专利名称：一种载体传递的佐剂化抗原及其制备方法
技术领域：
本发明属生物技术免疫制剂领域，涉及疫苗的佐剂载体系统及其制备方法和应用。具体的说，本发明采用载体传递佐剂化抗原，在稀释给药后，能诱生强的体液和细胞免疫应答，可用于传染性疾病的预防和治疗。
背景技术：
已有的研究表明，持续性病毒感染如慢性乙肝病毒持续性感染的原因是由于机体缺陷的免疫应答能力。如何有效的启动机体对持续性感染病毒的应答，产生清除病毒所需的体液和细胞免疫应答，尤其是细胞免疫应答，是目前治疗性疫苗研制的热点。
据报道，由重组DNA技术产生的蛋白质疫苗免疫原性较差，常需要添加佐剂才能更有效的诱生免疫应答，目前疫苗所采用的佐剂大多为铝佐剂，对持续性病毒感染的疫苗治疗其效果尚不尽理想，其原因可能是铝佐剂为Th2型佐剂，不能有效的诱生细胞免疫应答。CpG ODN是目前报道有Th1型佐剂作用的一种含胞嘧啶-磷酸硫代-鸟嘌呤(PS-CpG)基序的寡聚脱氧核苷酸。实验表明PS-CpG能激活B细胞，单核细胞，NK细胞，诱生大量细胞因子的产生(IL-6，IL-10，IL-12，IL-18，IFN-α，IFN-γ和TNF-α)。在小鼠模型研究中，已表明PS-CpG能增强抗原特异性抗体应答，促进免疫应答向Th1型方向发展，增强CTL活力。PS-CpG作为乙肝疫苗的佐剂于1999年在美国进入I期临床。临床结果表明PS-CpG安全并耐受良好，但由于CpG基序的种属特异性，小鼠有效的PS-CpG序列在人免疫细胞中没有或表现很低的免疫刺激活力，由于难以用人体评价寡核苷酸的免疫刺激活力，有关CpG刺激人免疫刺激研究大多通过对人外周血单核细胞(PBMC)进行。有研究鉴定出两种ODN结构特性不同的有免疫刺激作用的CpG，其一为“K”型，为磷酸硫代化骨架，含多重5’-TCGTT-3’和/或5’-TCGTT-3’基序，能激发浆细胞状树突细胞(PDC)的成熟和分泌IL-8，刺激B细胞增殖和IgM的分泌，促进巨噬细胞产生IL-6；其二为D型，为磷酸硫代和磷酸二酯混合骨架，含有5’-pur-pyr-CpG-pur-pyr-3’基序，两侧由互补的碱基形成颈环结构，3’端由polyG组成，D型CpG能促进PDC成熟并产生大量的IFN-α，直接或间接激发NK细胞分泌IFN-α，以及促进髓样树突细胞(MDC)的成熟。
TLR9在人和小鼠免疫细胞对CpG的激活中起作用的重要细胞表面分子。但Verthelyi D etc，al等采用TLR9转染的HEK 293细胞研究，发现K ODN的识别是通过TLR9实现的，但转染的细胞并不对D ODN反应。对乙肝病毒慢性携带者的PDC进行分析，发现其启动免疫应答能力低下，可能是导致T细胞免疫缺陷的主要原因。CpG有提高DC协调刺激分子的表达，上调细胞因子的分泌，改善DC功能，可以用来作为慢性病毒感染的免疫治疗。
上述对CpG的研究基本都是采用PS-CpG或PS/PE混合骨架CpG。在早期对小鼠B细胞的刺激实验中，含5’pur-pur-CpG-pyr-pyr-3’基序的磷酸二酯CpG(PE-CpG)有刺激活力，尤以含5’-GACGTT-3’基序的最佳。后来Yi AK发现在这个基序的5’端增加5’-TpC-3’能提高CpG的刺激活力，而在3’端增加一个多聚嘧啶尾巴会进一步增强寡核苷酸的刺激作用。根据这个原理，Gunther Hartmann设计了一系列的PE-CpG和PS-CpG用于人PBMC体外刺激实验，结果发现PE-CpG和PS-CpG的最大免疫刺激活力是相似的，含有8个寡核苷酸基序5’-TCGTCGTT-3’的PE-CpG(2080)能强烈上调人B细胞CD86，再增加一个5’-GTCGTT-3’基序不能进一步增强其活力，有些CpG磷酸硫代修饰后，其免疫刺激活力完全丧失，需添加额外的CpG基序才能重新获得刺激活力。有些CpGDNA磷酸硫代修饰后与相应蛋白的结合能力降低。ODN磷酸硫代后，由于空间位阻的加大，碱基配对能力下降，也会影响CpG的三维结构。有实验表明将CpGODN于抗原通过共价交联或生物素-亲和素蛋白方式连接免疫，结果比游离形式分别免疫要好。但是无论共价交联或通过生物素-亲和素蛋白方式连接，都存在改变抗原和/或CpG ODN三维结构的问题。
脂质体作为疫苗载体已有广泛研究，如脂质性疟疾疫苗，霍乱疫苗，HIV疫苗。磷脂脂质体中的主要原料为卵磷脂，原料不均一，含较多的不饱和健，易发生过氧化反应，形成有毒的过氧化物而导致脂质体结构破裂，虽可以通过加氢法来改善，但费用很昂贵。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于预防性和治疗性疫苗的佐剂载体系统及其制备方法。本发明的进一步目的是提供所述佐剂载体系统的应用。
本发明将抗原佐剂化后，用载体包裹佐剂化抗原制备成佐剂化抗原载体系统，载体传递的佐剂化抗原在稀释给药后，能诱生强的体液和细胞免疫应答，能用于传染性疾病的预防和治疗。
所述佐剂化抗原，其特征在于所说抗原与所说的佐剂混合。
所述载体传递的佐剂化抗原，其特征在于佐剂化抗原被包裹在所说的载体中。
本发明采用脂质体和高分子复合物制备的颗粒化载体为载体，用以传递较易受降解佐剂和抗原的降解及在辅助免疫应答产生中起作用。所述脂质体优选非磷脂脂质体，它是由胆固醇和具有R1-O-(CH2-CH2-O-)M-亲水亲脂两性结构的聚氧乙烯脂肪醚类表面活性剂。具有稳定性好，包裹率高，使抗原在体内缓慢释放，延长对机体免疫刺激的时间，可被巨噬细胞、肝细胞、肠微生物及大多数环境微生物的氧化代谢所分解的优点。更为突出的是脂质体作为免疫调节剂和抗原的共传递载体时，还可增强这种免疫反应CpG介导的免疫刺激作用的内化和内吞体中的酸化过程，保持天然骨架的PE-CpG能更好地模拟细菌DNA，为TLR9所识别。
所述抗原，可为重组DNA技术来源的多肽、蛋白质、福尔马林灭活的微生物疫苗和编码基因的DNA载体。其中蛋白质抗原优选乙型肝炎表面抗原。
所述佐剂采用可有效刺激哺乳动物免疫系统的寡核苷酸，其中寡核苷酸的免疫刺激元件具有5’pur/pyr/CG/pur/pyr3’、5’pur/pur/CG/pyr/pyr3’结构，寡核苷酸的骨架为磷酸硫代骨架、磷酸二酯键骨架和混合骨架。
本发明载体传递的佐剂化抗原，通过载体将佐剂和抗原同时传递，实验证实能诱生很强的体液和细胞免疫应答，可用于预防性和治疗性疫苗，尤其针对持续性病毒感染的治疗性疫苗。其给药方式为与水溶性溶液混匀稀释后给药，可减低副作用，，加快局部吸收，有效诱导免疫应答。
具体实施例方式
本发明的实施例与效果可由以下实例说明，但必须指出，以下仅为实例，并不意味限制本发明的范围。
实施例1 脂质体传递破伤风类毒素(TT)与PE-CpG诱生的抗体应答用非磷脂脂质体(Np)包裹TT与PE-CpG免疫Balb/c小鼠，于0，3，6周免疫三次，最后一次免疫后一周采血，用间接ELISA法测定抗体滴度，以无佐剂、铝佐剂和CFA的TT组比较，结果诱生的抗体滴度为无佐剂和铝佐剂组的20倍左右，为CFA组的3倍。抗体亚类分析结果表示脂质体传递的TT和PE-CpG诱生了很高的IgG2a与IgG1，诱生的是Th1/Th2型均衡的免疫应答。
表1不同佐剂TT组诱生的特异性抗体及亚类滴度GroupIgG2a IgG1 IgG2a/IgG1总IgGNone ＜100 16117 045600Al 672 61466 0.1 42380CFA 30300 1675650.2 203761Np(TT+PE-CpG)2826062744421.0 757133实施例2 脂质体传递乙脑灭活疫苗(inactivate JEV)与PE-CpG诱生的抗体应答用非磷脂脂质体(Lp)包裹乙脑灭活疫苗与PE-CpG免疫Balb/c小鼠，以无佐剂和CFA组为对照，于0，3，周免疫2次，第9周采集血清，血清以50倍稀释，以乙脑活病毒包板，用间接ELISA法检测anti-JEV抗体，结果以OD490nm表示。Lp包裹PE-CpG和乙脑灭活疫苗后免疫，可提高乙脑灭活疫苗诱生的特异性抗体滴度。
表2第九周免疫小鼠抗乙脑病毒特异性抗体(OD490nm)疫苗 佐剂总IgG乙脑灭活疫苗 无 0.174±0.042乙脑灭活疫苗 CFA 0.617±0.012ab乙脑灭活疫苗 LpCpG 0.906±0.011ab正常小鼠 0.082±0.044注a表示与乙脑灭活疫苗相比有显著差异(P＜0.05)；实施例3 脂质体传递乙脑灭活疫苗(inactivate JEV)与PE-CpG诱生的细胞免疫效果用非磷脂脂质体(Lp)包裹乙脑灭活疫苗与PE-CpG免疫Balb/c小鼠，以无佐剂和CFA组为对照，于0，3，周免疫2次，于第5周取免疫小鼠脾淋巴细胞体外用病毒刺激培养后收集母细胞，以乙脑病毒感染12小时的Balb/c乳鼠原代肾细胞为靶细胞，以效靶比为20∶1采用MTT法进行CTL的检测。结果表明，乙脑灭活疫苗只诱生很低的CTL活力，用Lp传递的PE-CpG与乙脑灭活疫苗诱生的CTL活力有显著的提高，与乙脑减毒活疫苗诱生的CTL活力相当。
表3不同乙脑疫苗组免疫小鼠第五周的anti-JEV CTL活力疫苗 佐剂特异性杀伤(E∶T＝20)乙脑灭活疫苗 无 6.5％乙脑灭活疫苗 CFA 31.9％乙脑灭活疫苗 LpCpG 42.6％乙脑减毒活疫苗无 44.3％正常小鼠 5.1％实施例4 脂质体传递乙肝表面抗原与PE-CpG诱生的抗体应答脂质体包裹乙肝表面抗原与PE-CpG后免疫Balb/c小鼠，雄性，每组15只，随机分组，以无佐剂、铝佐剂、PE-CpG和单纯脂质体Lp组为对照，于0，3周免疫两次，第五周采血用间接ELISA法检测抗体滴度。结果表明，LpCpG组诱生了很高的抗体滴度，为铝佐剂的8倍左右，PE-CpG组和Lp组诱生的抗体滴度与无佐剂组相似。亚类分析结果显示LpCpG不仅诱生很高的Th1型IgG2a，还诱生较高滴度的IgG1，属混合型应答。
表4不同佐剂的乙肝疫苗组第5周诱生的特异性抗体及亚类滴度佐剂 IgG2a IgG1 总IgG无 ＜100 1182 1100铝佐剂 ＜100 590.8 1256CpG107.5 104 700Lp 2421957 1314LpCpG 3854.8 914.3 7984实施例5 脂质体传递乙肝表面抗原和PE-CpG免疫的Balb/c小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子水平脂质体传递乙肝表面抗原和PE-CpG免疫Balb/c小鼠，以未免疫的正常小鼠和铝佐剂组小鼠为对照，第8周检测小鼠脾淋巴细胞在特异性抗原的刺激下IFN-γ分泌水平。结果表明，LpCpG组的小鼠脾淋巴细胞在HBsAg的刺激下分泌了很高水平的IFN-γ。
表5不同佐剂乙肝疫苗组免疫小鼠脾淋巴细胞在不同刺激原刺激后的上清IFN-γ含量(pg/ml)组别 刺激原None ConA HBs(1.25ug)normal189.31±15.081229.25±8.16a 243.34±91.26Al177.62±23.551474.12±88.36a188.47±22.31LpCpG 274.20±120831182.94±15.34a847.44±67.87a实施例6 脂质体传递乙肝表面抗原和PE-CpG免疫的Balb/c小鼠诱生的CTL活力脂质体传递乙肝表面抗原和PE-CpG免疫Balb/c小鼠，以未免疫的正常小鼠和铝佐剂组小鼠为对照，于0，3，12周免疫三次，最后加强后两周(14周)取小鼠的脾淋巴细胞在体外用丝裂霉素失活HBsAg Ld限制性的表位肽S29-38脉冲过的P815细胞为刺激细胞刺激培养5天，收集淋巴母细胞，以HBsAg Ld限制性的表位肽S29-38脉冲过的P815细胞为靶细胞，用MTT法进行CTL活力分析。
表6可以看出LpCpG组诱生了较高的CTL活力。
表6不同佐剂乙肝疫苗组免疫小鼠抗原特异性CTL活力(specific lysis％)效靶比(effector∶target)佐剂 100∶1 50∶1 20∶1Normal5.0±6.0 1±1.42.8±3.0Al0±0 1.0±1.0 0±0LpCpG 45.7±11.2a21.1±7.7a4.9±8.0注a表示与正常小鼠组相比有统计意义(P＜0.05)b表中小鼠个数normal5；Al3；LpCpG5c表内数据为特异性杀伤％＝杀伤P815-S％-杀伤P815％实施例7 脂质体传递乙肝表面抗原和PE-CpG以稀释给药后免疫Balb/c小鼠的抗体应答脂质体传递乙肝表面抗原和PE-CpG，免疫时与生理盐水按一定比例(1∶4)稀释，，以正常未免疫小鼠和铝佐剂组小鼠为对照，第0，3周免疫，第5周采血检测血清抗体滴度，结果表明，稀释免疫的LpCpG诱生的抗体滴度是LpCpG 5倍，抗体亚类分析结果表明，稀释给药后，诱生的免疫应答更倾向Th1/Th2型均衡应答。
表7不同佐剂乙肝疫苗免疫的小鼠的特异性抗体及亚类滴度佐剂 稀释比例 IgG2a IgG1 总IgG无 - ＜100 1182 2176铝佐剂 - 259.7 2535 3716LpCpG- 1582 3829 4479LpCpG1∶4 19776 14304 20008实施例8 脂质体传递乙肝表面抗原和PE-CpG以稀释给药后诱生的CTL活力脂质体传递乙肝表面抗原和PE-CpG，免疫时与生理盐水按一定比例(1∶4)稀释，，以正常未免疫小鼠和铝佐剂组小鼠为对照，第0，3周免疫，第7周检测CTL活力，结果显示LpCpG稀释给药后，依然诱生了CTL，活力较未稀释的LpCpG组的还高。
表8不同佐剂乙肝疫苗组免疫小鼠的CTL活力佐剂CTL(1∶50)无 0铝佐剂 0LpCpG 21.7％LpCpG(1∶2) 65.60％实施例9 脂质体传递乙肝表面抗原和PE-CpG以稀释给药后硬结消失时间LpCpG肌肉免疫小鼠后，于注射部位有明显硬结的产生，需要3个月才完全消失，稀释2倍以上，注射后24小时即观察不到硬结。
表9不同比例稀释给药的LpCpG免疫后产生硬结消失情况佐剂 稀释度 硬结消失时间LpCpG - 3个月LpCpG 1∶11个月LpCpG 1∶23周LpCpG 1∶324小时LpCpG 1∶4无硬结
权利要求
1.一种载体传递的佐剂化抗原，其特征在于含有载体和佐剂化抗原，其中载体包裹佐剂化抗原。
2.按权利要求1所述的载体传递的佐剂化抗原，其特征在于所说的佐剂化抗原其中抗原为重组DNA技术来源的多肽或蛋白质、福尔马林灭活的微生物疫苗和编码基因的DNA载体。
3.按权利要求1所述的载体传递的佐剂化抗原，其特征在于所说的佐剂化抗原其中蛋白质为乙型肝炎表面抗原。
4.按权利要求1所述的载体传递的佐剂化抗原，其特征在于所说的佐剂为可有效刺激哺乳动物免疫系统的寡核苷酸。
5.按权利要求4所述的抗原，其特征在于所述寡核苷酸的免疫刺激元件具有5’NNCGNN3’结构，N可为任何嘌呤或嘧啶，所述寡核苷酸的骨架为磷酸二酯键骨架。
6.按权利要求1-5所述的载体传递的佐剂化抗原，其特征是所述佐剂化抗原是所说的抗原与所说的佐剂混合。
7.按权利要求1所述的载体传递的佐剂化抗原，其特征在于所说的载体为脂质体。
8.按权利要求1所述的载体传递的佐剂化抗原，其特征在于所说的载体为非磷脂脂质体。
9.上述任一权利要求的载体传递的佐剂化抗原，在制备预防性和治疗性疫苗中的用途。
10.权利要求9所述的用途，其特征是所述抗原与水溶性溶液混匀稀释后在制备预防性和治疗性疫苗中的用途。
全文摘要
本发明属生物技术免疫制剂领域，涉及疫苗的佐剂载体系统及其制备方法和应用。本发明将抗原佐剂化后，用脂质体载体包裹佐剂化抗原制备成佐剂化抗原载体系统，通过载体将佐剂和抗原同时传递，实验证实，在稀释给药后，能诱生很强的体液和细胞免疫应答，能提高疫苗的吸收，降低毒副作用，可用于预防性和治疗性疫苗，尤其针对持续性病毒感染的治疗性疫苗。
文档编号A61K39/39GK1554446SQ20031012286
公开日2004年12月15日 申请日期2003年12月26日 优先权日2003年12月26日
发明者何春艳, 刘庆良 申请人:上海生物制品研究所