专利名称：NF－kappaB活化的促进因子及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及促进转录因子NF-kappaB(nuclear factor-kappaB)活化的核因子，具体涉及一种促进NF-kappaB(nuclear factor-kappaB)活化的人的特异基因、该基因编码的蛋白序列以及它们在制备防治与NF-kappaB活化失调相关疾病的药物等方面的用途。
背景技术：
NF-kappaB(nuclear factor-kappaB)是一种存在于人体，可在各种类型细胞中广泛表达的转录因子，通常与抑制因子IkappaBs(inhibit kappaB)相结合，以非活性形式存在于细胞质中。NF-kappaB调节大量与细胞应急状态相关的基因的转录，特别是涉及免疫和炎症反应的基因的转录，包括细胞因子(生长因子)、受体、粘附分子、急性期蛋白、病毒基因、转录因子和调节因子等。
NF-kappaB在机体免疫应答和炎症反应中发挥重要作用。人类许多病症与NF-kappaB活化的失调直接相关(Barnes et al.，1997)，如癌症、神经退行性疾病、毛细血管扩张共济失调症、类风湿性关节炎、哮喘、肠炎以及大量其它炎症；同时NF-kappaB在某些造血细胞，上皮细胞和淋巴器官结构发育过程中发挥重要作用。近来的研究证明，NF-kappaB家族成员还参与了神经突触的形成和肿瘤的迁移(Karin and Ben-Neriah，2000)。
因此NF-kappaB活化途径中的关键因子均可作为药物设计筛选的靶标，调节NF-kappaB活性的因子的研究为免疫及炎症的预防和治疗提供了新的途径。例如最有效的抗哮喘药物肾上腺皮质激素是淋巴细胞中NF-kappaB活力的有效抑制物(Auphan et al.，1995)；美国IMMUNEX公司研发能阻断肿瘤坏死因子TNF诱导NF-kappaB激活的药物Enbrel用于治疗类风湿性关节炎。
发明内容
本发明的目的是提供一种促进NF-kappaB(nuclear factor-kappaB)活化的cDNA序列，以及该基因编码的蛋白，为干预NF-kappaB的活化提供药物设计靶标。
本发明利用酵母双杂交筛选获得了促进NF-kappaB活化的新的调节因子。
本发明发现了具有SEQ ID NO1所示序列的cDNA，命名为NKAP(NuclearNF-kappaB Activating Protein)。实验结果证明，NKAP基因及其编码的NKAP蛋白(具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列)是促进NF-kappaB(nuclear factor-kappaB)活化的调节因子。
上述NKAP基因和蛋白是用已知在TNF-R1诱导的NF-kappaB活化过程中发挥重要作用的激酶RIP作为钓饵，用酵母双杂交方法筛选与之相互作用的蛋白而得到的。
序列分析表明，NKAP与已知基因没有明显的序列同源性并在各物种间序列保守。在293细胞中过量表达NKAP能够剂量依赖性地活化NF-kappaB。反义RNA实验进一步证明，NKAP表达量的下降能够抑制NF-kappaB的活化，并使TNF和IL-1诱导NF-kappaB激活的能力明显降低。免疫荧光染色的实验结果表明NKAP定位于细胞核内。以上实验结果证明，NKAP是TNF和IL-1激活NF-kappaB信号途径中一种新的调节因子。
因为能够对NF-kappaB活性起调节作用的蛋白可作为潜在的蛋白药物直接调节NF-kappaB的活性，或者作为药物设计的靶标，药物通过调节其的活性间接调节NF-kappaB的活化。
本发明提供的NKAP基因和蛋白可以调控NF-kappaB的活化，因此可以为干预NF-kappaB活化的药物筛选的分子提供设计靶标及炎症的诊断标记。与各种药物可接受的赋形剂、药物辅剂配伍后，可以将NKAP基因和蛋白全长分子或片段直接作为蛋白药物制成各种类型的药物，增加NF-kappaB的活性；或者针对NKAP设计抑制药物，通过抑制NKAP来降低NF-kappaB的活性。用于预防或治疗与NF-kappaB活化的失调相关的疾病。
图1是NKAP对NF-kappaB及NKAP对转录因子AP-1的效应的荧光报告基因检测对比结果。图中可看出，NKAP能够活化NF-kappaB，而对AP-1的活性没有影响。
图2是NKAP反义RNA稳定表达细胞系与对照细胞系的荧光报告基因测试结果。图中显示NKAP表达量的下降能够抑制NF-kappaB的活化。
具体实施例方式一.材料人胚肾293细胞购自ATCC；细胞培养用DMEM，胎牛血清，0.05％胰酶溶液，丙酮酸钠溶液，青、链酶素溶液购自GIBCO和Hyclone；
酵母培养用Peptone购自Difco，添加剂CSM-Trp-，CSM-Trp-Leu-，CSM-His-Leu-Trp-购自Q-BIO Gene；鲑精DNA购自Roche；哺乳动物细胞表达载体pRK-HA由本实验室构建；NF-kappaB荧光报告质粒由Dr.Gary Johnson(University of Colorado Health ScienceCenter)惠赠；pRL-SV40 Renilla荧光报告质粒购于Promega；酵母双杂交“钓饵”载体pGBT9购自CLONTECH；人B细胞cDNA文库购自ATCC；大肠杆菌表达载体PET-15b，大肠杆菌BL21(DE3)菌株及镍离子柱纯化试剂盒购自Novagen；含有NKAP部分编码序列的EST克隆BG391661购自ATCC，用于构建NKAP反义RNA的载体pIRESneo3购自CLONTECH；载体构建所需限制性内切酶购自Promega；DNA回收试剂盒Geneclean III Kit购自Q-BIO Gene；DNA序列测定由中国上海生工生物工程公司完成；PCR引物由中国上海生工生物工程公司合成；双荧光报告基因检测试剂盒购自Promega；免疫共沉淀所用磁珠Protein G-Sepharose购自Amersham Biosciences；Western blot用硝酸纤维素膜Hybond ECL和HRP偶联的羊抗鼠IgG、羊抗鼠兔IgG购自Amersham pharmacia biotech.；化学发光底物试剂盒购自PIERCE；重组的人TNF，IL-1购自R&D Systems Inc.；HA单克隆抗体购自Sigma；兔抗人NKAP蛋白的多克隆抗体由中科院遗传所免疫室制备；TXRD偶联的羊抗鼠IgG，FITC偶联的羊抗兔IgG，DAPI购自Southern BiotechnologyAssociates Inc.；防淬灭封片剂Gel/mountTM购自Biomeda Corp.；CaCl2，PEG4000，LiAc，DMSO购自Sigma；CsCl购自Fisher Biotech.；β-gal购自Promega；其它化学试剂购自北京化学试剂商店。
二.方法1.质粒构建及DNA纯化从293细胞cDNA文库中PCR得到RIP全长分子，构建到酵母双杂交用，编码转录因子Gal4结合结构域的载体pGBT9，得到可在酵母细胞中表达的质粒pGBT9-RIP；GeneBank检索及EST(expression sequece tag)序列拼接得到NKAP分子的全长编码序列，根据这一序列分别设计5’端及3’端引物，通过PCR从B细胞cDNA文库中克隆到NKAP全长分子，SalI/NotI或XhoI/BamHI酶切后分别插入哺乳动物细胞表达载体pRK-HA和大肠杆菌表达载体PET-15b中，得到哺乳动物细胞表达质粒pRK-HA-NKAP及大肠杆菌表达质粒PET-15b-NKAP。
构建的哺乳动物细胞表达质粒均参照《分子克隆》(J.萨姆布鲁克等，1999)质粒大量提取法，经CsCl密度梯度超速离心纯化。
2.酵母双杂交筛选参照文献方法(Chen et al.，2002)。
3.细胞培养和细胞转染人胚肾293细胞培养于含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基中37□5％二氧化碳培养箱培养。
293细胞(1×105)接种于12孔板中，18小时后参照《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等，1999)进行磷酸钙介导的转染。
4.荧光报告基因检测293细胞(～1×105)接种于12孔板中，18小时后进行磷酸钙介导的转染。每个样品设三个平行实验组，适量加入空载体以保持每组转染的DNA总量相等。每孔加入0.1μgNF-kappaB荧光报告质粒；为了平衡转染效率，同时加入0.1μg pRL-SV40-Renilla荧光报告质粒。转染后14-18小时进行检测，用Promega公司的荧光检测试剂盒检测NF-kappaB荧光报告基因及pRL-SV40-Renilla荧光报告基因的活性，方法分别参照产品说明。
5.免疫共沉淀及Western blot293细胞(～2×106)接种于10cm培养皿中，20小时后用1ml细胞裂解液(20mM Tris，150mM NaCl，1％Triton，1mM EDTA，10μg/ml aprotinin，10μg/ml leupeptin，1mMphenylmethylsulfonyl fluoride pH7.5)裂解细胞，在0.5ml细胞裂解液中加入2μgNKAP的抗血清或免疫前血清，再加入30μl protein A偶联的Sepherose，4□旋转混合4小时。磁珠被裂解液清洗三次后，加入2×SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳样品缓冲液20μl，沸水浴后进行10％SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳，电泳及转膜操作参照《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等，1999)。硝酸纤维素膜用封闭液5％脱脂奶-TBST(150mM NaCl，25mM Tris，0.05％Tween-20，pH7.5)室温温育20mins，加入0.5μg/mlNKAP的抗血清或免疫前血清，室温温育2hrs，TBST洗涤三次后加入HRP偶联的羊抗鼠IgG或羊抗鼠兔IgG(1∶1000稀释)，室温温育1hrs，TBST洗涤三次后用荧光底物检测试剂盒检测。
6.重组蛋白的表达及纯化将PET-15b-NKAP质粒转化入大肠杆菌BL21-DE3，扩增培养至500ml，用1mM IPTG诱导5小时，参照先前的方法(李联运等，2001)及Novagen镍离子柱纯化试剂盒说明进行NKAP重组蛋白的纯化。
7.反义RNA表达载体的构建及稳定表达细胞系的筛选EST克隆BG391661中的表达质粒(载体为pCMV-sport6)含有NKAP分子5’端约700bp编码序列，以及NKAP启动子之前的145bp非编码序列。将这一质粒用NheI和EcoRI双酶切后插入载体pIRESneo3相应位点中，由于NheI和EcoRI在这两个载体多克隆位点上的位置相反，我们得到了NKAP的反义RNA表达载体pIRESneo3-AS-NKAP。
将pIRESneo3-AS-NKAP用磷酸钙介导法转染入293细胞中，培养24hr后更换培养液，并加入G418(1μg/ml)进行筛选，两周后挑取单克隆进行克隆培养。
8.免疫荧光染色将293细胞培养于载玻片上，用表达载体或相应的空载体进行转染并培养20hrs；将细胞用冰预冷的甲醇和丙酮分别固定10mins。经PBS漂洗后，用0.1％Trition X-100 PBS浸3mins，分别用HA的单克隆抗体(Sigma)，兔抗人NKAP蛋白抗血清以及对照鼠IgG或兔免疫前血清于37□温育2hrs，经PBS漂洗后，再分别与TXRD偶联的羊抗鼠IgG，FITC偶联的羊抗兔IgG于37□蔽光温育1hr，经PBS漂洗后，加DAPI室温作用5mins，Gel/Mount封片。Lecai DMR/XA(DMRB)荧光显微镜100×物镜观察。
三.NKAP的克隆及功能鉴定1.NKAP cDNA的克隆我们用RIP全长分子为钓饵，对人B细胞cDNA文库进行酵母双杂交筛选。我们一共筛选了5×106个酵母克隆，β-半乳糖染色结果显示有26个酵母克隆呈阳性。我们进而分别对这26个克隆中的B细胞cDNA文库质粒进行了序列测定，发现其中9个克隆文库质粒的插入片段与编码转录因子GAL4激活结构域的基因不在同一个读码框架中；在读码框架正确的17个克隆中，两个克隆的插入片段均编码FADD的部分序列，FADD是一种已报道的具有死亡结构域且能够与RIP结合的接头蛋白；另外有3个克隆的插入片段分别编码不同的未知功能蛋白，其中一个我们命名为NKAP。
我们对测序获得的NKAP分子部分编码序列进行了EST(expressed sequece tag)序列检索及拼接，获得了NKAP的全长序列(SEQ ID NO1所示)，(起始密码子位于256-258，中止密码子位于1501-1503)。在NKAP分子起始密码子的5’端具有位于同一读码框架内的终止密码子(202-204)，而3’端具有poly(A)。根据这一序列我们设计了5’引物和3’引物，通过PCR从B细胞cDNA文库中获得了NKAP全长cDNA。NKAP的全长cDNA为1248bp，编码416个氨基酸(SEQ ID NO2所示)，序列分析表明，NKAP是一个碱性的蛋白分子，并且在进化过程中非常保守。人与鼠NKAP的氨基酸同源性高达90％。
2.NKAP的蛋白表达我们用纯化的NKAP蛋白制备了兔抗人NKAP蛋白的抗血清。Western blot结果表明制备的抗血清能够特异性识别293细胞中内源性表达的NKAP蛋白。分子量约为52kD，与纯化的NKAP蛋白分子量一致，略小于过量表达的HA-NKAP，说明我们克隆到了NKAP的全长分子。
3.NKAP的细胞定位我们用免疫荧光染色研究了NKAP在293细胞中的分布。过量表达pRK-HA-NKAP的293细胞用抗HA的单抗进行染色，结果显示过量表达的NKAP聚集于核内。用NKAP抗血清标记未转染的293细胞，结果同样显示细胞内本底表达的NKAP蛋白定位于核内。以上结果说明NKAP是一个核因子。
4.NKAP的功能鉴定(1)NKAP促进NF-kappaB的活化293细胞中转入0.1μg NF-kappaB或0.1μg AP-1荧光报告质粒，0.1μg pRL-SV40 Renilla荧光报告质粒以平衡转染效率。同时转入图中标注量的NKAP表达质粒。转染后约16小时检测荧光报告基因的活性。每一样品设置三个平行实验，图1结果为三次独立实验所得结果的平均。
NF-kappaB荧光报告基因检测结果显示，NKAP在293细胞中过量表达时，能够剂量依赖性地活化NF-kappaB(图1)。为了检测这种活化作用是否具有特异性，我们同时检测了NKAP对另一种转录因子AP-1的效应，结果表明NKAP对AP-1没有明显的激活或抑制作用(图1)。说明NKAP对NF-kappaB的活化作用是相对特异的。
(2)NKAP抑制TNF和IL-1诱导的NF-kappaB的活化为了检测NKAP在生理条件下的功能，我们检测了NKAP表达的缺失能否影响NF和IL-1诱导的NF-kappaB的活化。我们构建了NKAP反义RNA表达质粒并将它转入293细胞中，经筛选得到稳定表达NKAP反义RNA的细胞株AS-NKAP-293，Western blot结果显示NKAP的反义RNA能够抑制NKAP蛋白的表达。
AS-NKAP-293细胞中TNF和IL-1诱导NF-kappaB活化的能力下降。293细胞和AS-NKAP-293细胞中分别转入RIP表达质粒或对照质粒以及0.5μg NF-kappaB荧光报告质粒，同时转入0.5μg pRL-SV40 Renilla荧光报告质粒以平衡转染效率。转染后14小时用TNF(20ng/ml)及IL-1(20ng/ml)处理细胞，6小时后检测荧光报告基因的活性。
荧光报告基因实验结果显示，与转入空载体的293细胞相比，AS-NKAP-293细胞中本底水平的NF-kappaB活性明显降低(图2)。并且AS-NKAP-293细胞中TNF和IL-1诱导NF-kappaB的激活的能力受到明显抑制。
以上结果说明NKAP是一个新的NF-kappaB活化的调节因子。
序列表<110>北京大学<120>NF-kappaB活化的促进因子及其用途<130>03-01<160>2<170>Patentln version 3.1<210>1<211>1695<212>DNA<213>人(human)<400>1atattaataa acataaaata cccgccgccc cctccatggt acggtccgga ttcccgggat60tcgtcgaccc cgcgtccgcg gacgcgtggg tcgacccacg cgtccgtttg cagaagtacc120cagaactgtg tccaaggttt cctcaaattt gggctgttcc gcagcggcag gtcccgggaa180ccaaggcaac agacatcttc ctaggctcgc gagagcgccc ccttgtccca cggctgctgg240ggccccccag tagccatggc tccggtgtcc ggctcacgca gcccggatag ggaggcctcg300ggctcggggg gaagacgtcg cagttcgtcg aagagtccga agcccagcaa atctgcccgc360tccccgcggg gccgccgctc tcgctcgcac tcttgctctc ggtccgggga ccggaatgga420ctcacccatc agctgggtgg cctcagccaa ggctcccgaa accagtccta ccgctcacgc480tcgcggtcgc gttctagaga gcggccctct gcgccccggg gcatcccctt cgcttctgcc540tcctcgtcag tctattacgg cagctactcg cgcccctacg ggtgcgacaa gccttggcct600agcctcctcg acaaggagag ggaggagagc cagcggcaga agagattaag tgagagagag660agaattggag aattgggagc tcctgaagta tggggacttt ctccaaagaa tcctgaacca720gattctgatg aacatacacc agtggaggat gaagagccaa agaaaagcac tacttcagct780tctacttcag aagaagaaaa aaagaagaag tctagccgtt caaaagaaag gtccaagaaa840aggagaaaga aaaaatcatc gaaaagaaaa cataagaagt attctgaagt aagcgacagt900gactctgatt ctgaaacaga ctccagtgat gaagataaca aaaggagagc aaagaaagcc960aagaaaaagg aaaagaagaa gaaacacaga tcgaagaaat ataagaaaaa gaggtctaag1020
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1.具有SEQ ID NO1所示序列的DNA。
2.权利要求1所述DNA调节NF-kappaB活化的用途。
3.用权利要求1所述DNA在制备预防或治疗与NF-kappaB活化的失调相关的疾病的药物的用途。
4.权利要求1所述DNA在筛选干预NF-kappaB活化的药物的用途。
5.用权利要求1所述DNA作为炎症的诊断标记的用途。
6.具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
7.权利要求6所述氨基酸序列调节NF-kappaB活化的用途。
8.用权利要求6所述氨基酸序列在制备预防或治疗与NF-kappaB活化的失调相关的疾病的药物的用途。
9.权利要求6所述氨基酸序列在筛选干预NF-kappaB活化的药物的用途。
10.用权利要求6所述氨基酸序列作为炎症的诊断标记的用途。
全文摘要
本发明涉及NF－kappaB活化的促进因子及其用途。本发明发现了一种促进NF－kappaB(nuclear factor－kappaB)活化的人的特异基因。实验结果证明，该基因及其编码的蛋白是促进NF－kappaB活化的调节因子，可以为干预NF－kappaB活化的药物筛选提供设计靶标及炎症的诊断标记，并且可用于制备与NF－kappaB活化失调相关疾病的药物。
文档编号A61K48/00GK1600789SQ20031011528
公开日2005年3月30日 申请日期2003年11月27日 优先权日2003年11月27日
发明者陈丹英, 舒红兵, 翟中和 申请人:北京大学