专利名称：用于鉴定前哨淋巴结的方法、化合物和制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于鉴定前哨淋巴结的方法以及所述方法中使用的化合物和制剂。
淋巴系统由始于组织的脉管或导管组成，并且用来将淋巴液体携带至局部的淋巴结，在淋巴结中液体被过滤并经过加工，沿着管道送到邻近的淋巴结，直到该液体到达胸导管，并由此进入血流。进入淋巴管的淋巴液体携带了来自组织的物质和材料，例如抗原、颗粒和细胞。淋巴结通过筛分来加工淋巴液体，结节内部的巨噬细胞通过吞噬作用除去由淋巴液体携带的颗粒和细胞材料。
当在组织或器官中发生癌症时，其疏松的基质可容许驱动细胞进入淋巴系统，在淋巴结中截留并生长。在结节中发展的癌症的早期，癌症保持限制在结节中的状态。然而随后，结节沉积物可能生长至完全替代该结节和/或可能下行扩展至邻近的下一个结节。排流目标组织或器官(即，癌性组织)的淋巴结被称为区域性的淋巴结，并且截留癌症的第一个结节被称为前哨淋巴结。
肿瘤扩展的模式是很复杂的，如赘生性细胞的转移不仅仅导致赘生性细胞扩展至机体中下一个最接近的结节。这些结节更可能包含前哨淋巴结；然而前哨淋巴结可能在更远的结节组中。这可能由于肿瘤、感染、损伤而发生，或上述的治疗可能阻断直接排流目标组织或器官的淋巴管，而促进异常途径的发展。
在过去，在一些情况中已经有常规做法以除去潜在地包藏从肿瘤转移的赘生性细胞的所有淋巴结。高发病速率与该做法相关。因此，开发了几个方法来鉴定和活体检查前哨淋巴结。如果前哨淋巴结没有赘生性细胞，就可避免进一步的淋巴结活体检查和(进一步的)淋巴结解剖。已经通过将标记试剂注射进入产生肿瘤的组织并且追踪标记系统经过淋巴系统的途径来鉴定前哨淋巴结。
已经使用可视标记试剂，例如染料来用肉眼可视地检测前哨淋巴结(A.E.Giuliano et al.，Ann.Surg.220，1994，391-401)。这种方法需要有效的外科解剖。除非染色，否则结节与围绕组织是很难区分的，并且遗憾的是该染料具有不可预料的和快速的清除率。
US-A-5,732,704公开了利用放射性药物化合物并借助于放射性检测探针定位所述化合物来检测前哨淋巴结的方法。尽管这种化合物具有更延迟的转运，但是患者和医务人员潜在地暴露于有害剂量的电离辐射。放射性同位素也形成环境污染和处理问题。
US-A-5,496,536描述了利用直径小于1μm的颗粒并且用不同的成像方式检测那些颗粒的淋巴造影方法。如C.Oussoren等人，BiochimBiophys.Acta 1328，1997，261-272所观察到的，小颗粒吸收进入淋巴毛细管至很高的程度；然而它们只被淋巴结较少地保留下来。这种小颗粒一般较少有效地散射超声波，因此不适于以超声波为基础的淋巴造影术。由于淋巴结较少将它们保留下来，它们的选择性不足以只检测前哨淋巴结，而是可推进到其他的淋巴结。
通过WO-A-00/45855和WO-A-00/38579所公开的内容证实了由Oussoren等人所观察到的结果。
WO-A-00/38579公开了利用能够在特定的时间范围内优选在小于3小时内迁移到淋巴结的造影剂，并且用适当的检测方式检测所述的造影剂，从而检测前哨淋巴结的方法。为了在该时间范围内迁移，造影剂必须包括直径在0.05和5μm之间的颗粒。
WO-A-00/45855公开了利用平均颗粒大小为1-10μm的颗粒造影剂和在淋巴结中检测所述造影剂的成像方式来鉴定前哨淋巴结的方法。
如WO-A-00/38579和WO-A-00/45855所列出的，造影剂颗粒的尺寸似乎对所述文件中公开的方法的可操作性具有显著的影响。令人遗憾地是就所使用的造影剂和成像方式而论，所描述的方法操作得不是太好。尽管具有几乎相同的尺寸，用于相同成像方式的不同造影剂表现出显著的差别，因此，在所描述的方法中使用某些造影剂可能导致灵敏度不够。
因此，需要可靠的方法来鉴定前哨淋巴结。另外，所述的方法应该是灵敏的、安全的和便于实现的。
已经令人惊讶地发现用于在病患中鉴定前哨淋巴结的方法，包括a)对所述的病患施用包括含有外壳和气体或气体前体的微泡的制剂，所述的微泡具有直径为大约0.25-15μm的平均颗粒大小，和在120mm Hg的压力下至少为50％的压力稳定性，b)容许所述的微泡在所述的前哨淋巴结中积聚以及
c)利用满足上述标准的超声波成像来检测所述前哨淋巴结中的所述微泡。
因此，本发明提供用于在病患中鉴定前哨淋巴结的方法，包括a)对所述的病患施用包括含有外壳和气体或气体前体的微泡的制剂，所述的微泡具有直径为大约0.25-15μm的平均颗粒大小，和在120mm Hg的压力下至少为50％的压力稳定性，b)容许所述的微泡在所述的前哨淋巴结中积聚以及c)利用超声波成像来检测所述前哨淋巴结中的所述微泡。
在另外的方面，本发明涉及用于在病患中鉴定前哨淋巴结的方法，包括利用超声波成像检测先前在所述病患的所述前哨淋巴结中施用的微泡，其中所述的微泡包括外壳和气体或气体前体，具有直径为大约0.25-15μm的平均颗粒大小，和在120mm Hg的压力下至少为50％的压力稳定性。
在另一方面，本发明涉及用于鉴定前哨淋巴结的微泡，其包括外壳和气体或气体前体，具有直径为大约0.25-15μm的平均颗粒大小，和在120mm Hg的压力下至少为50％的压力稳定性。
本发明的另一方面是用于鉴定前哨淋巴结的制剂，其包括含有外壳和气体或气体前体，具有直径为大约0.25-15μm的平均颗粒大小，和在120mm Hg的压力下至少为50％的压力稳定性的微泡。
本发明的另一方面是利用包括外壳和气体或气体前体，具有直径为大约0.25-15μm的平均颗粒大小，和在120mm Hg的压力下至少为50％的压力稳定性的微泡在制备鉴定前哨淋巴结的试剂中的用途。
根据本发明的微泡在注射后是保持完整无损的。它们不只是容易被淋巴系统和前哨淋巴结吸收，而且它们也保留在前哨淋巴结中，并且保持稳定的状态，因此可提供灵敏有效的超声波检测。
在根据本发明的方法的步骤a)中，将包括含有外壳和气体或气体前体的微泡的制剂施用于病患。所述的微泡具有直径为大约0.25-15μm的平均颗粒大小和在120mm Hg mm Hg的压力下至少为50％的压力稳定性。在本发明的范围中，″病患″是指脊椎动物病患，例如鸟或哺乳动物，并且优选为人。
根据本发明的微泡和/或制剂应该是生物相容的或非生理有害的或对生物功能有害的，并且其不会导致任何程度的无法接受的毒性，包括过敏反应和疾病状态。
本发明范围中的微泡包括外壳和气体或气体前体。
在本发明的范围中，术语″外壳″可以与术语″壁″或″膜″互换地使用，并且是指围绕或限定微泡的物质。外壳可以是一个或多个分子层的形式，优选为单个的单分子层或双分子层(单层)的形式，并且单或双分子层可用来形成一个或多个单或双分子层(寡层或多层)。在多于一个单或双分子层的情况下，单或双分子层优选是同心的。适当地，外壳是从脂类、天然或合成的聚合物质、蛋白质物质、碳水化合物、糖类等或其组合来配制的。在优选的实施方案中，外壳具有总体上为负的或正的净电荷。因此，外壳可包括或由具有过量的负或正电荷的聚合材料或蛋白质材料组成，或外壳可包括或由带负或正电荷的脂类组成。备选地，外壳可包括或由利用产生总的净电荷的带负或正电荷的成分进行结合或表面改性的中性聚合的蛋白质性质的物质或脂类物质组成。优选地，外壳包括或由脂类组成，更优选地包括或由下列物质组成磷脂，例如磷脂酰胆碱，优选二月桂酰磷脂酰胆碱、双肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二十七碳烷酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、甘油二花生酰基磷脂酰胆碱或二山嵛酰基磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸，优选二棕榈酰基或二硬脂酰基磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油，优选二棕榈酰基或二硬脂酰基磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺，优选二棕榈酰基或二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇，优选二棕榈酰基或二硬脂酰基磷脂酰肌醇、磷脂酸、优选二棕榈酰基或二硬脂酰基磷脂酸、心磷脂或上述命名的化合物的任何混合物，任选地与胆甾醇、硫酸胆甾醇、胆甾烯基半琥珀酸、N-棕榈酰高半胱氨酸、棕榈酸、油酸、硬脂酸或花生酸混合。备选地，外壳也可包括或由上述脂类的氟化类似物组成。在另一优选的实施方案中，外壳包括或由共价连接的亲水聚合物例如聚乙二醇(PEG)，优选PEG2000-8000的上述脂类组成，例如二棕榈酰基或二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000。在特别优选的实施方案中，外壳包括或由50至100％的数量，更优选70至90％的数量的带负电的磷脂，更优选基于具有至少14个碳原子的脂肪酸的带负电磷脂组成，例如肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸油酸或花生酸，例如二棕榈酰基磷脂酰甘油或二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺-PEG。在另一个优选的实施方案中，外壳包括优选1至20％数量的带正电荷的合成脂类，例如常规用于递送核酸的阳离子脂类组成，例如DOTAP(N-1(-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基铵甲基硫酸盐)、DOTMA(N(1-(2，3-二油酰氧基)-丙基)-N，N，N-三甲基三甲基铵氯化物)、DOGS(二辛基癸基酰胺基甘氨酰基精胺)等。备选地，外壳包括或由脂肽，例如在WO-A-99/55383中所描述的脂肽组成，其内容在此引入作为参考。
在本发明的范围中，术语″气体前体″表示在环境温度和压力下为液体或固体，并且在相关温度，例如病患的身体温度下从液体变化到气体相的材料。当引用″气体″和″气体前体″时，可以理解气体和气体前体的混合物也落入该定义中。
适当地，根据本发明的微泡包括空气、氮气和部分氟化的或完全氟化的氟化物(全氟化的化合物)作为纯化合物或其混合物。在优选的实施方案中，微泡包括全氟化的化合物，例如全氟代丙烷、全氟代丁烷、全氟代戊烷、全氟代己烷、六氟化硫等，任选地其与氮气混合。
根据本发明的微泡具有直径为0.25-15μm，优选为0.5-7μm，特别优选为1-5μm的平均颗粒大小。
根据本发明的微泡具有在120mm Hg的压力下至少为50％的压力稳定性。在本发明的范围中，术语″至少为50％的压力稳定性″是指在暴露于120mm Hg的压力后微泡的声波衰减效果是在暴露于所述压力前的所述微泡声波衰减效果的至少50％。因此，通过比较暴露于压力前后的微泡的声波衰减效果，可获得微泡超声波成像效果的测量。可利用一个或两个中心频率为3.5和/或5.0M Hz的宽带传感器测量声波束经过微泡样品的稀释悬浮体的衰减(dB/cm)来确定声波衰减效果。通过脉冲反射技术测量传输；从传感器发射短脉冲的声波，并在从隔室的后壁反射前横穿过测量元件隔室，再由发射传感器接收。通过示波器数字化脉冲并且通过傅里叶变换法计算频谱。为了补偿传输路径和传感器特性，将波谱标准化至纯稀释剂的波谱。衰减频谱测量的详细描述和合适的系统装备在L.Hoff，Acoustic Characterization ofContrast Agents for Medical Ultrasound Imaging，Kluwer AcademicPublishers 2001，第4章，第99-109页中有描述，其公开的内容在此引入作为参考。在0℃至50℃的范围内，优选在周围环境的室温下按常规进行分析。在分析的第一步骤中，从稀释剂获得参考波谱。合适的稀释剂没有气泡并且可使用在其中微泡保持稳定的任何液体，优选稀释剂是等渗的盐水溶液，如Isoton II(Coulter Electronics Ltd.Luton，UK)，包含磷酸缓冲液和用于减少表面张力的去污剂的0.9％盐水溶液。在下一个步骤中，将微泡样品与稀释剂混合并且在环境压力下测量一个或多个衰减频谱。使微泡样品的浓度适合于微泡的大小。优选地，稀释系数是使来自微泡样品的衰减在15和20dB，即大约3dB/cm之间。这一般是指以103至104的系数稀释微泡。在下一个步骤中，将压力升高为120mm Hg并且测量一个或多个衰减频谱。为了确定本发明所述的压力稳定性，将压力前微泡样品的声波衰减效果设置为100％，因此容许计算压力后微泡样品的相对声波衰减效果。
在优选的实施方案中，根据本发明的微泡具有至少70％，更优选至少85％，最优选至少为95％的的压力稳定性。
在优选的实施方案中，根据本发明的微泡对于与机械指数至少为0.2的超声波成像相关的压力变化是稳定的。确定与超声波成像压力相关的微泡稳定性的方法在W.T.Shi等人，Ultrasound in Med.& Biol.，第26卷，2000，1-11中有描述。
适当地，根据本发明的微泡是产生回波的，即它们能够散射或反射超声波。优选地，微泡适合于返回不同于超声波脉冲发送频率的频率信号。也就是说，微泡适宜于如US 5,540.909所描述的谐波超声波成像。
根据本发明的微泡可以以多种对于本领域技术人员来说为显而易见的方式制备，包括例如振摇、涡旋、超声处理、挤出、重复冻融循环、在压力下经过限定大小的孔隙的挤出以及喷雾干燥。例如对于包括脂类的微泡，包含脂类的介质可接受任何适当的乳化形成技术，例如在存在所选择的气体或气体前体的情况下进行超声处理、高压均质化、高剪切混合。用于乳化步骤的气体不必与最终微泡中的气体相同。因此，大部分这种气体可在随后的冻干步骤期间除去，并且残留气体可通过干制品的抽真空而被除去，然后可将所需要的终产物气体以大气压或超压施用于该干制品(参见例如WO-A-97/29783，其内容在此引入作为参考)。
形成本发明所述微泡的其他方法包括形成包括蛋白质的微泡(EP-A-359246和US 4,718,433)、形成包含脂类的微泡(US 4,684,479)以及形成脂质体的微泡(US 5,088,499；US 5,123,414和WO-A-94/28874)，其内容在此引入作为参考。
根据本发明的方法，以制剂的形式，优选以液体药剂的形式施用微泡。在下文中，术语″制剂″与术语″微泡制剂″是可互换使用的。
根据本发明的制剂包括上述的微泡和一种或多种选自渗透剂、稳定剂、表面活性剂、缓冲液、粘性调节剂、乳化剂、增溶剂、悬浮剂、润湿剂、抗氧化剂、增粘剂、渗透性增强剂、盐、糖等的成分。加入这些成分来保证微泡的最大寿命和有效性。另外，可利用这些成分控制如无菌性、等渗性和生物相容性的因素。
合适的粘性调节剂包括例如，碳水化合物及其磷酸化和磺化衍生物；聚醚，优选分子量介于400和100.000范围之间，以及二和三羟基链烷烃及其聚合体，优选其分子量介于200和50.000范围之间。
合适的乳化和/或增溶剂包括，例如阿拉伯胶、胆甾醇、单硬脂酸甘油酯、羊毛脂醇、卵磷脂、单-和甘油二酯、乙醇胺、二乙醇胺油酸、油醇、泊洛沙姆、例如、泊洛沙姆188、泊洛沙姆184和泊洛沙姆181、聚氧化乙烯50硬脂酸化物、硬脂酸40聚羟氧基酯、聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯40、多山醇酯60、多山醇酯80、丙二醇双乙酸酯、单硬脂酸丙二醇酯、十二碳烷基硫酸钠、硬脂酸钠、单-月桂酸山梨聚糖酯、单-油酸山梨聚糖酯、单-棕榈酸山梨聚糖酯、单硬脂酸山梨糖醇酐酯、硬脂酸、三乙醇胺、乳化蜡等。
合适的悬浮剂和/或增粘剂包括例如，阿拉伯胶、琼脂、藻酸、单硬脂酸铝、膨润土、糊剂、卡波姆934P、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、鹿角菜胶、葡聚糖、白明胶、瓜耳豆胶、刺槐豆胶、硅酸镁铝、硅酸镁-铝、二氧化硅、沸石、果胶、聚环氧乙烷、聚烯吡酮、藻酸丙二醇酯、海藻酸钠、黄芪胶、黄原胶、a-d-葡糖酸内酯、甘油和甘露糖醇。
合适的悬浮剂例如是聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、聚丙二醇(PPG)、聚山梨酸酯等。
使张力稳定和增加的合适的张力膨松剂是例如，山梨糖醇、甘露糖醇、海藻糖、蔗糖、丙二醇和甘油。
根据本发明的制剂可进一步包括染料或生物活性剂，优选选自止痛剂、抗生素、白细胞三烯抑制剂或拮抗剂、抗组胺剂、抗炎药、抗肿瘤药、抗胆碱能药、麻醉剂、酶、类固醇、遗传物质、病毒载体、反义试剂、蛋白质和肽。
在优选的实施方案中，该制剂进一步包括促进巨噬细胞摄取的化合物，例如甘露聚糖，例如酵母聚糖、包含甘露糖的寡-和多糖、免疫球蛋白分子的Fc(可结晶片段)部份、互补成分，例如C3b或C3bi、清除受体的配体、钟状受体的配体、LRPs(LDL-受体样蛋白质)的配体、细菌性糖肽或脂多糖，例如博来霉素或内毒素的化合物。
该制剂优选是无菌的可注射剂型，如悬浮液或乳状液，其包括合适的载体，包括无毒的肠胃道外-可接受的含水或不含水溶液，以及如上所述的成分和/或化合物。优选的载体是水或盐水。
该制剂可根据已知的方法配制。在优选的实施方案中，该制剂在使用前立即配制。因此，可将干燥的微泡产物与合适的载体和一种或多种上述的化合物和成分混合。在另一优选的实施方案中，在使用前立即大量制备制剂并在制备制剂期间原位产生微泡，例如通过将合适的载体加入包含所需要气体和包括微泡外壳成分的小瓶，以及搅动该混合物。根据本发明的制剂优选在给药前杀菌和/或由无菌的原始材料制成。可通过过滤经过保留细菌的过滤器、通过掺入杀菌试剂、通过照射等实现对该制剂的灭菌。
根据本发明方法的步骤a)可以以多种非血管内的方式进行给药。肠胃外给药的方法是优选的，并且包括但不限于下列途径肌内的、经皮肤的、直接地在淋巴管中、间质地、腹膜内的、鞘内的、皮下的、滑膜内的、经过上皮的(包括透过皮肤起作用的)、真皮的、皮内的、皮下的、在肿瘤中或其发病过程中的方式等。优选地，该制剂可间质地给药、优选通过间质注射，包括皮下的和皮内的注射。就癌症患者来说，该制剂优选是接近于肿瘤注射的(肿瘤周围的)。该制剂也可通过两个或多个肠胃外模式的组合进行注射，例如肌内的、皮下的、和在发病过程中的方式，以保证其积聚在前哨淋巴结中。
该制剂正常地可在部位处并且通过保证其被运动和吸收进入淋巴循环内的方式给药。这可随待成像的系统而变化。在研究中为了容许适当排流到区域性的淋巴结，多个注射部位可能是优选的。有时，需要注射到肿瘤或活体检查部位的周围。在其它情况下，优选注射进入特定的皮鞘或关节窝。注射进入手指或脚趾的蹼状结构是用于研究外周淋巴的常见模式。该制剂可在手术前和/或手术内施用于病患以定位前哨淋巴结。根据本发明的方法容许在对目标部位施用该制剂后，可即时和实时地鉴定前哨淋巴结，而不需要有效的超前时间给药以到达前哨淋巴结。此外，可使用附加的方法来改进或变化该制剂到前哨淋巴结的转运，包括按摩注射部位或刺激流动。优选地，可按摩注射制剂的部位。
本发明的方法在定位与乳房肿瘤相关的前哨淋巴结中具有实用性。可通过注射该制剂进入肿瘤和邻近于肿瘤的皮肤下及其周围来获得腋窝、锁骨下和锁骨上的结节的图像。可在与肿瘤同侧的肋下部位进行单侧注射，然后进行两侧的淋巴结成像。通过在肿瘤附近注射该制剂，医师可了解到涉及并通向前哨淋巴结的淋巴管可能集中到腋窝、内部乳腺或锁骨上的链中，其中在每次注射后，在适当的时间进行超声波检测是很有效的。
另一个方法是将该制剂以两侧方式注射到乳房乳晕组织的周围，然后检测腋窝、内部乳腺或锁骨上的链。除经乳晕注射之外，可进行指间施用该制剂来显示腋窝的淋巴腺(参见，DeLand et al.，(1980)，Cancer Res.402997-3001)。组合该制剂的指间给药和经乳晕给药的方式，可增加证明受影响的腋窝结节中摄取增加的准确度。也可在患有乳腺癌或黑色素瘤的病患中进行造影剂的肿瘤内注射。
可以以有效量，即容许足够检测的数量施用该制剂。可以预期以液体的形式施用0.1至30ml，优选0.1至3ml，特别优选0.5至1.5ml之间的该制剂。用于给药的特别优选的体积相应于大约为5至15μl的所施用微泡的气体体积。在优选的实施方案中，进行多次注射(一般为4次)，每次使用少量的该制剂，例如对病患的每个注射部位施用0.1至3ml。可根据注射的数目和注射部位进行变化。根据本发明的方法，可以考虑该制剂的其他数量，例如大约0.005ml/kg至大约1.0ml/kg。在液体形式中制剂的数量可根据例如，给药部位、制剂的浓度、注射的数目、制剂的组成和/或其中微泡的类型和为每个个别病患所特有的特点而进行常规的变化。
在根据本发明方法的步骤b)中，容许微泡在前哨淋巴结中积聚。
在给药后，微泡不需要明显的超前时间以到达前哨淋巴结并在其中积聚。因此，在施用本发明所述的制剂后前哨淋巴结的即时和实时鉴定是可能的。一般地，根据本发明的微泡能够在少于60分钟内在前哨淋巴结中积聚。在优选的实施方案中，根据本发明的微泡在少于15分钟内，并且特别优选地少于5分钟内在前哨淋巴结中积聚。
在给药后，根据本发明的微泡具有至少5分钟，优选至少15分钟以及特别优选至少60分钟的半衰期。
因为微泡在前哨淋巴结中的积聚时间是相对短的，因而本发明所述的微泡容许在给药后不久成像，从而改善后勤保障并延长探测时间。
在根据本发明方法的步骤c)中，利用超声波成像在前哨淋巴结中检测微泡并由此鉴定前哨淋巴结。
关于超声波，预期用于本发明的超声波成像技术是本领域公知的，并且如下有描述，例如，McGahan和Goldberg，DiagnosticUltrasoundA Logical Approach(Lippincott-Raven Publishers 1998)，以及Frederick和Kremkau，Diagnostic UltrasoundPrinciples andInstruments，(W B Saunders Co.1998)。对于公开的本发明有用的特异超声波成像模式包括谐波或非线性的成像、灰度(B-模式)、多普勒(包括脉冲波、功率、流量、色彩、振幅、频谱和谐波)、3-D成像、控制门成像等。关于非线性的成像，可认识到本发明适合宽带谐波成像和脉冲反转谐波成像。
如果需要使用谐波成像，并且将超声波成像机器设置为在特定的频率下成像，提供给声传感器的输出波形式可以是视频的数字分数(例如1/2、2/3、1/3等)或视频的整数或分数倍数(例如，2、{分数(3/2)}、3、4等)。对于微泡制剂和激发频率的任何特定组合，某些谐波可能是占优势的。二次谐波是常见的实施例。由于明显的理由，那些强烈的谐波是优选的，尽管可选择其他的谐波或频率，例如为了制剂的多重成像或消除背景。另外可同时检测几个频率，包括谐波和非谐波的频率或其一些组合，以提供所需要的图像。也就是说，在优选的实施方案中除了询问频率外的任何频率都可用来提供所需要的数据。当然，本领域的技术人员将认识到可通过对造影剂制剂的简单的经验性测试来确定占优势的谐波。
为了检测由微泡制剂产生的再发射超声波的能量，可使用改进的常规超声波扫描仪系统或可商业购买的非线性成像系统。这些系统能够检测或选择由微泡制剂发射的一种或多种或所有的新频率或谐波来用于产生超声波图像。换言之，它检测不同于发射频率的频率。在WO-A-91/15999中公开了适用于谐波超声波成像的设备。然而利用能够进行宽频带宽度操作的传感器和发送给传感器的输出波形的许多常规超声波成像装置是软件控制的。因此，重新编程以发射不同于所检测波形的波形是在本领域技术人员的水平之内的。
尽管非线性的超声波成像，例如谐波超声波成像、二次谐波超声波成像或优选脉冲反转是特别优选用于所公开方法的，然而其他类型的超声波常规成像，例如B-模式(灰度成像)、F-模式(色彩流量或多普勒成像)和D-模式(频谱多普勒)也是兼容的并且在本发明的范围之内。
在B-模式成像中，超声波系统一般沿着扫瞄管道传送一系列波束，转向扫描所需要的视野。超声波系统一般以相应于传送波束的方式转向″接收波束″。从各个接收波束处返回的数据被传递到图像显示辅助系统，其从B-模式数据重建二维的灰度图像并且显示在控制台上。下行于单个管道的这种系列的脉冲可能是相同的或可能具有相等的或不相等的频率或具有接近180度的相变换(倒脉冲)以促进造影剂与周围组织的差别。
F-模式成像以类似于B-模式成像的方式实现，因为超声波系统发射并且接收一系列波束以扫描视野。然而，由于F-模式成像需要计算目标的速率，因而对各个管道发射和接收若干次。如同B-模式成像一样，使用从各个管道发射返回的数据来在控制台上重建图像。
经常伴随B-模式成像而同时使用F-模式成像。例如，从B-模式扫描重建的灰度图象可与从具有相同视野的F-模式扫描或较少地包括该视野的F-模式扫描重建的F-模式图象叠加。可利用色彩显示F-模式信息，其中用不同颜色在B-模式图像部分标明不同的正或负流量速率或紊流，在B-模式上叠加像素。因为F-模式成像只是用来提供对患者体内目标移动的定性理解，F-模式信号的超声波系统加工不必具备振幅或像素分辨力中的高度的空间或速度分辨率。然而，由于F-模式成像的重要价值是为了检测相对于体内解剖结构的流量，F-模式图像适当地以B-模式图像记录在屏幕上通常是很重要的。由于该技术依赖于从一个脉冲获得的信号与后继的脉冲的相关性，并且由于微泡可能被第一个脉冲破坏，产生的F-信号与运动是不相关的。该相关性的损失可以以多种显示形式显示，但一般以色彩显示出来。
在D-模式(频谱多普勒)探测中，超声波系统发射波束并且加工单个目标的回波信号。通过传递或接收连续波(CW)或脉冲波(PW)的超声波能来获得频谱多普勒信息。在CW多普勒探测中，例如，功率多普勒(多普勒血管造影术)超声波接收器在身体内的接收器灵敏面内连续地接收来自所有对象的回波，并且不能分离来源于任何特定范围间隔的信息。CW多普勒是最有用的，其中可通过物理放置探针或通过波束形成或两者来调节仪器的灵敏面，以只包括所需要的目标。在PW多普勒探测中，超声波仪器接收来自个别脉冲的回波，其时机意味着在产生回波的目标体内的范围间隔。一般临床医师选择预期定位的目标内的范围间隔。
在D-模式探测中，需要能够产生跨越大范围信号水平(动态范围)的详细的定量测量。通过超声波系统加工D-模式信息以显示相对于时间作图的目标的速度谱，或提供携带类似信息的声频输出。频谱多普勒探测在L.Hatle和B.Angelsen，″Doppler Ultrasound in Cardiology″(第一版，1982)和(第二版1984)中有描述。
除了B-、F-和D-模式探测之外，也存在第四个模式，被称为M-模式，但这只是以类似于B-或F-模式探测的方式来获得数据的不同显示方式。M-模式探测的技术要求并不显著地不同于B-或F-模式探测的技术要求。备选地或此外，也预期3-维的超声波，其中3-D扫描需要特殊的探针和软件来积聚和形成图像。可认识到发射的超声波能量----如果足够高----可使存在于淋巴中的微泡破裂。如上所述基于多普勒的成像方法可将此检测作为″假的多普勒″信号，从而容许对固定的或极缓慢移动的微泡进行灵敏和特异的检测(参见例如US 5,425,366)。
预期用于本发明的附加技术是本领域公知的，并且在例如Gamsu等人，Diagnostic Imaging Review(W.B.Saunders Co 1998)中有描述。
可将超声波能量用于病患的至少一部分以使靶组织成像。然后可获得病患内部范围的可见影像，以使得可确定对前哨淋巴结的鉴定。
本发明的另一个方面是用于在预先施用了包括外壳和气体或气体前体的微泡的病患中鉴定前哨淋巴结的方法，所述的微泡具有直径为大约0.25-15μm的平均颗粒大小和在120mm的压力下至少为50％的压力稳定性，该方法包括利用超声波在所述病患的所述前哨淋巴结中检测积聚的所述微泡。
根据本发明的方法不只对鉴定前哨淋巴结有用，而且可用于确定所述的前哨淋巴结是否在淋巴结构中显示缺陷或紊乱。因此，本发明也提供用于在病患中辨别良性和恶性前哨淋巴结的方法，包括a)对所述的病患施用包括含有外壳和气体或气体前体的微泡的制剂，所述的微泡具有直径为大约0.25-15μm的平均颗粒大小和在120mmHg压力下至少为50％的压力稳定性，b)容许所述的微泡在所述的前哨淋巴结中积聚，c)利用超声波检测所述前哨淋巴结中的所述微泡以及d)根据淋巴结内造影增强的模式来表征所述前哨淋巴结为良性或恶性。
Mattrey等人注意到，在前哨淋巴结超声波成像期间结节内的肿瘤不充满造影剂物质，因此留下填充缺陷。然而，一般认为需要进一步的工作加以证实。(R.Mattrey etal.，Academic Radiology9,2002，S231-S235)。现在发现在根据本发明的方法鉴定淋巴结后，由于其造影增强的不同模式有可能对它们进行分类良性的前哨淋巴结一致地出现回波产生，而恶性前哨淋巴结显示异质的增强模式，对于回声产生增大的区域和回声产生没有增大的区域都是如此。这个发现代表了主要的临床进步，因为根据本发明的方法不仅允许非侵略性地和安全地检测前哨淋巴结，而且允许非侵略性和安全地检测它们的转移性浸润。
正是通过对所获得的超声波图象进行可视评估，上述方法提供了优良的结果。可进一步通过应用图像处理方法来增加正常和浸润结节之间造影增强模式的差异而改善良性和恶性淋巴结之间进行的鉴别。现在将参考下列非限制性的实施例来对本发明进行更详细的描述。
实施例实施例1压力稳定性的测量测试包含微泡的各种超声波造影剂的压力稳定性AlbunexTM，在变性的人血清白蛋白的外壳中包含空气的微泡，其可如EP-A-359246中所公开的方法进行制备。
SonovueTM，包含包封在磷脂膜中的SF6的微泡SonazoidTM，包含包封在表面活性剂膜中的全氟丁烷的微泡a)粒径分布和体积浓度的测定通过用配备有50μm孔径，规定的计量范围为1至30μm的CoulterMultisizer Mark II(Coulter Electronics Ltd.，Luton，英国)进行Coulter计数来确定所有样品的微泡浓度和粒径分布。以64的对数间隔大小的通路进行分析。在环境室温下，在200ml Isoton II(Coulter Electronics)中稀释20μ样品，并且在分析前搅拌4分钟。作为分析反应，使用的微泡体积浓度为悬浮物体积和微泡的体积中值直径的百分数。
b)声波衰减测量如L.Hoff，Acoustic Characterization of Contrast Agents forMedical UltrasoundImaging，Kluwer Academic Publishers，2001，第4章所描述的，测量所有样品的声波衰减波谱。利用中心频率为3.5MHz的宽带传感器测量经过稀释的样品悬浮物的声波束的声波衰减。在分析前，于环境室温下将合适的样品体积均匀地分散在55ml Isoton II中。通过脉冲反射技术测量传输；从传感器发射短脉冲的声波，并在从隔室的后壁反射前横穿过测量元件隔室，再由发射传感器接收。通过示波器数字化脉冲并且通过傅里叶变换法计算频谱。为了补偿传输路径和传感器特性，将波谱标准化至纯Isoton II的波谱。将结果标准化至1∶1000的稀释度。在3.5MHz处测量大气压力下的声波衰减[dB/cm]，并将获得的测量读数设置为100％声波衰减效果。在应用120mm Hg的压力30秒后，再次测量衰减并计算压力后的声波衰减效果。报告的压力稳定性为压力后的衰减效果占压力前的衰减效果的百分数。
实施例2体内前哨淋巴结的检测和表征使用患有黑色素肿瘤的麻醉的Sinclair猪来研究前哨淋巴结检测并利用SonazoidTM表征。
a)体内前哨淋巴结的检测在原发肿瘤周围经皮内施用1ml的SonazoidTM。在轻柔按摩注射部位5分钟后，用Siemens Elegera扫描仪进行超声波扫描。在脉冲反转灰度图像上，前哨淋巴结显示强烈的造影增强，并用大功率的色彩流量成像进一步评估，其产生表示微泡破裂特征的马赛克增强模式。通过从注射部位到前哨淋巴结的淋巴通道的造影增强进一步辅助鉴定前哨淋巴结。在皮肤上标记淋巴结的位置。经肿瘤注射放射性胶体追踪剂，并且根据目前临床实践的蓝色染料来证实前哨淋巴结的位置。前哨淋巴结的造影增强呈现达到3小时。
在6只黑色素瘤Sinclair猪中应用在Example 2a中描述的方法。利用超声波、淋巴闪烁照相法和蓝色染料(镀金标准)评估31个黑色素瘤中的17个原发肿瘤。对于超声波，正确鉴定前哨淋巴结的准确度是90％，而对于淋巴闪烁照相法是81％。
b)体内前哨淋巴结的检测和表征在患有3个黑色素肿瘤的Sinclair猪中，对每个原发肿瘤周围经皮内施用1ml的SonazoidTM。在轻柔按摩注射部位5分钟后，用SiemensElegera扫描仪进行超声波扫描，并如实施例2a中所描述的方式鉴定前哨淋巴结。一个淋巴结显示均质的造影增强模式，而另2个显示多斑点的、异质的增强模式。根据超声波成象将第一个结节表征为正常，而将后者的2个表征为恶性的。淋巴结的显微组织学检查证实在第一个结节中没有肿瘤，而在后者的2个结节中存在肿瘤。病理学的评估产生病理学样本的伪彩色图谱，其与在超声波上观察到的正常淋巴组织的造影增强以及在肿瘤组织中不存在增强的造影增强模式很好地相关。
将实施例2b中描述的方法应用于6只黑色素瘤Sinclair猪。总共研究了31个淋巴结。在淋巴结中正确地检测存在或没有转移性的黑色素肿瘤的准确度是86％。在造影增强的超声波和病理学之间没有统计学上的显著性差异。
实施例3AlbunexTM和SonazoidTM的比较如实施例1所描述的，在麻醉的狗的后肢中指间注射1ml的AlbunexTM。轻柔地按摩注射部位5分钟。用装备有以脉冲反转方式操作的L12-5传感器的ATL HDI5000扫描仪对排流的淋巴结成像(Innpopliteus)。分别在注射5和15分钟后的成像中都没有看到造影增强。
在注射AlbunexTM20分钟后，在与实施例3a所描述的相同成像步骤后，如实施例1所描述的方式，在相同的后肢中指间注射1ml的SonazoidTM。在注射5分钟后的成像中看到强烈的造影增强并且在注射15分钟后在成像中保持增强作用。峰值的造影增强大于7dB。
权利要求
1.一种用于在病患中鉴定前哨淋巴结的方法，包括a)对所述的病患施用包括含有外壳和气体或气体前体的微泡的制剂，所述微泡具有直径为大约0.25-15/μm的平均颗粒大小，和在120mmHg的压力下至少为50％的压力稳定性，b)容许所述的微泡在所述的前哨淋巴结中积聚以及c)利用超声波检测所述前哨淋巴结中的所述微泡。
2.根据权利要求1的方法，其中所述的制剂以间质方式，优选经皮肤的方式给药。
3.根据权利要求1和2的方法，其中所述外壳具有总体上为负或正的净电荷，优选具有总体上为负的净电荷。
4.根据权利要求1至3的方法，其中所述外壳包括脂类，优选磷脂。
5.根据权利要求1至4的方法，其中所述外壳包括数量为50％至100％的带负电荷的磷脂。
6.根据权利要求1至5的方法，其中所述微泡对于与机械指数至少为0.2的超声波成像相关的压力变化是稳定的。
7.根据权利要求1至6的方法，其中所述的制剂进一步包括刺激巨噬细胞的化合物。
8.用于鉴定前哨淋巴结的微泡，其包括外壳和气体或气体前体，并且具有直径为大约0.25-15/μm的平均颗粒大小，其中所述的微泡具有在120mmHg的压力下至少为50％的压力稳定性。
9.根据权利要求8的微泡，其中所述的外壳具有总体上为负的净电荷。
10.根据权利要求8和9的微泡，其中所述的外壳包括脂类，优选磷脂。
11.根据权利要求8至10的微泡，其中所述的外壳包括数量为50％至100％的带负电荷的磷脂。
12.用于鉴定前哨淋巴结的制剂，包括权利要求8至11所述的微泡。
13.根据权利要求12的制剂，进一步包括刺激巨噬细胞的化合物。
14.根据权利要求8至11的微泡在制备用于鉴定前哨淋巴结的制剂中的用途。
全文摘要
本发明涉及用于鉴定前哨淋巴结的方法以及所述方法中使用的化合物和制剂。
文档编号A61K9/50GK1694732SQ200380100791
公开日2005年11月9日 申请日期2003年10月1日 优先权日2002年10月3日
发明者A·托内斯, J·奥斯滕森, H·拉斯穆森, L·霍夫 申请人:安盛药业有限公司