PDGF受体α基因的外显子1β及其应用的制作方法

专利名称：PDGF受体α基因的外显子1β及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有PDGF受体α基因的外显子1β或其一部分的多核苷酸，以及以含PDGF受体α基因的mRNA中的外显子1β的RNA为靶的PDGF受体α的表达抑制方法、表达抑制物质和表达抑制剂，以及癌症的治疗剂。
背景技术：
血小板衍生生长因子(PDGF)在细胞的增殖和发生、分化、创伤愈合以及癌恶变和动脉硬化等中起着重要作用。因此预期控制PDGF信号的物质可作为这些疾病的治疗剂。实际上已提出作为治疗剂的PDGF表达抑制剂(例如，参照日本专利特开平10-59850号公报)、PDGF与PDGF受体α的结合阻断剂(例如，参照日本专利特表平8-500010号公报)和PDGF受体α酪氨酸激酶抑制剂(例如，参照日本专利特表2002-514228号公报)。
然而，担心这些抑制剂和阻断剂不仅对癌特异性PDGF信号、也对正常PDGF信号产生影响。本发明的目的在于提供用于可仅选择性抑制癌细胞特异性PDGF信号的表达抑制方法的多核苷酸、表达抑制物质、表达抑制剂和癌治疗剂。
发明的揭示本发明的多核苷酸的特征在于，具有序列编号2所示的碱基序列或其一部分。作为具有序列编号2所示的碱基序列的一部分的多核苷酸，可列举具有序列编号1所示的碱基序列的多核苷酸。
本发明的多核苷酸的特征在于，具有在序列编号2所示的碱基序列中，缺失、取代或插入1个或数个碱基，并包含在PDGF受体α基因的有意义链的碱基序列中的碱基序列或其一部分。
这里“PDGF受体α基因”是GenBank登录号AC026580及AC025013所示的碱基序列构成的基因及其同系物。
而且，本发明的多核苷酸也可以是具有与上述多核苷酸互补的碱基序列或其一部分的多核苷酸。
这些多核苷酸可以是双链DNA、单链DNA、双链RNA、单链RNA中的任一种。此外，具有1个或数个碱基的缺失、取代或插入等的基因多态性(geneticpolymorphism)、具有包含在PDGF受体α基因的有意义链的碱基序列中的碱基序列的多肽也在本发明的范围内，但较好是具有同等机能的多肽，特别好的是由E2F-1调节转录的多肽。
本发明的PDGF受体α的表达抑制方法的特征是，以含PDGF受体α基因的mRNA中的外显子1β的mRNA作为靶。这里“mRNA”是指从经转录形成的hnRNA除去内含子部分、外显子部分结合而形成的RNA。“以mRNA作为靶”是指直接或间接地特异地使该mRNA不生成其编码的蛋白质。“蛋白质的表达”表示DNA上的遗传信息由mRNA被正确地翻译而产生蛋白质。
本发明的PDGF受体α的表达抑制方法也可以是使用反义核苷酸、核酶、大酶(maxizyme)或RNAi的方法。
这里“PDGF受体α基因的反义核苷酸”是指与PDGF受体α基因的mRNA的碱基序列互补的核苷酸，可以是反义RNA或反义DNA，核苷酸也可以被修饰。上述反义RNA或DNA指与从作为对象的基因转录的mRNA序列互补的RNA或DNA，用于阻断细胞内的遗传信息的表达，特异地抑制靶蛋白的产生。
“核酶”是具有酶活性的RNA的总称，指特异地切断来自生物的RNA的酶。如果被掺入细胞内，则具有切断靶RNA序列的机能。其结果是，抑制了蛋白质由靶RNA的表达。由于对靶RNA序列的特异性高，所以作为蛋白质的表达抑制物质较好。核酶包括锤头型核酶和发夹型核酶(hairpin ribozyme)等。
“大酶”一般如WO99/46388号公报的说明书记载，是形成二聚体结构的RNA分子，例如，它的两个RNA分子不识别正常细胞中的mRNA，而通过构成大酶能识别癌细胞中特异性的mRNA，因而可只切断癌细胞中特异性的mRNA。
“RNAi”指利用诱导被称为RNA干扰(RNA interference)的现象的双链RNA(dsRNA)的方法。“被称为RNA干扰的现象”是将上述双链RNA导入细胞内抑制靶基因表达的现象，目前认为是通过宿主内在的机制被切短成为21～23碱基对，切短的RNA分子识别由宿主基因转录而成的mRNA，发生序列特异性的分解，其结果是，特异地抑制由宿主基因编码的蛋白质的表达。
本发明的PDGF受体α的表达抑制方法可以是利用编码反义RNA、核酶、大酶、或RNAi中的任一种的DNA的方法。
本发明的PDGF受体α的表达抑制物质的特征在于，以含有PDGF受体α基因的mRNA中的外显子1β的mRNA作为靶。例如通过表达抑制物质使其结合于该mRNA，或使该mRNA分解，也可以是表达抑制物质间接地使其他物质结合于该mRNA，或由其他物质使该mRNA分解。“PDGF受体α的表达抑制物质”是指抑制PDGF受体α蛋白质由PDGF受体α基因产生的物质。
作为本发明的PDGF受体α的表达抑制物质，具体可列举反义核苷酸、核酶、大酶或RNAi等。
作为本发明的PDGF受体α的表达抑制物质，具体可列举编码反义RNA、核酶、大酶或RNAi中的任一种的DNA等。
本发明的PDGF受体α的表达抑制剂的特征在于，以上述表达抑制物质为有效成分。
本发明的癌症的治疗剂的特征在于，含有上述表达抑制剂。
本发明的癌的治疗方法的特征在于，含有上述表达抑制剂。
附图的简单说明

图1是显示本发明实施例2中用RT-PCR揭示的PDGF受体α基因的外显子1β～4的表达模式的图。
图2是显示核酶结构的图。
图3是显示大酶结构的图。
图4是显示本发明的实施例1中用含-1395至+312的碱基序列的报道构建物(reporter construct)进行荧光素酶测定的结果的图。图中的“+”表示导入100ng含-1395至+312的碱基序列的报道构建物的结果，“-”表示导入100ng不含-1395至+312的碱基序列的报道构建物的结果。
图5是表示本发明的实施例1中用含-517至+1445的碱基序列的报道构建物进行荧光素酶测定的结果的图。
图6是表示本发明的实施例1中用缺失转录起始点的不同长度的缺失突变体进行荧光素酶测定的结果的图。
图7是表示由基本转录因子转录的PDGFRα的mRNA和由E2F-1转录的PDGFRα的mRNA的示意图。
实施发明的最佳形式已知在癌细胞中，大部分的场合，RB蛋白等抑制癌的蛋白质参与的信号转导途径发生异常。例如，在RB蛋白上游起作用的细胞周期蛋白D1的过度表达，通过增强对生长因子的敏感性，认为其参与癌细胞的恶变。在体外的细胞培养体系中，通过向过度表达细胞周期蛋白D1的细胞株加入FGF(成纤维细胞生长因子)，可使该细胞恶变。本申请的发明者发现PDGF(血小板衍生生长因子)也起同样作用，可使过度表达细胞周期蛋白D1的细胞株恶变。
在细胞周期蛋白D1-RB途径的下游存在转录因子E2F-1，通过增加FGF受体的表达而使对FGF的敏感性提高。如下列实施例详述，E2F-1也使PDGF受体α的表达亢进，但本申请的发明者发现它不作用于以往知道的启动子，而作用于以往的内含子1中由E2F-1控制的新启动子区域，对通过该新启动子转录时所用的新外显子1β进行了鉴定。
这样，在E2F-1和PDGF参与的癌的恶变中，了解到这些因子的一个靶是具有PDGF受体α的外显子1β的mRNA。因此，通过特异性抑制从具有该外显子1β的转录产物产生PDGF受体α，可阻断与癌细胞恶变有关的信号，从而抑制癌细胞增殖。并且，不限于细胞周期蛋白D1-E2F-1途径，如果癌细胞的增殖是由于通过具有外显子1β的mRNA的过度转录而与PDGF受体α共同引起癌恶变的因子的话，本发明可应用于这种癌细胞的增殖抑制。
以下，对根据上述发现完成的本发明的实施方式举实施例详细说明。实施方式和实施例如无特别说明，可用J.Sambrook，E.F.Fritsch & T.Maniatis(Ed.)，Molecular cloning，a laboratory manual(2nd edition)，Cold Spring HarborPress，Cold Spring Harbor，New York(1989)；F.M.Ausubel，R.Brent，R.E.Kingston，D.D.Moore，J.G.Seidman，J.A.Smith，K.Struhl(Ed.)，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons Ltd.等的标准方案集记载的方法，或其经修饰、改变的方法。使用市售的试剂盒和测定装置时，如无特别说明，可使用其所附的方案。
本发明的目的，特征、优点及其思路，根据本说明书的说明，本领域普通技术人员应该可以明白，从本说明书的记载，本领域普通技术人员能够很容易地再现本发明。以下说明的发明的实施方式及具体实施例等是说明本发明的较好实施方式的例子，仅是为举例或说明而提出的，本发明并不限于此。在本说明书揭示的本发明的意图和范围内，根据本说明书的记载，可作各种改变和改进，这对本领域普通技术人员是显而易见的。
具有序列编号2所示的人PDGF受体α基因的外显子1β的碱基序列或其一部分的多核苷酸，根据序列编号2所示的碱基序列信息，可从cDNA文库、基因组文库等人基因文库制备。而且，来自小鼠、大鼠、鸡、猪、狗、猴等人以外的生物物种的PDGF受体α基因的外显子1β也可以用E2F-1控制转录来确定，例如与人PDGF受体α基因的外显子1β的杂交也可通过检查以往的内含子1中的序列中的新外显子等来鉴定，它们也包含在本发明的多核苷酸中。
这里，“人PDGF受体α基因的外显子1β”是指包含具有序列编号2所示的碱基序列的多核苷酸而构成的外显子，“PDGF受体α基因的外显子1β”是指包含具有序列编号2所示的碱基序列的多核苷酸而构成的外显子以及在人以外的生物物种中与此对应的外显子。
PDGF受体α基因的外显子1β由于是mRNA上的非翻译区域，在人以外的生物物种中，在碱基序列水平上不一定要求有高度同源性，但有必要在特定种类的细胞中保存转录机能，例如必需有由E2F-1控制转录这一其它外显子1所没有的特征。
如图1所示，含有PDGF受体α基因的mRNA中的外显子1β的mRNA，仅在特定的癌细胞中被检出。因此，以含PDGF受体α基因的mRNA中的外显子1β的mRNA为靶的表达抑制方法，以及本发明的多核苷酸，表达抑制物质和表达抑制剂等，作为攻击特定癌细胞(如具体可列举人大肠癌细胞SW480和人食道癌细胞TTn等)用的癌治疗方法和癌治疗剂是有用的。
本发明的表达抑制方法是以含PDGF受体α基因的mRNA中的外显子1β的mRNA作为靶的方法，例如，可以是结合于含PDGF受体α基因的mRNA中的外显子1β的mRNA，抑制翻译从而抑制PDGF受体α的表达的方法，或是分解或切断上述mRNA从而抑制PDGF受体α的表达的方法。以下对使用反义核苷酸、核酶、大酶或RNAi等表达抑制物质的表达抑制方法举例进行说明。
(1)反义核苷酸的制备作为本发明的表达抑制方法中使用的反义核苷酸，具体可例举含与PDGF受体α基因的mRNA中的外显子1β对应的这部分碱基序列或其一部分互补的碱基序列的反义RNA或反义DNA。还可以是由15～30个碱基序列组成的反义寡核苷酸。
本发明的反义核苷酸在结构上不受其序列的位置、长度、修饰、错配序列的存在等的限制。作为经过上述修饰的反义核苷酸，具体可例举为使反义核苷酸在体内或细胞内保持稳定而使磷酸二酯键的磷酸基的一个氧原子被硫原子或甲基修饰的反义核苷酸、吗啉-4-基修饰的反义核苷酸。
本发明的反义DNA可用S1核酸酶等依赖DNA的DNA聚合酶经引物延伸法在体外合成。此外，将反义链的一部分作为引物进行PCR，可仅合成反义链。也可用DNA合成仪等进行人工合成。反义寡核苷酸的合成可依据反义DNA进行，最好人工合成。
另一方面，本发明的反义RNA，例如用RNA合成仪和固相合成法等可容易地合成。其后用HPLC以NH3OH/EtOH洗脱，可分离出目标RNA。
本发明的反义RNA可通过以上方法人工合成，也可制作在特异地识别T7RNA聚合酶的启动子序列(5’-TAATACGACTCACTATA-3’序列编号3)的下游插入了具有与反义RNA对应的DNA序列的双链DNA的载体，用T7RNA聚合酶由体外转录体系合成。
此外，也可以使用掺入了与反义RNA对应的DNA的病毒载体或质粒等表达载体，在细胞内使反义RNA表达。作为病毒载体，可以是腺病毒载体或逆转录病毒载体。
(2)插入了核酶的质粒的制备如图2所示，核酶具有与靶mRNA的碱基序列互补的碱基序列(表示核酶的5’末端部分和3’末端部分的碱基序列)和具催化活性部位(以○记号表示的碱基)的24个碱基序列。核酶的5’末端部分和3’末端部分的碱基序列如果与靶mRNA的碱基序列特异地结合，则切断存在于mRNA上的NUX序列(N为任意碱基，X是a、u、c中的任一个碱基)而使靶mRNA分解。即，认为如果基于与PDGF受体α基因的mRNA中的外显子1β对应的部分的碱基序列合成核酶并给予细胞内，则可特异地切断含有PDGF受体α基因的mRNA中的外显子1β的mRNA。
因此，作为本发明的表达抑制物质的核酶，可从序列编号2所示的人PDGF受体α基因的外显子1β的碱基序列中选择与NUX序列对应的序列，使其包含与含有该序列的15～20个碱基序列互补的碱基序列以及具有催化活性部位(以○记号表示的碱基)的24个碱基序列。作为与NUX对应的序列，可例举序列编号2表示的34～36位的GTC、75～77位的GTC、78～80位的GTC、81～83位的GTC、172～174位的GTC、267～269位的GTC。此外，上述核酶可以是锤头型核酶或发夹型核酶。
实际的合成方法有人工合成、体外合成、由表达载体在细胞内合成等，与(1)的反义RNA的情况相同，故在此省略说明。
(3)大酶的设计与制备如图3所示，大酶由形成二聚体结构的RNA分子构成，两个RNA分子具有特异地识别靶RNA的传感器部位(图中表示成X···X部分，X指任意碱基。上行的X和下行的X表示互补的碱基)、催化活性部位(图中不形成双链的部分)、存在于含靶RNA的mRNA上的NUX序列(N为任意碱基，X表示A、U、C中的任一碱基。图中表示成GUC序列的部分。)以及识别其上游(图中GUC序列部分的上游)或下游(图中GUC序列部分的下游)的部位。大酶的传感器部位特异地识别靶RNA并与其结合，而该大酶的另一传感器部分特异地识别存在于含靶RNA的mRNA上的NUX序列的上游和下游并与其结合，切断存在于含靶RNA的mRNA上的NUX序列，可使靶mRNA特异地分解。即，如果基于与PDGF受体α基因的mRNA中的外显子1β对应的部分的碱基序列合成大酶并给予细胞内，认为可特异地切断含PDGF受体α基因的mRNA中的外显子1β的mRNA。
例如，将PDGF受体α基因的外显子1β作为靶RNA，将与该靶RNA互补的碱基序列作为传感器部位。此外，从PDGF受体α的mRNA选择存在于靶RNA下游的NUX序列，确定与NUX序列上游和下游的序列互补的碱基序列。NUX序列可以是PDGF受体α基因的外显子1β的mRNA上的序列。由这些信息，通过RNA合成仪合成大酶的各RNA分子，可制作大酶。图中X的数目可以增减1个或数个。
实际合成方法有人工合成、体外合成、由表达载体在细胞内合成等，与(1)的反义RNA的情况相同，这里省略说明。但因大酶使用2分子的RNA，用表达载体在细胞内表达时，2分子RNA可掺入1个载体，也可分别掺入2个载体中。
(4)RNAi的制备如果将与目标基因对应的双链RNA导入体内，有报道认为对应的mRNA会发生分解(Bass，B.L.(2000)Cell 101，235-238；Fire，A.(1999)Trends Genet.15，358-363；Sharp，P.A.(2001)Genes Dev.15，485-490)。因此，如果将与具有PDGF受体α基因的外显子1β或其一部分的mRNA对应的双链RNA(RNAi)导入细胞内或体内，则认为含有PDGF受体α基因的mRNA中的外显子1β的mRNA会发生分解。
作为本发明的表达抑制物质的RNAi可如下制备。即，可用RNA合成仪人工合成与PDGF受体α基因的外显子1β的有意义链或其一部分的碱基序列对应的RNA以及与该RNA互补的RNA。此外，也可用HiScribe RNAi Transcription Kit(NEB公司制)在体外和体内合成。
另外，可将在正、负两个方向克隆了PDGF受体α基因的外显子1β或其一部分的病毒载体或质粒等表达载体分别导入细胞内，使DNA的两链在细胞内表达，在细胞内形成RNAi，并使靶的mRNA分解。也可使用具有将对应于PDGF受体α基因的外显子1β或其一部分的双链的各链的DNA序列融合的序列的DNA，即，具有使有意义链DNA的3’末端和反义链DNA的5’末端融合的序列的DNA，或者将具有使互补的DNA的3’末端和有意义链的DNA的5’末端融合的序列的DNA掺入表达载体。上述病毒载体可以是腺病毒载体或逆转录病毒载体等。这样的RNAi希望在30个碱基以内，最好是21个碱基。
(5)表达抑制物质的导入在体外的细胞培养系统中将表达抑制物质导入细胞内时，可将制备的反义核苷酸、核酶、大酶、RNAi等表达抑制物质，用电穿孔法、微量注射法、脂质转染法、用腺病毒、逆转录病毒等病毒载体等的病毒感染法或用钙的转染法等，导入作为对象的癌细胞。
作为将表达抑制剂导入个体体内的方法，可以是将以如上制备的反义核苷酸、核酶、大酶、RNAi等表达抑制物质作为有效成分的表达抑制剂，直接给于人或人以外的脊椎动物中作为导入对象的癌细胞附近，也可根据表达抑制剂不经口、口服、皮内、皮下、静脉内、肌肉内或腹腔内给予的方法。这种情况下，表达抑制剂可根据使用部位和目的还含有药理学上许可的适当的赋形剂或基质。
作为给予个体的表达抑制剂，较好是配制成使表达抑制物质容易被细胞摄取的形态。例如，可以是将编码上述反义核苷酸、核酶、大酶、RNAi的DNA融合入病毒载体而得到的表达载体，在体外感染适当的细胞株，产生病毒，并注射此病毒引起感染的方法。作为病毒载体，可以用在细胞内表达的腺病毒载体和逆转录病毒载体。
此外，可通过使上述表达载体包裹入脂质体中，与癌细胞融合而将质粒导入细胞内。也可用TransIT In Vivo Gene Delivery System(TakaRa的商品名)进行体内转染。这种情况下，表达抑制剂可直接注射于患部或静脉注射。
也可将如上制备的反义核苷酸、核酶、大酶、RNAi等RNA，经体外选择法(invitro selection)与易导入细胞内的HIV的TAT等肽结合，将形成的RNA适体(RNAaptamer)作为表达抑制剂进行注射。
作为对象的癌细胞，具体可例举人大肠癌细胞SW480和人食道癌细胞TTn，但只要是能确认由DPGF受体α基因的外显子1β转录的mRNA，什么癌细胞都可以。
(6)表达抑制物质的表达抑制作用的评价用上述(5)记载的方法，对在体外培养的特定的癌细胞导入了表达抑制物质和未导入的，通过RT-PCR法比较评价由PDGF受体α基因的外显子1β转录的mRNA的量，可对表达抑制物质的表达抑制作用进行评价。此外，也可用通过Northern印迹法等评价由PDGF受体α基因的外显子1β转录的mRNA的量的方法。根据这些结果，发现可更有效地抑制由PDGF受体α基因的外显子1β转录的mRNA的翻译的反义核苷酸。
上述是体外试验，也可能用体内试验进行评价。
作为体内评价方法，具体可例举以下方法。即，对正常小鼠皮下注射上述特定的癌细胞，在一定期间内使肿瘤生长，其后用(5)的导入方法给予如上制备的表达抑制剂一至数次。给予后，通过比较评价导入了表达抑制剂的小鼠和未导入表达抑制剂的小鼠的癌的大小和生存率，可进行表达抑制物质的表达抑制作用的评价。
以下，详细说明本发明的实施例。
<实施例1>
本实施例鉴定PDGF受体α基因中由转录因子E2F-1控制的新外显子。
首先，本申请的发明者发现小鼠NIH3T3细胞加入PDGF后其增殖不依赖于支架(scaffold)。因此考察了该细胞株中PDGF受体α(PDGFR-α)的表达，发现PDGF受体的表达上升，它在转录水平受到调控。
由于细胞周期蛋白D1通过依赖细胞周期的pRb磷酸化而使转录因子E2F-1活化，研究了其上升是否是由于E2F-1对人PDGF受体α的启动子的调节。将转录起始点的-1395至+312的序列(根据Genomics，Vol.30，224-232，1995报道的转录起始点将碱基编号。参照GenBank登录编号D50001S01)组成的启动子区域，用pGL3荧光素酶载体克隆在荧光素酶基因的上游，在细胞周期蛋白D1过度表达的NIH3T3细胞中用转染法与E2F-1的表达载体一起导入。培养24～72小时后，进行荧光素酶测定，考察上述启动子的转录活性。作为阳性对照，使用在mFGFR-1的启动子的下游插入了荧光素酶基因的质粒。其结果是，mFGFR-1启动子的转录活性上升，但PDGF受体α的启动子的转录活性未见上升(图4)。因此，表明以前知道的PDGF受体α的启动子并不参与过度表达细胞周期蛋白D1的小鼠NIH3T3细胞中的PDGF受体α的表达的上升。
另外，通过转录因子结合序列检索(TF search)，考察在人PDGFR-α基因的外显子1β的下游是否是与E2F-1结合的共有序列，发现据认为E2F-1可结合的序列在报告的转录起始点下游约1kbp附近成群地存在于4个位置。因此，将由-295至+1445的碱基序列组成的DNA结合在荧光素酶基因的上游，用所得的报道构建物与上述记载的方法同样进行荧光素酶测定，考察E2F-1的转录活性。其结果是，可确认该区域的转录活性由于E2F-1而上升(图5)。此外，无E2F-1转录活化能的突变E2F-1(1～368位的氨基酸序列)或132位的亮氨酸被谷氨酸取代而无DNA结合能的突变E2F-1均未见转录活性，因而提示该区域实际由E2F-1调节。
然而，推定的E2F-1结合位点位于所报告的转录起始点下游约1.2kbp，很难认为该启动子活性作用于以前报告的转录启始点。因此，为考察该区域是否作用于以前报道的转录起始点，制作了缺失该转录起始点的不同长度的缺失突变体，与上述方法同样进行荧光素酶测定，考察E2F-1的转录活性。其结果是，在转录起始点下游缺失达到约1kbp的构建物也具有启动子活性，而且E2F-1引起的转录活性也见上升。由这些结果提示PDGFR-α由E2F-1调节的mRNA从新的转录起始点表达的可能性(图6)。
因此，用5’-RACE法确定E2F-1引起的转录起始点。将荧光素酶基因上游结合了-295至+1445的碱基序列组成的DNA的报道构建物经转染导入NIH3T3细胞株，从该细胞株提取mRNA，用5’-Full RACE Core Set(TakaRa的商品名)，通过对荧光素酶基因序列具特异性的引物[正向引物-1(序列编号45’-CCTTAATTAAGGGATTCTCGCATGCCAGAGATCCTA-3’)和反向引物-1(序列编号55’-CCTTAATTAAGGGGCGCAACTGCAACTCCGATAAAT-3’)]进行PCR，得扩增产物。考察该扩增产物的DNA序列后发现，在以前认为是内含子的区域存在新的外显子。这样，证明在以前认为是内含子的区域存在着由E2F-1调节转录的新的外显子。
<实施例2>
本实施例确定PDGF受体α基因的外显子1β是否在癌细胞中特异地表达。
根据PDGF受体α基因的外显子1β和已知的外显子4的序列设计引物[正向引物-2(序列编号65’-CCTTAATTAAGGAACCGCACACCAAGGGGCCCTCATT-3’)和反向引物-2(序列编号75’-AACAGCACAGGTGACCACAATCG-3’)]，用从图1所示的各癌细胞提取的总RNA进行RT-PCR。如图1所示，人大肠癌细胞SW480和人食道癌细胞TTn中检出信号。回收这些扩增的条带，测定DNA序列后发现，这些条带是PDGF受体α基因的外显子1β和已知的外显子2～4的序列连结的人PDGFR-α的mRNA片断，同时测定了序列编号1所示的全长338bp的外显子1β的序列。即发现新鉴定的启动子区域是人PDGFR的mRNA2(图7)。
<实施例3>
用5’-RACE法测定外显子1β的5’末端的更正确的位置。从表达含外显子1β的PDGFR-αmRNA的人骨肉癌细胞MG-63提取mRNA，用5’-Full RACE Core Set，以对外显子1β特异的引物[正向引物-2(序列编号6)和反向引物-3(序列编号85’-CCGCTCGAGGCGACGACGACTTCTTCACTCAGG-3’)]进行PCR。测定该PCR所得扩增产物的DNA序列的结果是，得到序列编号2所示的363bp的碱基序列，发现外显子1β的5’末端至少延伸到+1210。
产业上利用的可能性如上所述，本发明可提供用于仅选择性抑制癌特异性PDGF信号的表达抑制方法的多核苷酸、表达抑制物质、表达抑制剂以及癌症的治疗剂。
序列表<110>学校法人庆应义塾(KEIO UNIVERSITY)<120>PDGF受体α基因的外显子1β及其应用<130>PCT/711<150>JP 02/332142<151>2002-11-15<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>338<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<223>发明人Imoto，Masaya发明人Minato，Yusuke发明人Tashiro，Etsu<400>1gcgcgggggc gacagcggcg gcgcgggcgg gcggtctgga ataatgacaa acacatttgg 60ccctgagtga agaagtcgtc gtcgcctcgc attccagcaa ctgggatttg aggaatttcg120aaccgcacac caaggggccc tcattgtgct ccgtggcccc cgcccccgcc cgtcttcccg180cgccccctcc tcggtggaat catttctgca ttgcccgggg gctctgcttt cgctcagttc240tggccgcagg caggaagaga ggaaaggtct ccaggaaggt gccgaacttc ttgtgaggaa300gttagggacg acttggaact ggggaaactt gtttgcag338<210>2<211>363<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)
<400>2cagtgtgctc gggttgcacg ccctagcgcg ggggcgacag cggcggcgcg ggcgggcggt 60ctggaataat gacaaacaca tttggccctg agtgaagaag tcgtcgtcgc ctcgcattcc120agcaactggg atttgaggaa tttcgaaccg cacaccaagg ggccctcatt gtgctccgtg180gcccccgccc ccgcctgtct tcccgcgccc cctcctcggt ggaatcattt ctgcattgcc240cgggggctct gctttcgctc agttctggcc gcaggcagga agagaggaaa ggtctccagg300aaggtgccga acttcttgtg aggaagttag ggacgacttg gaactgggga aacttgtttg360cag 363<210>3<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>启动子序列<400>3taatacgact cactata17<210>4<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>正向引物2<400>6ccttaattaa ggaaccgcac accaaggggc cctcatt 37<210>7<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向引物2<400>7aacagcacag gtgaccacaa tcg 23<210>8<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向引物3<400>8ccgctcgagg cgacgacgac ttcttcactc agg 3权利要求
1.多核苷酸，其特征在于，具有序列编号2所示的碱基序列或其一部分。
2.多核苷酸，其特征在于，具有在序列编号2所示的碱基序列中缺失、取代或插入一个或数个碱基，并包含在PDGF受体α基因的有意义链的碱基序列中的碱基序列或其一部分。
3.多核苷酸，其特征在于，具有与权利要求1或2所述的多核苷酸互补的碱基序列或其一部分。
4.PDGF受体α的表达抑制方法，其特征在于，以含有PDGF受体α基因的mRNA中的外显子1β的mRNA为靶。
5.如权利要求4所述的PDGF受体α的表达抑制方法，其特征还在于，使用反义核苷酸、核酶、大酶或RNAi。
6.如权利要求4所述的PDGF受体α的表达抑制方法，其特征还在于，使用编码反义RNA、核酶、大酶或RNAi中的任一种的DNA。
7.PDGF受体α的表达抑制物质，其特征在于，以含有PDGF受体α基因的mRNA中的外显子1β的mRNA为靶。
8.如权利要求7所述的PDGF受体α的表达抑制物质，其特征还在于，它是反义核苷酸、核酶、大酶或RNAi。
9.如权利要求7所述的PDGF受体α的表达抑制物质，其特征还在于，它是编码反义RNA、核酶、大酶或RNAi中的任一种的DNA。
10.PDGF受体α的表达抑制剂，其特征在于，以权利要求7所述的表达抑制物质为有效成分。
11.癌症的治疗剂，其特征在于，含有权利要求10所述的表达抑制剂。
12.癌症的治疗方法，其特征在于，使用权利要求10所述的表达抑制剂。
全文摘要
用基于特定的癌细胞中表达的PDGF受体α基因的外显子1β的碱基序列或其一部分多肽制作的反义核苷酸、核酶、大酶或RNAi，抑制由PDGF受体α基因的外显子1β转录的mRNA的翻译。以反义核苷酸、核酶、大酶或RNAi等抑制表达的物质为有效成分的表达抑制剂作为癌症的治疗剂是有效的。
文档编号A61K31/7088GK1729291SQ20038010705
公开日2006年2月1日 申请日期2003年11月14日 优先权日2002年11月15日
发明者井本正哉, 湊雄介, 田代悦 申请人:学校法人庆应义塾