专利名称：非结合型亲脂化合物被贫化的天然牝马结合型雌激素混合物的获取方法
技术领域：
本发明涉及天然的牝马结合型雌激素混合物的获取方法，该混合物中非结合型亲脂化合物被贫化，所述非结合型亲脂化合物包括非结合型类黄酮、非结合型异类黄酮、非结合型去甲类异戊二烯、非结合型类固醇(尤其是雄烷-和孕烷-类固醇)以及类似的非结合型化合物。
雌激素在医学中用于激素替代治疗。尤其是将雌激素混合物用于治疗和预防妇女在自然绝经或人为绝经后出现的更年期症状。已经证明，结合型雌激素天然混合物，例如存在于妊娠牝马尿液中的，以下被称为牝马结合型雌激素天然混合物，对此特别有效且具有良好的耐受性。
溶解在妊娠牝马尿液(＝pregnant mares urine，以下简称为“PMU”)中的固体含量自然会在较大的范围内变动，一般为每升40-90克干物质。PMU的固体含量中，除尿素和其它常见的尿容物之外，酚类成份含量大约为干物质的2-5重量％。这些酚类成份中有甲酚和以HPMF著称的二氢-3，4-双[(3-羟基苯基)甲基]-2(3H)-呋喃酮。它们以游离或结合的形式存在。PMU中含有雌激素天然混合物，其很大程度上以结合的形式例如作为硫酸半酯-钠盐(以下简称为“硫酸盐”)存在。结合型雌激素的含量(以雌激素硫酸盐计算)为干物质的0.1-1重量％。此外在PMU固体含量中还可以存在其它亲脂化合物，其含量可以在较大的范围内变化并且不可预见。这些亲脂化合物主要来源于作为饲料被妊娠牝马摄入的植物，主要包括各种类黄酮-、异类黄酮-、去甲类异戊二烯-衍生物和类似化合物，例如7-羟基-4’-甲氧异黄酮、染料木黄酮、大豆黄素、鸡豆黄素A、Equol和香豆雌酚。这些原本植物来源的亲脂化合物可以在尿液中以结合或游离(非结合型)的形式存在。属于PMU固体含量中的亲脂成份的，此外还有非结合型类固醇衍生物，尤其是雄烷-和孕烷类固醇，还包括非结合型雌激素衍生物。
含有结合型雌激素天然混合物的提取物，通常是采用固相提取法获取的，或者通过基于各种液-液-萃取步骤的方法获取，所述液-液-萃取步骤使用与水不相混合或仅仅少量混合的有机溶剂。通常适宜的是，为使所获取的结合型雌激素天然混合物能够作为活性物质用于制药，必须使之符合一定的制药学规格，例如必须符合USP(美国药典)或欧洲药典制定的规格。如此，必须使结合型雌激素基于干物质的含量保持在一定的界值内。
美国专利No.2,551,205和No.2,429,398描述的方法用于由PMU制备一种水溶性雌激素制剂，其中首先经过活性炭或其它适宜的吸附性材料的吸附，用一种可与水相混合的有机溶剂例如吡啶进行洗脱，并随即去除溶剂而获取一种水性浓缩物，其含有来源于初始PMU中的水溶性雌激素成份的绝大部分。在美国专利No.2,429,398中，将浓缩物用粗苯和/或乙醚萃取进一步提纯，而在美国专利No.2,551,205中描述的是，将浓缩物酸化至pH-值为2-6，优选为4-5，然后迅速用选自脂族、芳香族或脂环族的烃(例如己烷、粗苯、甲苯、环己烷)或氯化的烃(例如氯仿、二氯化乙烯、三氯乙烯、四氯化碳、氯苯)的与水几乎不相混合的有机溶剂进行萃取，以使无用的物质如脂肪、油、游离酚类成份和非结合型类固醇通过转移至有机相而被去除。最后通过中和作用使水相稳定。美国专利No.2,551,205推荐，将获取的萃取液通过随后的萃取步骤和沉淀作用进一步提纯。总之，在实施美国专利No.2,551,205描述的方法后，所获取的产率约为所应用的浓缩物的雌激素成份的80％。
美国专利No.2,565,115中描述了用丙酮由PMU提取结合型雌激素的方法。但是没有陈述所获取的雌激素级分的纯度。
美国专利No.2,696,265所描述的方法是，首先将雌激素用脂族醇或酮，例如己醇、环己醇或环己酮进行萃取。雌激素进入有机相，随即被进一步提纯，此外还将含有雌激素的水相用盐酸调节至pH-值为4，并用二氯化乙烯萃取。
美国专利Nr.2,834,712公开了高纯度低毒性雌激素混合物的制备方法，其原理是采用多个不同溶剂和不同pH-值设置的单独萃取步骤。其中需要应用大量溶剂如己烷和粗苯。例如在某一步骤中将已经提纯的浓缩物溶于水，用盐酸调节至pH-值约为5.0，用粗苯并随即用乙醚萃取，以去除酚类成份。
国际专利申请书WO 01/27134描述了一种由PMU萃取结合型雌激素的相对简单的方法在添加盐例如氯化钠后，将PMU用至少同等体积份的有机溶剂例如醋酸乙酯进行萃取，就此结合型雌激素进入有机相。将有机相分离并干燥，以获取提取物。WO 01/27134没有陈述所获取的结合型雌激素提取物的纯度。
然而以上所描述的和由现有技术已知的液-液-萃取方法过程中会出现许多问题，如产生大量泡沫、产生沉淀、形成乳浊液和差的相分离。一般需要诸多萃取步骤，而导致损耗并只能部分获取雌激素含量。而且这些萃取步骤还需要大量的部分有损健康的溶剂。此外在以上列举的专利文本中，既没有陈述在所获取的产物中非结合型亲脂成份(例如非结合型类黄酮-、异类黄酮-、去甲类异戊二烯-衍生物和类似的非结合型化合物)的含量或者是非结合型类固醇(尤其是雄烷-和孕烷-类固醇)的含量，也没有陈述这些成份的去除过程。所述由现有技术已知的方法，不是在产率方面或者在所获取的提取物的纯度方面(基于干物质测量所获取的激素的总量)均不能提供满意的结果，就是需要诸多不同方法步骤和应用大量有机溶剂，甚至部分溶剂根据毒理学观点是不适宜的。
此外，由现有技术已知各种不同的固相萃取方法，可用于获取酚类尿容物被进一步贫化的牝马结合型雌激素天然混合物。国际专利申请书WO 98/08526如此描述了一种方法，其通过在一种半极性，尤其是在非离子半极性聚合性吸附性树脂上进行固相萃取，可以获取一种酚类尿容物被贫化的、且不含甲酚和HPMF的、基本完全含有PMU中的天然雌激素成份的混合物。国际专利申请书WO 98/08525描述了一种类似的方法，在固相萃取时采用硅胶作为吸附材料。还有中国专利申请书CN 1308083描述了一种应用含氰基的极性吸附性树脂的类似方法。所获取的提取物适合于作为起始物，用于制备所含活性物质来源于PMU的结合型雌激素天然混合物的药物。
根据WO 98/08526或WO 98/08525的方法由PMU获取的结合型雌激素混合物通常可达到所制定的制药学规格的要求，例如在基于干物质的结合型雌激素含量方面所应保证的界值。但是事实表明在所获取的干物质中，除含有所需要的结合型雌激素外，还可能含有非结合型亲脂化合物。这些非结合型亲脂化合物例如有各种非结合型类黄酮-、异类黄酮-、去甲类异戊二烯-衍生物及类似的非结合型化合物，例如7-羟基-4’-甲氧异黄酮、染料木黄酮、大豆黄素、鸡豆黄素A、Equol和香豆雌酚，并且还包括非结合型类固醇，尤其是雄烷-和孕烷-类固醇，以及非结合型雌激素，在此所列举的并非囊括了全部可能性。由PMU所获取的结合型雌激素混合物中存在的非结合型亲脂化合物没有统一标准，游离的和结合的亲脂化合物的含量和成份例如根据妊娠牝马所摄食饲料的不同而有所变化。
虽然牝马结合型雌激素天然混合物的组成不会因为额外存在非结合型亲脂化合物而有所改变，但是基于干物质的牝马结合型雌激素含量却会因此而降低。通过针对性地去除非结合型亲脂成份，可以提高所获取的提取物中活性物质(牝马结合型雌激素)的浓度。即使出于药物安全性的原因，为了保证各种提取物配比成份的组成均衡而去除非结合型亲脂化合物是合理的，因为如此将非结合型亲脂成份去除(其在PMU中的含量和组成因妊娠牝马所摄入饲料种类随季节变换而有所不同)，则由此所获取的提取物基于干物质均具有近似的牝马结合型雌激素含量。此外，去除非结合型亲脂化合物还有利于达到均衡的生理学活性谱。例如由牝马结合型雌激素的天然混合物中去除可能存在的非结合型亲脂化合物可以是有意义的，因为它们或许本身具有所不期望的生理作用。
因此，本发明的任务是，开发出一种技术上和经济上最优化的获取牝马结合型雌激素天然混合物的方法，在此，该混合物的非结合型亲脂化合物进一步被贫化，特别是非结合型类黄酮-、异类黄酮-和去甲类异戊二烯-衍生物。本发明的任务尤其是要开发出一种只应用少量无损健康的溶剂的方法。此外还应该开发一种只通过少数步骤即提供牝马结合型雌激素提取物的方法，该提取物基于干物质具有相对较高的结合型雌激素含量。此外应用本发明的方法应能以简单的方式如此处理从妊娠牝马尿液(其中非结合型亲脂化合物含量是变换的，视情况会升高的)中获取的酚类尿容物已经被贫化的结合型雌激素混合物，使本发明方法所获取的牝马雌激素天然混合物具有满意的活性物质含量，并能够达到所要求的制药学规格，尤其是在基于干物质的结合型雌激素含量方面，应该保证在所要求的界值内。
现已发明了一种方法，以出人意料的简单方式，即使从非结合型亲脂化合物含量变换的、视情况含量会升高的PMU中也能获取牝马结合型雌激素混合物，其中所获取的牝马结合型雌激素混合物中非结合型亲脂化合物(尤其是非结合型类黄酮-、异类黄酮-和去甲类异戊二烯-衍生物)是进一步被贫化的。本发明方法尤其是可应用于从妊娠牝马尿液中获取酚类尿容物已经被贫化的结合型雌激素混合物，以使该方法所获取的牝马结合型雌激素混合物保证达到具有高产品质量和制药学规格的要求，尤其是基于干物质在结合型雌激素的含量方面保证在界值内。
根据本发明用于获取牝马结合型雌激素天然混合物的方法，其特征在于，所获取混合物中非结合型亲脂化合物已经被贫化，包括非结合型类黄酮、非结合型异类黄酮、非结合型去甲类异戊二烯、非结合型类固醇(尤其是雄烷-和孕烷-类固醇)以及类似的非结合型化合物，该方法的特征为，a)将选自以下化合物组的水性起始相(i)酚类尿容物已经被贫化的妊娠牝马尿液的结合型雌激素天然混合物的水溶液，
(ii)酚类尿容物已经被贫化的妊娠牝马尿液的结合型雌激素天然混合物的水性浓缩液，(iii)尿液的浓缩液，和(iv)视需要经过滤预先提纯的尿浓缩液，用足量的萃取剂进行液-液萃取(该萃取剂为适合于萃取上述非结合型亲脂化合物的、与水不相混合或几乎不相混合的有机溶剂)，并随即将水相分离，b)视需要将所获取的水相重复步骤(a)，以及c)获得含结合型雌激素天然混合物的水相，视需要将其浓缩。
作为本发明方法的水性起始相，可以使用酚类尿容物已经被贫化的妊娠牝马尿液的结合型雌激素天然混合物的水溶液(i)，或酚类尿容物已经被贫化的妊娠牝马尿液的结合型雌激素天然混合物的水性浓缩液(ii)。该水溶液或水性浓缩液，可以通过例如已经在国际专利申请书WO 98/08526和WO 98/08525或中国专利申请书CN 1308083中描述的方法，以及专业人员由此根据所述发表的专利申请书常用的方法获取。出于公开的目的，所述WO 98/08526、WO 98/08525和CN1308083的内容也成为本发明的内容。源自妊娠牝马尿液的的酚类尿容物已经被贫化的结合型雌激素天然混合物的水溶液或水性浓缩液，也可以是液-液-萃取的产物，正如国际专利申请书WO 01/27134描述的。根据上述专利申请书中描述的方法获取的水溶液或水性浓缩液，可以在其应用于根据本发明方法前，按照已知的方式例如蒸馏法进一步浓缩，以获取进一步去除了有机溶剂的浓缩液。
此外对于根据本发明的方法，作为水性起始相还可以使用一种将PMU浓缩所获取的浓缩液(iii)，或由PMU所获取的、经过滤法或类似方法已经预先提纯的浓缩液(iv)。将所收集的尿液(PMU)首先按照已知的方式去除粘液物质和固态物质。适宜的是将固态物质和粘液物质进行沉淀，然后按照已知的分离方法，例如倾析法、分离法和/或过滤法分离。如此可以将PMU例如置入一种已知的分离装置例如分离器、过滤装置或沉淀器中。作为分离装置例如可以应用砂床，或者应用市售的分离器，例如喷嘴式分离器或箱式分离器。视需要还可以应用微量过滤装置或超过滤装置，在所述应用中同时还可以使过滤后的PMU很大程度上达到无菌和无病毒。
视需要可以在尿液或尿液浓缩液中添加贮藏剂、杀微生物剂、杀细菌剂和/或驱蠕虫剂。
作为预先提纯的尿液浓缩液(iv)，还可以应用浓缩的PMU保留液，其可以由PMU通过本身已知的膜过滤方法获得。保留液的固体含量及其组成可分别依据其所应用的PMU和用于膜过滤的膜(例如其孔径)，以及过滤条件的不同而有所不同。例如应用纳米过滤膜时，可以几乎无损失地浓缩PMU保留液中的雌激素含量，而同时去除至多50重量％的低分子PMU内容物。用于根据本发明方法可以使用浓缩约至1∶10的比例(例如约1∶7)的PMU保留液，即其容积可以浓缩至起始PMU容积的约1/10(例如约1/7)。
如果作为水性起始相所应用的浓缩液为经浓缩的PMU浓缩液，或者为例如通过膜过滤已经预先提纯的PMU浓缩液，那么，所获取的已经根据本发明方法而将非结合型亲脂化合物贫化的牝马结合型雌激素混合物已经具备了足够的纯度，但仍然可能会含有显著剂量的酚类尿容物，必须通过进一步的方法步骤去除。所以可以用所获取的水相，例如根据国际专利申请书WO 98/08526和WO 98/08525或中国专利申请书CN 1308083中描述的方法，以及专业人员由此根据发表的所述专利申请书常用的方法，获取一种即使在酚类尿容物的含量方面也能达到对于结合型雌激素所要求的制药学规格的产物。
在本发明的范围内特别优选应用源自妊娠牝马尿液的酚类尿容物已经被贫化的结合型雌激素天然混合物的水溶液，或者源自妊娠牝马尿液的酚类尿容物已经被贫化的结合型雌激素天然混合物的水性浓缩液作为水性的起始相。
根据本发明在方法步骤(a)中用上面详细描述的水性起始相与足量萃取剂进行液-液-萃取，该萃取剂为与水不相混合或几乎不相混合的、且适合于萃取非结合型亲脂化合物(特别是非结合型类黄酮、非结合型异类黄酮、非结合型去甲类异戊二烯)和非结合型类固醇的有机溶剂。此外该有机相应与水性起始相不混合或几乎不混合，在此几乎不混合是指，在水相中溶解的有机溶剂最多为6容积％。对于所述液-液-萃取可以原则上应用任何一种与水不混合的有机溶剂，只要其能将非结合型亲脂化合物从水相中萃取出来。对于萃取非结合型亲脂化合物，特别是非结合型类黄酮、非结合型异类黄酮、非结合型去甲类异戊二烯和非结合型类固醇适宜的溶剂，例如可以是以下具有1-10个碳原子、呈直链的、分支的或环状排列的有机溶剂C4-C10醇(例如丁醇、己醇、环己醇和戊醇)、C2-C10酯化酸(例如乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸丙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯、乙酸戊酯、乙基甲基丙二酸酯(Ethylmethylmalonat)、膦酸二甲酯)、C3-C10醛和C4-C10酮(例如丁酮、戊酮、己-2，4-二酮、己二醛、环己烷链烷醛、甲基·苯基酮(Methylphenylketon)等)、或者常见的C3-C10烷氧基化合物、C2-C10醚(乙醚、甲基·叔丁基醚)、C3-C6腈和C1-C3卤代烷烃(二氯甲烷)，以及上述溶剂的混合液。尤其是乙酸-C1-C4-烷基酯、己醇、乙醚、二氯甲烷、甲基·叔丁基醚和上述溶剂的混合液，可以作为萃取剂用于本发明。在此可选范围内，乙酸-C1-C4-烷酯，尤其是乙酸乙酯优选为萃取剂用于本发明。
在方法步骤(a)中根据本发明用足量萃取剂实施液-液-萃取时，水性起始相与萃取剂的容积比例在本发明范围内不受限制。一般使用与水性起始相的容积相当的有机溶剂容积，然而其中水相与有机相的比例可以在10∶1至1∶10的范围内。优选水性起始相与有机萃取剂的容积比例在5∶1至1∶3的范围内，尤其是在2∶1至1∶2范围内的容积比例被认为是合适的。
一个这样的萃取过程的实施对专业人员而言是从现有技术中已知的。通常在一种装置内进行液-液-萃取，该装置可使水相和与水不混合的有机相持续不断地充分混合。例如有一种所谓的混合器-沉淀器装置(Mixer-Settler-Apparatur)可以通过搅拌混合所述二种液相，其适合于这样的萃取过程的实施。
原则上任何一种pH-值的水性起始相均可用于根据本发明描述的液-液-萃取。在根据本发明描述的液-液-萃取的一种特别优选的方案中，在方法步骤(a)中首先将水性起始相的pH-值调节至4-12范围内。优选将pH-值调节至4.0-7.0范围内，即弱酸性至中性范围内。十分特别优选将pH-值调节至4.0-6.0范围内，尤其是4.7-5.3范围内。
在调节pH-值时，适宜的是，在一个足够大的惰性容器中，例如在不锈钢桶中，用搅拌器或类似搅拌装置将预先置入的溶液充分混合，以保证pH-值的调节迅速和均匀。可应用通常的碱或酸调节pH-值。例如欲降低pH-值，则可应用通常的无机或有机酸，适宜的是稀释的酸。特别适宜降低或调节pH-值至小于7的是例如应用稀释的硫酸，优选1N硫酸、稀释的醋酸、稀释的磷酸或稀释的盐酸，优选1N盐酸。
本发明所描述的液-液-萃取不需要调节特定的温度，而是可以在5℃和有机溶剂的沸点或最高95℃之间宽广的温度范围内进行。优选在室温下进行本发明液-液-萃取，因为如此，额外的能量消耗为最小。室温通常是指周围环境温度，例如10℃-30℃之间的温度。
这种液-液-萃取的时间长短在本发明范围内不受限制，可以在5分钟和数小时之间；时间长短与所应用的水性起始相的剂量相关。一般是将步骤(a)的水相和有机萃取剂相互混合5-60分钟，优选10-20分钟，以使非结合型亲脂成份由水相尽可能充分地转移到有机相。
通过充分混合进行萃取步骤之后，静置相混合液，以使相分离。依照所应用容积大小的不同，相分离的时间长短可以是10分钟至数小时，优选静置相混合液30-120分钟。当水相和有机相彼此分离之后，将水相分离并保留以备继续应用，弃去有机相。
视需要可以重复上述方法步骤(a)；然后根据本发明随即进行任选步骤(b)，即用足量萃取剂与由步骤(a)所获取的水相进行新的液-液-萃取，所述萃取剂为与水不相混合或几乎不相混合的，适合于萃取非结合型亲脂化合物，特别是非结合型类黄酮、非结合型异类黄酮、非结合型去甲类异戊二烯和非结合型类固醇的有机溶剂。
萃取剂的选择和萃取过程实施的方式，即萃取过程所应用的装置、时间长短和温度，应以上述方法步骤(a)中所罗列的可能性为模板。
根据本发明，在方法步骤(a)和(b)这两者中，既可应用不同的萃取剂，又可应用相同的萃取剂。优选在这两个萃取步骤中应用相同的萃取剂，尤其是在这两个萃取步骤中作为萃取剂应该应用乙酸-C1-C4-烷基酯，尤其是乙酸乙酯。
在步骤(b)中根据本发明用足量萃取剂进行液-液-萃取时，由步骤(a)所获取的、已经萃取过一次的、含有牝马结合型雌激素的水相与萃取剂的容积比例在本发明范围内不受限制。一般来说，有机溶剂容积明显小于由步骤(a)所获取的水相的容积，不过水相对有机相的比例可以在40∶1至1∶2的范围内。优选由步骤(b)所获取的水相对有机萃取剂的容积比例在20∶1至1∶1的范围内，尤其适宜的是容积比例在10∶1至2∶1的范围内。
在步骤(b)中通过充分混合进行萃取之后，静置混合液相，以使相分离。相分离过程的时间长短可以是10分钟至数小时，优选静置相混合液20-90分钟。当水相和有机相彼此分离时，将水相分离并保留以备继续应用，弃去有机相。
在分离有机相和水相之后，在步骤(c)中获取含有结合型雌激素天然混合物的水相。该水相含有在PMU中出现的结合型雌激素天然混合物，此外还有极少量原本在PMU中或经处理的PMU浓缩液中存在的非结合型亲脂成份。视需要可以将水相按照已知的方式进一步浓缩，以获取进一步去除有机溶剂的、适合于进一步处理过程的浓缩液。因此可以例如将残存的有机溶剂从所获取的水相中蒸馏除去。通过蒸馏还可以将水性萃取相的干物质含量调节至具体的数值，优选干物质含量在5-15％之间的范围内，尤其优选干物质含量为9％。随即为了稳定所获取的牝马结合型雌激素天然混合物，还可以将水性萃取液的pH-值调节至碱性范围内，优选8-13的范围内，优选9-12之间的数值范围内。用通常适合于调节pH-值的碱(例如1N NaOH或Na2CO3)来调节pH-值。
根据本发明在方法步骤(c)所获取的、视需要还需进一步处理或浓缩的水相可以作为起始材料，用于制备含牝马结合型雌激素天然混合物的药物。视需要可以通过合适的干燥过程例如喷雾干燥法制备不含洗脱剂的固体混合物。如果结合型雌激素天然混合物用来制备固态药物，适宜的是，在浓缩和干燥之前，在含有结合型雌激素的水相中混合加入固态载体物质，以这种方式获取含有结合型雌激素和载体物质的固体混合物。无论是含有雌激素混合物的水相，还是由此制备的浓缩液或经干燥的固体产物，均可以按照已知的方式处理成固体的或液体的加仑氏制剂，如片剂、糖衣剂型、胶囊或乳剂。可以按照已知的方式，在应用通常的固体或液体载体物质如淀粉、纤维素、乳糖或滑石粉或液体石蜡和/或在应用通常的制药学助剂例如片剂崩解剂、增溶剂或贮藏剂的条件下，制备这些加仑氏制剂。如此可以将含有结合型雌激素的产物与制药学载体物质和助剂按照已知的方式混合，然后将混合物转化成合适的剂型。
根据本发明描述的液-液-萃取过程，以简单的方法从水性起始相中去除许多非结合型亲脂化合物，所述水性起始相可以为源自妊娠牝马尿液的酚类尿容物已经被贫化的结合型雌激素天然混合物的水溶液，为源自妊娠牝马尿液的酚类尿容物已经被贫化的结合型雌激素天然混合物的水性浓缩液，为尿液的浓缩液，或者为一种视需要经过滤预先提纯的尿浓缩液。去除的非结合型亲脂化合物尤其是指非结合型类黄酮、非结合型异类黄酮、非结合型去甲类异戊二烯和非结合型类固醇，在此尤其是非结合型雄烷-和非结合型孕烷-衍生物。
与经典的液-液-萃取法相比较，在此应用较小容积的有机溶剂，因为作为水性起始相总是应用原始PMU的浓缩液。如果例如应用依据国际专利申请书WO 98/08526描述的方法所获取的水性浓缩液作为本发明描述的液-液-萃取方法的水性起始相，则对于5000升PMU仅用约35升浓缩液和相应小剂量的有机溶剂用于萃取过程。
如果作为应用于本发明液-液-萃取过程的水性起始相，使用源自妊娠牝马尿液的酚类尿容物已经被贫化的结合型雌激素天然混合物的水溶液，或者使用源自妊娠牝马尿液的酚类尿容物已经被贫化的结合型雌激素天然混合物的水性浓缩液，那么作为活性物质提取物所获取的、非结合型亲脂成份和酚类尿容物被贫化的牝马雌激素天然混合物，具有明显优化的制药学规格，正如根据本发明所确证的那样。特别是通过液-液-萃取过程使牝马结合型雌激素基于干物质的比例提高了8-20％，而在萃取过程中又没有明显损失牝马结合型雌激素。由此证明在方法步骤(c)中所获取的含牝马雌激素天然混合物的水相，与现有技术相比较具有有利的组成成份和基于干物质提高了的总激素含量。经此可获取例如基于组成和活性物质含量明显改善的质量产物。
非常令人惊异的是，将源自含不同和变化剂量的非结合型亲脂成份的妊娠牝马尿液的酚类尿容物被贫化的牝马雌激素天然混合物的水溶液或浓缩液，进行一种自认为简单的液-液-萃取方法，却能如此明显改善所获取的活性物质提取物的质量。尤其令人惊异的是，非结合型亲脂化合物的份额，其取决于所应用的PMU不仅在量上也在组成成份上都会有很大变化，却能通过本发明方法可以如此肯定地减少，从而在方法步骤(c)中作为水相可以获取牝马结合型雌激素天然混合物，其能达到制药学规格的高标准规格，例如根据USP或欧洲药典提出的要求。
另外还令人惊异的是，根据本发明的萃取方法的实施中还可以去除这样一些非结合型亲脂化合物如消泡剂，其在先前的处理步骤(例如制备浓缩液的过程)中作为助剂添加至PMU中。
已经发现本发明方法还有一个优点明显简化和方便了进一步处理所获取的、经萃取的并且为非结合型亲脂化合物已经被贫化的牝马结合型雌激素天然混合物形式的浓缩液的过程，以及其转化成加仑氏制剂的过程。令人惊异的特征是根据本发明方法所获取的活性物质提取物具有很好的干燥性，并且其在干燥后所获取的固体物质具有非常好的流动性。因此例如根据本发明方法获取的经萃取的浓缩物比未经萃取的溶液明显更易于涂敷在载体物质上。活性物质浓度的调节也被简化并且是可重复的。
正如以上详细描述的，本发明方法相对于现今技术水平具有许多优点和改善。所以本发明还可以应用非结合型亲脂成份含量变换的PMU，例如其可以具有较高含量的游离类黄酮、游离异类黄酮、游离去甲类异戊二烯或游离类固醇衍生物，在此尤其是游离雄烷-或游离孕烷-类固醇，而不致违反应该遵守的制药学规格。根据本发明方法可以保障各种萃取剂配比成份的均衡组成，因为总是能够去除在PMU中的含量和组成取决于妊娠牝马所摄食的饲料种类而会有所变化的非结合型亲脂成份，并且由此使所获取的萃取液都具有相当的基于干物质的牝马结合型雌激素含量。此外通过使用根据本发明的方法定向去除非结合型亲脂成份，所获取的萃取液中具有较高浓度的活性物质，即牝马结合型雌激素。根据本发明方法还具有经济节省的优点，因为明显减少了因丧失重要活性物质而不能遵守制药学规格的危险，例如基于干物质的结合型雌激素含量不够的情况。此外通过应用本发明方法可以基本上准确而且重复地调节所获取的萃取液中活性物质的含量。根据本发明的方法提供了基于干物质含量提高了激素含量的质量改善的活性物质成份。该活性物质成份特别适合于制备含有牝马雌激素天然混合物作为活性物质的药物。
以下实施例应能进一步描述本发明，而并非将其范围仅限于此。
实施例以下实施例将描述由PMU获取活性物质萃取液的一般工作程序，所述萃取液含有PMU中所含有的结合型雌激素的天然混合物，并且其中非结合型亲脂化合物被进一步贫化，例如非结合型类黄酮、非结合型异类黄酮、非结合型去甲类异戊二烯、非结合型类固醇尤其是雄烷-和孕烷-类固醇和类似的非结合型化合物。还将说明根据本发明如何由非结合型亲脂化合物份额变换或提高的PMU获取活性物质含量高的优质萃取液。
源自妊娠牝马尿液中的酚类尿容物已经被贫化的结合型雌激素天然混合物的水性浓缩液的萃取作为水性起始相，应用35.3kg(实施例1)或者26.7kg(实施例2)来源于妊娠牝马尿液的酚类尿容物已经被贫化的结合型雌激素天然混合物的水性浓缩液，其采用国际专利申请书WO 98/08526中描述的方法由约5000升PMU制备的(干物质含量(＝TS)以及借助于HPLC和GC测定的结合型雌激素例如雌酮硫酸盐的含量，和非结合型亲脂化合物例如7-羟基-4’-甲氧异黄酮的含量，在以下实施例表中对于所应用的水性浓缩液的各种配比成份进行了描述)。将所述水性浓缩液在不锈钢桶中借助于搅拌器充分混合，将pH-值用1N H2SO4调节至约为5.0。将所获取的溶液在混合器-沉淀器装置中、在水相对有机相比例为10∶8的条件下掺入醋酸乙酯(EE-剂量说明见以下实施例表格)并剧烈搅拌约15分钟。然后将混合液静置约90分钟用于相分离。随即将相分离，在水相对有机相比例为10∶2的条件下，将水相再次掺入醋酸乙酯(EE-剂量说明见以下实施例表格)并搅拌15分钟。萃取后为使相分离，静置混合液约30分钟。分离有机相后将水相转移至反应炉内。在正常压力下从水相中蒸馏去残存的醋酸乙酯。通过蒸馏将干物质含量调节至约9％。随即将溶液的pH-值通过添加1N NaOH或Na2CO3调节至约11.0。如此所获取的结合型雌激素水性萃取相的含量借助HPLC和GC分析检测(干物质含量(＝TS)且借助HPLC和GC测定的结合型雌激素例如雌酮硫酸盐的含量、非结合型亲脂化合物例如7-羟基-4’-甲氧异黄酮的含量，在以下实施例表中对于所使用的水性浓缩液的各种配比成份进行了描述)。各种激素成份相互之间的比例，即结合型雌激素混合液中雌酮硫酸盐、马烯雌酮硫酸盐和17-α-DH-马烯雌酮硫酸盐的相对含量，可以在各种配比成份上随着PMU中的自然变化而变化。通过针对性地相互混合各种配比成份可以调节所需要的各种激素成份之间的比例。
如果不是用来自妊娠牝马尿液的酚类尿容物已经被贫化的结合型雌激素天然混合物的水性浓缩液作为水性起始相，而是用尿液浓缩液、视需要经过滤预先提纯的尿浓缩液或者来自妊娠牝马尿液的酚类尿容物已经被贫化的结合型雌激素天然混合物的水溶液作为水性起始相，所述萃取方法可以以类似的方式进行。
权利要求
1.获取结合型雌激素天然混合物的方法，其特征在于，所获取的混合物中非结合型亲脂化合物已经被贫化，所述非结合型亲脂化合物包括非结合型类黄酮、非结合型异类黄酮、非结合型去甲类异戊二烯、非结合型类固醇，尤其是雄烷-和孕烷-类固醇，以及类似的非结合型化合物，该方法的特征为，a)将选自以下化合物组的水性起始相(i)酚类尿容物已经被贫化的妊娠牝马尿液的结合型雌激素天然混合物的水溶液，(ii)酚类尿容物已经被贫化的妊娠牝马尿液的结合型雌激素天然混合物的水性浓缩液，(iii)尿液的浓缩液，和(iv)视需要经过滤预先提纯的尿浓缩液，用足量的萃取剂进行液-液萃取，该萃取剂为适合于萃取上述非结合型亲脂化合物的、与水不相混合或几乎不相混合的有机溶剂，并随即将水相分离，以及b)视需要将所获取的水相重复步骤(a)，以及c)获得含结合型雌激素天然混合物的水相，视需要将其浓缩。
2.根据权利要求1的方法，其中在步骤(a)中所应用的水性起始相为，源自妊娠牝马尿液的酚类尿容物已经被贫化的结合型雌激素天然混合物的水溶液(i)，或源自妊娠牝马尿液的酚类尿容物已经被贫化的结合型雌激素天然混合物的水性浓缩液(ii)。
3.根据上述权利要求之一的方法，其中萃取剂选自呈直链的、分支的或环状排列的C4-C10醇、C2-C10酯化酸、C3-C10醛、C4-C10酮、C2-C10醚、C3-C6腈和C1-C3卤代烷烃，以及上述溶剂的混合液。
4.根据权利要求3的方法，其中萃取剂选自乙酸-C1-C4-烷基酯、己醇、乙醚、二氯甲烷、甲基·叔丁基醚和上述溶剂的混合液。
5.根据权利要求4的方法，其中萃取剂为乙酸-C1-C4-烷基酯，优选醋酸乙酯。
6.根据权利要求1-5之一的方法，在方法步骤(a)中，将水性起始相调节至pH-值为4-12之间的范围内。
7.根据权利要求6的方法，其中将pH-值调节至4.0-7.0范围内，特别是在4.0-6.0范围内，优选在4.7-5.3范围内。
8.根据权利要求1-7之一的方法，其中在方法步骤(a)中水性起始相与萃取剂的容积比例在5∶1至1∶3的范围内，优选在2∶1至1∶2范围内。
9.根据权利要求1-8之一的方法，其中在方法步骤(b)中将方法步骤(a)中所获取的水相与萃取剂的容积比例调节在20∶1至1∶1的范围内，优选在10∶1至2∶1范围内。
全文摘要
本文描述了一种通过牝马结合型雌激素混合物的液－液－萃取获取含有天然的牝马结合型雌激素混合物的提取物的方法，所获取的混合物中非结合型亲脂化合物已经被贫化，包括非结合型类黄酮、非结合型异类黄酮、非结合型去甲类异戊二烯、非结合型类固醇(尤其是雄烷－和孕烷－类固醇)以及类似的非结合型化合物。
文档编号A61K31/56GK1691951SQ200380100699
公开日2005年11月2日 申请日期2003年10月8日 优先权日2002年10月11日
发明者I·巴恩, K-G·格尔林, H-J·米勒, S·瓦克斯曼 申请人:索尔瓦药物有限公司