不饱和脂肪酸修饰的胰岛素及其制备方法

专利名称：不饱和脂肪酸修饰的胰岛素及其制备方法
技术领域：
本发明涉及采用不饱和脂肪酸或其衍生物对胰岛素进行化学修饰，制备得到可以用于治疗糖尿病的口服药物胰岛素类似物及其制备方法。
背景技术：
糖尿病是一种常见的多发性代谢疾病，国内外发病率均呈上升趋势。据不完全统计，全国现有糖尿病患者3000万人以上，糖尿病的发病率已高达3.2％。糖尿病是引起人类死亡占第三位的主要原因。胰岛素是治疗糖尿病的特效性多肽激素化合物，迄今为止尚无更有效的替代药物。但是，由于胰岛素是一种蛋白质，易被胃肠道蛋白水解酶降解而失活，因此只能注射，不能口服。胰岛素依赖型糖尿病人必须每日使用胰岛素以降低血糖，维持生命的正常代谢。频繁注射用药，给需终身用药的病人带来极大的痛苦和不便。因此研究开发安全、方便而有效的胰岛素非注射给药途径已经成为世界各国医药界广泛关注的重要课题。
口服胰岛素一直是医生和糖尿病患者梦寐以求的药物，但迄今尚未取得突破性进展。为了解决给药途径，延缓胰岛素在体内的降解或排泄，近年来国内外对胰岛素新剂型开展了广泛研究，有经口服、鼻腔、舌下、眼部、直肠、透皮吸收等多种途径给药，其中口服给药是最受病人欢迎的途径，成为目前倍受亲睐的研究热点，但国际上至今尚无较好的口服制剂。
化学修饰是口服胰岛素的重要研究课题之一。现有技术通过对胰岛素进行化学修饰，增强胰岛素抵抗蛋白水解酶的破坏作用，进而研制出适于口服的胰岛素。Kuraray Co.，Ltd.的专利EP 0 511600 A2合成了[protein][Z]n的衍生物，其中[protein]为多肽蛋白质包括胰岛素，[Z]为-CO-W-COOH，式中W为长链的可含杂原子的碳水基团。N.Ekwuribe等人(专利PCT Int.Appl.WO 0078302)将一种低聚物共价连接到重组人胰岛素上得到胰岛素类似物M2，其口服降糖作用起效快，降糖效果与皮下注射相当，剂量为皮下注射的2倍，美国Protein Delivery公司正进行临床试验。Novo Nordisk A/S申请的专利WO 95/07931以及EliLilly公司的两个专利EP 0 712861 A2及EP 0 712862 A2也分别介绍了化学修饰胰岛素的合成方法。但有关给药安全性及患者进餐前后对用药的影响等仍在研究之中，迄今尚无临床试验成功的报道。本研究组曾申请了发明专利“治疗糖尿病的口服药脂肪二酰氨基酸胰岛素及其合成方法”(专利申请号011284998.6)，此项发明采用的修饰剂为脂肪族二元羧酸的单氨基酸衍生物，得到的修饰胰岛素可提高其抗酶解能力，但该修饰剂的活化中间体合成产率较低。本发明采用的修饰剂不饱和脂肪酸的活化中间体相对合成产率较高，而且不饱和脂肪酸是细胞膜磷脂的重要成分，是人体必需脂肪酸，无毒、无害、无刺激性，用其修饰胰岛素具有良好的生物安全性，能够提高胰岛素的抗酶解能力，增强药物的透膜吸收。本发明修饰胰岛素所采用的基团与上述提及的专利所采用的都不同。本发明的化学修饰胰岛素目前尚未见报道。

发明内容
本发明旨在采用化学修饰的方法在胰岛素的合适部位共价结合一种不饱和脂肪酸或其衍生物，保护胰岛素易被胰蛋白酶进攻的位点，使胰岛素能够抵抗胰蛋白酶的降解作用。
具体是将单不饱和脂肪酸(Monounsaturated fatty acid，MUFA)及不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid，PUFA)或其衍生物共价结合到胰岛素(Insulin，Ins)的特定部位，得到MUFA-Ins或PUFA-Ins。所选修饰剂PUFA，存在于动物体内，是微生物和原生动物生长发育所必需的物质。已有的研究主要采用直链饱和脂肪酸(Saturaed fatty acid，SFA)共价修饰胰岛素。美国关于食物中脂肪酸与胰岛素抵抗的研究显示，正常人空腹胰岛素水平与脂肪、SFA摄入呈正相关，而与MUFA、PUFA摄入呈负相关；SFA摄入过多与高胰岛素血症、胰岛素抵抗有关。SFA使细胞膜坚韧，而PUFA有利于膜的流动性。PUFA主要包括ω-3、ω-6、ω-9系列，其中ω-3和ω-6PUFA具有较重要的生物学意义，如亚油酸(LA)和亚麻酸(LNA)是人体必需脂肪酸，分别是ω-6和ω-3高不饱和脂肪酸(HUFA)的前体；HUFA中花生四烯酸(AA)参与多种生理代谢功能，二十二碳六烯酸(DHA)是脑和视网膜的重要脂质成分。PUFA是细胞膜磷脂的重要成分，其成分的改变可影响膜的流动性和某些酶的活性以及激素与受体的结合和信号的传递。细胞膜的生物起源和完整性需要PUFA。PUFA可促进细胞膜的流动性和组装；对基因表达具有调节作用；可有效防治心血管疾病；可促进生长发育等。为此，本发明采用PUFA为修饰剂对胰岛素进行化学修饰。利用这些具有重要生理功能的PUFA作为化学修饰基团不仅可以保护胰岛素免受胰蛋白酶等的破坏，提高胰岛素的稳定性，增加胰岛素的脂溶性，促进胰岛素的透膜吸收，而且还可促进体内PUFA的平衡，从而维护人体的正常生理机能。
该物质的化学通式为CnH2(n-m)+1CO-Ins或CnH2(n-m)+1CONHCHRCO-Ins式中CnH2(n-m)+1CO-为直链不饱和脂肪酸酰基(n＝17、19、21，m＝1～6)，对应的不饱和脂肪酸可以是C17H33COOH(油酸)，C17H31COOH(亚油酸，LA)，C17H29COOH(亚麻酸，LNA)，C19H31COOH(花生四烯酸，AA)，C19H29COOH(二十碳五烯酸，EPA)，C21H33COOH(二十二碳五烯酸，DPA)，C21H31COOH(二十二碳六烯酸，DHA)等；R为赖氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸的侧链。CnH2(n-m)+1CO-Ins的合成反应式如下

具体合成的步骤是①将一定量的不饱和脂肪酸(UFA)水浴加热至50～60℃，然后向其中滴加三氯化磷(PCl3)，PCl3的摩尔数为UFA的1/2至2/3。滴加完毕，继续在50～60℃下搅拌反应4～5小时。停止反应后，分去下层亚磷酸。上层液体减压蒸出过量三氯化磷，剩余液体即不饱和脂肪酰氯；②将苯并三唑溶于乙醚中，加入与苯并三唑等摩尔的三乙胺(TEA)，然后在0～10℃下向其中滴加不饱和脂肪酰氯，不饱和脂肪酰氯的摩尔数为苯并三唑的1.02～1.05倍。滴加完毕后，在15～20℃下搅拌反应2～3小时；停止反应后，减压过滤，滤除白色沉淀物，得澄清滤液。将滤液减压浓缩至干，加入丙酮溶解，冷却结晶。过滤，得白色针状结晶，真空干燥至恒重，即得不饱和脂肪酰苯并三唑(I)，产率约10～30％；③胰岛素的酰化反应在水和N-甲基-吡咯烷酮的混合溶剂中进行。在0℃下将一定量的胰岛素溶解在N-甲基-吡咯烷酮和二次水的混合溶剂中，水的体积百分含量为25％～75％，再加入摩尔数约为胰岛素用量30～50倍的TEA。
④将摩尔数为胰岛素用量的2～3倍的不饱和脂肪酰苯并三唑(I)溶解于N-甲基-吡咯烷酮中，将不饱和脂肪酰苯并三唑(I)的N-甲基-吡咯烷酮溶液加入到步骤③制备的胰岛素溶液中，在0℃下搅拌反应2～3小时；⑤向反应混合物中加入丙酮至有沉淀生成，冷冻离心，去掉上清，沉淀经冷冻干燥至恒重，得到不饱和脂肪酸酰基化胰岛素(II)(CnH2(n-m)+1CO-Ins)，其产率(按胰岛素的加入量计)大于95％。CnH2(n-m)+1CONHCHRCO-Ins的合成反应式如下

具体合成的步骤是①将氨基酸溶于等摩尔的氢氧化钠溶液，再加入上述溶液3～5倍体积的四氢呋喃(THF)，在0～10℃下，缓慢滴加与氨基酸等摩尔的不饱和脂肪酰氯，同时缓慢滴加0.1mol/L的氢氧化钠或碳酸钠溶液，使反应体系pH值控制在8.5～10；滴加完毕，在0～10℃搅拌反应2小时后，升温至20～30℃，继续搅拌反应2～3小时。停止反应后，用盐酸酸化至pH2～3，加入与混合液等体积的石油醚，去水层，待有机层冷却结晶，过滤得不饱和脂肪酰氨基酸(III)，产率40～60％；②将不饱和脂肪酰氨基酸(III)溶于THF中，加入与式(III)化合物等摩尔的苯并三唑，搅拌溶解。冰浴下，缓慢滴加等摩尔的二环己基碳二亚胺(DCC)的THF溶液，滴完后，0℃下继续搅拌反应2小时，升温至20℃，继续搅拌2～3小时；减压过滤，滤除白色不溶物，将滤液减压浓缩后，冷却结晶；过滤，得白色粉状物，真空干燥至恒重，即得不饱和脂肪酰氨基酸酰基苯并三唑(IV)，按式(III)化合物的用量计，产率约30～60％；③在0℃下将一定量的胰岛素溶解在N-甲基-吡咯烷酮和二次水的混合溶剂中，水的体积百分含量为25％～75％，再加入摩尔数约为胰岛素用量30～50倍的三乙胺(TEA)；④将摩尔数为胰岛素用量2～3倍的式(IV)化合物溶解于N-甲基-吡咯烷酮中，将式(IV)化合物的N-甲基-吡咯烷酮溶液加入到上述胰岛素溶液中，在0℃下搅拌反应2～3小时；⑤加丙酮入反应混合物中至有沉淀生成，冷冻离心，去掉上清，沉淀经冷冻干燥，得到不饱和脂肪酰氨基酸酰化胰岛素(V)(CnH2(n-m)+1CONHCHRCO-Ins)，产率80～95％。
所得修饰胰岛素用反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析。色谱系统为Agilent 1100，色谱柱为Phenomenex公司的Jupiter C18反相柱(250×4.6mm，5μm，30nm)；流动相A为磷酸盐缓冲液(pH3.0)，流动相B为乙腈，梯度洗脱，流速1ml/min，进样量20μl，柱温30℃，检测波长214nm。流动相梯度如下0min 74％A-26％B
4min 70％A-30％B8min 70％A-30％B14min 64％A-36％B25min 64％A-36％B相同的色谱条件下，未修饰的猪胰岛素的保留时间(tR)为9.5min，而修饰胰岛素的tR均大于9.5min。
动物试验采用正常小鼠考察所得修饰胰岛素的降血糖活性，并与天然胰岛素对照；同时用胰蛋白酶对修饰胰岛素进行体外降解试验。
取24只体重约30g昆明小鼠，禁食12小时，随机分成四组。将修饰胰岛素和胰岛素分别用磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)配成0.18IU/ml的注射液，小鼠腹膜皮下注射0.1ml/只(0.6IU/kg体重)。空白组注射等量的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)。尾静脉采血，测定不同时间的血糖值。结果证明，与胰岛素相比，修饰胰岛素不仅保持降糖活性，而且在体内持续作用时间延长，如图1所示。
将上述修饰胰岛素用磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)配成36IU/ml，加入一定量的胰蛋白酶(胰岛素∶胰蛋白酶＝25∶1)，在37℃下保温2h、4h、6h、8h、10h、12h，取体重约30g禁食12小时的昆明小鼠(每组不少于6只)，皮下注射0.1ml/只(0.6IU/kg体重)，尾静脉采血，测定注射后40min的血糖值。体外抗酶解实验结果表明，所得修饰胰岛素抵抗胰蛋白酶降解作用的能力提高，即使酶解12h仍然有一定的降糖作用；而未修饰的胰岛素酶解4～6h生物活性丧失。如图2所示。


图1胰岛素(Ins)和修饰胰岛素(C17H33CO-Ins与C17H31CO-Ins)的降血糖作用纵坐标为实测血糖平均值(P＜0.05)，单位为mmol/L；横坐标为时间，单位为分钟(min)○标记的曲线为空白组，●标记的曲线为胰岛素组，▲标记的曲线为油酸修饰胰岛素(C17H33CO-Ins)，■标记的曲线为亚油酸修饰胰岛素(C17H31CO-Ins)。
图2酶解时间对胰岛素(Ins)和修饰胰岛素(C17H33CO-Ins与C17H31CO-Ins)降糖能力的影响 纵坐标为相对降糖率(％)，横坐标为酶解时间，单位为小时(h)，●标记的曲线为胰岛素组，▲标记的曲线为油酸修饰胰岛素(C17H33CO-Ins)，■标记的曲线为亚油酸修饰胰岛素(C17H31CO-Ins)相对降糖率指已酶解的胰岛素(或修饰胰岛素)注射后40min引起的血糖降低值除以未酶解的胰岛素(或修饰胰岛素)注射后40min引起的血糖降低值。
具体实施例方式
例1油酸修饰胰岛素(C17H33CO-Ins)的制备称取56.4g油酸(0.2mol)，水浴加热至50℃，滴加13.7g(0.1mol)三氯化磷，30min滴完，然后在60℃搅拌反应5h。停止反应后，分去下层亚磷酸。上层液体减压蒸出过量三氯化磷，得浅棕色刺激性气味液体即油酰氯，收率98.8％。
称取0.595g苯并三唑(5mmol)溶于10ml无水乙醚，加入0.5g三乙胺(5mmol)。在10℃下缓慢滴加油酰氯1.55g(5.1mmol)，30min内滴完。然后，继续在15℃下搅拌反应3h。反应混合物过滤除去白色沉淀物。将澄清的滤液减压蒸发至干。残留物中加入5ml丙酮，冷却至0℃，析出白色针状结晶。过滤得白色针状晶体0.6g，真空干燥至恒重，即油酰苯并三唑，产率31.5％。
在0℃下，将100mg猪胰岛素溶于1.4mlN-甲基吡咯烷酮及0.7ml二次水的混合溶剂中，搅拌下加入0.08mlTEA。然后，一次性加入0.3ml0.1M油酰苯并三唑的N-甲基吡咯烷酮溶液。0℃下搅拌反应150min。停止反应，向反应混合物中加入22.5ml冰冷的丙酮，冷冻离心(-10℃，10000rpm)，去掉上清，沉淀物冷冻干燥，得白色粉状物，即油酸酰化胰岛素C17H33CO-Ins。RP-HPLC测得C17H33CO-Ins的保留时间为13.5min。
例2亚油酸酰化胰岛素(C17H31CO-Ins)的制备称取7g亚油酸(0.025mol)，水浴加热至50℃，加入1.8g(0.013mol)三氯化磷，然后在55℃，搅拌反应4.5h。停止反应后，分去下层亚磷酸，得浅棕色刺激性气味液体，即亚油酰氯。
称取0.595g苯并三唑(5mmol)溶于10ml无水乙醚，加入0.5g三乙胺(5mmol)。在10℃下缓慢滴加亚油酰氯1.55g(5.1mmol)，30min内滴完。然后，继续在15℃下搅拌反应3h。反应混合物过滤除去白色沉淀物。将澄清的滤液减压蒸发至干。残留物中加入5ml丙酮，冷却至0℃，析出白色针状结晶。过滤得白色针状晶体，真空干燥至恒重，即亚油酰苯并三唑。
在0℃下，将100mg猪胰岛素溶于1.4mlN-甲基吡咯烷酮及0.7ml二次水的混合溶剂中，搅拌下加入0.08mlTEA。然后，一次性加入0.3ml0.1M亚油酰苯并三唑的N-甲基吡咯烷酮溶液。0℃下搅拌反应150min。停止反应，向反应混合物中加入22.5ml冰冷的丙酮，冷冻离心(-10℃，10000rpm)，去掉上清，沉淀物冷冻干燥，得白色粉状物，即亚油酸酰化胰岛素C17H31CO-Ins。RP-HPLC测得C17H31CO-Ins的保留时间为15.3min。
例3亚油酸酰化胰岛素(C17H31CO-Ins)的制备称取7g亚油酸(0.025mol)，水浴加热至50℃，加入1.8g(0.013mol)三氯化磷，然后在60℃，搅拌反应5h。停止反应后，分去下层亚磷酸，得浅棕色刺激性气味液体，即亚油酰氯。
称取0.595g苯并三唑(5mmol)溶于10ml无水乙醚，加入0.5g三乙胺(5mmol)。在10℃下缓慢滴加亚油酰氯1.58g(5.2mmol)，30min内滴完。然后，在15℃下继续搅拌反应2h。反应混合物过滤除去白色沉淀物。将澄清的滤液减压蒸发至干。残留物中加入7ml丙酮，冷却至0℃，析出白色针状结晶。过滤得白色针状晶体，真空干燥至恒重，即亚油酰苯并三唑，产率约28％。
在0℃下，将100mg猪胰岛素溶于1.4mlN-甲基吡咯烷酮及0.5ml二次水的混合溶剂中，搅拌下加入0.1mlTEA。然后，一次性加入0.3ml0.1M亚油酰苯并三唑的N-甲基吡咯烷酮溶液。0℃下搅拌反应180min。停止反应，向反应混合物中加入22.5ml冰冷的丙酮，冷冻离心(-10℃，10000rpm)，去掉上清，沉淀物冷冻干燥，得白色粉状物，即亚油酸酰化胰岛素C17H31CO-Ins，收率96％。RP-HPLC测得C17H31CO-Ins的保留时间为15.3min。
例4亚油酸酰化胰岛素(C17H31CO-Ins)的制备称取0.595g苯并三唑(0.005mol)溶于10ml无水乙醚，加入1.4g亚油酸。冰浴下，边搅拌边缓慢滴加1.04g(0.005mol)DCC的无水乙醚溶液。滴加完毕后，冰浴下继续搅拌反应3h。然后，升温至20℃，继续搅拌2h。停止反应后，减压过滤，滤除白色不溶物。将滤液减压浓缩后，置冰箱冷冻，析出白色针状结晶。过滤，得白色针状晶体，真空干燥至恒重，即得亚油酰苯并三唑，产率约30％。
在0℃下，将100mg猪胰岛素溶于1.4mlN-甲基吡咯烷酮及0.7ml二次水的混合溶剂中，搅拌下加入0.08mlTEA。然后，一次性加入0.3ml0.1M亚油酰苯并三唑的N-甲基吡咯烷酮溶液。0℃下搅拌反应120min。停止反应，向反应混合物中加入22.5ml冰冷的丙酮，冷冻离心(-10℃，10000rpm)，去掉上清，沉淀物冷冻干燥，得白色粉状物，即亚油酸酰化胰岛素C17H31CO-Ins，收率95％。RP-HPLC测得C17H31CO-Ins的保留时间为15.3min。
例5亚油酸酰化胰岛素(C17H31CO-Ins)的制备按上例方法合成亚油酰苯并三唑。在0℃下，将100mg猪胰岛素溶于1.5mlN-甲基吡咯烷酮及0.5ml二次水的混合溶剂中，搅拌下加入0.1mlTEA。然后，一次性加入0.3ml0.1M亚油酰苯并三唑的N-甲基吡咯烷酮溶液。0℃下搅拌反应150min。停止反应，向反应混合物中加入22.5ml冰冷的丙酮，冷冻离心(-10℃，10000rpm)，去掉上清，沉淀物冷冻干燥，得白色粉状物，即亚油酸酰化胰岛素C17H31CO-Ins，收率95％。RP-HPLC测得C17H31CO-Ins的保留时间为15.3min。
例6花生四烯酸酰化胰岛素(C19H31CO-Ins)的制备称取0.595g苯并三唑(5mmol)溶于10ml无水乙醚，加入1.52g花生四烯酸。冰浴下，边搅拌边缓慢滴加1.04g(0.005mol)DCC的无水乙醚溶液。滴加完毕后，冰浴下继续搅拌反应2h。然后，升温至20℃，继续搅拌2h。停止反应后，减压过滤，滤除白色不溶物。将滤液减压浓缩后，置冰箱冷冻，析出白色针状结晶。过滤，得白色针状晶体，真空干燥至恒重，即得花生四烯酰苯并三唑。
在0℃下，将100mg猪胰岛素溶于1.4mlN-甲基吡咯烷酮及0.7ml二次水的混合溶剂中，搅拌下加入0.08mlTEA。然后，一次性加入0.3ml0.1M花生四烯酰苯并三唑的N-甲基吡咯烷酮溶液。0℃下搅拌反应180min。停止反应，向反应混合物中加入22.5ml冰冷的丙酮，冷冻离心(-10℃，10000rpm)，去掉上清，沉淀物冷冻干燥，得白色粉状物，即花生四烯酸酰化胰岛素C19H31CO-Ins。RP-HPLC测得C19H31CO-Ins的保留时间为16.8min。
例7亚油酰甘氨酸酰化胰岛素(C17H31CONHCH2CO-Ins)的制备将1.5g(0.02mol)甘氨酸和0.8g(0.02mol)氢氧化钠溶于15ml水，加入4倍体积的THF。在冰浴下，缓慢滴加亚油酰氯，同时缓慢滴加氢氧化钠溶液，使反应体系pH保持在8.5～9.5，加毕，搅拌反应2h后，调温至20℃，继续搅拌反应2h。停止反应，用盐酸酸化至pH2～3，加入30ml石油醚，分出水层。有机层冷却结晶，过滤得亚油酰甘氨酸，产率约50％。
将1.68g(0.005mol)亚油酰甘氨酸溶于20mlTHF中，加入0.595g(0.005mol)苯并三唑，搅拌溶解。冰浴下，缓慢滴加1.04g(0.005mol)DCC的THF溶液。滴加完毕后，冰浴下继续搅拌反应2h。然后，升温至20℃，继续搅拌3h。停止反应后，减压过滤，滤除白色不溶物。将滤液减压浓缩后，冷却结晶。过滤，得白色粉状物，真空干燥至恒重，即得亚油酰甘氨酸苯并三唑，产率约30％。
在0℃下，将100mg猪胰岛素溶于1.4mlN-甲基吡咯烷酮及0.7ml二次水的混合溶剂中，搅拌下加入0.08mlTEA。然后，一次性加入0.3ml0.1M亚油酰甘氨酸苯并三唑的N-甲基吡咯烷酮溶液。0℃下搅拌反应180min。停止反应，向反应混合物中加入30ml冰冷的丙酮，冷冻离心(-10℃，10000rpm)，去掉上清，沉淀物冷冻干燥，得白色粉状物，即亚油酰甘氨酸酰化胰岛素C17H31CONHCH2CO-Ins。RP-HPLC测得其保留时间为15.8min。
例8亚麻酰丙氨酸酰化胰岛素(C17H29CONHCH(CH3)CO-Ins)制备将1.78g(0.02mol)丙氨酸和0.8g(0.02mol)氢氧化钠溶于15ml水，加入4倍体积的THF。在冰浴下，缓慢滴加γ-亚麻酰氯，同时缓慢滴加氢氧化钠溶液，使反应体系pH保持在8.5～9.5，加毕，搅拌反应2h后，调温至20℃，继续搅拌反应2h。停止反应，用盐酸酸化至pH2～3，加入30ml石油醚，分出水层。有机层冷却结晶，过滤得亚麻酰丙氨酸。
将0.87g(0.0025mol)亚麻酰丙氨酸溶于10mlTHF中，加入0.298g(0.0025mol)苯并三唑，搅拌溶解。冰浴下，缓慢滴加0.52g(0.0025mol)DCC的THF溶液。滴加完毕后，0℃下继续搅拌反应2h。然后，升温至20℃，继续搅拌3h。停止反应后，减压过滤，滤除白色不溶物。将滤液减压浓缩后，冷却结晶。过滤，得白色粉状物，真空干燥至恒重，即得亚麻酰丙氨酸苯并三唑。
在0℃下，将100mg猪胰岛素溶于1.4mlN-甲基吡咯烷酮及0.7ml二次水的混合溶剂中，搅拌下加入0.08mlTEA。然后，一次性加入0.3ml0.1M亚麻酰丙氨酸苯并三唑的N-甲基吡咯烷酮溶液。0℃下搅拌反应180min。停止反应，向反应混合物中加入30ml冰冷的丙酮，冷冻离心(-10℃，10000rpm)，去掉上清，沉淀物冷冻干燥，得白色粉状物，即亚麻酰丙氨酸酰化胰岛素C17H29CONHCH(CH3)CO-Ins。RP-HPLC测得其保留时间为15.8min。
权利要求
1.一种化学修饰的胰岛素，其化合物通式为CnH2(n-m)+1CO-Ins，式中CnH2(n-m)+1CO-为直链不饱和脂肪酸酰基，n＝17、19、21，m＝1～6；Ins为胰岛素。
2.按照权利要求1的化学修饰的胰岛素，所说的直链不饱和脂肪酸酰基可以为下列不饱和脂肪酸之一油酸C17H33COOH、亚油酸C17H31COOH、亚麻酸C17H29COOH、花生四烯酸C19H31COOH、二十碳五烯酸C19H29COOH、二十二碳五烯酸C21H33COOH、二十二碳六烯酸C21H31COOH。
3.权利要求1的化学修饰胰岛素的制备方法，合成路线和具体合成的步骤如下 ①将不饱和脂肪酸与滴加进入的三氯化磷在50～60℃下搅拌反应4～5小时，然后分液、上层液体蒸馏制得不饱和脂肪酰氯；②将苯并三唑溶于乙醚中，加入三乙胺，0～10℃下滴加不饱和脂肪酰氯，滴加完毕后，在15～20℃下搅拌反应2～3小时；过滤、结晶即得不饱和脂肪酰苯并三唑(I)；③在0℃下将胰岛素溶解在N-甲基-吡咯烷酮和二次水的混合溶剂中，再加入三乙胺；④将不饱和脂肪酰苯并三唑(I)溶解于N-甲基-吡咯烷酮中，将式(I)化合物的N-甲基-吡咯烷酮溶液加入到步骤③的胰岛素溶液中，在0℃下搅拌反应2～3小时；⑤向反应混合物中加入丙酮至有沉淀生成，离心、干燥，即得到不饱和脂肪酸酰基化胰岛素(II)。
4.按照权利要求3的化学修饰胰岛素的制备方法，步骤①所述的PCl3的摩尔数为不饱和脂肪酸的1/2至2/3；步骤②所述的三乙胺与苯并三唑等摩尔；所述的不饱和脂肪酰氯的摩尔数为苯并三唑用量的1.02～1.05倍；步骤③所述的N-甲基-吡咯烷酮和二次水的混合溶剂，水的体积百分含量为25％～75％；所述的三乙胺摩尔数约为胰岛素用量的30～50倍；步骤④所述的不饱和脂肪酰苯并三唑(I)的摩尔数为胰岛素用量的2～3倍。
5.一种化学修饰的胰岛素，其化合物通式为CnH2(n-m)+1CONHCHRCO-Ins式中CnH2(n-m)+1CO-为直链不饱和脂肪酸酰基，n＝17、19、21，m＝1～6；Ins为胰岛素。
6.按照权利要求5的化学修饰的胰岛素，所说的直链不饱和脂肪酸酰基可以为下列不饱和脂肪酸之一油酸C17H33COOH、亚油酸C17H31COOH、亚麻酸C17H29COOH、花生四烯酸C19H31COOH、二十碳五烯酸C19H29COOH、二十二碳五烯酸C21H33COOH、二十二碳六烯酸C21H31COOH；R为赖氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸的侧链。
7.权利要求6的化学修饰胰岛素的制备方法，合成路线和具体合成的步骤如下CnH2(n-m)+1CONHCHRCO-Ins的合成反应式如下 (V)①将氨基酸溶于氢氧化钠溶液，再加入上述溶液3～5倍体积的四氢呋喃，在0～10℃下，滴加不饱和脂肪酰氯，同时滴加0.1mol/L的氢氧化钠或碳酸钠溶液，控制体系pH值在8.5～10；滴完后，0～10℃搅拌反应2小时后，升温至20～30℃，继续搅拌反应2～3小时；停止反应后，用盐酸酸化至pH2～3，加入与混合液等体积的石油醚，去水层，冷却结晶，得不饱和脂肪酰氨基酸(III)；②将不饱和脂肪酰氨基酸(III)溶于四氢呋喃中，加入苯并三唑，搅拌溶解；冰浴下滴加二环己基碳二亚胺的四氢呋喃溶液，滴完后，0℃下继续搅拌反应2小时，升温至20℃，继续搅拌2～3小时；过滤，将滤液浓缩、结晶、干燥，即得不饱和脂肪酰氨基酸酰基苯并三唑(IV)；③在0℃下将一定量的胰岛素溶解在N-甲基-吡咯烷酮和二次水的混合溶剂中，再加入三乙胺；④将摩尔数为胰岛素用量2～3倍的不饱和脂肪酰氨基酸酰基苯并三唑(IV)溶解于N-甲基-吡咯烷酮中，将式(IV)化合物的N-甲基-吡咯烷酮溶液加入到上述胰岛素溶液中，在0℃下搅拌反应2～3小时；⑤加丙酮入反应混合物至有沉淀生成，离心、干燥，得不饱和脂肪酰氨基酸酰化胰岛素(V)。
8.按照权利要求7的化学修饰胰岛素的制备方法，步骤①所述的氢氧化钠溶液、不饱和脂肪酰氯的用量等摩尔于氨基酸的用量；步骤②所述的苯并三唑和二环己基碳二亚胺的用量等摩尔于不饱和脂肪酰氨基酸(III)的用量；步骤③所述的N-甲基-吡咯烷酮和二次水的混合溶剂，水的体积百分含量为25％～75％；所述的三乙胺摩尔数为胰岛素用量的30～50倍。
9.权利要求1和5的化学修饰胰岛素在用于制备治疗糖尿病的口服药物中的应用。
全文摘要
一种可以用于治疗糖尿病的口服药物的不饱和脂肪酸或其衍生物修饰的胰岛素及其制备方法。本发明旨在保护胰岛素易被胰蛋白酶进攻的位点，使胰岛素能够抵抗胰蛋白酶的降解作用。合成方法是采用化学修饰的方法在胰岛素的合适部位共价结合一种不饱和脂肪酸或其衍生物。动物实验证明，与胰岛素相比，修饰胰岛素不仅保持降糖活性，而且在被试验动物的体内持续作用时间延长，抗胰蛋白酶降解的能力明显提高。
文档编号A61P3/00GK1528790SQ20031011124
公开日2004年9月15日 申请日期2003年10月17日 优先权日2003年10月17日
发明者黄开勋, 黄涛, 徐辉碧 申请人:华中科技大学