专利名称：包含至少两个牛痘ati启动子的重组痘病毒的制作方法
技术领域：
本发明涉及在病毒基因组中包含至少两个表达盒的重组痘病毒(poxvirus)，每个表达盒包含牛痘ATI启动子或其衍生物以及编码序列，其中该编码序列的表达由所述启动子或其衍生物调节。该病毒可以用作疫苗或作为药物组合物的一部分。
背景技术：
重组痘病毒被广泛地用于在受感染细胞中表达外来抗原。此外，重组痘病毒作为很有前景的疫苗，目前被测试用来诱导针对痘病毒载体表达的外来抗原的免疫反应。最普遍的不是禽痘病毒(avipoxviruse)就是痘苗病毒(vaccinia viruse)。US 5,736,368和US 6,051,410公开了表达HIV抗原和蛋白质的重组痘苗病毒株Wyeth。US 5,747,324公开了表达慢病毒基因的重组痘苗病毒株NYCBH。EP 0 243 029公开了表达人逆转录病毒基因的重组痘苗病毒株Western Reserve。US 5,736,368和US 6,051,410公开了在病毒基因组中包含HIV基因的家禽痘病毒(fowlpoxvirus)。
为了诱导有效的免疫反应，最好不要仅表达将要诱导的免疫反应针对的病原体的单个蛋白质。而优选要表达所述病原体的尽可能多的不同蛋白质和表位以获得针对所述病原体的广泛的和有效的免疫。因而，如果打算使用痘病毒作为疫苗接种的载体，有利的是将几个不同的表达盒插入同一痘病毒的基因组中。US 5,736,368描述了构建携带HIV-1 env基因和HIV-1 gag·pol基因的表达盒的重组痘病毒。为了表达由不同的表达盒编码的蛋白质使用了不同的启动子，即痘苗病毒D1启动子和40K启动子。这种策略的缺点是不同启动子的活性不相同，导致不同表达盒的蛋白质的表达水平不同。
如果在痘病毒基因组中不同表达盒中的启动子是相同的，则可以获得几乎相同的表达水平。然而，这一策略的缺点是在同源/同一启动子序列间存在发生不期望的重组事件的风险。实际上，Howley等(Gene(1996)172，233-237)已经表明可以制出在病毒基因组的不同的位置包含三个p7.5启动子的重组痘苗病毒；然而在同源启动子序列之间发生的重组导致产生了一个该重组痘病毒的混合基因组群。如果打算使用重组痘病毒用于疫苗接种，特别是用于人的疫苗接种，这种反映了病毒基因组不稳定性的混合的和不确定的基因组群是不可接受的。
发明目的本发明的目的是提供携带至少两个表达盒的稳定的重组痘病毒，优选的用于携带不是痘病毒基因组的天然部分的基因，其中应当能以相似的数量生产由所述至少两个不同表达盒编码的蛋白质。
发明的详细说明通过提供一种重组痘病毒已经达到了这一目的，该重组痘病毒在病毒基因组中包含至少两个表达盒，每个表达盒包含牛痘ATI启动子或其衍生物以及编码序列，其中该编码序列的表达由所述启动子或其衍生物调节。
本发明人表明，包含两个或多个ATI启动子的拷贝的痘病毒竟预料不到的稳定；已经证实在同源乃至相同的ATI启动子序列之间没有可检测的重组事件发生。这与在病毒基因组中包含两个或多个p7.5启动子的痘苗病毒的结果相反。
根据本发明，痘病毒可以是任何痘病毒，其中基因的表达应由ATI启动子或其衍生物调节。因而，痘病毒可以是脊索痘病毒亚科(Chordopoxvirinae)和昆虫痘病亚科毒(Entomopoxvirinae)的任一病毒(见病毒学领域，第三版，Lippincott-Raven出版社，费城，美国，第83章，ISBN 0-7817-0253-4)。如果重组痘病毒用于在哺乳动物，包括人体内表达基因，来自脊索痘病毒亚科的病毒是特别优选的。属于脊索痘病毒亚科的特别优选的属是正痘病毒属(Orthopoxvirus)、副痘病毒属(Parapoxvirus)、禽痘病毒属(Avipoxvirus)，山羊痘病毒属(Capripoxvirus)、野兔痘病毒属(Leporipoxvirus)和猪痘病毒属(Suipoxvirus)。最优选的是正痘病毒属和禽痘病毒属。禽痘病毒的例子有金丝雀痘病毒(canarypoxvirus)和家禽痘病毒(fowlpoxvirus)。正痘病毒的一个例子是痘苗病毒。根据本发明可使用的痘苗病毒株可以是任何痘苗病毒株，例如Copenhagen、Temple of Heaven、Wyeth、Western Reserve、Elstree、NYCBH痘苗病毒株等。特别优选的是经过改良的痘苗病毒安卡拉株(ModifiedVaccinia Ankara，MVA)。通过在鸡胚成纤维细胞上对痘苗病毒的安卡拉株(CVA)连续传代516代产生了MVA(参见Mayr，A.等，Infection 3，6-14)。由于长期的传代，获得的MVA病毒删除了大约31kb的基因组序列，并因此被描述为宿主细胞高度局限于鸟类细胞(Meyer，H.等，J.Gen.Virol.72，1031-1038)。已经表明，在各种动物模型中，获得的MVA是明显无毒力的(Mayr，A.& Danner，K.Dev.Biol.Stand.41225-34)。另外，该MVA株已经在临床试验中被测试作为针对人天花病免疫的疫苗(Mayretal.，Zbl.Bakt.Hyg.I，Abt.Org.B 167，375-390 1987]，Stickl等，Dtsch.med.Wschr.99，2386-2392)。
根据本发明可以使用任何MVA株。根据本发明使用的、并按照布达佩斯条约的要求保藏的MVA病毒株的例子是MVA 572株和MVA 575株，保藏在索尔兹伯里市(英国)的欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)，保藏号分别为ECACC V94012707和ECACC V00120707，以及MVA-BN株，保藏号为ECACC V00083008。
最优选的MVA株是MVA-BN或其衍生物。MVA-BN的特征、容许评价MVA株是否是MVA-BN或其衍生物的生物鉴定法和容许获得MVA-BN或其衍生物的方法的说明，在WO02/42480中公开。将该申请中的内容引用到本申请中作为参考。
如果将病毒用于接种或治疗包括人的动物，一般的优选使用对包括人的动物无害的病毒。对于人特别安全的痘病毒是不同的痘苗病毒株例如MVA，和禽痘病毒例如家禽痘病毒和金丝雀痘病毒。
为了繁殖痘病毒，用病毒感染真核细胞。真核细胞是那些对各自的痘病毒的感染敏感的细胞，能容许传染性病毒的复制和生产。这些用于每种痘病毒种类的细胞是本领域的技术人员熟知的。对于MVA这类细胞的一个例子是鸡胚成纤维细胞(CEF)和BHK细胞(Drexler I.，Heller K.，Wahren B.，Erfle V.and Sutter G.，J.Gen.Virol.(1998)，79，347-352)。CEF细胞可以在本领域的技术人员熟知的条件下培养。优选的，CEF细胞被培养在固定的(stationary)烧瓶或滚动瓶的无血清培养基中。优选的在37±2℃培养48到96小时。用于感染时优选以感染复数(MOI)0.05到1 TCID50使用MVA，优选的在37±2℃孵化48到72小时。
痘苗病毒A型包涵体蛋白基因的启动子(promoter of the cowpox A-typeinclusion protein gene)(ATI启动子)的序列是本领域的技术人员熟知的。对此可参考Genebank，登记号码为D00319。优选的ATI启动子序列如SEQ IDNO1所示，如下5′GTTTT GAATA AAATT TTTTT ATAAT AAAT3′根据本发明可以使用SEQ ID NO1所示的ATI启动子或使用该ATI启动子的衍生物，其可以是根据SEQ ID NO1的序列的子序列。术语“根据SEQ ID NO1的序列的子序列”指的是仍然具有启动子的活性，特别是痘苗病毒晚期启动子活性的SEQ ID NO1的序列的较短的片段。典型的SEQID NO1的序列的片段具有SEQ ID NO1的序列的至少10个核苷酸，更优选的至少15个核苷酸，进一步优选的至少20个核苷酸，最优选的至少25个核苷酸。子序列优选的可包含SEQ ID NO1的核苷酸25到29，例如位于SEQ ID NO1的3’端的序列5’-TAAAT-3’。子序列还可包含SEQ ID NO1的核苷酸22到29，例如位于SEQ ID NO1的3’端的序列5’-TAATAAAT-3’。
启动子可以以这样的方式插入编码序列的上游，从而SEQ ID NO1的核苷酸28到29(在上述序列中下划线标示)成为翻译起始密码子5’-ATG-3’的一部分。做为选择，启动子也可被几个核苷酸同翻译起始密码子隔开。在根据SEQ ID NO1的启动子的3’端和起始密码子5’ATG3’的A之间的间隔区优选的小于100个核苷酸，更优选的小于50个核苷酸，进一步优选的小于25个核苷酸。然而，只要该启动子仍然能控制位于启动子下游的编码序列的表达，间隔区可以更长。
该ATI启动子的衍生物还可以是具有对SEQ ID NO1的序列或其子序列进行的一个或多个核苷酸替换、删除和/或插入的序列，其中所述衍生物仍然具有启动子的活性，特别是痘苗病毒晚期启动子的活性。具有一个或多个核苷酸替换的序列是指SEQ ID NO1的序列的一个或多个核苷酸被不同的核苷酸替换的序列。具有一个或多个核苷酸插入的序列是指一个或多个核苷酸被插入到SEQ ID NO1的一个或多个位置的序列。具有一个或多个核苷酸删除的序列是指SEQ ID NO1的序列的一个或多个核苷酸在一个或多个位置被删除的序列。在SEQ ID NO1的衍生物中删除、替换和插入可组合在一个序列中。优选的该衍生物在与SEQ ID NO1的序列对比时具有至少40％、更优选的至少60％、进一步优选的至少80％、最优选的至少90％的同源性。根据最优选的实施方式，在SEQ ID NO1的序列中不超过6个核苷酸、进一步优选的不超过3个核苷酸被替换、删除和/或插入。
特别地，或许更好的是保持SEQ ID NO1的核苷酸25到29，即启动子中的序列5′-TAAAT-3′以获得最大的启动子活性。同样或许更好的是保持SEQID NO1的核苷酸22到29，即启动子中的序列5′-TAATAAAT-3′。
以上涉及ATI启动子或其子序列的位置的说明也适用于上述定义的在SEQ ID NO1或其子序列中具有一个或多个核苷酸的替换、删除和/或插入的序列。
大量的先有技术文件容许本领域的技术人员预测SEQ ID NO1的哪些衍生物仍然具有痘病毒启动子，特别是痘苗病毒晚期启动子的生物活性。关于这一点可参考Chakrarbarti等，Biotechniques(1997)23，1094-1097，以及Davison和Moss，J.Mol.Biol.(1989)210，771-784。此外，一个片段是否仍然具有痘病毒启动子，特别是痘苗病毒晚期启动子的活性可以容易地由本领域的技术人员检验。特别地，序列衍生物可被克隆到质粒结构中的报告基因的上游。所述结构可被转化到真核细胞或细胞系中，例如已用痘病毒感染的CEF或BHK细胞。用于感染的痘病毒优选的是来自同一属的痘病毒，更优选的是与欲将启动子插入其基因组的痘病毒相同的痘病毒。然后确定报告基因的表达并与按照SEQ ID NO1的启动子控制的报告基因的表达进行对比。按照本发明的衍生物优选的是在所述测试系统中与SEQ ID NO1的启动子序列的活性相比具有至少10％、优选的至少30％、更优选的至少50％、进一步优选的至少70％、最优选的至少90％的启动子活性的衍生物。那些与SEQ ID NO1相比具有更高启动子活性的SEQ ID NO1的衍生物也包含在本根据本发明重组痘病毒包含至少两个表达盒，每个表达盒包含一个ATI启动子或其衍生物。换句话说重组痘病毒的基因组可包含两个或更多ATI启动子或其衍生物。在病毒基因组中的ATI启动子可以是相同的或不同的。因而，可以是所有的ATI启动子都具有SEQ ID NO1的序列。也可以是所有的ATI启动子都是SEQ ID NO1序列的同样的衍生物。做为选择，一个或多个ATI启动子可以具有SEQ ID NO1的序列，并且在同样的痘病毒基因组中的一个或多个ATI启动子可以是SEQ ID NO1序列的衍生物。如果这种痘病毒基因组包含两个或更多ATI启动子的衍生物，则这些衍生物可以是相同的或不同的。进一步可选择的是在痘病毒基因组中的所有ATI启动子都是SEQ IDNO1序列的不同的衍生物。
一般的说本发明涉及在痘病毒基因组中包含至少两个ATI启动子或其衍生物的重组痘病毒。因而，该病毒基因组可在其病毒基因组中包含，例如两个、三个、四个、五个、六个或更多ATI启动子或其衍生物。
ATI启动子或其衍生物通常是表达盒的一部分，每个表达盒包含牛痘ATI启动子或其衍生物以及编码序列，编码序列的表达由所述启动子调节。编码序列可以是任何序列，其表达应当由ATI启动子或其衍生物控制。
作为一种选择，在痘病毒基因组中至少一个ATI启动子可被用于表达已经是痘病毒基因组的一部分的基因。这种基因可以是病毒基因组的天然的部分或是已被插入到痘病毒基因组中的外源基因。在这些例子中ATI启动子被插入到痘病毒基因组中的所述基因的上游，该基因的表达将由该ATI启动子控制。
做为选择的或另外的，至少一个ATI启动子或其衍生物可以是被导入痘病毒基因组中的表达盒的一部分。该包含ATI启动子或其衍生物以及编码序列的表达盒可被插入到病毒基因组的任何适当的位置。不限于下述例子，适当的插入位点可以选自(i)非必需基因例如TK基因，(ii)病毒的复制所必需的基因，如果所述基因的功能由用来繁殖该病毒的细胞补足；(iii)痘病毒基因组的基因间隔区，其中术语“基因间隔区”优选的指位于两个相邻基因之间的那些病毒基因组部分，其不包含编码序列；(iv)痘病毒基因组的自然发生删除的位点。具有自然发生删除的位点的病毒基因组的例子是MVA的基因组，相对于痘苗病毒株Copenhagen的基因组，MVA的基因组中某些区域被删除了。
如上所指出的，插入位点不局限于这些优选的插入位点，因为在本发明的范围中，只要有可能获得能在至少一个细胞培养系统中扩增和繁殖的重组体，表达盒可被插入到病毒基因组中的任何位置，例如在使用MVA及其它痘病毒例如通常的痘苗病毒和禽痘病毒的情况下，所述细胞培养系统例如是鸡胚成纤维细胞(CEF细胞)。
不同的表达盒/ATI启动子或其衍生物可被插入到痘病毒基因组中的不同插入位点。
由于种种理由，或许优选的是将两个或更多表达盒插入到痘病毒基因组的相同的插入位点中。然而，在这种情况下必须排除在不同的表达盒之间发生的同源重组。同源重组将导致部分表达盒被删除的重组病毒。因为没有痘病毒载体基因组的重要部分的删除，所获得的重组体仍然是能生存的。因而，对于在相同的插入位点维持了两个或更多表达盒的病毒是没有选择的。为了避免这种非期望的重组事件，如果两个或更多表达盒被插入到相同的插入位点，使用不同的启动子。根据本发明，由于在表达盒中的启动子间不发生同源重组，现在可以将两个或更多各自包含ATI启动子或其衍生物的表达盒插入到相同的插入位点。
因而，根据优选的方案，如果不是所有的，至少两个表达盒插入到痘病毒基因组中的相同的插入位点。在这种情况下，不同的表达盒直接相邻，在不同的表达盒之间没有痘病毒的序列或至少仅有相当短的痘病毒序列。
构建重组痘病毒所必需的方法是本领域的技术人员公知的。举例来说，表达盒和/或ATI启动子或其衍生物可能通过同源重组插入痘病毒基因组中。为此将核酸转染到感受细胞系中，其中该核酸包含表达盒和/或ATI启动子或其衍生物，其侧翼是核苷酸延伸片段(stretches)，该片段与表达盒和/或ATI启动子或其衍生物将插入的痘病毒基因组区域同源。对于MVA，容许细胞是CEF细胞和BHK细胞。用痘病毒感染该细胞，在受感染细胞中在所述核酸和病毒基因组之间发生同源重组。做为选择，也可以先用痘病毒感染该细胞，然后将核酸转染到受感染细胞中。再在该细胞中发生重组。然后通过先有技术中已知的方法选择重组痘病毒。重组痘病毒的构建不局限于这种特定方法。作为替代，为此可以使用本领域技术人员所知的任何合适的方法。
重组痘病毒中的ATI启动子可用来控制任何编码序列的表达。编码序列优选的可编码至少一个抗原表位或抗原。在这种情况下，重组痘病毒可用于在感染了生物体例如包括人的哺乳动物的细胞之后表达所述抗原。所述抗原/表位的表达可在生物体中引发免疫反应，可产生该生物体对抗病原体(agent)的疫苗接种，所述抗原/表位来源于该病原体。更具体地说该表位/抗原可以是更大的氨基酸序列例如多表位、肽或蛋白的一部分。这种多表位、肽或蛋白的例子可以是来源于(i)病毒，例如HIV、HTLV、疱疹病毒、登革病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、肝炎病毒等，(ii)细菌，(iii)真菌的多表位、肽或蛋白。
从不同的表达盒表达的蛋白质、肽或表位可以来源于相同的病原体，例如病毒、细菌或真菌。举例来说从表达盒表达的所有产物都可以是HIV蛋白。如果所有产物都来源于相同的病原体，有可能诱导出针对所述病原体的很广泛的免疫反应。做为选择，从不同的表达盒表达的蛋白、肽或表位也可能来源于不同的病原体。举例来说，来源于痘病毒基因组中的表达盒的产物来源于不同的病毒，例如腮腺炎、麻疹和风疹病毒。依据这种方案有可能使用一个重组痘病毒来诱导针对几个病原体的免疫反应。
做为选择，至少一个编码序列可编码治疗化合物例如白细胞介素、干扰素、核糖酶、酶等。
可以根据本领域技术人员的知识将根据本发明的重组痘病毒施予动物或人体。因而，根据本发明的重组痘病毒作为药剂(例如药物组合物)或疫苗是有用的。
该药物组合物或疫苗除包括重组痘病毒外通常可包括一个或多个药学上可接受的和/或认可的载体、添加剂、抗生素、防腐剂、佐剂、稀释剂和/或稳定剂。这种辅助物质可以是水、盐水、甘油、乙醇、湿润或乳化剂、pH缓冲剂等。适合的载体通常是大的、代谢缓慢的分子例如蛋白、多聚糖、聚乳酸、聚乙二醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、脂质聚合体等。
为制备药物组合物或疫苗，将重组痘病毒转变为生理上可接受的形式。这可根据用于预防天花接种的痘病毒疫苗制备的经验(如Stickl，H.等Dtsch.med.Wschr.99，2386-2392中所述)来进行。例如，如果痘病毒是MVA，可将纯化的病毒在-80℃以5×108TCID50/ml的滴度配制在约10mMTris、140mM NaCl pH7.4中保存。为制备疫苗注射剂(Vaccine shot)，例如101-109粒根据本发明的重组病毒在存在2％蛋白胨和1％人白蛋白的磷酸盐缓冲盐水中，在安瓿瓶中，优选的在玻璃安瓿瓶中冻干。做为选择，疫苗注射剂可通过在一配方中逐步地冻干病毒来生产。这个配方可包含额外的添加剂例如甘露醇、葡聚糖、糖、甘氨酸、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮或其它添加剂例如抗氧化剂或惰性气体、稳定剂或适合于体内施用的重组蛋白(例如人血清白蛋白)。适合于重组MVA的冻干的典型配方包含10mM Tris-缓冲液、140mM NaCl、18.9g/l Dextran(MW 36.000-40.000)、45g/l蔗糖、0.108g/l L-谷氨酸单钾盐一水合物、pH 7.4。然后密封玻璃安瓿瓶，可在4℃至室温保存数月。然而，只要不存在需求，安瓿瓶优选的在低于-20℃的温度保存。
为了疫苗接种或治疗，可将冻干物溶于0.1至0.5ml水溶液中，优选水、生理盐水或Tris缓冲液，既可全身地也可局部地施用，即肠胃外的、肌肉的或有经验的医师所知的任何其它施用途径。施用的方式、剂量和施用次数可由本领域的技术人员以已知的方式进行优化。
因而，根据相关的方案，本发明涉及在活的动物体包括人体内影响、优选诱导免疫反应的方法，包括向需治疗的动物或人施用根据本发明的病毒、组合物或疫苗。如果重组痘病毒是重组MVA，疫苗注射通常包含至少102、优选的至少104、更优选的至少106、进一步优选的108至109TCID50(组织培养感染剂量)的病毒。
发明进一步涉及将至少两个编码序列导入靶细胞的方法，包括用根据本发明的病毒感染靶细胞。靶细胞可以是病毒能在其中复制的细胞或能被重组病毒感染但病毒不能在其中复制的细胞，例如对重组MVA而言各种类型的人细胞。
发明进一步涉及生产肽、蛋白和/或病毒的方法，包括用根据本发明的重组病毒感染宿主细胞，然后在适宜条件下培养受感染的宿主细胞，再然后分离和/或富集所述宿主细胞生产的肽和/或蛋白和/或病毒。如果打算生产、即扩增根据本发明的病毒，所述细胞必需是病毒能在其中复制的细胞，例如对重组MVA而言是CEF或BHK细胞。如果打算生产由病毒编码的肽/蛋白，优选的由编码序列编码的蛋白/肽，其表达由ATI启动子或其衍生物控制，则所述细胞可以是任何能被重组病毒感染并容许痘病毒编码的蛋白/肽表达的细胞。
本发明进一步涉及用根据本发明的病毒感染的细胞。
附图的简要说明附
图1和附图2重组载体pBN70(附图1)和pBN71(附图2)的图解介绍。
F1A137L＝插入区的侧翼1；F2A137L＝插入区的侧翼2；F2rpt＝侧翼2的重复；prATl＝ATI启动子；pr7.5＝p7.5启动子；GUS＝GUS编码区；NS1＝NS1编码区；NPTII＝新霉素抗性；IRES＝内核糖体进入位点；EGFP＝增强的绿色荧光蛋白编码区；AmpR＝氨苄青霉素抗性基因。
附图3用于确定在用MVA-mBN30(附图3A)或MVA-mBN31(附图3B)感染的细胞中NS1基因的表达的RT-PCR分析。在所有进行了PCR的情况中引物都是特异于NS1基因的。
A)M分子量标记物；第1泳道用质粒pBN70分析(阳性对照)；第2泳道无添加的核酸的分析(阴性对照)；第3泳道用从MVA-mBN30感染的BHK细胞中分离的RNA不添加反转录酶进行的PCR；第4泳道用从MVA-mBN30感染的BHK细胞分离的RNA进行的RT-PCR；第5泳道用从MVA-BN感染的BHK细胞中分离的RNA不添加反转录酶进行的PCR；第6泳道用从MVA-BN感染的BHK细胞中分离的RNA进行的RT-PCR。
B)M分子量标记物；第1泳道用来自被mBN31感染的细胞的RNA进行的RT-PCR；第2泳道用来自被在基因组中包含NS1基因的不同的重组MVA感染的细胞的RNA进行的RT-PCR；第3泳道用来自MVA-BN感染的细胞的RNA进行的RT-PCR；第4泳道用来自被mBN31感染的细胞的RNA进行的PCR(未添加反转录酶)；第5泳道用来自被在基因组中包含NS1基因的不同的重组MVA感染的细胞的RNA进行的PCR(未添加反转录酶)；第6泳道用来自MVA-BN感染的细胞的RNA进行的PCR(未添加反转录酶)；第7泳道用质粒pBN71进行的分析(阳性对照)；第8泳道未添加核酸进行的分析(阴性对照)。
实施例以下的实施例将进一步说明本发明。本领域的技术人员最好应当理解的是，提供的实施例无论如何也不能被理解为将本发明提供的技术的适用性限制到该实施例上。
由牛痘ATI启动子调节的两个外源基因稳定的插入MVA基因组的单个位点中这个实施例的目的是表明都由ATI启动子调控的两个外源基因的插入是稳定的。
概述以下实施例表明了在病毒基因组中包含两个ATI启动子拷贝的重组MVA的稳定性。为此将牛痘ATI启动子分别与GUS基因(大肠杆菌β-葡糖醛酸酶)和登革病毒(Dengue Virus)的非结构(NS)1基因融合。
为了对照，GUS基因还与自然发生的痘苗病毒pr7.5启动子融合。ATI启动子-NS1基因表达盒以及ATI启动子-GUS基因表达盒或p7.5启动子-GUS基因表达盒都被插入到包含与MVA基因组同源的序列的重组载体中。(附图1和2)。在获得的质粒pBN70(ATI启动子-NS1基因表达盒和ATI启动子-GUS基因表达盒)和pBN71(ATI启动子-NS1基因表达盒和p7.5启动子-GUS基因表达盒)中，表达盒的侧翼由与表达盒将插入其中的MVA基因组中的序列同源的序列填充。该同源序列指导表达盒插入到MVA基因组的基因间隔区(IGR)136-137。分别用MVA-BN感染、以及用pBN70和pBN71感染CEF细胞。在细胞中MVA基因组和重组质粒间发生的同源重组产生了重组的MVA基因组。对重组体进行几轮噬菌斑提纯，在CEF细胞中传代(包括噬菌斑提纯的传代总数20)。检测重组体的稳定性、插入基因的表达和包含两个不同的组别的双启动子的重组MVA结构的序列。序列、PCR和功能性检测的分析显示重组片段被正确地插入，并且即使当ATI启动子在基因组中被插入两次时这种插入也是稳定和有功能的。
材料和设备初始CEF细胞；滴度为108TCID50/ml的MVA-BN；Effectene转染试剂盒(Qiagen)；VP-SFM细胞培养基(Gibco BRL)；G418(Gibco BRL)；DNANucleospin Blood快速纯化试剂盒(Macherey Nagel)；Triple Master DNA聚合酶(Eppendorf)；Oligos(MWG)；测序DCTS Quickstart试剂盒(BeckmanCoulter)。
方法重组载体pBN70和pBN71(附图1和2)按照本领域技术人员所知的标准方案克隆。
每一转染反应在6孔板的孔中接种5×105CEF细胞，并在VP-SFM中37℃、5％ CO2维持过夜。在每孔0.5ml的VP-SFM中用MVA-BN(moi 1.0)感染细胞，在摇动器上室温孵化1h。线性化pBN70和71的转染按厂家说明(Qiagen)中描述的方式执行。
获得的重组病毒在选择条件(G418，300μg/ml)下传代几次，分离出单个噬菌斑，进行扩增和分析直到产生纯的克隆。最后将分析出的病毒传代20次。
结果1.重组病毒的构建创建出在两个不同的启动子组合(ATI-NS1/ATI-GUS或ATI-NS1/p7.5-GUS)的控制下表达NS1序列和GUS序列的两个重组MVA。这些序列以及选择表达盒IRES/EGFP(内部核糖体进入位点/增强的绿色荧光蛋白)根据本领域技术人员公知的方法被插入到MVA基因组的136-137 IGR(MVA基因组的ORFA136L和A137L之间的基因间隔区)。在选择条件下纯化病毒和传代20次。两个重组MVA都被扩增到粗制品储备规模(crude stock scale)(1×175cm2瓶)。在这个实施例中的ATI启动子序列相应于SEQ ID NO1的序列。
2.EGFP编码区的表达为了确定在IGR 136-137间插入的试验基因的功能，在传代期间观察荧光。如果在这个位点插入的基因是没有功能的，则应检测不到EGFP的表达。MVA-mBN30和MVA-mBN31感染的BHK清楚地显示了在136-137 IGR间插入的基因已被转录。
3.MVA-mBN30和MVA-mBN31的136-137 IGR的PCR分析为了排除在IGR 136-137位点中的空载体污染以及检查病毒基因组是否包含期待大小的插入物，进行了PCR分析。为此，使用了与插入位点侧翼的区域结合的引物。对于与侧翼1和2位点结合的引物，期待的PCR带是(i)重组MVA-mBN30为3.4kb，(ii)重组MVA-mBN31是3.5kb以及(iii)空载体MVA-BN是212bp。对于MVA-mBN30和MVA-mBN31发现了期待大小的带，表明重组体具有期待的基因组结构。在任何检验的MVA-mBN30或MVA-mBN31 DNA制备物中都没有发现野生型病毒。进一步的，空的载体对照MVA-BN(空载体)在两个重组MVA中都产生了期待的212bp产物。在阴性对照中未检测到信号。因而，经过选择压力获得了从空载体MVA-BN中对重组载体的有效选择和分离。
4.136-137区的测序测序结果显示对于mBN31和mBN30，启动子和GUS被插入IGR 136-137位点而没有碱基对改变。对于mBN30中的NS1也没有发现碱基对序列的改变。在mBN31中NS1的碱基对序列中具有四个点突变(位点1315C代替G，位点1582G代替A，位点1961A代替C和位点1963G代替T)。它们中的两个(位置1582和1963)没有导致氨基酸的变化。不考虑这些次要的序列偏差，测序结果清楚的表明两个重组体mBN31和mBN30都包含了整个NS1序列。此外，从测序数据可以断定，NS1基因被稳定地包含在含有两个ATI启动子的重组mBN30中。该实验表明了重组体的稳定性，尽管有两个相同的ATI启动子序列被包括在病毒基因组中。
5.对重组体mBN30和mBN31中NS1基因和GUS基因表达的分析以上描述的PCR和序列数据已经显示NS1基因和GUS基因被包含在重组体MVA-mBN30和31的基因组中。为了检测这些基因是否从病毒基因组中表达，进行NS1区域的RT-PCR和功能检测以及生产的GUS蛋白的定量。
5.1 NS1区域的RT PCR进行这个实验是为了证明在IGR 136-137位点间都包含插入的NS1基因的重组MVA-mBN30和mBN31，都能功能性地将NS1表达为mRNA。分别用病毒MVA-mBN30和mBN31感染BHK细胞。从这些细胞中分离RNA，用于RT-PCR分析。结果清楚地表明在感染的BHK细胞中从两个病毒中都表达出NS1。病毒DNA的污染可以被排除，因为当省略了反转录步骤时没有检测到PCR信号。水对照是阴性的，对于两个病毒的质粒阳性对照都可以看到清晰的PCR带(附图3)。
5.2 GUS活性的测量为了表明在传代20轮后插入到MVA-mBN30和mBN31中的GUS的表达，定量地检测GUS活性。表1清楚的显示在两个重组病毒中都表达了GUS，而在无插入的MVA-BN中没有GUS表达可以被测量到。
表1在20次传代后MVA mBN30、MVA-mBN31和MVA-BN中GUS活性的测量。MVA-mBN30和MVA-mBN31总共传代20次。用两个重组病毒感染细胞，24小时后在溶菌缓冲液中收获病毒。根据本领域技术人员所知的方法测量GUS活性。活性值通过415nm处的吸收来测量。＜0.05和＞2.0的值在范围之外。
接受标准IGR 136-137的PCR分析在阴性对照泳道中不应观察到条带，在阳性对照中应该仅观察到一个期待大小的条带。对于MVA-BN 212bp片段是预期的。
136-137区的测序和PCR用引物对病毒靶DNA的PCR扩增应当显示期待长度的单个片段。序列的组装应当产生一个表现出期待长度的双链DNA片段的连续的序列。如果在这个区域没有发生突变，短的单链延伸片段是可接受的。另外，由于PCR扩增产物的异质特性，所述连续的序列的末端可容许仅是单链的。测试的样品的序列应当显示与参考序列或各自的数据库序列有＞/＝97％同源性。
NS1的RT-PCR在阴性对照泳道中不应观察到条带，在阳性对照中应该仅观察到一个期待大小的条带。对于pBN71 909bp片段是预期的，对于pBN70 907bp片段是预期的。
结论在选择条件下的20次传代之后，136-137 IGR的PCR分析显示对于MVA-mBN31(ATI-NS1/p7.5-GUS)或MVA-mBN30(ATI-NS1/ATI-GUS)没有空载体污染。对于MVA-mBN30，PCR显示在ATI位点没有发生同源重组。通过进行(1)最终PCR以证明储存物(stock)是无空载体的，即使当两个基因在同一IGR位点相同的启动子条件下，两个基因仍然都被插入(对于mBN30)，(2)区域测序以证明未改变的碱基序列，(3)定量的GUS分析检测GUS的功能性表达和NS1的RT-PCR，来检测MVA-mBN30和mBN31。研究的结果显示，即使在很高的传代次数之后，在同一IGR在相同的启动子的控制下两个不同基因的双插入，没有在启动子位点产生重组事件。显示了两个插入的基因都被表达。
关于微生物保藏的说明(细则13之二)
PCT/RO/134表(1992年7月)
应用微生物学和研究中心以及欧洲细胞培养物保藏中心本文件在此证明，根据1977年颁布的布达佩斯条约，该病毒(保藏号V00083008)已于2000年8月30日被欧洲细胞培养物保藏中心接受为专利保藏。
Dr.P J Packer质量经理，ECACCCAMR 欧洲细胞培养物保藏中心，CAMR，Salisbury，Wiltshir SP4 OJG英国电话44(0)1980 612512传真44(0)1980 611315Emailecacc@camr.org.uk网址ecacc.org.uk
BP/4表格(第1页)附录3第25页
4如果要求该信息并且如果检验为阴性，则填写此项。
附录3第24页布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏国际局表格收件人 存活证明BAVARIAN NORDIC RESEARCH 由下一页所指明的国际保INSTITUTE GMBH藏单位根据细则10.2出具FRAUNHOFERSTRASSE 18BD-82152 MARTINSRIED德国应接到此存活证明的单位的名称和地址 1指的是初始保藏日，或者，当进行了新的保藏或保藏的转换时，指的是最相关的日期(新保藏的日期或是转保藏的日期)。
2对于那些法规10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情况，指的是最近的存活性检验。
3用打叉表示选定。
附录3第14页布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏国际局表格收件人BAVARIAN NORDIC RESEARCHINSTITUTE GMBHFRAUNHOFERSTRASSE 18BD-82152 MARTINSRIED德国保藏人的姓名和地址 当适用于细则6.4(d)时，所述的日期为国际保藏单位的资格被认定的日期。
表格sp/4(只此一页)
完整细胞溶液分析试验的证书产物描述 MVA-BN保藏号00083008
批准人＿＿＿＿＿ECACC质量主管 日期＿＿＿＿＿＿＿
完整细胞溶液分析试验的证书产物描述 MVA-BN保藏号00083008 批准人＿＿＿＿＿ECACC质量主管 日期＿＿＿＿＿＿＿
仅供ECACC填写保藏号保藏人编码ECACC专利保藏登录表格—病毒保藏人信息保藏人/公司/机构名称Bavarian Nordic Research Institute GmbH联系人名称Dr.Paul M.Howley，Dr.Petre Pielken保藏人地址Fraunhoferstraβe 18b，D-82152 Martinsried，Germany电话++49 89 8565 0030传真++49 89 8565 1333必须附带的生物危害声明该保藏根据1977年布达佩斯条约的条款进行。我同意遵守关于向ECACC保藏细胞系的条件和规则。
签名 日期25.08.2000寄送发票的地址(如果与上述不同)Accounts Department，Bavarian Nordic Research Institute GmbHFraunhoferstraβe 18b，D-82152 Martinsried，Germany病毒信息全称改良的痘苗病毒Ankara简称MVA-BN安瓿瓶标识Lot 010600菌株 ＿＿＿＿＿ vral#3；32；51；76；82；85；84；88；98；99；106；109正常宿主无保藏的病毒的滴度 ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿病毒增殖宿主细胞(首选)鸡胚成纤维细胞(CEF)可选宿主细胞-宿主细胞生长的详细资料(例如培养基、温度、种子密度、生长因子等)在含10％FCS的RPMI培养基中，于37℃、5％CO2下培养鸡胚成纤维细胞。不需生长因子。
病毒生长的详细资料(例如宿主细胞汇合、共培养、moi、效果、时间)以MOI 0，1TCID50/细胞汇合，在接近细胞汇合(约90％)时感染CEF细胞；在37℃、5％CO2条件下感染时间平均3天病毒储藏储藏的材料(例如上清夜、感染细胞的提取物、活的感染细胞等)温度和条件感染细胞的提取物，-80℃病毒分析方法(如果需要可写明)不形成噬菌斑。在CEF单层上形成病灶。用TCID50法滴定。
参考文献(如果有)Ingo Drexler et al.2000，Methods in Molecular Medicine vol 35Gene Therapy，Methods and Protocol.sEd.W.Walther and U.Stein.Human Press其他相关信息 Virus Looses Viability At Low pH.Dilute Virus With Sterile IMM Tris-Hcl pH9 Buffer在低pH病毒释放活力，用无菌IMM Tris-HClpH 9缓冲液稀释病毒仅供ECACC填写保藏号ECACC生物危害声明(所有保藏物都需包含在本声明)保藏物类别细胞培养物□ 植物培养物□ 病毒重组DNA□ DNA探针□ 细菌□上述保藏物是否表现感染性、毒性或过敏危害性？ 是□否 如果是，请给出详细和和相关的危害类别(例如ACDP类别)并向ECACC PRIOR发传真以运输细胞。
上述保藏物是否包含遗传操作材料？ 是□否 如果是，请写出普通的描述并回答下列问题a.该材料是 DNA□ RNA□b.该材料是否存在于宿主生物体中？ 是□否□c.该遗传材料是否容易转移给环境生物体？ 是□否□d.该遗传材料是否可能表达为蛋白质？ 是□否□e.根据ACGM规则，这一材料的类别是什么？即，i.防范级别＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ii.GMO类型＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿对于问题b-d是否定回答的请给出详细说明请提供进一步的关于确定将在ECACC保藏的材料的安全条件的详细说明在人体和动物体内高度减毒不能复制签名 日期25.08.2000姓名打印Dr.Petra Pielken请注意，本身是或包含动物病原体的保藏物需要EC的进入许可。请允许8周时间来递交ECACC要求的信息尽快用于许可证申请。
CAMR 欧洲细胞培养物保藏中心，应用微生物学和研究中心Salisbury，Wiltshir SP4 OJG 英国电话44(0)1980 612512传真44(0)1980 611315Emailecacc@camr.org.uk网址ecacc.org.uk
关于微生物保藏的说明(细则13之二)
PCT/RO/134表(1992年7月)
应用微生物学和研究中心以及欧洲细胞培养物保藏中心本文件在此证明，根据1977年颁布的布达佩斯条约，该病毒(保藏号V00120707)已于2000年12月7日被欧洲细胞培养物保藏中心接受为专利保藏。
Dr.P J Packer质量经理，ECACCCAMR欧洲细胞培养物保藏中心，CAMR，Salisbury，Wiltshir SP4 OJG英国电话44(0)1980 612512传真44(0)1980 611315Emailecacc@camr.org.uk网址ecacc.org.uk
附录3第14页布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏国际局表格收件人BAVARIAN NORDIC RESEARCHINSTITUTE GMBHFRAUNHOFERSTRASSE 18BD-82152 MARTINSRIED德国保藏人的姓名和地址 当适用于细则6.4(d)时，所述的日期为国际保藏单位的资格被认定的日期。
表格sp/4(只此一页)
附录3第24页布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏国际局表格收件人BAVARIAN NORDIC RESEARCH 存活证明INSTITUTE GMBH由下一页所指明的国际保藏FRAUNHOFERSTRASSE 18B单位根据细则10.2出具D-82152MARTINSRIED德国应接到此存活证明的单位的名称和地址 1指的是初始保藏日，或者，当进行了新的保藏或保藏的转换时，指的是最相关的日期(新保藏的日期或是转保藏的日期)。
2对于那些法规10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情况，指的是最近的存活性检验。
3用打叉表示选定。
BP/4表格(第1页)第25页
4如果要求该信息并且如果检验为阴性，则填写此项。
分析试验的证书产物描述 MVA-575保藏号 00120707 批准人＿＿＿＿＿ECACC质量主管 日期＿＿＿＿＿＿＿
分析试验的证书产物描述 MVA-575保藏号00120707
批准人＿＿＿＿＿ECACC质量主管 日期＿＿＿＿＿＿＿＿
仅供ECACC填写保藏号保藏人编码ECACC专利保藏登录表格—病毒保藏人信息保藏人/公司/机构名称Bavarian Nordic Research Institute GmbH联系人名称Dr.Paul M.Howley，Dr.Petre Pielken保藏人地址Fraunhoferstraβe 18b，D-82152 Martinsried，Germany电话++49 89 8565 0030传真++49 89 8565 1333必须附带的生物危害声明该保藏根据1977年布达佩斯条约的条款进行。我同意遵守关于向ECACC保藏细胞系的条件和规则。
签名日期 05.12.2000寄送发票的地址(如果与上述不同)Accounts Department，Bavarian Nordic Research Institute GmbHFraunhoferstraβe 18b，D-82152 Martinsried，Germany病毒信息全称改良的痘苗病毒 Ankara简称MVA安瓿瓶标识＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿菌株No.575血清学类型＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿正常宿主无保藏的病毒的滴度＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿病毒增殖宿主细胞(首选)鸡胚成纤维细胞(CEF)可选宿主细胞-宿主细胞生长的详细资料(例如培养基、温度、种子密度、生长因子等)在含10％FCS的RPMI培养基中，于37℃、5％CO2下培养鸡胚成纤维细胞。不需生长因子。
病毒生长的详细资料(例如宿主细胞汇合、共培养、moi、效果、时间)以MOI 0，1TCID50/细胞汇合，在接近细胞汇合(约90％)时感染CEF细胞；在37℃、5％CO2条件下感染时间平均3天病毒储藏储藏的材料(例如上清夜、感染细胞的提取物、活的感染细胞等)温度和条件感染细胞的提取物，-80℃病毒分析方法(如果需要可写明)不形成噬菌斑。在CEF单层上形成病灶。用TCID50法滴定。
参考文献(如果有)Ingo Drexler et al.2000，Methods in Molecular Medicine vol 35 Gene Therapy，Methods and Protocol.sEd.W.Walther and U.Stein.Human Press其他相关信息Virns Looses Viability At Low pH.Dilute Virus With Sterile IMM Tris-Hcl pH9 Buffer在低pH病毒释放活力，用无菌IMM Tris-HClpH 9缓冲液稀释病毒CAMR欧洲细胞培养物保藏中心，CAMR，Salisbury，Wiltshir SP4 OJG英国电话44(0)1980 612512 传真44(0)1980 611315Emailecacc@camr.org.uk网址ecacc.org.uk
仅供ECACC填写保藏号保藏人编码ECACC生物危害声明(所有保藏物都需包含在本声明)保藏物类别细胞培养物□ 植物培养物□ 病毒重组DNA□ DNA探针□ 细菌□上述保藏物是否表现感染性、毒性或过敏危害性？ 是□ 否 如果是，请给出详细和和相关的危害类别(例如ACDP类别)并向ECACC PRIOR发传真以运输细胞。
MVA被ZKBS归类于生物安全级别1(S1) 文件号6790-10-14 日期1997年5月上述保藏物是否包含遗传操作材料？ 是□ 否 如果是，请写出普通的描述并回答下列问题a.该材料是DNA□ RNA□b.该材料是否存在于宿主生物体中？ 是□ 否□c.该遗传材料是否容易转移给环境生物体？是□ 否□d.该遗传材料是否可能表达为蛋白质？是□ 否□e.根据ACGM规则，这一材料的类别是什么？即，i.防范级别＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ii.GMO类型＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿对于问题b-d是否定回答的请给出详细说明＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿请提供进一步的关于确定将在ECACC保藏的材料的安全条件的详细说明在人体和动物体内高度减毒不能复制签名 日期＿＿＿＿＿＿姓名打印Dr.Petra Pielken请注意，本身是或包含动物病原体的保藏物需要EC的进入许可。请允许8周时国来递交ECACC要求的信息尽快用于许可证申请。
CAMR欧洲细胞培养物保藏中心，应用微生物学和研究中心Salisbury，Wiltshir SP4 OJG英国电话44(0)1980 612512传真44(0)1980 611315Emailecacc@camr.org.uk网址ecacc.org.uk
关于微生物保藏的说明(细则13之二)
PCT/RO/134表(1992年7月)
公共健康实验室服务应用微生物学和研究中心Public Health Laboratory ServiceCentre for Applied Microbiology and Research本文件在此证明，根据1977年颁布的布达佩斯条约，该病毒(保藏号V94012707)已于1994年1月27日被欧洲细胞培养物保藏中心接受为专利保藏。
Dr.Alan Doyle，馆长布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏国际局表格收件人原始保藏的收据Dr h.c.mult Anton Mayr博士 由本页底部所指明的国际保藏单Bockmeyrstrasse 9 位根据细则7.1出具80992 Munchen德国保藏人的姓名和地址 当适用于细则6.4(d)时，所述的日期为国际保藏单位的资格被认定的日期。
表格sp/4(只此一页)
布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏国际局表格收件人 存活证明Dr h.c.mult Anton Mayr博士 由下一页所指明的国际保藏单Bockmeyrstrasse 9位根据细则10.2出具80992 Munchen德国应接到此存活证明的单位的名称和地址 1指的是初始保藏日，或者，当进行了新的保藏或保藏的转换时，指的是最相关的日期(新保藏的日期或是转保藏的日期)。
2对于那些法规10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情况，指的是最近的存活性检验。
3用打叉表示选定。
4如果要求该信息并且如果检验为阴性，则填写此项。
序列表<110>巴法里安诺迪克有限公司(Bavarian Nordic A/S)<120>包含至少两个牛痘ATI启动子的重组痘病毒<130>BN52PCT<150>DK PA 2002 01814<151>2002-11-25<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>29<212>DNA<213>痘病毒<220>
<221>启动子<222>(1)..(29)<223>
<400>1gttttgaata aaattttttt ataataaat 29
权利要求
1.在病毒基因组中包含至少两个表达盒的重组痘病毒，每个表达盒包含牛痘ATI启动子或其衍生物以及编码序列，其中编码序列的表达由所述启动子或其衍生物调节。
2.根据权利要求1的重组痘病毒，其中至少两个表达盒被插入到痘病毒基因组中的相同的插入位点中。
3.根据权利要求1到2的任何一个的重组痘病毒，其中在至少一个所述表达盒中的ATI启动子具有SEQ ID NO1的序列。
4.根据权利要求1到2的任何一个的重组痘病毒，其中在至少一个所述表达盒中的ATI启动子是ATI启动子的衍生物，选自(i)根据SEQ ID NO1的序列的子序列(ii)对根据SEQ ID1的序列或对其子序列具有一个或多个核苷酸替换、删除和/或插入的序列，其中所述子序列和序列在所述痘病毒中作为启动子仍有活性。
5.根据权利要求1到4的任何一个的重组痘病毒，其中所述痘病毒选自由正痘病毒和禽痘病毒构成的组。
6.根据权利要求5的重组痘病毒，其中所述正痘病毒是痘苗病毒，和其中所述禽痘病毒选自金丝雀痘病毒和家禽痘病毒。
7.根据权利要求6的重组痘病毒，其中所述痘苗病毒是经过改良的痘苗病毒安卡拉株(MVA)，特别是MVA-BN和MVA 575，其保藏在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)编号分别为V00083008和V00120707。
8.根据权利要求7的重组痘病毒，其中，相对于痘苗病毒Copenhagen株的基因组而言，至少一个所述表达盒被插入到MVA基因组的自然发生删除的位点。
9.根据权利要求1到8的任何一个的重组痘病毒，其中至少一个所述表达盒被插入到痘病毒基因组的基因间隔区。
10.根据权利要求1到9中任一项的重组痘病毒，其中至少一个所述编码序列编码至少一个抗原、抗原表位、和/或治疗化合物。
11.作为疫苗或药物的根据权利要求1到10中任一项的重组痘病毒。
12.包含根据权利要求1到10中任一项的重组痘病毒的疫苗或药物组合物。
13.根据权利要求1到10中任一项的重组痘病毒用于制备疫苗或药物的用途。
14.将编码序列导入靶细胞的方法，包括用根据权利要求1到10中任一项的病毒感染所述靶细胞。
15.生产肽、蛋白和/或病毒的方法，包括a)用根据权利要求1到10中任一项的重组痘病毒感染宿主细胞，b)在适宜的条件下培养感染的宿主细胞，和c)分离和/或富集所述宿主细胞生产的肽和/或蛋白和/或病毒。
16.在活的动物体包括人体内影响、优选诱导免疫应答的方法，包括向需治疗的动物或人施用根据权利要求1到10中任一项的病毒或根据权利要求12的疫苗或组合物。
17.根据权利要求15所述的方法，包括施用至少102TCID50(组织培养感染剂量)的所述病毒。
18.包含根据权利要求1到10任一项的病毒的细胞。
19.生产根据权利要求1到10中任一项的重组病毒的方法，包括将至少两个表达盒插入到痘病毒基因组中的步骤。
全文摘要
本发明涉及在病毒基因组中包含至少两个表达盒的重组痘病毒，每个表达盒包含牛痘ATI启动子或其衍生物以及编码序列，其中该编码序列的表达由所述启动子或其衍生物调节。该病毒可以用作疫苗或作为药物组合物的一部分。
文档编号A61K39/285GK1717488SQ200380104098
公开日2006年1月4日 申请日期2003年11月12日 优先权日2002年11月25日
发明者桑贾·莱勒, 保罗·豪利 申请人:巴法里安诺迪克有限公司