专利名称：通过微波照射处理生物体组织的方法
技术领域：
本发明涉及再生医疗即进行移植以代替不发挥正常功能的患者自身的器官或组织而恢复正常功能的医疗技术领域。具体地说，涉及一种通过从动物来源的生物体组织中除去细胞成分或者通过典型地使用固定剂戊二醛固定组织，来制作移植用组织片的方法。
背景技术：
通过用戊二醛这样的固定剂对生物体组织进行化学处理，或者通过除去生物体组织中的细胞成分，而制作成移植用组织片，这被广泛地应用于临床。例如，在心脏瓣膜置换术中，异种生物体瓣膜是指用戊二醛固定化猪的心脏瓣膜或牛的心脏瓣膜以降低免疫原性。这种异种生物体瓣膜在抗凝固性方面具有优势，但如果用于年轻人，只有大约5～10年的耐久性，通常适用于60岁以上的高龄人群。欧美从1985年开始，而日本国内也从近几年开始建立了通过冷冻保存的组织库，由尸体提供的冷冻保存同种瓣膜正用于临床。这种同种瓣膜与机械瓣膜相比具有抗血栓性，与异种生物体瓣膜相比具有耐久性，并且在抗感染性方面也具有优势。然而，提供数量绝对不够是个大问题。另外，有报道称在年轻人当中，有在移植后比较早期出现功能不全的病例，提示与免疫反应强烈相关。对年轻人有效的Ross手术的特点是，把自身的肺动脉瓣置换移植到主动脉瓣的位置上，再用冷冻保存的同种瓣膜重新构建缺损的肺动脉瓣，而移植到主动脉瓣位置上的自体的肺动脉瓣会随着患者的成长逐渐增大。与此相比，更不必说机械瓣膜或异种生物体瓣膜，就连冷冻保存的同种瓣膜也没有成长性，所以，很多儿科患者都需要重新移植。最近，为了解决这些问题，出现了关于通过除去同种瓣膜中来源于供体的细胞以减弱抗原性而降低免疫反应的关联性、从而提高瓣膜的耐久性和自体化的研究的报道。美国CryoLife公司发表了通过名为SynerGraft的药液处理的细胞除去方法，报道了在移植后几个月内自体细胞向组织内浸润而自体组织化。另外，德国的Hannover医科大学的Haverich等的小组将作为表面活性剂的Triton X-100或作为蛋白质分解酶的胰蛋白酶(tripsin)溶液用于除去细胞。然而，只在仅仅利用过去的表面活性剂或者药液的清洗工序中，除去组织片内部的细胞成分以及细菌或病毒是通过药液从表面的扩散或渗透进行的，所以不够充分。另外，因为具有这样的限制，在对大块组织片的处理中，很难完全地除去细胞或细菌、病毒。另外，当用化学方法处理时，为了达到充分的效果，有必要提高处理的程度，这样就会产生埋入后的钙化或处理试剂的除去等问题。而且，正如在硬膜移植的BSE和CJD的感染中所知道的那样，确保移植组织的安全性是极其重要的，可是用现在的化学药液处理并不能保证使组织内的病毒完全失活。另外，由于处理过程中的污染，来自移植用组织的感染事故也经常发生。
另外，关于已除去细胞成分的异种或同种移植用组织片，在其中播种患者自身的细胞，使自家细胞在细胞片内增殖，从而作为混合再生组织用于移植。
发明内容
本发明的目的在于改善如上所述的以往技术的问题点。即，首先第一是实现用药液处理不能实现的除去大块组织内部的细胞成分以及细胞、病毒，第二是在不破坏处理组织的生物体力学特性的情况下进行处理，第三是简便而短时间地进行处理。
本发明提供一种生物体组织的处理方法，其特征在于，针对浸渍于处理液中的动物来源的生物体组织，在维持0℃～40℃的温度的同时照射微波。
图1是表示用于实施本发明的装置的一个例子的概略图。
图2是表示猪心脏瓣膜组织的组织断面照片。左图表示提供以往方法的处理，右图表示通过合用了微波照射的本发明的处理。在以往的处理中，在组织深部(照片的左下方)内可见细胞核的残留。
图3是表示从用Triton X-100已除去细胞的猪心脏瓣膜的Triton X-100的除去效率的曲线图。在通过微波照射的本发明的方法中，用以往方法的大约10分之1的时间除去Triton X-100是可能的。
具体实施例方式
本发明的方法可以应用于除去生物体组织中的细胞成分而制作移植用组织片的处理。这种情况下，作为处理液，可以使用含有水、高渗溶液、低渗溶液、表面活性剂溶液、酶溶液、液体培养基(liquid medium)或它们当中的任一种和小比例的有机溶剂的混合液。
当将本发明的方法应用于固定组织制作移植用组织片的处理时，使用戊二醛这样的化学固定剂的溶液。
即便在任何处理中，在不照射微波的以往的方法当中，处理液通过从样品表面的扩散和渗透而遍布全体，所以需要长时间的处理，其间也有污染样品等危险。微波照射能够将处理液渗透到达组织深部所需的时间缩短为以前的约10分之1，所以能够大幅度地提高处理效率，能够防止其间的样品污染等。另外，当除去组织中的细胞制作移植片时，在短时间内除去组织深部的细胞核成为可能，这在以前的方法中是不可能或是难以完成的。
在病理组织学领域中，微波处理应用于组织固定、骨骼的脱钙、脱脂、免疫组织化学等。但是，没有将微波照射用于制作移植用组织片的先例。在本发明的新的生物来源组织处理方法中，将处理样品放入到透过微波的玻璃或塑料制的样品容器内；在除去细胞的处理中，注入表面活性剂或低渗溶液、高渗溶液等处理液并将样品完全浸入其中；在细胞固定处理中，注入戊二醛等化学固定液并将样品完全浸入其中。将处理样品的温度控制在0～40℃内，同时照射微波，一般在照射微波时样品温度上升，所以为了长时间照射微波，必须冷却样品。对此，使用例如市售的微波迅速样品处理装置是有效的。将该装置改造为使经微波炉外部的冷却装置冷却的防冻溶液在用于照射微波的微波炉内的样品容器周围循环，从而使用。在样品容器内设置温度传感器并间歇性地控制冷却装置和微波照射时间，由此可以在微波照射时将样品温度控制为0～40℃。与病理组织学领域不同，在移植用生物体组织的情况下，为了不改变生物体力学特性，需要防止构成基质的变性，在微波照射时，必须避免温度在冰点以下或40℃以上。
图1是表示用于实施本发明的装置的一个例子的概略图。装置由具备磁控管(magnetron)12的微波炉1构成。在炉内部设置有容纳了冷却用防冻溶液21的冷却槽2，在冷却槽2的大致中央位置放置样品容器3。样品容器3内装满了处理液，在其中浸渍样品即想要处理的生物体组织4。冷却槽2和样品容器3是用玻璃或塑料如聚丙烯、聚苯乙烯等透过微波的材料制成。如前所述，微波的照射是依照处理液31对样品4进行加热，使样品的构成基质不可逆地发生热变性，所以有必要使冷却槽2内的冷却液31通过导管5、6在设置于炉1外部的冷却装置7和冷却槽2之间循环。因此，在冷却槽21变暖的冷却液21通过导管6返还到冷却装置的热交换器72，再次冷却后通过导管5并借助泵71回到冷却槽21。用传感器11感知槽21内的冷却液的温度，为了将该温度维持在0℃～40℃范围内的恒定温度例如如20℃，借助控制器13间歇性且自动地控制磁控管12的工作时间。为了均匀地照射微波，也可设置搅拌扇等其它机构。
本发明的方法也可以与用于除去组织中的细胞成分的已知方法组合使用。例如在使用表面活性剂或酶进行除去组织内的细胞的前处理之后，可以在微波照射下进行除去残留在组织片中的药液的清洗。
本发明的方法的应用领域或用途1)移植用动物来源的软组织例如从来自于脑死亡或心脏死亡供体的移植用软组织处理，或者从来自于猪、牛等异种动物的移植用软组织处理除去细胞成分的清洗处理工序的效率能够得到飞跃性的提高。另外，还能够达到大幅度减少抗原性原因物质的目的。
2)移植用动物来源的硬组织例如与上述一样，能够进行骨、软骨、牙齿等硬组织处理。
3)医疗用生物组织的处理例如能够用于对动物和植物来源的组织中含有细胞的组织进行的细胞破坏处理。
实施例1.从食用猪养殖场买进猪心脏，在4℃的条件下搬运。摘出心脏时的热缺血时间为20分钟以内。摘出肺动脉瓣、血管，用Hank氏液清洗。将样品浸渍于作为表面活性剂的Triton X-100的1％水溶液中，用图1中以概略图表示的装置在20℃下间歇性地照射48小时微波，除去供体细胞。在处理后，用磷酸缓冲生理盐水清洗除去。借助HE染色对处理标本的组织断面进行光镜观察，由此进行组织学评价。其结果是在猪肺动脉瓣膜叶组织中，当如图2所示合用微波照射时，与不合用时的情况相比，更能除去组织深部的细胞。
2.同样将从食用猪养殖场买进的猪心脏瓣膜在作为表面活性剂的Triton X-100的1％水溶液中浸渍24小时，由此除去细胞。然后浸渍于磷酸缓冲生理盐水中，在10℃下间歇性地照射48小时微波进行处理。如图3所示，其结果是为了除去在不照射微波的以往的方法中显示细胞毒性的Triton X-100溶液，需要3周左右，而通过照射微波可以将处理时间大幅度地缩短为几天。
权利要求
1.一种生物体组织的处理方法，其特征在于，针对浸渍于处理液中的动物来源的生物体组织，在维持其温度为0℃～40℃的同时对其照射微波。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述处理是用于除去生物体组织中的细胞成分的处理，处理液是水、高渗溶液、低渗溶液、表面活性剂溶液、酶液、液体培养基或它们当中的任一种与小比例的有机溶剂的混合液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述处理是用于固定生物体组织的化学处理，处理液是含有戊二醛的药液。
4.根据权利要求1～3中任意一项所述的方法，其特征在于，所述微波照射是在频率2450MHz下，作为净照射时间进行照射1小时～1周。
5.根据权利要求1～4中任意一项所述的方法，其特征在于，处理的生物体组织是含有血管、心脏瓣膜、心膜、角膜、羊膜、和硬膜的软组织。
6.根据权利要求1～4中任意一项所述的方法，其特征在于，处理的生物体组织是含有骨、软骨、和牙齿的软或硬组织。
7.根据权利要求1～4中任意一项所述的方法，其特征在于，处理的生物体组织是含有心脏、肾脏、肝脏、胰脏、和脑的脏器或其一部分。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包含在微波照射后使用新鲜的清洗液从组织中清洗除去已被破坏的供体细胞的工序。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，处理的生物体组织接受使供体细胞的除去变得容易的前处理。
全文摘要
本发明提供一种有效地完成从来源于动物的生物体组织除去或固定化供体细胞的处理的方法，其包含针对浸渍于处理液中的动物来源的生物体组织，在维持其温度为0℃～40℃的同时对其照射微波。
文档编号A61L27/36GK1723047SQ200380105579
公开日2006年1月18日 申请日期2003年12月11日 优先权日2002年12月12日
发明者藤里俊哉, 岸田晶夫, 船本诚一, 中谷武嗣, 北村惣一郎 申请人:国立循环器病中心总长代表的日本国