，3-4天后，再采用气—液界面培养10-14天。
7.如权利要求书5所述的制备方法，其特征在于构建组织工程复合皮肤的具体步骤为1适当大小的PGA置于具有通透性膜的小支架上，将分离培养的真皮成纤维细胞以10-20×106/ml的浓度接种其上，加入含10％胎牛血清的DMEM培养液，2-3天换液一次，体外培养1-3周，形成成纤维细胞—生物材料复合物；2)分离培养的表皮干细胞完全融合后再继续培养3-7天，用中性蛋白酶消化，形成表皮膜片；将膜片覆盖在成纤维细胞—生物材料复合物表面，3-4天后，再采用气—液界面培养1-2周。
8.如权利要求书5所述的制备方法，其特征在于表皮干细胞是通过对IV型胶原(或其它细胞外基质，如层粘连蛋白(laminin)和纤维粘连蛋白(fibronectin)等)的差速粘附试验和筛选具有克隆形成能力的细胞分离出来的。
9.如权利要求书8所述的制备方法，其特征在于表皮干细胞分离的具体步骤为1)取手术切除的小儿包皮，或其他体表皮肤；2)分离表皮用剪刀仔细剪去皮下脂肪组织及部分真皮，并修剪成0.5×1cm2大小，用无钙镁PBS漂洗两次，表皮面朝上浸于0.25％中性蛋白酶中4℃过夜；3)收集角质形成细胞过夜消化后，用镊子将表皮与真皮撕开，表皮用0.05％胰蛋白酶-0.53mM EDTA在37℃消化5-30分钟，含10％胎牛血清培养基终止消化，用150目不锈钢滤网过滤，1000转/分(r/min)离心5分钟，弃去上清液，加入培养液10ml，混匀，台盼蓝染色计数；4)表皮千细胞分离将计数后的角质形成细胞悬液加入IV型胶原(或其它细胞外基质，如层粘连蛋白(laminin)和纤维粘连蛋白(fibronectin)等)，包被的培养皿中，静置20分钟后，吸弃未粘附的悬浮细胞，用刮勺刮下已粘附的细胞，以100-1000/皿密度接种于培养皿中，10天后挑选形成大克隆的细胞，就得到了表皮干细胞。
10.如权利要求书5所述的制备方法，其表皮干细胞的另一种分离方法为采用荧光标记的相应膜抗体标记角质形成细胞，再通过FACS(或MACS)分选。
11.如权利要求书10所述的制备方法，其特征在于表皮干细胞分离的具体步骤为1)取手术切除的小儿包皮，或其他体表皮肤；2)分离表皮用剪刀仔细剪去皮下脂肪组织及部分真皮，并修剪成0.5×1cm2大小，用无钙镁PBS漂洗两次，表皮面朝上浸于0.25％中性蛋白酶中4℃过夜；3)收集角质形成细胞过夜消化后，用镊子将表皮与真皮撕开，表皮用0.05％胰蛋白酶-0.53mM EDTA在37℃消化5-30分钟，含10％胎牛血清培养基终止消化，用150目不锈钢滤网过滤，1000转/分(r/min)离心5分钟，弃去上清液，加入培养液10ml，混匀，台盼蓝染色计数；4)表皮干细胞分离将计数后的角质形成细胞悬液，经整合素β1荧光抗体标记处理后，用FACS(或MACS)分选出其中高表达整合素β1的一组细胞，即表皮干细胞，在以人成纤维细胞(或小鼠3T3细胞)制备的饲养层上体外培养。
12.如如权利要求书8至11任意之一所述的制备方法，其特征在于表皮干细胞培养的具体步骤为1)饲养层的制备根据生长融合情况，人真皮成纤维细胞(小鼠3T3细胞)用5-10μg/ml丝裂霉素1-5小时处理(钴60照射处理)，再用无钙镁PBS冲洗三次，备用；2)制备培养基DMEM与Ham’sF12培养液按3∶1配置，含10％胎牛血清，添加表皮细胞生长因子，胰岛素，腺嘌呤，氢化考的松，霍乱毒素等；3)原代培养计数后的表皮干细胞悬液，以0.5-1×106/75cm2密度接种在预置饲养层的培养皿中，加入上述培养基，在37℃，5％CO2，100％相对湿度的培养箱中培养，2-3天换液一次；4)传代培养当细胞生长到60％-75％融合时，吸弃培养基，无钙镁PBS冲洗一次，0.02％EDTA预处理1-3分钟，再用0.05％胰蛋白酶-0.53mM EDTA 37℃消化2-3分钟，加入含10％胎牛血清的培养液中止消化，刮下细胞至离心管中，1000r/min离心5分钟，弃去上清液，加入培养液10ml，混匀，计数，按1∶3的比例传代培养，2-3日换液一次，直到60％-75％融合时，再次传代。
13.权利要求书5所述的制备方法，其特征在于真皮成纤维细胞的分离与培养的具体步骤为1)收集成纤维细胞将撕去表皮后的真皮剪成碎块，用0.1％的I型胶原酶在37℃消化2-4小时，经150目不锈钢滤网过滤，以1000r/min离心5分钟，弃去上清液，加入无钙镁PBS清洗3次，加入含10％胎牛血清的DMEM培养液10ml，混匀，台盼蓝染色计数；2)原代培养单细胞悬液按0.5×106/75cm2密度接种培养皿，用含10％胎牛血清的DMEM培养液，在37℃，5％CO2，100％相对湿度的培养箱中培养，2-3天换液一次；3)传代培养当细胞生长60％-75％融合时，吸弃培养液，用10ml无钙镁PBS冲洗一次，经0.25％胰蛋白酶消化2-3分钟，加入含10％胎牛血清的DMEM培养液终止消化，刮下细胞至离心管中，1000r/min离心5分钟；弃去上清液，加入含10％胎牛血清的DMEM培养液10ml，混匀，计数，按1∶3-5的比例传代培养；2-3日换液一次，直到细胞至60％-75％融合时，再次传代。
全文摘要
本发明涉及一种组织工程复合皮肤，包括表皮层和真皮层，表皮层是复层的，由表皮干细胞不断生长增殖、分化形成，包括由表皮干细胞形成的基底层和位于基底层上面的由已分化的角质形成细胞构成的数层组织；真皮层由聚羟基乙酸等支架材料(所采用的生物支架材料，除聚羟基乙酸外，还包括脱细胞真皮基质、胶原凝胶、聚乳酸(PLA)等)和成纤维细胞及其分泌的基质组成。该复合皮肤可以直接覆盖创面，修复皮肤缺损。本发明还涉及上述复合皮肤的制备方法。
文档编号A61F2/10GK1528253SQ20031010800
公开日2004年9月15日 申请日期2003年10月17日 优先权日2003年10月17日
发明者曹谊林, 张 杰, 崔磊, 刘伟 申请人:上海第二医科大学附属第九人民医院