专利名称：肝病治疗用药用植物溶剂提取物的制作方法
技术领域：
本发明是关于一种具有抑制B型肝炎病毒DNA复制及B型肝炎病毒表面抗原(HBs)及e抗原(HBe)分泌的肝病治疗用的药用植物提取物；该提取物不仅对野生型(wild·type)B型肝炎病毒具有抑制效果，亦对肝安能抗药性(lamivudine-resistant)的B型肝炎病毒的病毒DNA复制及病毒表面抗原及e抗原的分泌具抑制效果。此肝病治疗用的药用植物来源为具有特定核糖体基因间序列(ribosomal DNA Internal transcribed Spacer，简称ITS序列)的荨麻科植物，以及该ITS序列可作为该药物植物的鉴识比对。
背景技术：
全世界有三亿五千万人口为慢性B型肝炎带原者，在美国约有一百二十五万的慢性肝炎感染者，在中国大陆约有三千至五千万人感染B型肝炎，一亿二千万人为慢性B型肝炎带原者，其中每年约有三十万人死于B型肝炎，在台湾则约有三百万人感染B型肝炎。
据估计在美国每年约有14-32万人感染B型肝炎，因B型肝炎感染所引起的经济损失每年至少七亿美元。在台湾的慢性肝病及肝硬化患者超过五千人，为国人第六大死因，再加上引起肝肿瘤等病症，则更为可观。
目前治疗B型肝炎以干扰素(interferon)及肝安能(lamivudine)为主。干扰素在1992年为FDA允许使用于治疗慢性B型肝炎，但是在使用期间会引起非常大的副作用，且仅约20％的B肝病人对干扰素有反应，而肝安能在1998年通过FDA的许可用来治疗慢性B型肝炎，但也仅有17-33％的病人有反应，而中国人对肝安能的反应更低，最严重则为长期使用肝安能会引起B肝病毒的突变，随使用时间加长，其突变率也随之增加，在使用第一年约有24％的突变率，至第二年则增加为42％，第三年为52％，至第四年则高至67％。故可知目前为止，仍未有高疗效低副作用且不会引起病毒突变的治疗B型肝炎药物。
根据研究发现，B型肝炎带原者的e抗原呈阳性，患者罹肝癌危险为常人六十倍，推估七十岁时，罹肝癌风险高达九成；因此开发更为有效、同时可以抑制B型肝炎病毒表面抗原及e抗原的产生、不会引起病毒突变，甚至可抑制突变病毒的B型肝炎治疗药物为当务之急。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种具有抑制B型肝炎病毒DNA复制及B型肝炎病毒表面抗原及e抗原分泌的肝病治疗用的药用植物提取物；以及利用核糖体基因间序列(ITS序列)对该药用植物进行鉴定的方法。
本发明的主要目的是提供一种用于肝病治疗的药用植物提取物，是由将山苧麻、长叶苧麻、咬人猫、水麻、苧麻、木苧麻的根或茎部磨碎打粉、以溶剂提取而制成。
本发明的另一目的是提供一种提取方法，以用于制造抑制B型肝炎病毒DNA复制，B型肝炎病毒表面抗原及治疗e抗原分泌的肝病用的药用植物提取物，是由将山苧麻、长叶苧麻、哎人猫、水麻、苧麻、木苧麻的根或茎部磨碎打粉、以溶剂提取而制成。
本发明的又一目的是提供一种用于肝病治疗的药用植物的药用植物鉴定法，是由与山苧麻、长叶苧麻、咬人猫、水麻、苧麻、木苧麻的核糖体基因间序列(Internal transcribed Spacer，简称ITS序列)进行比对，其ITS序列相似度至少为70％，以单离出具有对抑制B型肝炎病毒DNA复制，B型肝炎病毒表面抗原及治疗e抗原分泌的肝病有较佳药效的植物药材。
为实现上述目的，本发明提供的用于肝病治疗的荨麻科植物根或茎部的溶剂提取物，提取自一苧麻科植物，且该苧麻科植物其与山苧麻(Boehmeria frutescsns)，长叶苧麻(Boehmeria zollingeriana)、咬人猫(Urlicathunbergiana)、水麻(Pilea spp)、苧麻(Boehmeria nivea)及木苧麻(Boehmeriadensiflora)的核糖体基因间序列(Internal transcribed Spacer)相似度大于70％以上。
其中该山苧麻的核糖体基因间序列如序列识别号1、2及3所示。
其中该长叶苧麻的核糖体基因间序列如序列识别号4、5及6所示。
其中该咬人猫的核糖体基因间序列如序列识别号7、8及9所示。
其中该水麻的核糖体基因间序列如序列识别号10、11及12所示。
其中该苧麻的核糖体基因间序列如序列识别号13、14及15所示。
其中该木苧麻的核糖体基因间序列如序列识别号16、17及18所示。
其中山苧麻、长叶苧麻、咬人猫、水麻、苧麻、木苧麻之一的核糖体基因间序列可用于肝病治疗的药用植物提取物的药用植物鉴定。
其中植物提取物是经抽取待测荨麻科植物DNA、连锁聚合酶反应增幅放大、核糖体基因间序列片段定序、分析比对山苧麻、长叶苧麻、咬人猫、水麻、苧麻、木苧麻的核糖体基因间序列、建立荨麻科植物核糖体基因间序列资料库的步骤鉴定。
该溶剂提取物的提取方法包括下列步骤(a)将该等荨麻科植物根或茎部根或茎部磨碎打粉，得到一粉状物；(b)以一高极性溶剂或其溶剂混合物处理步骤(a)中所得粉状物，得到提取液；经蒸发干固萃取物；以及(c)再以低极性溶剂及水溶剂混合物处理该步骤(b)中所得的水溶液层，经蒸发干固萃取物。
其中该高极性溶剂为甲醇、乙醇或其混合物。
其中该低极性溶剂选自一群组包括乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯甲烷、环己烷、正己烷、正丁醇乙醚、苯，及上述的混合物。
其中该低极性溶剂为乙酸乙酯。
其中肝病治疗为B型肝炎治疗。
并可用于抗甘安能药物的B型肝炎治疗。
其中肝病治疗的荨麻科植物根或茎部的溶剂提取物配合其他肝病治疗药物使用。
本发明提供的荨麻科植物药材鉴定方法，包括以下步骤(a)提供一已知的荨麻科植物药材的核糖体基因间序列(ITS)资料库；(b)提供一荨麻科植物药材的根部或茎部，抽取其DNA；(c)设计一引子对(Primer)如下，5’-CACACCGCCCGTCCTACCGA-3’
5’-ACTCGCCGTTACTAGGGGAA-3’并针对该步骤(b)中所抽取的DNA进行聚合酶连锁反应，得到一第一ITS序列；(d)将步骤(c)中所得到的该第一ITS序列进行定序(sequencing)；以及(e)将该第一ITS序列与该资料库中的ITS序列资料进行相似度比对，当相似度大于70％以上时，即为该步骤(b)中的荨麻科植物药材。
其中该步骤(b)抽取DNA方法是先以CTAB(cetyltrimethylammoniumbromide)、PVPP(polyvinyl polypyrrolidone)及不同盐浓度处理，再经过沉淀离心、Chloroform萃取及酒精沉淀而得。
其中该步骤(b)中的荨麻科植物药材选自一群组包括山苧麻(Boehmeria frutescsns)，长叶苧麻(Boehmeria zollingeriana)、咬人猫(Urlicathunbergiana)、水麻(Pilea spp)、苧麻(Boehmeria nivea)及木苧麻(Boehmeriadensiflora)。
在一具体实施例中，本发明将肝病治疗的药用植物提取物作为活体外抑制病毒的应用(1)抑制野生型(wild-type)B型肝炎病毒DNA复制及其病毒表面抗原(HBs)及e抗原(HBe)的分泌；(2)抑制抗肝安能药性(lamivudine-resistant)的B型肝炎病毒DNA复制及其病毒表面抗原及e抗原的分泌。
另一具体实施例中，本发明以山苧麻、长叶苧麻、咬人猫、水麻、苧麻、木苧麻的ITS序列作为植物提取物的药用植物鉴定法的应用。
图1为荨麻科植物提取物抑制动物细胞中B型肝炎病毒s抗原及e抗原的效果。
图2为肝病治疗植物提取物抑制动物细胞中野生型与抗肝安能突变种B型肝炎病毒s抗原及e抗原的效果。
图3为肝病治疗植物提取物抑制动物细胞中野生型与抗肝安能突变种B型肝炎病毒DNA复制的效果。
图4为荨麻科植物核糖体ITS序列比对结果。
具体实施例方式
本发明的说明中，山苧麻是指荨麻科苧麻属植物(Boehmeriafrutescens)；长叶苧麻是指荨麻科苧麻属植物(Boehmeria zollingeriana)；咬人猫是指荨麻科苧麻属植物(Urlica thunbergiana)、水麻是指荨麻科苧麻属植物(Pilea spp)、苧麻是指荨麻科苧麻属植物(Boehmeria nivea)及木苧麻是指荨麻科苧麻属植物(Boehmeria densiflora)。
本发明包括一种用于肝病治疗的药用植物提取物，由将山苧麻、长叶苧麻、咬人猫、水麻、苧麻、木苧麻的根或茎部磨碎打粉，以溶剂提取而制成。
而前述药用植物提取物的磨碎打粉，是将山苧麻、长叶苧麻、咬人猫、水麻、苧麻、木苧麻的根或茎部以捣碎、研磨，切碎等物理方式处理而使其成为单小颗粒，较佳是磨碎成粉末状，以利后续溶剂提取。
上述药材处理步骤为在此技术中的人士所熟知，无须特别教示，并且也涵盖于本发明的范畴内。
前述溶剂提取，是以溶剂萃取法提取药用植物的有效成份，先以高极性溶剂，如水、甲醇、乙醇、或其溶剂混合物，但不限于此，作为溶剂进行萃取的萃取物；所得的萃取物或以萃取物再以低极性溶剂萃取，本发明定义其介电常数为10以下，如乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯甲烷、环己烷、正己烷、正丁醇乙醚、苯或其混合物，但不限于此，进行萃取。
在本发明的实施例中，先以高极性溶剂如乙醇回流加热、再以低极性溶剂如乙酸乙酯或以不同水与乙醇混合比例溶液进行萃取药用植物的有效成份。
在上述药用植物药材磨碎打粉后，萃取步骤亦可视需要以甲醇或乙醇或其混合物而进行前萃取步骤。如上所述，虽然甲醇及乙醇是属于亲水性、高极性的溶剂(介电常数约为26至31)，但由于除了蛋白质、油脂及蜡之外，中草药植物细胞中的其他成份在甲醇或乙醇中均有一定程度的溶解度，因此，使用甲醇或乙醇，或其混合物进行萃取可有助于后续本发明以低极性溶剂的萃取。
本发明的另一型态是提供一种用护肝病治疗的药用植物提取物的提取方法，是由将山苧麻、长叶苧麻、咬人猫、水麻、苧麻、木苧麻的根或其茎部磨碎打粉、先以高极性溶剂处理、再以低极性溶剂处理的提取而制成。视需要，高极性溶剂处理步骤可以甲醇或乙醇或其混合物而进行前萃取步骤，此可有助于后续本发明以低极性溶剂的萃取。
然而，为了使萃取物中有效成份的纯度提高，可视需要于本发明的萃取步骤后，进行各种的纯化步骤。将萃取物进行纯化的方法无须特别教示，且为一般此技术中的人士所熟知，可使用的方法包括，例如，层析法、结晶法、过滤法、沉淀法等，应视所欲达到的目的而决定。
本发明另一种用于肝病治疗的药用植物提取物，是由将山苧麻、长叶苧麻、咬人猫、水麻、苧麻、木苧麻的根或茎部磨碎打粉、以溶剂提取制成具有抑制野生型(wild-type)B型肝炎病毒及抗肝安能(lamivudine-resistant)B型肝炎病毒的提取物。
前述药用植物提取物抑制野生型B型肝炎病毒及抗肝安能B型肝炎病毒效果，由抑制B型肝炎病毒DNA复制及B型肝炎病毒表面抗原(HBs)及e抗原(HBe)分泌。
在一具体实施例中，本发明将肝病治疗的药用植物提取物作为活体外抑制病毒的应用(1)抑制野生型B型肝炎病毒DNA复制及其病毒表面抗原及e抗原的分泌；(2)抑制抗肝安能B型肝炎病寿DNA复制及其病毒表面抗原及e抗原的分泌。
本发明肝病治疗的药用植物提取物可配合其他物质而使用，例如，其他对抗病毒的药物或其混合物或营养成份等，以达到增强抗病毒效果的协同活性。
本发明可单独地或与医药上可接受的载体或赋形剂结合，以单一剂量或多剂量的形式而投药。医学上可接受的载体或稀释剂以及任何其他已知的佐剂及赋形剂，可根据传统的技术而调配，例如，参见Remington’sPharmaceutical Sciences，第19版，Gennaro编辑，Mack出版公司，Easton，PA(1995)。
本发明的再一型态是提供一种用于肝病治疗的药用植物提取物的药用植物鉴定法，由与山苧麻、长叶苧麻、咬人猫，水麻、苧麻、木苧麻的核糖体基因间序列(Internal transcribed Spacer，简称ITS序列)进行比对，其ITS序列相似度至少为70％。
前述用于肝病治疗的药用植物提取物的药用植物鉴定法，由与具有抑制B型肝炎病毒活性提取物的山苧麻、长叶苧麻、咬人猫、水麻、苧麻、木苧麻的ITS序列进行ITS序列比对，其ITS序列的相似度至少为70％。
前述用于肝病治疗的药用植物提取物的药用植物鉴定法，包括下列步骤抽取待测荨麻科植物的总DNA，然后以连锁聚合酶反应(PolymeraseChain Reaction，简称PCR)增幅故大该所抽取总DNA中的ITS片段；接著针对此ITS片段进行定序，获得荨麻科植物核糖体的ITS序列；经由分析比对山苧麻、长叶苧麻、咬人猫、水麻、苧麻、木苧麻的ITS序列后可建立具有肝病治疗用荨麻科植物核糖体的ITS序列资料库。
前述用于肝病治疗的药用植物提取物的药用植物鉴定法，由与山苧麻、长叶苧麻、咬人猫、水麻、苧麻、木苧麻的ITS序列比对，其中山苧麻的ITS1、5.8S及ITS2的序列识别号分别为1、2、3所示的核苷酸序列，长叶苧麻的ITS1、5.8S及ITS2的序列识别号分别为4、5、6所示的核苷酸序列，咬人猫的ITS1、5.8S及ITS2的序列识别号分别为7、8，9所示的核苷酸序列，水麻的ITS1、5.8S及ITS2的序列识别号分别为10、11、12所示的核苷酸序列；苧麻的ITS1、5.8S及ITS2的序列识别号分别为13、14、15所示的核苷酸序列，木苧麻的ITS1、5.8S及ITS2的序列识别号分别为16、17、18所示的核苷酸序列。
前述用于肝病治疗的采用植物提取物的药用植物鉴定法，由与山苧麻、长叶苧麻、哎人猫、水麻的ITS序列比对，其比对的ITS相似度至少为70％。
在一具体实施例中，本发明以山苧麻、长叶苧麻、咬人猫、水麻、苧麻、木苧麻的ITS序列作为植物提取物的药用植物鉴定法的应用。
本发明将由以下实施例进一步详细说明，但该等实施例仅用于举例说明，而非用于限制本发明的申请专利范围。
实施例1药用植物提取物的提取药用植物提取物的提取方法如下(1)选取山苧麻、长叶苧麻、咬人猫、水麻、苧麻、木苧麻的荨麻科植物。
(2)分别将步骤(1)荨麻料植物药材的根或茎部位经过清洗，刮去外皮而后切细片，研磨成粉。
(3)分别取步骤(2)中的粉末600g，以95％酒精3000ml进行回流加热10小时，滤取已纯粹取液，减压浓缩除去乙醇，加入乙酯乙酯及蒸镏水各1000ml，搅拌30分钟后，静置1小时。
(4)将步骤(3)的水层产物，以500ml的乙酸乙酯分相萃取，将水层冻干燥浓缩，即为提取物。
实施例2药用植物提取物的细胞试验药用植物提取物的细胞试验如下(1)选用含有B型肝炎病毒的细胞株HepG2.2.15，以DMEM培养基进行培养。
(2)将实施例1的提取物500μg/ml加入步骤(1)细胞株中培养五天。
(3)分别于第一、三、五天，将步骤(2)的细胞培养液收集，进行离心(2000xg 2分钟)。
(4)将步骤(3)离心的上清液部份进行B型肝炎病毒表面抗原及e抗原抑制的测试；离心下层细胞部份则进行细胞毒性或B型肝炎病毒DNA含量测试。细胞经缓冲液清洗两次后，加入50μl事先配好再DMEM培养液中的MTT放入37℃培养液中反应30分钟至2小时，再加入150μlDMSO使反应呈色，以光谱仪590nm读取吸光值，与未加入药物的细胞吸光值比较，作为药物对细胞毒性的依据。细胞经缓冲液清洗两次后。加入含Triton-100的缓冲液，置于冰上反应15分钟，括取收集反应后的溶液细胞至离心管，置予冰上再反应15分钟后，以1300xg离心1分钟，收集上层液与沉淀物；上层液以自动核酸萃取仪抽取细胞质中B型肝炎病毒DNA。
细胞试验结果如下说明图1为荨麻科植物提取物抑制动物细胞中B型肝炎病毒s抗原与e抗原的效果。荨麻科植物提取物(500μg/ml)加入细胞HepG2.2.15中，分别于第g一、三，五天收集细胞培养液，以酵素免疫反应法(ELISA)分别分析B型肝炎病毒s抗原与e抗原的含量，以未加入药物的细胞液中的病毒s抗原与e抗原比较，检测出不同荨麻科植物提取物对细胞中B型肝炎病毒s抗原与e抗原有不同程度的抑制效果。
图2是肝病治疗植物提取物抑制动物细胞中野生型与抗肝安能突变种B型肝炎病毒s抗原与e抗原的效果。将含有野生型与抗肝安能突变型B型肝炎症毒DNA质体转植至肝细胞HepG2中，加入植物提取物(500μg/ml)或肝安能(200μg/ml)于不同转植肝细胞，经培养两天后，收取细胞培养液，以酵素免疫反应法(ELISA)分别分析B型肝炎病毒s抗原与e抗原的含量，发现所加入的植物提取物可同时抑制野生型与抗肝安能突变型B型肝炎病毒s抗原与e抗原；而肝安能仅能抑制野生型B型肝炎病毒s抗原与e抗原。
图3是肝病治疗植物提取物抑制动物细胞中野生型与抗肝安能突变种B型肝炎病毒DNA复制的效果。将含有野生型与抗肝安能突变型B型肝炎病毒DNA质体分别转植至HepG2与HuH7肝细胞中，加入植物提取物(500μg/ml)或肝安能(200μg/ml)于不同转植肝细胞，经培养四天后，收取细胞培，经分离萃取病毒DNA后，以琼胶电泳将DNA分开后，转滞到特殊膜(HybondN)，经以由Dig标记病毒DNA杂交，压片后，获得不同细胞转植株中不同药物对B肝病毒DNA复制不同的抑制作用。C为未加药物的控制组；L为处理肝安能的实验组，其仅对野生型B肝病毒DNA复制有抑制作用；B为处理植物提取物的测试组，显示其对野生型与抗肝安能突变型B型肝炎病毒DNA复制均有抑制作用。
实施例3药用植物的荨麻科植物ITS序列鉴定(1)荨麻科植物药材的根和茎经过清洗，刮去外皮以减少微生物污染，而后切细片，以液态氮冻脆后研磨成粉；(2)DNA抽取方法主要采用CTAB、PVPP及不同盐浓度处理，经过沉淀、离心、Chloroform萃取及酒精沉淀而得；(3)设计PCR增幅放大ITS序列的引子对(primer)如下5’-CACACCGCCCGTCGCTCCTACCGA-3’5’-ACTCGCCGTTACTAGGGGAA-3’以Tm＝60℃进行聚合酶链反应；(4)复制出的DNA片段经自动序列分析仪(ABI 3100)分析出序列后以DNAMAN⑧软件进行序列相似度比对；其中该步骤(2)的萃取步骤如下(2-1)萃取缓冲液100mM Tris.HCl20mM EDTA1M NaCl1％CTAB(cctyltrimcthylammonium bromide)1％PVPP(Polyvinyl Polypyrrolidone，在使用前加入)(2-2)3-100mg样本+0.5ml萃取缓冲液；(2-3)在70℃反应30分钟；(2-4)以chloroform∶IAA＝24∶1萃取，以10,000g离心5分钟；(2-5)取上清液，加入二倍体积的沉淀缓冲液；50mM Tris.HCl10mM EDTA40mM NaCl1％CTAB倒转2分钟；(2-6)以13000g离心15分钟；(2-7)以350μl的1.2M NaCl将步骤(2-6)的沉淀物溶解；(2-8)以Rnase A在37℃反应30分钟；(2-9)以chloroform∶IAA＝24∶1萃取，以10,000g离心5分钟；(2-10)加入0.6倍体积的isopropanol，在20℃静置15分钟；(2-11)在4℃下以13000g离心20分钟；(2-12)以1ml 70％的EtOH清洗沉淀物；以及(2-13)将沉淀物溶解在TE缓冲液中(每20mg的起始物使用10-25μl的缓冲液)。
药用植物的荨麻科植物ITS序列鉴定结果如下说明图4是荨麻科植物核糖体ITS序列比对结果。
上述实施例仅是为了方便说明而举例而已，本发明所主张的权利范围自应以申请专利范围所述为准，而非仅限于上述实施例。
SEQUENCE LISTING<110>Industrial Technology Research Institute<120>肝病治疗用药用植物溶剂提取物<130>WW<160>18<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>219<212>DNA<213>Boehmeria frutescens<400>1tcgtaacctg ccatgcagaa caacccgcga acatgtttat taatctcttg gcgcgtttgt 60ggcccttcgg ggagacaaac tcgccttgtg ttgggggccc ccgactttaa aacaaatcgg 120gcgcggtatg cgccaaggaa acaataaaag atcgagccgc aacctcgagg caaggacctt 180ggcgtgttgc ggtcggtcgc taaaatgaaa tgtcgtaac 219<210>2<211>155<212>DNA<213>Boehmeria frutescens<400>2cgactctcgg caacggatat ctcggctctc gcatcgatga agaacgtagc gaaatgcgat 60acttggtgtg aattgcagaa tcccgtgaac catcgagtct ttgaacgcaa gttgcgcccg 120aagccgttag gccgagggca cgtctgcctg ggctc 155<210>3<211>238<212>DNA<213>Boehmeria frutescens<400>3acgcaccgtc gccccctccc caaaccagtc tttttgacgg gattgggtgg ggcggatatt 60ggcctcccgt gcgaatgcgt gcggctggcc caaaatcgag tccccggctt tgtttgccgc 120
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<213>Boehmeria densiflora<400>17gactctcggc aacggatatc tcggctctcg catcgatgaa gaacgtagcg aaatgcgata 60cttggtgtga attgcagaat cccgtgaacc atcgagtctt tgaacgcaag ttgcgcccga 120agcctttcgg ccgagggcac gtctgcctgg gcgtc 155<210>18<211>235<212>DNA<213>Boehmeria densiflora<400>18acgcatcgtc gcccccactc ctcccaggtt cttctgggcc gttggtgtgg ggcggataat 60ggcctcccgt acgcttgcgg tgcggatggc cgaaaattga gtccccggct tcgtttgccg 120cgacattcgg tggtcgtcga ttactcggtg tcccgtcgtg cgcgcggccg gagggctcgc 180tggaatgacc cacgcggccc gttgctggac ccccagtgat gcgcgccctt ctaag23权利要求
1.一种用于肝病治疗的荨麻科植物根或茎部的溶剂提取物，提取自一苧麻科植物，且该苧麻科植物其与山苧麻(Boehmeria frutescsns)，长叶苧麻(Boehmeria zollingeriana)、咬人猫(Urlica thunbergiana)、水麻(Pileaspp)、苧麻(Boehmeria nivea)及木苧麻(Boehmeria densiflora)的核糖体基因间序列(Internal transcribed Spacer)相似度大于70％以上。
2.如权利要求1所述的溶剂提取物，其特征在于，其中该山苧麻的核糖体基因间序列如序列识别号1、2及3所示。
3.如权利要求1所述的溶剂提取物，其特征在于，其中该长叶苧麻的核糖体基因间序列如序列识别号4、5及6所示。
4.如权利要求1所述的溶剂提取物，其特征在于，其中该咬人猫的核糖体基因间序列如序列识别号7、8及9所示。
5.如权利要求1所述的溶剂提取物，其特征在于，其中该水麻的核糖体基因间序列如序列识别号10、11及12所示。
6.如权利要求1所述的溶剂提取物，其特征在于，其中该苧麻的核糖体基因间序列如序列识别号13、14及15所示。
7.如权利要求1所述的溶剂提取物，其特征在于，其中该木苧麻的核糖体基因间序列如序列识别号16、17及18所示。
8.如权利要求1所述的溶剂提取物，其特征在于，其中山苧麻、长叶苧麻、咬人猫、水麻、苧麻、木苧麻之一的核糖体基因间序列可用于肝病治疗的药用植物提取物的药用植物鉴定。
9.如权利要求8所述的溶剂提取物，其特征在于，其中植物提取物是经抽取待测荨麻科植物DNA、连锁聚合酶反应增幅放大、核糖体基因间序列片段定序、分析比对山苧麻、长叶苧麻、咬人猫、水麻、苧麻、木苧麻的核糖体基因间序列、建立荨麻科植物核糖体基因间序列资料库的步骤鉴定。
10.如权利要求1所述的溶剂提取物，其中该溶剂提取物的提取方法包括下列步骤(a)将该等荨麻科植物根或茎部根或茎部磨碎打粉，得到一粉状物；(b)以一高极性溶剂或其溶剂混合物处理步骤(a)中所得粉状物，得到提取液；经蒸发干固萃取物；以及(c)再以低极性溶剂及水溶剂混合物处理该步骤(b)中所得的水溶液层，经蒸发干固萃取物。
11.如权利要求10所述的溶剂提取物，其特征在于，其中该高极性溶剂为甲醇、乙醇或其混合物。
12.如权利要求10所述的溶剂提取物，其特征在于，其中该低极性溶剂选自一群组包括乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯甲烷、环己烷、正己烷、正丁醇乙醚、苯，及上述的混合物。
13.如权利要求12所述的溶剂提取物，其特征在于，其中该低极性溶剂为乙酸乙酯。
14.如权利要求1所述的溶剂提取物，其特征在于，其中肝病治疗为B型肝炎治疗。
15.如权利要求1所述的溶剂提取物，其特征在于，并可用于抗甘安能药物的B型肝炎治疗。
16.如权利要求1所述的溶剂提取物，其特征在于，其中肝病治疗的荨麻科植物根或茎部的溶剂提取物配合其他肝病治疗药物使用。
17，一种用于B型肝炎治疗的药用植物提取物，包括抗甘安能药物B型肝炎的治疗，该药用植物提取物将山苧麻、长叶苧麻、咬人锚、水麻的根或茎部磨碎打粉、再以溶剂提取而制成。
18.如权利要求17所述的药用植物提取物，其特征在于，其中溶剂提取物的提取方法包括下列步骤将山苧麻、长叶苧麻、咬人猫、水麻、苧麻、木苧麻的根或茎部磨碎打粉，以高极性溶剂处理，再以低极性溶剂处理提取而制成。
19.如权利要求18所述的药用植物提取物，其特征在于，高极性溶剂处理步骤可以甲醇或乙醇或其混合物进行。
20.如权利要求18所述的药用植物提取物，其特征在于，低极性溶剂处理步骤可以乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯甲烷、环己烷、正己烷、正丁醇乙醚、苯或其混合物进行。
21.如权利要求18所述的药用植物提取物，其特征在于，其中低极性溶剂处理步骤以乙酸乙酯进行。
22.如权利要求18所述的药用植物提取物，其特征在于，其中B型肝炎治疗药用植物提取物可进一步配合其他肝病治疗药物使用。
23.一种荨麻科植物药材鉴定方法，包括以下步骤(a)提供一已知的荨麻科植物药材的核糖体基因间序列(ITS)资料库；(b)提供一荨麻科植物药材的根部或茎部，抽取其DNA；(c)设计一引子对(Primer)如下，5’-CACACCGCCCGTCCTACCGA-3’5’-ACTCGCCGTTACTAGGGGAA-3’并针对该步骤(b)中所抽取的DNA进行聚合酶连锁反应，得到一第一ITS序列；(d)将步骤(c)中所得到的该第一ITS序列进行定序(sequencing)；以及(e)将该第一ITS序列与该资料库中的ITS序列资料进行相似度比对，当相似度大于70％以上时，即为该步骤(b)中的荨麻科植物药材。
24.如权利要求23所述的荨麻科植物药材鉴定方法，其特征在于，其中该步骤(b)抽取DNA方法是先以CTAB(cetyltrimethylammoniumbromide)、PVPP(polyvinyl polypyrrolidone)及不同盐浓度处理，再经过沉淀离心、Chloroform萃取及酒精沉淀而得。
25.如权利要求23所述的荨麻科植物药材鉴定方法，其特征在于，其中该步骤(b)中的荨麻科植物药材选自一群组包括山苧麻(Boehmeriafrutescsns)，长叶苧麻(Boehmeria zollingeriana)、咬人猫(Urlicathunbergiana)、水麻(Pilea spp)、苧麻(Boehmeria nivea)及木苧麻(Boehmeriadensiflora)。
全文摘要
本发明为一种用于肝病治疗的荨麻科植物根或茎部的溶剂提取物，所使用的荨麻科植物其核糖体基因间序列(ribosomal DNA Internal transcribed Spacer)与山苧麻、苧麻、长叶苧麻、咬人猫、水麻的核糖体基因间序列相似度大于70％以上另，本发明的肝病治疗用药用植物的提取物对(1)野生型B型肝炎病毒具有抑制效果；(2)对抗肝安能药性B型肝炎病毒具抑制效果。
文档编号A61P1/00GK1634964SQ200310123409
公开日2005年7月6日 申请日期2003年12月26日 优先权日2003年12月26日
发明者李连滋, 张秀凤, 李承榆, 邱淑娇, 童天送 申请人:财团法人工业技术研究院