用于癌症治疗的经修饰的细胞因子的制作方法

专利名称：用于癌症治疗的经修饰的细胞因子的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于癌症治疗的经修饰的细胞因子。更优选的是，本发明涉及能够定向于肿瘤血管以及抗原呈递细胞的细胞因子衍生物。本发明还涉及含有经修饰的细胞因子的具有协同作用的组合物。
背景技术：
一些细胞因子的抗肿瘤活性是已知的，并且已经有所描述。一些细胞因子也已经应用于人类治疗(29)。例如，像白介素-2(IL-2)和白介素α(IFNα)这样的细胞因子已经在不同类型肿瘤患者中显示出确切的抗肿瘤活性，所述肿瘤如肾转移性癌，多毛细胞白血病，卡波西肉瘤，黑色素瘤，多发性骨髓瘤等等。其它细胞因子例如IFNβ，肿瘤坏死因子(TNF)α，TNFβ，IL-1，4，6，12，15和集落刺激因子(CFSs)已经显示出对于一些类型肿瘤具有确定的抗肿瘤活性，因此它们成为进一步研究的目标。
一般而言，细胞因子的治疗性应用极大地受到其全身性毒性的限制。例如，最初发现TNF具有能够诱导某些肿瘤出血性坏死的能力(1)，并且其在体外对不同肿瘤细胞系产生细胞毒效应(2)，但是后来证明其具有促炎活性，这种活性在产生过量的情况下会对人体产生危险的影响(3)。
由于全身性毒性是细胞因子以药理学活性量在人类中应用的一个基本的难题，现在旨在保持这类生物学效应物的治疗效能的同时减少其毒性作用的新型衍生物和治疗性策略正在评估之中。
一些新的方法旨在a)研制能够将TNF转移至肿瘤中并提高局部浓度的融合蛋白质。例如，已经生产出由TNF和肿瘤特异性抗体组成的融合蛋白质(4)；b)研制保持抗肿瘤活性并且全身性毒性得以减弱的TNF突变体。因此，现在已经制备出能够选择性地识别单一受体(p55或p75)的突变体(5)；c)使用能够减少TNF的一些毒性作用但不损伤其抗肿瘤活性的抗TNF抗体。文献中已对这些抗体进行了描述(30)；d)使用具有更高半衰期的TNF衍生物(例如与聚乙二醇缀合的TNF)。
最近已经报道了能够选择性地靶向肿瘤位点的TNF衍生物的制备。例如，已经描述了一种融合蛋白质，其通过将抗-转铁蛋白受体mAb的重链基因与TNF基因相融合而获得(4)，或是抗肿瘤相关的TAG72抗原的单克隆抗体的“铰链”区域与TNF相融合的融合蛋白(6)，或一种Fv-TNF融合蛋白(6)。
EP 251 494公开了一种诊断剂或治疗剂的给药系统，其包括一种与抗生素蛋白或抗生物素蛋白链菌素缀合的抗体，一种能够使缀合抗体和缀合有生物素的诊断剂或治疗剂构成的化合物复合的试剂，其按顺序给药并被充分地延迟，通过由所述抗体识别生物素-抗生物素蛋白链菌素在靶细胞上的相互作用，从而使得诊断剂或治疗剂的定位成为可能。所述治疗剂或诊断剂包括金属螯合物，尤其是放射性核素和低分子量抗肿瘤剂例如顺铂、阿霉素等螯合物。
EP 496 074公开了一种方法，其提供了以生物素化抗体、抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素以及生物素化诊断剂或治疗剂顺序给药的方法。虽然其一般地提及了细胞毒素剂如篦麻毒素，但主要公开了与放射性标记的化合物相关的应用。
WO 95/15979公开了一种将高毒性剂定位于细胞靶点的方法，该方法基于以第一结合物给药之后再以第二缀合物给药，所述第一结合物包括与一种配体或抗-配体缀合的特异性靶分子，所述第二缀合物由缀合于一种抗-配体或配体的毒性剂构成。
WO 98/10795公开了肿瘤靶向分子，其包括含有氨基酸序列NGR的肽。并未描述所述肽对于将细胞因子靶向于肿瘤的用途。
WO 99/13329公开了基于将一种分子与NGR受体的配体相结合将该分子靶向于肿瘤血管生成的脉管上的方法。许多分子已经被建议为可能的替补物质，但仅仅对阿霉素进行了明确的描述。并未公开NGR受体的配体作为细胞活素载体以诱导免疫反应的用途。
WO 01/61017公开了选自TNF或IFNγ的细胞因子与CD13受体配体的一种缀合产物。
发明概述现在已经惊人地发现与CD13受体的一种配体偶联的TNF与IFNγ协同作用以至于分别以低于有效剂量的剂量共给药可以观察到有效的抗-癌活性。此外，我们发现通过以IFNγ给药，经修饰的TNF与另一种抗-癌剂例如阿霉素的组合的抗肿瘤活性得到了提高。
发明的目的根据本发明的一个方面，提供了一种药物组合物，其包括一种有效量的TNF与CD13受体的一种配体的偶联产物和一种有效量的IFNγ。
发明详述现在将通过非限制性的实施例描述本发明的各种优选特征和实施方式。
所述CD13受体的配体可以是一种抗体或其片段例如Fab、Fv、单链Fv、一种肽或肽模拟物，也就是能够结合CD13受体的类肽分子，任选地含有经修饰非天然存在的氨基酸。
CD13是一种在各种物种中高度保守的150kDa跨膜糖蛋白。它在正常细胞和骨髓瘤细胞系、血管生成的内皮以及一些上皮细胞中表达。CD13受体通常被认为是“NGR”受体。这些配体可以是天然的或是合成的。术语“配体”也指一种化学修饰的配体。配体的一个或多个结合区域可以由例如与受体结合的天然配体，或保持与受体的结合亲和力的天然配体的片段构成。合成的配体包括设计者配体(designer ligands)。这里所用的术语“设计者配体”指的是可基于它们的三维空间形态与受体结合的因子，其可与受体的空间形状相比拟。
所述配体优选是含有NGR基序的直链肽或环肽，例如CNGRCVSGCAGRC、NGRAHA、GNGRG、环状的CVLNGRMEC或环状的CNGRC，或更优选的是肽CNGRC。这些配体在WO98/10795中已有描述，其已并入本文作为参考。WO99/13329描述了识别CD13受体的配体的方法，其已并入本文作为参考。
在一个实施方式中，提供了一种筛选能够结合至CD13受体的试剂的方法，该方法包括将细胞表面分子与一种因子接触并确定该因子是否与所述的细胞表面分子结合。
这里所用的术语“试剂”包括但不限于一种化合物，例如一种检测化合物，其可以从任意合适的来源获得或产生，这种来源可以是天然的，也可以是非天然的。这种因子可以被设计出来或直接由化合物文库中获得，这种文库含有肽和其它化合物，例如小的有机分子，尤其是新的先导化合物。举例说来，这种因子可以是一种天然物质、一种生物学大分子，或是一种从例如细菌、真菌或动物(尤其是哺乳动物)细胞或组织的生物物质中获得的提取物、有机或无机分子、合成的试验化合物、半合成试验化合物、结构的或功能的模拟物、肽、肽模拟物、衍生的检测化合物、从完整的蛋白质中切下的肽，或人工合成(例如举例来说或者使用一种肽合成机)或通过重组技术获得的肽或其组合、重组的试验化合物，天然或非天然的试验化合物、融合蛋白质或其等同物和突变体、衍生物或其组合。
所述因子可以是氨基酸序列或其化学衍生物。该物质甚至可以是一种有机化合物或其它化学制剂。
这里所用的术语“肽模拟物井宽泛地是指具有与CD13配体结合活性的类肽分子。
可供选择的是，所述配体可从免疫球蛋白(Ig)可变区的重链和轻链序列获得。这种可变区可从天然人抗体或从其它物种的抗体例如啮齿类抗体中获得。可供选择的是，可变区可以从工程化抗体如人源化抗体中获得或从免疫或非免疫动物中所构建的噬菌体展示文库或经诱变的噬菌体-显示文库中获得。作为另一个选择，可变区可从单链可变片段获得(scFv)。所述配体可含有其它序列以实现多聚化作用(multimerisation)，或者作为结合区域之间的间隔区而起作用或者作为通过在编码配体的基因中插入限制性位点所产生的间隔区而起作用，所述序列包括Ig铰链区序列或新的间隔区和工程化的连接子序列。
所述配体除了一个或多个免疫球蛋白可变区之外还可以包括全部或部分Ig重链恒定区，因此可以含有天然的完整Ig、工程化Ig和工程化的Ig类分子、单链Ig或单链Ig类分子。可供选择的是，或此外，BP可含有从另外的蛋白质例如毒素获得的一个或多个区域。
这里所用的“抗体”是指由一个或多个主要由免疫球蛋白基因或其片段编码的多肽构成的蛋白质。抗体可以以完整的免疫球蛋白或一些片段的形式存在，包括通过用各种肽酶消化获得的经明确表征的片段。然而根据对完整的抗体的消化定义不同的抗体，任何技术人员都能够认识到抗体片段可以在体外通过化学或通过重组DNA方法合成。因此，这里所用的术语抗体也包括通过对完整抗体进行修饰或通过重组DNA方法体外合成获得的抗体片段。通过使用术语“抗体”，抗体片段包括但不限于Fab、Fab′、F(ab′)2、scFv、Fv、dsFv双链抗体和Fd片段。
如果需要多克隆抗体，用一种带有一个表位(s)的免疫原性多肽对一种挑选出来的动物(例如，小鼠、兔、山羊、马等)进行免疫。收集经免疫动物的血清，依照已知方法进行处理。如果在含有针对一种表位的多克隆抗体的血清中含有针对于其它抗原的抗体，则可以通过免疫亲合层析法纯化这些多克隆抗体。生产和加工多克隆抗血清的技术是本领域中已知的。为了能够制备出所述抗体，本发明还提供了在动物或人类中作为免疫原的本发明的多肽或被半抗原化而变成其它多肽的该多肽片段。
本领域技术人员也可以容易地获得定向结合于多肽中的细胞表面表位的单克隆抗体。通过杂交瘤制备单克隆抗体的一般方法是熟知的。生产抗体的无限增殖细胞系可以通过细胞融合来构建，也可以通过其它技术构建例如直接用致癌DNA转化B淋巴细胞，或用埃-巴二氏病毒转染。可以对生产获得的一组针对表位的单克隆抗体根据不同活性，例如同种型和表位亲和性进行筛选。
另一种可供选择的技术涉及筛选噬菌体展示文库，所述文库例如噬菌体在其衣壳表面表达scFv片段和大量决定簇互补区(CDRs)。该技术在本领域中是熟知的。
为了本发明的目的，除非有与此相反的指定，术语“抗体”包括保留对靶抗原的结合活性的完整抗体的片段。如上所述，这些片段包括Fv、F(ab′)和F(ab′)2片段和单链抗体(scFv)。此外，抗体和其片段可以是人源化抗体，如EP-A-239400所述。
这里所用的术语“肽”包括多肽和蛋白质。术语“多肽”包括单链多肽分子和多倍多肽复合体，所述复合体中单个的组分多肽之间以共价或非共价连接。术语“多肽”包括长度为2个或更多个氨基酸的肽，典型的是具有多于5、10或20个的氨基酸。
应当理解的是本发明中使用的多肽序列并不限于某种特定序列或其片段，而且还包括从任何来源获得的同源序列，例如相关的病毒/细菌的蛋白质、细胞同源物和合成肽以及其变异体或衍生物。本发明的多肽序列还包括由本发明的多核苷酸编码的多肽。
与本发明的氨基酸序列相关的术语“变异体”或“衍生物”包括对该序列的一个(或更多)氨基酸进行任意的取代、变异、修饰、替换、缺失、添加，只要所获得的氨基酸序列优选具有靶向活性，更优选具有序列表中所示多肽的至少25至50％活性，更为优选至少具有基本相同的活性。
因此，本发明中使用的序列可以被修饰。典型的是，进行能保持序列活性的修饰。因此，在一个实施方式中，如果经修饰的序列要保持至少大约25至50％或基本相同的活性，那么可以进行例如1、2或3至10、20或30个氨基酸的替换。然而，在一个可供选择的实施方式中，可以有目的地对本发明的一个多肽的氨基酸序列进行修饰以减少多肽的生物学活性。例如缺少功能效应区域但仍能与靶分子结合的经切割的多肽可能是有益的。
一般而言，优选与序列表中描述的相应区域相比，变异体或衍生物的少于20％、10％或5％氨基酸残基被改变。
氨基酸替代可以包括使用非天然存在的类似物，例如用以提高用于治疗性给药的多肽的血浆半衰期(参见下文以获得用于治疗的肽衍生物的生产的更多细节)。
例如，可以按照下表进行保守性替代。第二栏的同一单元格中的氨基酸和优选第三栏同一行中的氨基酸可以互相替换
本发明的多肽还包括上述多肽的片段及其变异体，包括其序列的片段。优选的片段包括含有表位或结合区域的片段。合适的片段其长度至少约为5，如10、12、15或20个氨基酸。它们的长度也可以少于200、100或50个氨基酸。蛋白质的多肽片段和等位基因和其物种变异体可以含有包括保守替代在内的一个或更多(如2、3、5或10)替代、缺失或插入。通过例如重组技术进行取代、缺失和/或插入的序列，优选其序列表中所列的序列的少于20％、10％或5％氨基酸残基被改变。
本发明的多肽和缀合物通常是通过重组方法获得的，例如通过下述方式获得。然而也可以采用技术人员已知的技术通过合成方法如固相合成法获得上述物质。Borgia和Fields在2000，TibTech18243-251中已经对各种化学合成多肽的技术进行了评述，并且其所引用的参考文献对这些技术进行了详细描述。
可以将肽直接偶联于或通过间隔区间接地偶联于细胞因子，所述间隔区可以是单个氨基酸、一段氨基酸序列或一个有机残基，例如6-癸酰胺-N-羟基琥珀酰亚胺。偶联步骤是本领域技术人员已知的，其包含基因工程或化学合成技术。
优选将肽配体连接于细胞因子的N-末端，从而使得经修饰的细胞因子与其受体结合中的任何干扰减少到最小。可供选择的是，该肽可与分子中天然存在的或通过基因工程技术人工插入的氨基酸残基相连接，所述氨基酸残基是氨基-或羧基-键受体。所述经修饰的细胞因子优选通过采用含有编码该肽的5’-邻近序列的cDNA制备得到。
根据一个优选实施方式，其提供了一种TNF和CNGRC序列之间的偶联产物。更优选的是，TNF的氨基-末端通过间隔子G(甘氨酸)连接于CNGRC肽。
经证明所得产物(NGR-TNF)比RMA-T淋巴瘤动物模型中的TNF活性更高。而且，经NGR-TNF处理的动物能够进一步抵抗致瘤剂量的RMA-T或RMA细胞。与正常TNF相比，在免疫活性动物中能够观察到抗肿瘤活性获得提高，但在免疫缺陷性动物中没有提高。这表明与“NGR”肽缀合的TNF的抗肿瘤活性的提高是由于免疫应答的增强而非该缀合物直接的细胞毒素活性所引起。
还证实了体内由NGR-TNF引起的免疫反应与CD13直接相关。例如，已经观察到特异于CD13受体的抗体和GNGRC配体在体内均与NGR-TNF相竞争，因此提示了由NGR-TNF介导的一种受体靶向机制。
TNF/CD13配体缀合物的治疗指数可以通过使用一种能够选择性地结合两种TNF受体之一的TNF突变型而获得提高，所述TNF受体为p75TNFR和p55TNFR。所述TNF突变型可通过定点诱变获得(5；7)。
本发明的经修饰的细胞因子的药物动力学可通过制备可使得细胞因子的血浆半衰期获得延长的聚乙二醇衍生物而获得提高。
本发明的另一个实施方式提供了双功能衍生物，其中经CD13配体修饰的细胞因子与抗肿瘤抗原或其它肿瘤血管生成的标记物的抗体或其片段、定向于胞外基质的成分的抗体或其片段，如抗肌腱蛋白抗体或抗纤连蛋白EDB区域缀合，其中肿瘤血管生成的标记物例如为αv整联蛋白、金属蛋白酶或血管生成因子。最近已经报道了TNF与针对胃腺癌和卵巢腺癌表达的肿瘤相关性TAG72抗原的mAb的铰链区的融合产物的制备(6)。
本发明的另一个实施方式提供了一种采用生物素/抗生物素蛋白的肿瘤预靶向系统。根据这种方法，在不同阶段在肿瘤抗原位点获得一种三元复合物，其由1)生物素化的mAb，2)抗生物素蛋白(或链霉抗生物素蛋白)和3)经CD13受体和生物素修饰的二价细胞因子形成。许多论文已经证明了与传统的采用免疫缀合物的靶向法相比，预靶向方法确实能够提高定位于靶点的活性分子与游离活性分子的比率，从而减少治疗毒性(11，10，9，8)。这种方法利用生物素化的TNF产生了良好结果，该生物素化的TNF能够在体外诱导细胞毒性，并且在正常TNF无活性的条件下减缓肿瘤细胞的生长(14，26)。该预靶向法也可以通过采用同时结合肿瘤抗原和经修饰的细胞因子的双特异性抗体的双相法进行。最近已经报道了将针对癌胚抗原和TNF的双特异性抗体作为一种TNF肿瘤预靶向的工具(31)。
根据另一个实施方式，本发明包含在不同TNF亚基上(直接地或通过生物素-抗生物素蛋白桥间接地)同时与一个CD13配体和一个抗体或其片段缀合的TNF分子，其中抗体或其片段针对肿瘤细胞表达的抗原或肿瘤基质的其它成分，如肌腱蛋白和纤连蛋白EDB区域。这使得经修饰的细胞因子的肿瘤靶向性质获得进一步改良，并且使得后者通过三聚体-单体-三聚体转变在肿瘤微环境中得以缓慢释放。如上述工作所示，事实上，TNF缀合物的经修饰亚基能够从靶向复合物中分离并重新聚集以形成未经修饰的三聚体TNF分子，其而后在肿瘤微环境中扩散。已经证实生物活性TNF的释放在靶向后24-48小时出现(21)。
可以将本发明的肽治疗性地给药于患者。优选不采用仅由天然存在的氨基酸构成的肽而是经修饰的肽，例如经修饰以减小免疫原性，或提高患者体内循环半衰期，提高生物利用率和/或提高效力和/或特异性。
已经有许多对肽进行修饰以用于治疗性用途的方法。一种方法是将肽或蛋白质与各种聚合物，例如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG)连接-参见例如美国专利Nos.5,091,176、5,214,131和US5,264,209。
也可以采用以各种非编码或经修饰的氨基酸例如D-氨基酸和N-甲基氨基酸替换天然存在的氨基酸来修饰肽。
另一种方法是使用双功能交联剂，例如N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯、N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯和硫代琥珀酰亚胺-6-[3-(2-吡啶二硫基)丙酰胺]己酸酯(参见美国专利5,580,853)。
理想的是使用本发明的构象受约束的肽的衍生物。构象约束指的是肽呈现出其三维形态的稳定性和优势构象。构象约束包括局部受约束，其包括限制肽中单个残基的构象的可动性；区域性受约束，其包括限制-组可能形成某个二级结构单元的残基的构象的可动性；和整体的受约束，其包括整个肽结构。
可以通过共价修饰，例如环化或通过掺入γ-内酰胺或其它类型的桥来稳定肽的活性构象。例如，侧链可被环化到主链上以在相互作用位点的两侧构建起L-γ-内酰胺部分。参见Hruby等，“Applications of Synthetic Peptides”in SyntheticPeptidesA User’s Guide259-345(W.H.Freeman&Co.1992)。也可以通过例如形成半胱氨酸桥，将相应的末端氨基酸的氨基端和羧基端基团相偶联，或将赖氨酸残基的氨基或相关同系物与天冬氨酸、谷氨酸或相关同系物的羧基偶联而实现环化。也可以通过碘代酐将多肽的α-氨基与赖氨酸残基的ε-氨基相偶联。参见Wood和Wetzel，1992，Int′l J.Peptide Protein Res.39533-39。
US5,891,418中描述了另一种方法，其包括在肽结构中络合了金属离子的主链。典型的是，优选的金属-肽主链基于特定的络合金属离子的配位区域所需的特殊的配位基团的必需的数量。一般说来，大部分可证明有用的金属离子的配位数为4-6。肽链上配位基团的种类包括具有胺、酰胺、咪唑或胍基官能团的氮原子；硫醇类或二硫化物的硫原子；和具有羟基、酚、羰基或羧基官能团的氧原子。此外，肽链和各氨基酸可以通过化学方法被改变成包含一个配位基团例如肟、肼基、巯基、磷酸盐、氰基、嘧啶、哌啶子基、吗啉子基。这种肽构建体可以是线性的，也可以是环化的，然而线性构建体通常是优选的。小的线性肽的一个例子是Gly-Gly-Gly-Gly，其主链中具有4个氮(N4络合系统)，该主链可与配位数为4的金属离子络合。
用于提高治疗性肽的特性的另一种技术是采用非肽的模拟肽。可采用许多种有用的技术来阐明肽的精确结构。这些技术包括氨基酸测序、x-射线晶相学、质谱分析、核磁共振分析、计算机辅助的分子模拟、肽图谱及其组合。肽的结构分析通常提供包含肽的氨基酸序列和其原子组分的三维定位在内的大量数据。根据这些信息，可以设计出非肽的模拟肽，其具有治疗活性所需的化学官能团但是更为稳定，例如更不易被生物降解。US5,811,512提供了这种方法的一个例子。
化学合成本发明的肽的技术在上述文献中均有描述，并且在Borgia和Fields，于2000在TibTech 18243-251发表的文献中也有评述，其所引用的参考文献中有具体的描述。
为了用于治疗，以合适的方式将本发明的经修饰的细胞因子制备成用于口服或非肠道给药的药物制剂。优选用于非肠道给药的剂型，其包括可注射用溶液剂或混悬剂和输注用的液体剂。为了制备非肠道给药制剂，将活性成分溶解或重悬于无菌载体、任选地添加的赋形剂如增溶剂、等渗剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂或分散剂中，接着分装到小瓶或安瓿中。
更详细的是，包括多肽和多核苷酸的本发明的缀合物可优选与各种成分混合以产生本发明的组合物。所述组合物优选与药物可接受载体、稀释剂或赋形剂组合以产生一种药物组合物(可用于人类或动物)。合适的载体和稀释剂包括等渗压盐溶液，例如磷酸盐缓冲盐水。可在Wade & Weller，American Pharmaceutical Association著《Handbook of Pharmaceutical Excipients》第二版中找到赋形剂的详细资料。本发明的组合物可通过直接注射给药。组合物可以制备成用以非肠道、肌肉内、静脉内、皮下、眼内、口腔给药或通过皮肤给药的形式。
组合物可以制备成每日给药、每星期给药或每月给药一次可提供所需每日剂量的形式。理想的是所述组合物可被便利地制备成以更低频率给药的形式，例如每2、4、6、8、10或12小时给药一次。
编码多肽组分的多核苷酸/载体可以以裸核酸构建体形式进行直接给药，其优选进一步包括与宿主细胞的基因组同源的侧翼序列。
通过几种已知的转染技术，如包括使用转染试剂的技术来提高哺乳动物细胞对裸核酸构建体的吸收。这些转染试剂的例子包括阳离子试剂(例如磷酸钙和DEAE-葡聚糖)和lipofectants(例如lipofectamTM和transfectamTM)。典型的是，核酸构建体与转染试剂相混合以产生一种组合物。
优选的是，本发明的多核苷酸或载体与一种药学可接受的载体或稀释剂相结合以产生一种药物组合物。合适的载体和稀释剂包括等渗压盐溶液，例如磷酸盐缓冲盐水。该组合物可以制备成用以非肠道、肌肉内、静脉内、皮下、眼内、口腔给药或通过皮肤给药的形式。
所述给药途径和给药方案仅意欲作为一种指导，因为熟练的从业人员能够为任何具体的患者和病症容易地确定出最佳给药途径和给药方案。
将细胞因子制备成脂质体形式能够提高其生物活性。事实上，已经观察到在体外TNF氨基的酰化引起其疏水性增强而其生物活性却没有降低。而且，已有报道称结合于脂质的TNF在体外不影响细胞毒性、在体内的免疫调节作用并减少毒性(12，13)。
在人体内大丸剂TNF的最大耐受剂量为218-410μg/m2(32)，比在动物体内的有效剂量低约10倍。基于从鼠科模型中获得的数据，人们相信为了在人体内获得抗肿瘤作用，必需至少加大十倍剂量(15)。在最初的对肢体高温隔离灌注的临床研究中，用单独的剂量为4mg的TNF与苯丙氨酸氮芥和干扰素γ联合应用获得了高反应率(16)。其它工作表明也可不用干扰素γ，即使TNF的剂量更低也足以引起治疗反应(17，18)。由于这两种细胞因子对内皮细胞有协同作用，它们组合之后，紧接着选择的目标可能产生更强的抗肿瘤活性，从而让克服肿瘤治疗中采用相同细胞因子组合物通常会遇到的全身性毒性的问题成为可能。此外，公知的是TNF能够降低内皮内层导管的屏障作用，从而提高其对大分子的渗透性。利用采用本发明的经修饰的TNF分子进行处理的低毒性，以及其肿瘤血管靶向特性，另一项可供选择的应用是其在提高肿瘤血管对于其它化合物的渗透性中的用途或用于治疗或诊断目的。举例来说，经修饰的TNF可被用于提高肿瘤的放射性免疫闪烁扫描法和放射免疫性疗法中肿瘤对放射性标记抗体或激素(肿瘤成像化合物)的吸收。可供选择的是，对化疗药、免疫毒素、载有药物或基因的脂质体或其它抗肿瘤药的吸收也可被提高，从而使得其抗肿瘤作用获得增强。
因此，本发明的细胞因子可以用于组合的、分离的或连续的制剂中，也可与其它诊断或治疗基质一起用于癌症的诊断和治疗中。
本发明涉及经修饰的TNF与IFNγ的组合的应用。该组合物可用于组合的、分离的或连续的制剂中。有利的是该组合物与其它诊断或治疗基质一起用于癌症的诊断和治疗中，例如阿霉素和苯丙氨酸氮芥。因此本发明提供了一种药物组合物，其含有修饰的TNF与IFNγ的组合，并任选另一种肿瘤治疗或抗肿瘤治疗基质。而且，该组合物可以用于组合的、分离的或顺序的制剂中。
在我们的专利申请PCT/IB03/02187中，我们发现微克剂量的细胞因子的靶向传输提高了化疗药的穿透性，为提高化疗药的治疗指数提供了一种新颖的并且令人惊奇的方法。因此将专利申请PCT/IB03/02187完整的并入本文作为参考文献。更为详细的是，我们已经发现以极低剂量的细胞因子向肿瘤和包括肿瘤脉管系统在内的肿瘤相关环境进行传输，为消除负反馈机制以及保存其改变药物-穿透屏障的能力提供了一种新的方法。
本发明的组合物可以被配制成用以非肠道、肌肉内、静脉内、皮下、眼内、口腔给药或通过皮肤给药的形式。在本发明关于这方面的一个实施方式中，本发明的缀合物可以以0.5至500ng/kg的剂量范围内给药，优选在1至50ng/kg范围内，更优选在5至15ng/kg范围内。
在本发明关于这方面的一个可供选择的实施方式中，提供了一种药物组合物，其含有与IFNγ相组合的本发明的缀合物，其中所述缀合物的存在量使得能够向被治疗的患者的血浆中提供的该缀合物或其代谢物的量不超过约35,000ng/天，优选约3,500ng/天，更优选1,000ng/天。
上述剂量涉及用于一个70kg患者的剂量。本领域的熟练技术人员能够容易地对所列举的剂量进行更改以用于质量超过70kg的患者。
所述给药途径和给药方案仅意欲作为一种指导，因为熟练的从业人员能够针对任何具体的患者和病症容易地确定出最佳给药途径和给药方案。
本发明的另一方面关注于编码本文所述缀合的细胞因子的cDNA，其可以通过加入编码CD13配体，优选编码上述靶向肽的5’-或3’-邻近DNA序列而由细胞因子cDNA制备获得。组合的cDNA可同样用于或在插入载体后用于基因治疗。在(19)中描述了合适的载体的制备和治疗性应用，其并入本文作为参考。
本发明所使用的多核苷酸包括编码本发明的多肽缀合物的核酸序列。本领域熟练技术人员可理解的是由于遗传密码的简并性，许多不同的核苷酸能够编码同样的多肽。此外，应被理解的是本领域熟练技术人员可以采用常规技术进行不影响本发明的核苷酸所编码的多肽序列的核苷酸替换，以反应在要表达本发明多肽的任意特定宿主生物体中的密码子的使用。
本发明的多肽包括DNA或RNA。它们可以是单链或双链。它们也可以是多核苷酸，其包括合成的或经修饰的核苷酸。对寡核苷酸的多种不同类型的修饰是本领域已知的。它们包括甲基膦酸酯和硫逐磷酸酯主链，在所述分子的3′和/或5′端添加吖啶或聚赖氨酸链。为了实现本发明的目的，应被理解的是本文所述的多核苷酸可以以任何现有技术中可知方法进行修饰。可以进行这种修饰以提高本发明的多核苷酸在体内的活性和寿命。
本发明的多核苷酸可以被整合到重组的可复制载体中。该载体可被用于在合适的宿主细胞中复制核酸。因此在另一个实施方式中，本发明提供了通过将本发明的多核苷酸导入可复制载体中，将该载体导入到合适宿主细胞中并在引起载体复制的条件下培养宿主细胞来制备多核苷酸的一种方法。可从宿主细胞中回收该载体。合适的宿主细胞包括细菌，例如大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞系和其它真核细胞系，例如昆虫Sf9细胞。
优选的是，载体中的本发明的多核苷酸可操作地连接于一段能够提供通过宿主细胞表达编码序列的控制序列，例如该载体是一种表达载体。术语“可操作地连接”是指所述成分处于能够允许各成分以预计方式起作用的关系中。一种“可操作地连接”于编码序列的调节性序列通过这种的方式连接，使得在与控制序列不矛盾的条件下实现编码序列的表达。
可通过例如添加另一种转录调节元件对所述控制序列进行修饰以使得由控制序列导向的转录水平对转录调节因子的反应更强。
为了表达本发明的蛋白质，可以以下文所述方式将本发明的载体转化或转染到一种合适的宿主细胞中。这个过程可以包括在提供由编码所述蛋白的序列的载体表达的条件下培养经上述载体转化的宿主细胞，并任选地回收表达的蛋白质。
所述载体可以是例如质粒或病毒载体，其装备有复制起点、任选的表达所述核苷酸的启动子以及任选的启动子的调节子。所述载体可含有一个或更多个选择性的标记基因，例如就细菌质粒而言，是一种氨苄青霉素抗性基因或者就哺乳动物载体而言，是一种新霉素抗性基因。所述载体可用于例如转染或转化一种宿主细胞。
可操作性地连接到编码本发明的蛋白质的序列上的控制序列包括启动子/增强子和其它表达调控信号。可对这些控制序列进行选择以与用于表达载体预计使用的宿主细胞相适应。术语“启动子”是本领域已知的，其包括大小和复杂性可从由最小的启动子变化至包括上游元件和增强子的启动子的核酸区域。
尽管也可以使用原核启动子和在其它真核细胞中有功能的启动子，但是所述启动子通常在哺乳动物细胞中有功能的启动子中选出。所述启动子通常是从病毒或真核基因的启动子序列获得。例如，其可以是从要进行表达的细胞的基因组中获得的启动子。至于真核启动子，它们可以是以普遍存在的方式起作用的启动子(例如a-肌动蛋白、b-肌动蛋白、微观蛋白启动子)或者，可供选择的是，以组织特异性方式起作用的启动子(例如丙酮酸激酶基因的启动子)。也可以使用特异于某种细胞的组织特异性启动子。它们可以是对特殊刺激源有反应的启动子，例如与类固醇激素受体结合的启动子。也可使用病毒启动子，例如Moloney鼠白血病病毒的长末端重复(MMLV LTR)启动子、劳氏肉瘤病毒(RSV)LTR启动子或人巨细胞病毒(CMV)IE启动子。
对于启动子而言，如果其为可诱导型以使得同源基因在细胞的生存期内的表达水平可被调节也是有利的。也可对采用启动子获得表达水平的诱导方法进行调节。
此外，这些启动子中的任何一个都可通过加入另一种调节序列，例如增强子序列而被修饰。也可使用包括来自两个或更多个上述不同启动子的序列元件的嵌合启动子。
为了复制载体/多核苷酸和/或表达由本发明的核苷酸编码的蛋白质，可将本发明的载体和多核苷酸导入到宿主细胞中。尽管可采用原核细胞作为宿主细胞来生产本发明的蛋白质，但优选采用真核细胞，例如酵母、昆虫或哺乳动物细胞，尤其是哺乳动物细胞。
可采用大量本领域已知的技术，例如转染、转化、电穿孔将本发明的载体/多核苷酸导入到合适的宿主细胞中。其中要向动物体给药本发明的载体/多核苷酸时，有几种技术是本领域中已知的，例如以重组病毒载体如逆转录病毒、单纯性疱疹病毒、腺病毒侵染、直接注射核酸和生物导弹式的转化。
可以采用含有本发明的多核苷酸的宿主细胞来表达本发明的缀合物。可在合适的容许本发明的多肽和缀合物表达的条件下培养宿主细胞。本发明产物的表达可能是组成型的，以便它们可以得到连续生产，或者也可以是可诱导型的，这需要一种刺激源来起始表达。至于可诱导型表达，如果需要可通过如在培养基中加入一种诱导基质如地塞米松或IPTG来起始蛋白质的生产。
本发明的缀合物可以通过大量现有技术中的已知技术从宿主细胞中提取，所述技术包括通过酶法、化学方法和/或渗透溶胞和物理裂解。


附图1TNF和NGR-TNF对RMA-T淋巴瘤(a和b)的生长以及对动物体重的影响(c和d)。
5个动物/组，在肿瘤移植10天后用单一剂量的TNF或NGR-TNF(腹腔内注射)进行治疗。根据对数曲线内推作为剂量(b)的函数的第14天的肿瘤面积值和治疗后体重的减少量(第11天和第12天的平均值)(d)。在14天时1μg或9μg的NGR-TNF引起的抗肿瘤作用比相当剂量的TNF所引起的抗肿瘤作用更强(分别为P＝0.024和P＝0.032)，而经治疗后体重减少量近似。箭头表示用外推法求得的引起类似作用的TNF和NGR-TNF的剂量。
附图2mAb R3-63和CNGRC对NGR-TNF(a)和TNF(b)的抗肿瘤活性的影响。
在肿瘤移植12天后，将MAb R3-63或CNGRC与NGR-TNF或TNF相混合，对长有RMA-T肿瘤的动物(n＝5个动物/组)给药。在一个单独的实验中(c)，将TNF和NGR-TNF与CNGRC或CARAC(对照肽)一起共给药于载带有11天大肿瘤的动物体(n＝5)。1μgNGR-TNF比9μg的TNF的抗肿瘤作用更强(P＝0.009，在20天时t检验)，并且这种作用极大地受到CNGRC(P＝0.035)和mAbR3-63(P＝0.011)的抑制。
附图3NGR-TNF和TNF的有限的胰蛋白酶消化对它们质量(a)和抗肿瘤活性的影响(b)。
根据生产商提供的说明，通过1mg胰蛋白酶与1ml活性CH琼脂糖(Activated CH Sepharose)(Pharmacia-Upjohn)偶联制备出胰蛋白酶-琼脂糖。NGR-TNF和TNF(300μl 0.15M氯化钠，0.05M磷酸钠，pH7.3中每份170μg)与15μl胰蛋白酶悬液混合(1∶4)或单独与缓冲液混合并在37℃下在指定的时间由末端-末端转动。通过0.22μm Spin-X装置(Costar，Cambridge，MA)对四种产物进行过滤，并将产物保存于-20℃直至使用。(a)电喷雾质谱分析法。分子量值和相应的产物(N-末端序列)均在各峰标出。序列上的箭头表示切割位点。(b)不与胰蛋白酶(上图)或与胰蛋白酶(下图)一起孵育的1或3μg的NGR-TNF和TNF对RMA-T肿瘤和动物体重的影响(经1和3μg的剂量处理的组的平均值+标准误差)。动物在肿瘤移植后13天进行处理(n＝5个动物/组)。
附图4变性/重折叠之前和之后人NGR-TNF的SDS-PAGE以及抗肿瘤活性。
在非还原条件下，实施例V中所述变性/重折叠过程之前(b)和之后(c)人TNF(a)，NGR-TNF的SDS-PAGE。
TNF和未重折叠的NGR-TNF对RMA-T淋巴瘤生长(B)和体重(C)的影响。人TNF(D)和重折叠NGR-TNF(由＞95％含有链内二硫化物的三聚体构成)(E)对肿瘤生长的影响。在肿瘤移植10天后，用一个剂量腹腔内给药TNF或NGR-TNF来治疗动物(如每张图所示，15或5只小鼠/组)。
附图5C57BL6小鼠中中和的抗mIFNγ抗体(AN18)对NGR-mTNF的抗肿瘤活性的影响以及阿霉素对B16F1肿瘤的影响。
附图6NGR-TNF和阿霉素在敲除IFN的小鼠中的作用。
附图7在裸鼠中NGR-mTNF、mIFNγ和阿霉素(单独或组合在一起)对B16F1肿瘤的影响。
附图8NGR-TNF和阿霉素在裸鼠中的作用。
附图9在免疫活性小鼠(C57BL6)中，NGR-mTNF、mIFNγ和阿霉素对B16F1肿瘤的影响。
附图10在敲除IFN的小鼠中，IFN当与NGR-TNF组合在一起时提高阿霉素在肿瘤中的穿透性。
下面的实施例进一步说明本发明。
实施例I鼠TNF和NGR-TNF的制备通过细胞质cDNA在大肠杆菌中表达生产出鼠重组TNF和Cys-Asn-Gly-Arg-Cys-Gly-TNF(NGR-TNF)。通过对从经脂多糖刺激的鼠RAW-264.7单核细胞-巨噬细胞中分离的mRNA进行反向转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)制备出编码鼠Met-TNF1-156的cDNA(20)，其中采用5′-CTGGATCCTCACAGAGCAATGACTCCAAAG-3′和5′-TGCCTCACATATGCTCAGATCATCTTCTC-3′作为3′和5′引物。
用Nde I和Bam HI(New England Biolabs，Beverley，MA)消化所扩增的片段，并克隆于预先经相同酶消化的pET-11b(Novagen，Madison，WI)中。
采用5′-GCAGATCATATGTGCAACGGCCGTTGCGGCCTCAGATCATCTTCTC-3′作为5′引物，上述3′引物对pTNF进行PCR扩增而获得编码Cys-Asn-Gly-Arg-Cys-Gly-TNF1-156的cDNA。按上述方法消化所扩增的片段并克隆到pET-11b中，并用于转化BL21(DE3)大肠杆菌细胞(Novagen)。根据pET11b生产商的说明用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导TNF和NGR-TNF的表达。通过在2mM乙二胺四乙酸、20mM Tris-HCl，pH8.0中进行细菌的超声波降解，然后离心(15000xg，20分钟，4℃)，从2升培养物中获得可溶性TNF和NGR-TNF。将两种提取物与硫酸铵混合(25％饱和)，置于4℃下1小时，然后按上述方式离心。那么上清液中的硫酸铵的饱和度就达到了65％，置于4℃下24小时，然后离心。将每个团块溶解于200ml的1M硫酸铵、50mM Tris-HCl，pH8.0中，然后在苯基-琼脂糖6 Fast Flow(Pharmacia-Upjohn)(梯度洗脱，缓冲液A50mM磷酸钠，pH8.0，含有1M硫酸铵；缓冲液B20％甘油，5％甲醇，50mM磷酸钠，pH8.0)上通过疏水作用色谱法进行纯化。收集含有TNF免疫活性物质(通过蛋白质印迹法)的部分，用2mM乙二胺四乙酸、20mM Tris-HCl，pH8.0透析，通过在DEAE-琼脂糖Fast Flow(Pharmacia-Upjohn)(梯度洗脱，缓冲液A20mMTris-HCl，pH8.0；缓冲液B1M氯化钠，20mM Tris-HCl，pH8.0)上的阳离子交换对其进行纯化。收集合有TNF-免疫反应活性的部分，通过用150mM氯化钠、50mM硫酸钠缓冲液，pH7.3(PBS)预平衡和洗脱的Sephacryl-S-300 HR(Pharmacia-Upjohn)上的凝胶过滤色谱纯化。收集符合40000-50000Mr产物的部分，分成等份并于-20℃储藏。所有在色谱分离步骤中使用的溶液都是用无菌的无内毒素的水(Salf，Bergamo，Italy)配制的。最后产率为45mg TNF和34.5mg NGR-TNF。
电喷雾质谱法测定纯化的TNF和NGR-TNF的分子量。采用商购的蛋白质检测试剂盒(Pierce，Rockford，IL)测定蛋白质的含量。以定量的生色的Lymulus Amoebocyte Lysate(LAL)检测(BioWhittaker)测得TNF和NGR-TNF的内毒素含量依次为0.75单位/μg和1.38单位/μg。
通过标准方法采用12.5或15％聚丙烯酰胺凝胶进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹分析。
通过可溶性p55-TNF受体(sTNF-R1)-琼脂糖凝胶上的亲合层析按下列方式对少量TNF和NGR-TNF进行进一步的纯化以所述方式(22)制备5mg重组sTNF-R1，并按照生产商的说明偶联于2ml活化的-CH-琼脂糖凝胶(Pharmacia)上。用无菌并且无内毒素的溶液彻底清洗两根彼此分离的柱子(每根1ml)，往柱中装载进纯化的溶于PBS的TNF或NGR-TNF，用梯度洗脱液(1小时，缓冲液APBS；缓冲液B0.5M氯化钠，0.2M甘氨酸-HCl)洗脱。中和含有TNF-抗原的部分，在无菌的生理溶液中透析。在透析之前加入无内毒素的人血清蛋白(0.5mg/ml)以阻止蛋白质吸附在膜上。通过ELISA和细胞溶解测试检测每份中的TNF含量。
TNF的非还原性SDS-PAGE显示一条17-18kDa条带，如所预期的单体TNF(未显示)。所不同的是，NGR-TNF的非还原性SDS-PAGE和蛋白质印迹分析显示大小为18，36和50kDa的不同的免疫活性形式，其可能对应于单体、二聚体和三聚体。在还原条件下，50和36kDa条带大部分转化为18kDa形式，其表明NGR-TNF分子与链间二硫桥键的存在。18kDa条带共占总物质的约2/3，而36kDa占剩余的大部分。这些电泳图案暗示NGR-TNF是一种由含有适当的链内二硫键的三个单体亚基构成的三聚体(至少50％)和剩余部分大部分为具有一个或多个链内二硫键的三聚体的混合物。同样通过还原性SDS-PAGE观察36kDa条带得到这样的启示NGR-TNF也含有不可逆变性的二聚体(约占总量的10％)。
通过电喷雾质谱法测得TNF和NGR-TNF单体的分子量依次为17386.1+2.0Da和17843.7+2.5Da。这些值与所预期的Met-TNF1-156(17386.7Da)和CNGRCG-TNF1-156(17844.2Da)大小完全吻合。
实施例II鼠TNF和NGR-TNF的体外细胞毒性活性通过基于L-M小鼠成纤维细胞(ATCCCCL1.2)的标准细胞溶解测试，按照所述方法(23)测定TNF和NGR-TNF的生物活性。在30ng/ml放线菌素D存在的条件下针对TNF和NGR-TNF对RMA-T细胞的细胞溶解活性进行检测。在三种不同的稀释度下，一式两份地对每个试样进行分析。结果表示为2-3个独立测试的平均数±标准偏差。
通过采用L-M细胞的标准细胞溶解测试测得TNF和NGR-TNF的体外细胞毒性活性依次为(1.2+0.14)×108单位/mg和(1.8±0.7)×108单位/mg。这些结果表明，NGR-TNF分子上的CNGRCG部分不阻止折叠、低聚反应和与TNF受体的结合。
在先前的研究中我们说明了RMA-T可在30ng/ml放线菌素D存在的条件下被TNF杀死，而若缺少转录抑制因子，即使在孵育几天后这些细胞对TNF仍具有抵抗力。在放线菌素D存在的条件下NGR-TNF对RMA-T细胞的体外细胞毒性活性为(1.4+0.8)×108单位/mg，其是采用TNF((1.2±0.14)×108units/mg)作为标准测量得出的。因此，NGR-TNF和TNF对L-M和RMA-T细胞的细胞毒性活性相似。
实施例III鼠TNF和NGR-TNF的治疗活性和毒性的表征在RPMI 1640、5％胎儿牛血清(FBS)、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.25μg/ml两性霉素B、2mM谷氨酰胺和50μM2-巯基乙醇中体外保存C57BL/6来源的劳舍尔病毒诱导的RMA淋巴瘤。通过以一种编码Thy1.1等位基因的构建体转染从RMA细胞系中获得RMA-T并以所述方式培养(14)。
在RPMI 1640、5％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.25μg/ml两性霉素B、2mM谷氨酰胺和1％MEM非必需氨基酸(BioWhittaker Europe，Verviers，Belgium)中培养B16F1黑色素瘤。
在动物模型中进行的体内研究已获Ethical Committee of theSan Raffaele H Scientific Institute批准，并按照规定准则进行。在左侧腰窝分别以5×104RMA-T或B16F1活细胞皮下注射来激发C57BL/6(Charles Rivet Laboratories，Calco，Italy)(16-18g)。在肿瘤植入10-12天后，用腹腔注射250μl经无内毒素的0.9％氯化钠稀释的TNF或NGR-TNF溶液处理小鼠。预备试验显示在TNF和NGR-TNF溶液中加入人血清蛋白作为载体对抗肿瘤活性没有改变。通过用测径计测量，对肿瘤生长进行每日监控。通过计算r1×r2估计肿瘤面积，而通过计算r1×r2×r3×4/3估计肿瘤体积，其中r1和r2为纵向和横向的半径，r3是由正常皮肤表面上突起的肿瘤厚度。在肿瘤直径达到1.0-1.3cm之前杀死小鼠。肿瘤尺寸表示为平均值+标准偏差(如图例所示每组5-10个动物)，并通过t-检验进行比较。
在C57BL6小鼠中采用RMA-T淋巴瘤和B16F1黑色素瘤模型比较NGR-TNF与TNF的抗肿瘤活性和毒性。由于RMA-T模型先前已经被表征并被用于以不同靶向方案研究TNF的抗肿瘤活性(26)，我们决定在本研究中也采用该模型。
施于带有已建立的RMA-T肿瘤的动物体的鼠TNF24小时后，引起肿瘤体积减小并导致肿瘤中心部分出血性坏死，之后肿瘤的生长严重延迟了数日(26)。以TNF单一处理甚至以接近LD50的剂量处理并不能诱导该肿瘤完全退化，这是由于坏死区域周围的活细胞在处理后几天内开始生长。
在第一组实验中，我们研究了以不同剂量腹腔内注射的TNF或NGR-TNF对动物存活的效果。为了避免过多的痛苦，当肿瘤直径超过1-1.3cm时处死动物。处理三天后TNF和NGR-TNF的致死率是相似的(分别为LD50、60μg和45μg)，而它们的抗肿瘤活性却有显著性差异(表1)。
表1.经TNF或NGR-TNF处理的长有RMA-T淋巴瘤小鼠的存活率

a)长有肿瘤的动物在肿瘤植入10天后经TNF或NGR-TNF腹腔内注射给药。当肿瘤直径超过1-1.3cm时处死动物。
b)用50,000RMA-T细胞(第二次激发)或50,000RMA(第三次)在指定时间对存活动物再次激发。每次针对5个正常动物监控所注射细胞的致肿瘤性。所有对照组动物在10天内都形成出一个肿瘤(数据未示出)。
举例来说，1或3μg NGR-TNF比27μg TNF对肿瘤生长的延迟更为有效，这表明NGR-TNF至少具有一种更高的数量级的活性。有趣的是，一些动物以低于LD50剂量的NGR-TNF进行治疗而获得治愈，而根本没有动物通过TNF而获得治愈。治愈的动物抵制进一步由致肿瘤剂量的RMA-T或野生型RMA细胞的激发，这暗示以NGR-TNF进行一次处理能够诱导保护性免疫。值得注意的是，加大TNF或NGR-TNF的剂量超过9-27μg将显著地提高毒性并且略微或根本不改变治疗活性。
作为TNF处理带来的结果，重量的损失是一项公知的全身性毒性的病症(26)。因此，为了进一步比较TNF和NGR-TNF的功效/毒性的比率，我们在处理后对肿瘤生长和动物的体重进行监控。1μg NGR-TNF对肿瘤生长的作用相似于或更高于9μg TNF的作用(附图1a)，而其处理1-2天后体重的减少与经1μg TNF造成的体重的减少相当(附图1c)。当我们使用剂量一反应图中的对数曲线内插数据时，我们发现14天时9μg TNF的治疗效果仅以少至0.6μg的NGR-TNF就可获得(附图1b)。与此相反，8.5μg的剂量对于诱导相当的毒性作用是必需的(附图1d)。因此，在这些条件下计算出的NGR-TNF的功效/毒性比TNF高14倍。
用B16F1黑色素瘤模型也获得了相似的结果。在第11天和第17天以1μg NGR-TNF进行的处理诱导出在第19天时的抗肿瘤应答比以4μg TNF获得的更强，与以12μg TNF获得的相似(数据未示出)。与之相反，由1μg NGR-TNF引起的重量的减少比由4和12μg TNF引起的明显少。以12μg NGR-TNF进行的处理甚至引起了更强的抗肿瘤效果，而毒性作用仅与12μg TNF相似。
当在第19天进行第三次注射时，在1-2天后各组中出现一些动物死亡(经盐水和12μg NGR-TNF治疗组中每5只中有2只死亡，余下组中每5只中有一只死亡)。值得注意的是，一种经12μg NGR-TNF处理的动物完全抵排斥了肿瘤。当以致肿瘤发生剂量的B16F1细胞第二次激发该动物时，在18天后形成了一个可触摸到的肿瘤，而对照组动物在6-7天内就形成了肿瘤。
总而言之，这些结果提示NGR-TNF对于抑制肿瘤生长的功效比TNF高10-15倍而毒性相似。而且，NGR-TNF比TNF能更为有效地诱导保护性免疫应答。
实施例IVNGR-TNF作用的机理从腹水中通过蛋白质-G-琼脂糖凝胶层析(Pharmacia-Upjohn，Uppsala，Sweden)纯化出抗-小鼠CD13 mAb R3-63，在0.9％氯化钠中透析。
由Primm srl(Milan，Italy)购得兔多克隆抗血清，在蛋白质-A-琼脂糖凝胶(Pharmacia-Upjohn)上通过亲合层析进行纯化。以前述方式制备CNGRC和CARAC肽(28)。
为了提供证据证明NGR-TNF的改良活性取决于通过NGR部分的肿瘤靶向，我们研究了NGR-TNF在体内的活性是否可被CNGRC部分竞争。为了这个目的，我们对长有RMA-T肿瘤的小鼠施以添加或不添加1摩尔额外的CNGRC的NGR-TNF(1μg)。与之平行的是其它动物用添加或不添加CNGRC的TNF(3或9μg)进行处理。如所预期的，CNGRC极大地减少了NGR-TNF的抗肿瘤活性(附图2a)，而未减少TNF的抗肿瘤活性(附图2b)。不同的是，对照肽(CARAC)不能引起NGR-TNF活性的大幅度减少(附图2c)。这些结果提示CNGRC与NGR-TNF竞争与CNGRC受体的结合，这就支持了关于改良活性的靶向机理的假设。值得注意的是，CNGRC不能减少NGR-TNF在体外的细胞毒活性(数据未示出)。
由于近来有报道称氨肽酶N(CD13)是一种CNGRC肽的受体，接着我们研究了这种受体在NGR-TNF的靶向机理中的贡献。为了这个目的，我们研究了抗-CD13 mAb(R3-63)对NGR-TNF和TNF的抗肿瘤活性的影响。MAb R3-63极大地抑制了NGR-TNF的抗肿瘤活性(附图2a)但未抑制住TNF(附图2b)，这表明CD13确实关键性地介入于NGR-TNF的抗肿瘤活性。通过对加入mAb R3-63的培养细胞进行FACS分析，观察到CD13在RMA-T细胞表面不表达(数据未示出)，这暗示可在体内通过抗体识别其它细胞。
尽管这些数据指示CD13是NGR-TNF的一个重要受体，但是我们不能完全排除与其它尚未识别的NGR受体的结合(即使程度很低)也会对靶向机理有贡献。
部分蛋白质水解的预备试验显示TNF(第2-3位残基)的N-末端区段的Arg-Ser键对胰蛋白酶十分敏感，而该分子的其它部分则更具抵抗力。因此，为了进一步提供能够证明NGR-TNF的改良活性与NGR部分相关的证据，我们设法通过用固定化的胰蛋白酶部分消化而从突变蛋白质N-末端区切下NGR区域。这种处理将NGR-TNF和TNF都转化成TNF3-156片段(预计大小为16986.2Da；测量的质量及预期序列参见附图)。
虽然消化并未减少NGR-TNF对L-M细胞(2.3±1.4)×108U/mg)的体外细胞溶解活性，但是其体内的抗肿瘤活性减少至TNF(附图3b)的水平。值得注意的是，根据处理一天后动物体重减少的量来判断，消化前和消化后NGR-TNF和TNF的毒性是相似的(附图3b，右图)，这说明依赖于NGR的靶向机理并不改变毒性。
实施例V人TNF和NGR-TNF的制备和表征通过重组DNA技术制备人的重组TNF和NGR-TNF(由人TNF1-157与CNGRCG的C末端融合构成)，基本上按照所述鼠TNF和NGR-TNF的纯化方式进行纯化。通过在含有hTNF编码序列的质粒(33)上进行PCR，采用下列引物制备出编码人NGR-TNF的cDNA-NGR-hTNF/1(正义)5’A TATCAT ATGTGC AAC GGC CGT TGC GGCGTC AGA TCA TCdT TCT CG 3’.
-NGR-hTNF/2(反义)5’TCAGGA TCCTCA CAG GGC AAT GAT CCCAAA GTA GAC 3’消化扩增片段，在pET-11b(Nde I/BamH I)中克隆并用于转化BL21(DE3)大肠杆菌细胞(Novagen)。根据pET11b生产商的说明，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导NGR-hTNF表达。通过在2mM乙二胺四乙酸、20mM Tris-HCl，pH8.0中进行细菌的超声波降解，然后离心(15000xg，20分钟，4℃)，从2升培养物中获得可溶性NGR-TNF。
将提取物与硫酸铵混合(35％饱和)，置于4℃下1小时，然后按上述方式离心。那么上清液中的硫酸铵的饱和度就达到了65％，置于4℃下24小时，然后离心。将每个团块溶解于1M硫酸铵、50mMTris-HCl，pH8.0中，然后在苯基-琼脂糖6Fast Flow(Pharmacia-Upjohn)(梯度洗脱，缓冲液A100mM磷酸钠、pH8.0、含有1M硫酸铵；缓冲液B70％乙二醇、5％甲醇、100mM磷酸钠，pH8.0)上通过疏水作用色谱法进行纯化。收集含有hTNF免疫活性物质(通过ELISA)的部分，用20mM Tris-HCl，pH8.0透析，通过在DEAE-琼脂糖Fast Flow(Pharmacia-Upjohn)(梯度洗脱，缓冲液A20mM Tris-HCl，pH8.0；缓冲液B1M氯化钠、20mM Tris-HCl，pH8.0)上的阳离子交换对其进行纯化。所有在色谱分离步骤中使用的溶液都是用无菌的无内毒素的水(Salf，Bergamo，Italy)配制的。
在这一点上从2升培养物中回收了约有30mg TNF和32mgNGR-TNF。非还原性SDS-PAGE显示了单体、二聚体和三聚体的条带，这表示人NGR-TNF也是一种有适当的链内二硫键的三聚体和具有一个或多个链间二硫桥键的三聚体的混合物(附图4A，泳道b)，这与鼠NGR-TNF一样。
通过以下四步变性-重折叠法从所述混合物中分离出具有适当的链内二硫键桥的三聚体以7M脲使纯化的人NGR-TNF变性，通过一种经7M脲、100mM Tris-HCl，pH8.0预平衡的HR Sephacryl S-300柱(1025ml)(Pharmacia)进行纯化。收集对应于单体的部分，通过YM MWCO 10kDa膜(Amicon)超滤，并通过在33倍体积的2.33M脲、100mM Tris-HCl，pH8中在4℃(140min)(140分钟)透析、而后在1.55M脲、100mM Tris-HCl，pH8(140分钟)透析和在1M脲、100mM Tris-HCl，pH8(140分钟)中透析而重折叠。最后在80倍体积100mM Tris-HCl(16小时)中透析，以13000xg离心(30分钟)，经SFCA 0.45μm膜(Nalgene)过滤，并通过经0.15M氯化钠、0.05M磷酸钠(PBS)预平衡的HR Sephacryl S-300柱(1020ml)(Pharmacia)凝胶过滤。约23mg重折叠的蛋白质获得回收。
经非还原性SDS-PAGE后，最终产物大部分为单体(附图4A，泳道c)，经在Superdex 75 HR柱上进行分析性的凝胶过滤HPLC，最终产物具有与三聚体人TNF相似的流体力学体积(未示出)，经电喷雾质谱分析测得最终产物的分子量为17937.8+1.8Da(预期的CNGRCG-TNF1-157的值为17939.4Da)。非重折叠和重折叠的NGR-TNF在体外对鼠L-M细胞的细胞溶解活性依次为(6.11×107)+4.9和(5.09×107)+0.3单位/mg，而纯化的人的TNF为(5.45×107)+3.1单位/mg。这些结果表明变性-重折叠过程不对人NGR-TNF与鼠p55受体之间的相互作用产生影响。
1μg人NGR-TNF(非重折叠)在体内的抗肿瘤活性比10μg TNF高(附图4B)，而由动物的体重来判断毒性却明显低(附图4C)。在重折叠之后，0.3μg NGR-TNF足以诱导比用10μg TNF所实现的更强的抗肿瘤效果(附图4D，4E)。
这些结果表明人NGR-TNF的抗肿瘤效果比人TNF的强。
此外，我们观察到重折叠的人和小鼠NGR-TNF即使在非常低的剂量(1-10ng/小鼠)下也能够对长有RMA-T肿瘤的小鼠诱导产生显著的抗肿瘤效果并且没有证据显示有毒效应，而在同样这些剂量下TNF不能诱导产生显著的效果(未示出)。
实施例VI鼠TNF和NGR-TNF的制备和表征通过重组DNA技术，以与NGR-TNF基本相同的方式制备与CNGRCG(NGR-IFNγ)融合的鼠干扰素(IFN)γ。CNGRCG区域与IFNγ的C末端相融合。此外，134位点的半胱氨酸被置换为丝氨酸；为了在大肠杆菌中表达，在位点-1处插入蛋氨酸。用于生产NGR-IFNγcDNA的PCR引物为5’-A TAT CTA CAT ATG CAC GGC ACA GTC ATT GAA AGC C(正义)和5’-TC GGA TCC TCA GCA ACG GCC GTT GCA GCC GGA GCG ACT CCT TTTCCG CTT CCT GAG GC。将cDNA克隆于pET-11b(Nde I/BamH I)中并用于转化BL21(DE3)大肠杆菌细胞(Novagen)。根据pET11b生产商的说明，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导蛋白质的表达。通过采用固定于琼脂糖的抗鼠IFNγmAb(AN18)的免疫亲合层析，按照标准技术从大肠杆菌提取物中纯化出产物。终产物的还原性和非还原性SDS-PAGE显示出大小为16kDa的单一条带。电喷雾质谱分析显示出分子量为16223+3.6Da(预期为1625.5Da)，相应于鼠Met-IFNγ1-134(C134S)CNGRC(NGR-IFNγ)。
通过免疫组织化学方法研究了NGR-IFNγ和NGR-TNF与抗-CD13抗体竞争结合肿瘤相关性血管的能力。
人肾细胞癌的新鲜外科样品是从Histopathology Department ofthe San Raffaele H Scientific Institute获得的。制备出Bouin固定的(4-6h)石蜡包埋的切片(5-6μm厚)，将其吸附于涂布有聚赖氨酸的载玻片上。采用下述的抗生物素蛋白-生物素蛋白复合物的方法检测CD13抗原按照标准方法采用二甲苯和分级乙醇系列再水合组织切片。将组织切片置于一种含有1mM EDTA的容器中，用微波炉(1000W)煮沸7分钟。再往该容器中填充1mM EDTA，再煮沸5分钟。将组织切片冷却，并在含有0.3％过氧化氢的PBS中孵育15分钟以抑制内源性过氧化物酶。然后用PBS冲洗样品，并与100-200μl PBS-BSA一起孵育(室温下1小时)，然后单独用mAb WM15(抗-hCD13)孵育或用与各种竞争剂(参见表2)在PBS-BSA中混合的mAb WM15(抗-hCD13)孵育(4℃过夜)。用PBS冲洗载玻片三次，在含有2％正常马血清的PBS-BSA(PBS-BSA-NHS)(Vector Laboratories，Burlingame，CA)中孵育5分钟。然后用3μg/ml生物素化的在PBS-BSA-NHS中的马抗小鼠IgG(H+L)(Vector Laboratories，Burlingame，CA)替换该溶液，然后再在室温下孵育一小时。再次清洗载玻片，用以1∶100稀释于PBS中的Vectastain Elite Reagent(Vector Laboratories，Burlingame，CA)孵育30分钟。在10ml含有0.03％过氧化氢的去离子水中溶解一片3，3’-二氨基-联苯胺-四盐酸盐(Merck，Darmstadt，Germany)，经0.2μm膜过滤后覆盖于组织切片上5-10分钟。以上述方式清洗载玻片，用哈里斯苏木精复染。通过用抗CD31 mAb(mAbJC/70A，anti-human CD31，IgG1，由DAKO，Copenhagen，Denmark获得)对组织的系列切片染色来鉴别出与肿瘤相关的血管。
上述结果总结于表2中。如其所示，WM15与肿瘤相关性血管的结合受到过量NGR-TNF、NGR-IFNγ和CNGRC的抑制，但并不受其它缺少NGR基序的对照试剂的抑制。这表示NGR在CD13上的结合位点与WM15表位在空间上重叠。与之相反，NGR-TNF不能与13C03竞争与上皮细胞的结合。
我们推断NGR-IFNγ和NGR-TNF的NGR部分能够与由mAb WM15识别的肿瘤相关性血管上的一种CD13形式相互作用。而且，这些结果表明CNGRC基序无论连接于细胞因子的N末端还是C末端都是有活性的。
表2.各种竞争剂存在条件下WM15与肾细胞癌切片的结合竞争剂 WM15与肿瘤相关性血管的结合无 +NGR-TNF(25μg/ml) -NGR-IFNγ(50μg/ml)-CNGRC(100μg/ml) -TNF(25μg/ml) +人血清蛋白(25μg/ml) +合成的CgA(60-68)(100μg/ml)+a在封闭步骤中加入溶于含有2％BSA的PBS中的竞争剂，然后与原初抗体混合。
bmAb WM15(抗人CD13，IgG1)是从Pharmingen(San Diego，CA)获得的；合成的肽CgA(60-68)对应于嗜铬粒蛋白A的片段60-68。
实施例VII采用抗肿瘤抗体和抗生物素蛋白的生物素化的NGR-TNF向肿瘤的靶向性传递(预靶向)下面的实施例根据肿瘤靶向抗体和肽CNGRC的结合阐述了TNF的“双重”靶向的可能性。
通过在pH6.8、1M碳酸钠缓冲液中将NGR-TNF与D-生物素-6-氨基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SocietáProdotti AntibioticiS.p.A，Milan，Italy)相混合(室温下3小时)而制备出一种生物素-NGR-TNF缀合物(21)。用1M Tris-HCl，pH7.5中断反应。
通过质谱分析法鉴定该缀合物，发现其含有1个生物素/三聚体(平均)。在左腰窝处以5×104个RMA-T活细胞皮下注射来激发C57BL/6(Charles River Laboratories，Calco，Italy)。当肿瘤面积达到40mm2时，按照前述“三天”策略向小鼠依次注射生物素化抗体、抗生物素蛋白和生物素-TNF(26)。我们注射了40μg生物素-mAb19E12(腹膜内步骤I)，18和19小时后分别注射60μg抗生物素蛋白和60μg抗生物素蛋白链霉素(腹膜内，步骤II)，，24小时后注射3μg生物素-NGR-TNF(腹膜内，步骤III)。每一种化合物均是以无菌的0.9％氯化钠溶液稀释的。在对照实验中，省去了抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白。各实验均在5只小鼠/组中进行。通过以测径计测量肿瘤大小来对肿瘤进行每日监控。在以mAb19E12-生物素/抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白/生物素-NGR-TNF(5只动物，平均值±标准偏差)处理的组中，处理前和处理后10天的肿瘤面积分别为39+4mm2和8+5mm2。对照组中(仅经mAb 19E12-生物素/生物素-NGR-TNF处理)，处理前和处理后10天的肿瘤面积分别为40+4mm2和20+6mm2，这表明以肿瘤靶向抗体和抗生物素蛋白预靶向提高了NGR-TNF的活性。
实施例VIIINGR-TNF和干扰素γ之间的协同效应以前述方式培养鼠B16F1黑色素瘤细胞(Curnis et al.，2000；Moro et al.，1997)。
中和的抗-IFNγ单克隆抗体AN18由P.Dellabona(Milan，Italy)友情提供。阿霉素(Adriblastina)从Pharmacia-Upjohn(Milan，Italy)商购获得。重组鼠IFNγ由Peprotech Inc.(USA)商购获得(内毒素含量＜1单位/μg)。将BALB/c自发性乳腺瘤的TS/A细胞培养于RPMI 1640培养基、10％胎儿牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.25μg/ml两性霉素B、2mM谷氨酰胺和含非必需氨基酸的1％最低必需培养基(BioWhittaker Europe，Verviers，Belgium)中。
通过重组DNA技术制备鼠TNF和NGR-TNF(由TNF与CNGRCG的C末端融合构成)，以前述方式从大肠杆菌提取物中将其纯化(Curnis，et al.，2000)。所有层析步骤中所用的溶液均以无菌的无内毒素的水(Salf，Bergamo，Italy)配制。用商购的蛋白质定量检测试剂盒测量蛋白质浓度(Pierce，Rockford，IL)。NGR-mTNF的细胞溶解活性为9.1×107单位/mg。NGR-mTNF的流体力学体积与mTNF相似，一种经Superdex75HR柱(Pharmacia，Sweden)上的凝胶过滤获得的同型三聚体蛋白质(Smith and Baglioni，1987)。NGR-mTNF内毒素含量为0.082单位/μg。
以标准的重组DNA方法进行DNA操作。通过对由经佛波醇-12-十四碳烷酸酯-13-乙酸酯刺激的鼠胸腺依赖性细胞获得的cDNA进行PCR制备出编码鼠IFNγ的cDNA，所采用的引物是5′AGAATTCATGAACGCTACACACTGCATCTTGGC3’(正向引物)；5’TATATTAAGCTTTCAGCAGCGACTCCTTTTCCGC3′(反向引物)。引物被设计成能扩增包括前导序列在内的编码全长鼠IFNγ的cDNA序列。它们包括用于克隆至哺乳动物表达载体pRS1-neo以产生pRS1neo-IFNγ的EcoRI和HindIII限制位点(下划线标出)。然后采用Plasmid Maxi试剂盒(Qiagen Inc.-Diagen，GmbH，Germany)制备出pRS1neo-IFNγ，在无菌的无内毒素的水(S.A.L.F.Laboratorio Farmacologico SpA，Bergamo，Italy)中稀释成1mg/ml。在RPMI 1640中将pRS1neo-IFNγ(3μg)与100μl 0.03mg/ml脂转染试剂(Gibco Brl)相混合，在室温下孵育20分钟。然后将混合物加入到1天前接种于20-孔微量滴定板的TS/A细胞中。在37℃5％CO2下孵育4小时之后，向每孔中加入2ml培养液。在孵育48小时后，将培养液换成添加有10％胎儿牛血清、2mM谷氨酰胺并含有1mg/ml遗传霉素的RPMI 1640。一星期后，通过在遗传霉素存在的条件下在96-孔微量滴定板上的有限稀释而克隆出存活细胞选择物。通过IFNγ-ELISA检测每一克隆的上清液，获得10个分泌IFNγ的克隆。挑选出一个每ml培养液产生1.13μg IFNγ的克隆，命名为TS/A-IFNγ，将其用于体内实验。
IFNγ-ELISA.以5μg/ml溶于PBS中的mAb AN18涂布PVC微量滴定板(Becton Dickinson，cod.3912)(4℃下16小时)。用PBS冲洗滴定板三次，用PBS中的2％牛血清蛋白(BSA)中断反应(PBS-BSA，37℃下1小时)。然后用PBS冲洗滴定板三次，然后用细胞培养上清液或稀释于PBS-BSA中的鼠IFNγ标准溶液孵育。用含有0.05％Tween-20(Merck)(PBS-TW)的PBS冲洗滴定板8遍，用mAb XMG1.2-bio孵育(PBS中0.2μg/ml，37℃下1小时)。再用PBS-TW冲洗滴定板，用以1∶300稀释于PBS-BSA中的抗生物素蛋白链霉素-辣根过氧化物酶(Sigma)在37℃下孵育1小时。用PBS-TW冲洗后，以邻苯二胺二盐酸过氧化物酶底物(Sigma)检测结合的过氧化物酶。30分钟后通过加入10％硫酸停止显色反应。用ELISA微板读数器(Biorad)检测A490。
对动物模型的研究已经Ethical Committee of the San RaffaeleH Scientific Institute批准，并按照指定方针进行。对重量为16-18g的小鼠通过在左侧腰窝处皮下注射5×104个B16F1活细胞进行激发；5天后，用NGR-mTNF和mIFNγ溶液(100μl)进行处理，两小时后施以阿霉素溶液(100μl)。所有药物均经腹膜内给药(i.p)。这些药物除了阿霉素均用含有100μg/ml无内毒素的人血清蛋白(Farma-Biagini，Lucca，Italy)的0.9％氯化钠稀释，阿霉素仅用0.9％氯化钠稀释。以前述方式用测径计测量肿瘤来对肿瘤生长进行每日监控(Gasparri et al.，1999)。在肿瘤直径达到1.0-1.5cm之前处死动物。肿瘤尺寸以平均值±标准偏差表示(5个动物/组)。
内源性IFN对于NGR-TNF/阿霉素的治疗活性是至关重要的。
我们已经在上文说明了NGR-mTNF和阿霉素在长有B16-F1肿瘤的免疫活性小鼠中有协同作用，通过预先施以0.1ng NGR-mTNF，阿霉素的抗肿瘤作用得到明显提高(上文以及Curnis et al.，2002)。因此，以低剂量的NGR-mTNF(0.1ng)与阿霉素(80μg)一起向长有B16-F1肿瘤的小鼠给药所引起的抗肿瘤作用比单独用阿霉素要强(附图.5)。这些药物的协同作用，当单独以低剂量使用NGR-TNF(0.1ng)时，其活性很低(Curnis et al.，2002)。
为了评价内源性mIFNγ在免疫活性小鼠中对NGR-mTNF的抗肿瘤活性的功能性价值，我们在C57BL6小鼠体中研究了一种中和抗-mIFNγ抗体(mAb AN18)对NGR-mTNF/阿霉素的作用。
当该抗体在NGR-mTNF给药24小时之前给药时，NGR-mTNF和阿霉素之间的协同作用完全消失(附图5)，这支持了关于内源性mIFNγ在NGR-mTNF的抗肿瘤活性中起重要作用的假设。
为了进一步支持IFN在对这些药的治疗反应中的作用，我们进行了其它体内试验，其中采用BALB/c IFNγ-/-“敲除”小鼠，这种小鼠长有皮下鼠TS/A-乳腺瘤。与之平行的是，我们采用野生型BALB/c IFNγ+/+小鼠进行了相似的试验。NGR-TNF/阿霉素显著地减少了BALB/cIFNγ+/+小鼠中的肿瘤质量(附图6，黑色条)，但是在BALB/cIFNγ-/-小鼠中却没有(附图6，白色条)。值得注意的是，以外源性IFN(300ng)与NGR-TNF和阿霉素一起对BALB/c IFNγ-/-小鼠给药恢复了这两种药物间的协同作用(附图6，白色条)。这些结果证实了关于IFN对于NGR-TNF/阿霉素协同效应来说是必需的假设。以IFN和阿霉素而不加NGR-TNF共给药没有在BALB/cIFNγ-/-小鼠中引起显著的抗肿瘤作用，这表明这种细胞因子与NGR-TNF具有协同作用与阿霉素有稍许或没有协同作用。
T-细胞和局部产生的IFN在NGR-TNF/阿霉素治疗活性中的作用T-和NK-细胞是免疫活性小鼠中IFN的最初来源。为了研究作为IFN的一种来源的T-细胞在NGR-TNF/阿霉素组合治疗中的作用，我们在缺少T-细胞的长有B16F1肿瘤的nu/nu小鼠中研究了这些药物的作用。在这种模型中，NGR-TNF/阿霉素的协同活性丧失了(附图7A-C)。然而，当这些药物与IFN结合给药时，又重新观察到了协同作用(附图7D)。这很可能是这些动物体中的内源性IFN的量并不足以激活NGR-TNF/阿霉素的协同作用，而以外源性IFN给药时恢复了协同作用。
免疫活性小鼠和nu/nu小鼠的体内试验结果可能暗示存在于免疫小鼠而非nu/nu小鼠的肿瘤块中的T-细胞产生足量的IFN以促进NGR-TNF与化学治疗剂之间的协同反应。为了评价肿瘤微环境中的IFN的产生是否能在nu/nu小鼠体内恢复协同效应，我们以鼠IFN cDNA转染TS/A细胞(附图8)。在培养基中筛选出一个能分泌IFN的克隆，命名为TS/A-IFN。然后将TS/A-IFN和野生型TS/A细胞皮下植入到nu/nu小鼠中。如所预期，NGR-TNF/阿霉素对TSA-IFN起着显著的抗肿瘤效果，而对TS/A肿瘤却没有这种效果，这充分表明了局部产生的IFN对于NGR-TNF/阿霉素的协同作用是至关重要的。
总而言之，这些结果以及上文提到的结果表明，NGR-TNF/阿霉素的治疗效果充分依赖于局部IFN的产生，其可能是由肿瘤浸润性胸腺依赖性细胞分泌的。
外源性IFN提高NGR-TNF/阿霉素在免疫活性小鼠中的治疗效果然后采用长有B16F1肿瘤的C57B16小鼠来评价NGR-TNF和阿霉素与外源性IFN(300ng)组合时的治疗活性。所附图9中所示，这三种物质组合时的抗肿瘤效果比NGR-TNF/阿霉素强。因此，以外源性IFN与NGR-TNF/阿霉素一起给药，在免疫活性小鼠中也诱导了更强的抗肿瘤效果。
三种物质组合(IFN、NGR-TNF和阿霉素)的作用机理我们在前面已经说明了，NGR-TNF/阿霉素协同作用的重要机理与由NGR-TNF造成的内皮屏障功能的改变以及肿瘤中阿霉素穿透性的提高相关。因此，我们研究了IFN是否对于这种作用是关键的。为了这个目的，我们测量了外源性IFN对于阿霉素在TS/A肿瘤中的穿透性的影响(附图10)。该试验利用了阿霉素是一种荧光化合物这一事实，从处理后的动物中回收的肿瘤细胞的荧光强度是穿透到肿瘤中的阿霉素的量的一种指征。该试验在nu/nu鼠中进行以减少内源性IFN的作用。与未处理的对照组相比，当长有肿瘤的小鼠经NGR-TNF处理2小时后，再施以阿霉素，肿瘤细胞中的阿霉素没有明显的增加。然而以IFN与NGR-TNF组合给药时，阿霉素在肿瘤中的穿透性获得提高。这表示IFN对于TNF诱导的化学治疗药的穿透性来说是至关重要的。
本研究显示内源性IFN对于NGR-TNF/阿霉素的协同作用是关键的，外源性mIFNγ与NGR-mTNF一起在免疫缺陷型及免疫活性小鼠中均诱导了更强的抗肿瘤作用。这一点已经由上述观察的结果所支持，即a)一种中和抗-IFN的抗体在免疫活性小鼠中显著地抑制了NGR-TNF/阿霉素的协同作用和b)在缺少IFN基因的小鼠中(IFN-/-小鼠)不出现协同效应。
已知T-和NK-细胞是免疫活性小鼠中IFN的最初来源，并且无胸腺nu/nu小鼠中缺少T-细胞，上述结果充分支持了T-细胞是对于NGR-TNF/阿霉素的协同作用所必需的IFN的主要来源。与该观点相一致的是，发现外源性或内源性IFN(经IFN cDNA转染的肿瘤细胞所生产的)在nu/nu小鼠中恢复了NGR-TNF/阿霉素的协同作用。
这些结果均指向IFN对于将NGR-TNF和阿霉素靶向肿瘤血管的重要作用。
IFN与阿霉素组合(没有NGR-TNF)没有治疗效果，这表示这种细胞因子与NGR-TNF具有协同作用，很少或不与阿霉素协同作用。考虑到化学治疗药物必须穿过血管壁，并迁移跨过间质组织以到达肿瘤细胞，IFN和NGR-TNF的作用位点很可能在血管内皮的内层上。已知的是，TNF可在内皮细胞上诱导细胞骨架肌动蛋白发生改变并诱导形成能导致对大分子穿透性增强的的胞间缝隙。在相同细胞上，TNF能诱导白细胞粘附分子、前炎症细胞因子、纤维蛋白沉积、一氧化氮生产以及细胞凋零。因此，我们发现与单独暴露于TNF相比，暴露于TNF和IFN的组合的体外内皮细胞单层对于辣根过氧化物酶的渗透性获得提高。考虑到TNF和IFN可对内皮细胞施加的不同作用，我们不能排除体内血管通透性的改变也可能是与可影响内皮细胞渗透性的其它重要炎性分子的局部释放相关的间接作用的结果。
我们的发现还有其它的重要含义。在动物模型中以及患者的几项研究显示TNF可以选择性地影响和损伤肿瘤血管而非与正常组织相关的血管。因此，当以TNF联合苯丙氨酸氮芥向患者进行隔离肢灌注后，观察到患者肿瘤而非正常组织的微-和大-血管的大面积地受到破坏。这种选择性的分子基础尚不清楚。假设为肿瘤血管的结构差异与/或肿瘤衍生的-“激活因子”的存在可能是TNF-血管选择性的原因。我们的研究表明了IFN的局部产生可能是其中的敏化因子之一。
上述说明书中所有提到的出版物均并入本文作为参考。在不偏离本发明的范围和精神下，对于本领域技术人员而言，对本发明所述方法及系统的各种修饰和变化形式是显而易见的。尽管以某些具体的实施例对本发明进行了描述，但应理解的是，本发明所要求保护的不应被过度地局限于这些具体的实施方式中。事实上，所述的对于本领域技术人员显而易见的用于对本发明的方法进行各种修饰的形式均确定为包含在权利要求书中。
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序列表<110>Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor<120>用于癌症治疗的经修饰的细胞因子<130>modcyt<140>
<141>
<160>7<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的说明PCR引物<400>1ctggatcctc acagagcaat gactccaaag 30<210>2<211>29<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明PCR引物<400>2tgcctcacat atgctcagat catcttctc 29<210>3<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的说明PCR引物<400>3gcagatcata tgtgcaacgg ccgttgcggc ctcagatcat cttctc 46<210>4<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的说明PCR引物<400>4atatcatatg tgcaacggcc gttgcggcgt cagatcatct tctcg 45
<210>5<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的说明PCR引物<400>5tcaggatcct cacagggcaa tgatcccaaa gtagac36<210>6<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的说明PCR引物<400>6atatctacat atgcacggca cagtcattga aagcc 35<210>7<211>58<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的说明PCP引物
<400>7tcggatcctc agcaacggcc gttgcagccg gagcgactcc ttttccgctt cttgaggc58
权利要求
1.一种药物组合物，其含有一种有效量的TNF与CD13受体的配体或编码该配体的多核苷酸的缀合物以及一种有效量的IFNγ或编码IFNγ的多核苷酸。
2.根据权利要求1的组合物，其还含有一种药学上可接受的载体和赋形剂。
3.根据权利要求1或2的组合物，其中所述TNF是TNFα或TNFβ。
4.根据前述任一权利要求的组合物，其中CD13受体的配体选自抗体或其活性片段、肽或肽模拟物。
5.根据权利要求4所述组合物，其中所述配体是一种含有NGR基序的肽。
6.根据权利要求5所述组合物，其中所述肽选自CNGRCVSGCAGRC、NGRAHA、GNGRG、环状的CVLNGRMEC、线性的CNGRC和环状的CNGRC。
7.根据前述任一权利要求的组合物，其中TNF是用聚乙二醇或一种酰基衍生的。
8.根据前述任一权利要求的组合物，其中TNF进一步与抗体、抗体片段、生物素中的一种化合物缀合，其中所述抗体或其片段针对选自下列组的一种化合物肿瘤抗原、肿瘤血管生成标记或细胞外基质成分。
9.根据权利要求8的组合物，其中TNF与CD13配体以及选自抗体、抗体片段、生物素中的一种化合物缀合。
10.根据前述任一权利要求的组合物，其以可注射溶液或悬浮液或者可灌输的液体形式存在。
11.根据权利要求1-9中任一项的组合物，其以脂质体形式存在。
12.根据前述任一权利要求的组合物，进一步包括另一种抗肿瘤剂或一种诊断用的肿瘤成像化合物。
13.根据权利要求12的组合物，其中所述的另一种抗肿瘤剂为阿霉素。
14.一种治疗或诊断癌症病人的方法，其包括以前述任一权利要求的药物组合物给药。
15.根据权利要求14的方法，其包括另外再以其它抗肿瘤剂或诊断用的肿瘤成像化合物给药。
全文摘要
能够定向于肿瘤血管和抗原呈递细胞的细胞因子衍生物以及其作为抗肿瘤制剂的用途。
文档编号A61K31/70GK1732016SQ200380107843
公开日2006年2月8日 申请日期2003年11月5日 优先权日2002年11月5日
发明者A·科尔蒂 申请人:圣拉斐尔德尔蒙特塔博基金中心