专利名称：球虫疫苗及其制造和使用方法
技术领域：
本发明涉及制备免疫原组合物和抗由球虫导致的疾病的疫苗。本发明也提供用于抗球虫病的减毒疫苗。
背景技术：
球虫病是由于感染一种或更多的许多种类的球虫而引起的疾病，所述球虫属于原生动物门(protozoa)的亚门，是顶复(Apicomplexa)亚门和艾美球虫(Eimeria)属的细胞内原生寄生虫。艾美球虫属包含大多数具有重要经济价值的家禽种类，例如鸡、鸭、鹅、珍珠鸡、孔雀、野鸡、鸽子和火鸡。虽然球虫病实际上会在所有种类的禽类中发生，但所述寄生虫是宿主特异性的并且各种球虫只在单一或有限相关宿主内出现。另一方面，已知鸟类宿主具有超过一个品种的球虫。在鸡中引起球虫病的艾美球虫种包括堆形艾美球虫(E.acervulina)、波氏艾美球虫(E.brunetti)、哈氏艾美球虫(E.hagani)、巨型艾美球虫(E.maxima)、和缓艾美球虫(E.mitis)、变位艾美球虫(E.mivati)、尼氏艾美球虫(E.necatrix)、塞前艾美球虫(E.praecox)和禽艾美球虫(E.tenella)。堆型艾美球虫是在烤房垃圾中发现的最普遍的品种。其具有巨大的繁殖潜能并且被认为是致病的，因为其对体重增长、更高的饲料转化率产生了明显的压制并且对小肠上部造成严重损伤。
在家禽中，鸡是最容易遭受来自球虫病造成的重大经济损失的，尽管在火鸡、鹅、鸭和珍珠鸡上也会发生损失。球虫病也曾给圈养在笼中的野鸡和鹌鹑造成严重损失。球虫病感染的效果会采取明显可见的毁灭性禽群死亡的形式，但另一个不希望看到的效果是由感染造成的病态和/或体重减少。
在生命周期中，所述艾美球虫寄生虫经历许多阶段(为查阅，参见例如美国专利6,100,241)。生命周期从鸡在地面喂养期间或通过吸入灰尘而摄入称作孢子形成了的囊合子的传染性阶段开始。所述孢子形成了的囊合子的壁通过鸟胃和肠道中的机械磨擦和化学作用相结合而破裂，导致释放4个孢子囊。所述孢子囊经过十二指肠，在那里其被暴露于胆汁和消化酶，导致每个孢子囊内释放2个子孢子。
所述子孢子是可移动的并且寻找合适的宿主上皮细胞以穿入并在其中繁殖。在感染上皮细胞后，所述寄生虫进入其生命周期的裂殖体阶段，每个裂殖体产生从8到16到大于200个裂殖子。一旦裂殖子从裂殖体中释放出来，其能自由地进一步感染上皮细胞。在2到5个这样的无性生殖周期后，细胞内裂殖子成长到进入称作雌性或大配子母细胞和雄性或小配子母细胞的有性形式。通过由小配子体母细胞释放的小配子与大配子母细胞的受精作用后形成了合子，所述合子在其自身周围形成了孢囊壁。新形成的囊合子以排泄物从感染的鸡中排出。
在温度和湿度以及空气中含有充分氧气的合适环境下，所述囊合子将形成孢子进入感染阶段，准备感染新的宿主并因此传播疾病。于是，不需要中间宿主将寄生虫在禽与禽之间传播。
艾美球虫寄生虫感染鸡消化道的结果是体重减少、增加的饲料转化、停止生产鸡蛋，以及在某些情况下死亡。家禽密集生产的急剧增加已经伴随着因这些寄生虫的严重损失；事实上，球虫病已经成为在经济上重要的寄生虫病。
过去，已经发展出几种用于试图控制球虫病的方法。在化学治疗药剂到来之前，使用消毒剂结合机械去除垃圾以改善卫生状况是主要运用的方法；然而，通常仍有足够多的囊合子留下传播疾病。在饲料和饮用水中导入抑球虫剂药物再加上良好的管理会在疾病控制上获得一些成功。已发现这类药物多年后效果会降低，部分因为产生了抗药性的球虫株系。此外，已发现几种化学治疗药物残留在肉中，使得其不适于消费。
美国专利4,438,097；4,639,372；4,898,404；5,055,292；5,068,104；5,387,414；5,602,033；5,614,195；5,635,181；5,637,487；5,674,484；5,677,438 5,709,862；5,780,289；5,795,741；5,814,320；5,843,722；5,846,527；5,885,5685,932,225；6,001,363和6,100,241涉及球虫病疫苗，包括活疫苗和重组疫苗。然而，在已有的球虫病疫苗中存在一些问题，例如药效降低、与其它寄生虫(例如梭菌属)发生交叉感染和较差的禽类表现。于是，需要具有减少或使交叉感染不存在、不会不利地影响禽类行为的有效的球虫病疫苗。
本发明中任何文献的引用或确认并不承认该文献作为本发明的现有技术而可以获得。
发明简述本发明部分基于减毒球虫病疫苗，所述疫苗能有效地面对致命攻击、降低与梭菌(clostridium spp.)的交叉反应并且通过与其它球虫病疫苗相比具有更好的由饲料转化率定义的禽类表现。
本发明涉及来自堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫和禽艾美球虫早熟株系的孢子形成了的囊合子的混合物。从由一只或多只鸡中收获的种子培养物中分离孢子形成了的囊合子，所述鸡是用堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫和禽艾美球虫的早熟株系培养物接种的，即用堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫或禽艾美球虫的早熟株系接种一只或多只鸡，产生4个组群的鸡，每个组群用不同的艾美球虫株系接种。所述分离的孢子形成了的囊合子组合起来形成来自堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫和禽艾美球虫早熟株系的孢子形成了的囊合子混合物。
在有利的实施方案中，所述鸡是2到8周大小的SPF鸡。在另一个有利的实施方案中，用约100到15,000个囊合子接种每只鸡以产生所述种子培养物。在另一个有利的实施方案中，通过离心分离来自种子培养物的孢子形成了的囊合子。
本发明也提供鉴定具有堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫或禽艾美球虫早熟株系特征的孢子形成了的囊合子。
本发明涉及来自堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫和禽艾美球虫的早熟株系的孢子形成了的囊合子的混合物，其中所述混合物有约10到1000个堆型艾美球虫囊合子、约10到100个巨型艾美球虫囊合子、约10到1000个和缓艾美球虫囊合子和约10到1000个禽艾美球虫囊合子。有利地，所述混合物含有约500个堆型艾美球虫囊合子、约50到100个巨型艾美球虫囊合子、约500个和缓艾美球虫囊合子、约100到500个禽艾美球虫囊合子。更有利地，所述混合物约由500个堆型艾美球虫囊合子、约100个巨型艾美球虫囊合子、约500个和缓艾美球虫囊合子和约100个禽艾美球虫囊合子组合而成。
本发明也涉来自堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫和禽艾美球虫早熟株系的孢子形成了的囊合子的特定比例，其中堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫和禽艾美球虫的比例约是10∶1到2∶10∶2到10(即对于每10个堆型艾美球虫孢子囊，就有1到2个巨型艾美球虫的孢子囊、约10个和缓艾美球虫孢子囊和约2到10个禽艾美球虫孢子囊)。有利地，堆型艾美球虫∶巨型艾美球虫∶和缓艾美球虫∶禽艾美球虫的比例是约5∶1∶5∶1(即10∶2∶10∶2)。
本发明也涉及测试来自堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫和禽艾美球虫早熟株系孢子形成了的囊合子混合物的效率。有利地，所述测试涉及对动物施用约100,000到500,000个堆型艾美球虫囊合子和约10,000到100,000个巨型艾美球虫囊合子、约100,000到500,000个和缓艾美球虫囊合子或约10,000到100,000个和缓艾美球虫囊合子的攻击剂量。在更有利的实施方案中，所述攻击剂量是约200,000个堆型艾美球虫囊合子和约20,000到50,000个巨型艾美球虫囊合子、约200,000个和缓艾美球虫囊合子或约20,000到50,000个和缓艾美球虫囊合子。
本发明涉及免疫鸡，有利地是烤子鸡(broiler chicken)。不过制造此处描述的疫苗的方法可以外推到其它被艾美球虫感染的动物，特别是禽，类例如但不限于鸡、鸭、鹅、珍珠鸡、孔雀、野鸡、鸽子、鹌鹑和火鸡。
本发明包括免疫原性或疫苗组合物，所述组合物包含分离自堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫和禽艾美球虫早熟株系的孢子形成了的囊合子的混合物。在有利的实施方案中，所述混合物是约10到1000个堆型艾美球虫囊合子、约10到100个巨型艾美球虫囊合子、约10到1000个和缓艾美球虫囊合子和约10到1000个和缓艾美球虫囊合子。有利地，所述混合物是约500个堆型艾美球虫囊合子、约50到100个巨型艾美球虫囊合子、约500个和缓艾美球虫囊合子和约100到500个和缓艾美球虫囊合子。更有利地，所述混合物是由约500个堆型艾美球虫囊合子、约100个巨型艾美球虫囊合子、约500个和缓艾美球虫囊合子和约100和缓艾美球虫囊合子组合而来。
本发明也涉及免疫原性或疫苗组合物，所述组合物包含特定比例的从堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫和禽艾美球虫早熟株系分离的孢子形成了的囊合子，其中堆型艾美球虫∶巨型艾美球虫∶和缓艾美球虫∶禽艾美球虫的比例约是10∶1到2∶10∶2到10(即对于每10个堆型艾美球虫孢子囊中就有1到2个巨型艾美球虫的孢子囊、约10个和缓艾美球虫孢子囊和约2到10个禽艾美球虫孢子囊)。有利地，堆型艾美球虫∶巨型艾美球虫∶和缓艾美球虫∶禽艾美球虫的比例是约5∶1∶5∶1(即10∶2∶10∶2)。
本发明也提供引起免疫应答或诱导免疫学的或保护性的应答，所述应答包括对施用有效量的免疫原性或疫苗组合物以引起或诱导动物中的应答，所述组合物包含从堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫和禽艾美球虫早熟株系分离的孢子形成了的囊合子混合物。有利地，所述动物是鸟类，例如但不限于鸡、鸭、鹅、珍珠鸡、孔雀、野鸡、鸽子、鹌鹑和火鸡。在最有利的实施方案中，所述鸟类是鸡，有利地是烤子鸡。引起免疫应答或诱导免疫学应答的方法也包括施用佐剂、细胞因子或两者都施用。
有利地，引起免疫应答或诱导免疫学或保护性应答的有效剂量是约10到1000个堆型艾美球虫囊合子、约10到100个巨型艾美球虫囊合子、约10到1000个和缓艾美球虫囊合子和约10到1000个和缓艾美球虫囊合子。有利地，有效剂量是约500个堆型艾美球虫囊合子、约50到100个巨型艾美球虫囊合子、约500个和缓艾美球虫囊合子和约100到500个禽艾美球虫囊合子。更有利地，有效剂量是约500个堆型艾美球虫囊合子、约100个巨型艾美球虫囊合子、约500个和缓艾美球虫囊合子和约100和缓艾美球虫囊合子的组合。在另一个实施方案中，所述有效剂量足以抵抗约100,000到500,000个堆型艾美球虫囊合子和约10,000到100,000个巨型艾美球虫囊合子、约100,000到500,000个和缓艾美球虫囊合子或约10,000到100,000个禽艾美球虫囊合子对动物的攻击剂量。更有利地，所述攻击剂量是约200,000个堆型艾美球虫囊合子和约20,000到50,000个巨型艾美球虫囊合子、约200,000个和缓艾美球虫囊合子或约20,000到50,000个和缓艾美球虫囊合子。
引起免疫应答或诱导免疫学或保护性应答的有效剂量也可以表示为来自堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫和禽艾美球虫早熟株系的孢子形成了的囊合子的比例，其中堆型艾美球虫∶巨型艾美球虫∶和缓艾美球虫∶禽艾美球虫的比例约是10∶1到2∶10∶2到10(即对于每10个堆型艾美球虫孢子囊，就有1到2个巨型艾美球虫的孢子囊、约10个和缓艾美球虫孢子囊和约2到10个禽艾美球虫孢子囊)。有利地，堆型艾美球虫∶巨型艾美球虫∶和缓艾美球虫∶禽艾美球虫的比例是约5∶1∶5∶1(即10∶2∶10∶2)。
考虑到各种艾美球虫品种的流行性和致病性，成功的减毒球虫病疫苗应当含有足以引起免疫应答或诱导免疫学或保护性应答的最少量的艾美球虫株系，所述反应对所述疫苗的接受者是非致病性的。该关系涉及来自4种特定艾美球虫株系的囊合子的组合，即堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫和禽艾美球虫，所述株系(组合)产生有效的和非致病性的疫苗。其它艾美球虫株系，例如波氏艾美球虫、尼氏艾美球虫和塞前艾美球虫的加入可能会对所述疫苗的效力、交叉反应或致病性不利。因为波氏艾美球虫、尼氏艾美球虫和塞前艾美球虫对于此处公开的球虫病疫苗的效力不是必需的，从本发明的疫苗中排除这些株系将是有利的。
应该注意在这个公开的说明书中和特别是在权利要求书和/或段落中，术语例如“包含”、“已包含”、“正包含”等具有属于美国专利法中的含意；例如，它们可是表示“包括”、“已包括”、“正包括”等；并且术语例如“基本由……构成”和“基本由……构成”具有美国专利法中规定的含意，例如它们允许组成部分不做明确地说明，但排除在现有技术中发现的或影响本发明基本性或新特征的组成部分。
这些和其它实施方案公开于或明显来自或包含于下面的详述中。
发明详述本发明部分基于减毒球虫病疫苗，所述疫苗能有效地面对致命攻击、降低与梭菌的交叉反应和当与其它球虫病疫苗相比时具有更好的由饲料转化率定义的禽类表现。
本发明涉及来自堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫和禽艾美球虫的早熟株系的孢子形成了的囊合子混合物。由从一只或多只鸡中收获的种子培养物中分离孢子形成了的囊合子，所述鸡是用堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫和禽艾美球虫的早熟株系培养物接种的，即用堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫或禽艾美球虫的早熟株系接种一只或多只鸡，产生4个组群的鸡，每个组群用不同的艾美球虫株系接种。
有利地，所述艾美球虫株系是早熟株系。早熟株系来源于野生品种，当施以适当剂量时其是非致病性的。在有利的实施方案中，所述艾美球虫株系是P.L.Long和Joyce K.Johnson在Avian Pathology，17305-314，1988标题为“Eimeria of American ChickensCharacteristics of Six Attenuated Strains Produced by Selectionfor Precocious Development”中所描述的各微生物的早熟株系，引用其公开的全文作为参考。通过对其早熟发育的选择可减毒微生物，如P.L.Long和Joyce K.Johnson在AvianPathology，17305-314，1988，标题为“Eimeria of AmericanChickensCharacteristics of Six Attenuated Strains Producedby Selection for Precocious Development”所描述的，引用其公开的全文作为参考。简短地说，通过选择较早的显露前期(pre-patent)，即当所述囊合子第一次出现在粪便中时，减毒所述微生物。这些方法对本领域技术人员来说是熟知的并且构成常规实验。
作为种子培养的艾美球虫株系的贮存培养物包括但不限于下面所列。据认为堆型艾美球虫的亲本，于1969年获自Hess和Clark实验室的T.K.Jeffers，曾由USDA，Beltsville，MD的M.M.Farr博士分离，所述亲本来自单一囊合子。所述巨型艾美球虫培养物来源于从Georgia，Delaware，Maryland，Virginia和Texas获得的10个纯化分离株的混合异种交配。和缓艾美球虫培养物的亲本于1978年7月在Gainesville，Georgia分离而来并且从单一囊合子分离物纯化而来。禽艾美球虫培养物的亲本来自由Pennsylvania State University的Patten博士自1960年代早期以来维持的培养物，并于1982年从Georgia大学获取。其它艾美球虫早熟株系包括LS100早熟堆型艾美球虫分离株系809-13和获自Merck研究实验室LS早熟和缓艾美球虫，所述株系获自Peter Long博士。或者，已作为专利保藏物(参见例如美国专利5,055,292，引用其公开全文作为参考)以孢子囊形式在欧洲动物细胞保藏中心(“ECACC”)保藏的减毒早熟艾美球虫株系是用于产生此处描述的艾美球虫种子培养物的保藏培养物。特别地，如美国专利5,055,292中描述的，堆型艾美球虫(保藏号ECACC 86072203)、巨型艾美球虫(保藏号ECACC 86112011和86112012)、和缓艾美球虫(保藏号ECACC 86072206)和禽艾美球虫(保藏号ECACC 86072201)的保藏物是用于产生本发明种子培养物的保藏培养物。
有利地，通过如上面描述对其早熟发育的选择对所述微生物进行减毒。在另外有利的实施方案中，所述培养物是无病原体的。上面描述的贮存培养物有利地维持在液氮的液相或气相中。这类方法对本领域技术人员是熟知的。
在有利的实施方案中，所述鸡是2到8周大小。孢子形成了的囊合子成功地、无限制地在鸡中传代，直至囊合子数目足够用作种子进行生产。有利地，为保持活力/有效性所述培养物不应该放置超过12个月。
在有利的实施方案中，用专用设施来维持各艾美球虫品种。有利地，将足够量的孢子形成了的囊合子(种子)与饲料混合或，进行经口给药以对每只鸡提供最小剂量。在有利的实施方案中，每只鸡接种约5000到15,000个囊合子以产生种子培养物。
有利地通过离心从禽类的粪便中分离来自种子培养物的所述孢子形成了的囊合子。在有利的实施方案中，如下进行收获。在水中以约10％(W/V)的比例匀浆排泄物。将匀浆物通过筛子以除去大的颗粒。将固体用离心、筛选或在5±3℃放置达24小时进行分离。如果固体通过在5±3℃放置进行分离，将它们通过离心进一步浓缩。弃去上清液，并将所述固体重新悬浮于饱和氯化钠(80％W/V)水溶液中。将终溶液离心。从液体上部中收集(取去)所述囊合子并重新悬浮于水中。任选地，将剩下的液体用水稀释到20-40％的氯化钠并离心。然后将所述沉淀重新悬浮于饱和氯化钠溶液中并再离心，直到没有额外的囊合子被回收。所述囊合子冲洗不超过2次。通过将囊合子重复重悬浮离心循环然后悬浮于0.5％的次氯酸钠溶液中10到15分钟以洗去囊合子的盐分。接着通过重复(3X)离心和重新悬浮步骤洗去囊合子的次氯酸钠溶液。最终悬浮在2.5％重铬酸钾(K2CrO7)液体溶液中。然后将囊合子转到孢子形成容器中。通过在27±3℃下在不超过72小时的时间内用空气喷射悬浮液帮助形成孢子。在形成孢子后将所述囊合子于5±3℃下放置直到产生最终产物。
在另一个实施方案中，可通过本领域技术人员所熟的几种方法中任何方法制备用于本接种疫苗方法的囊合子。这些方法包括J.F.Ryley等人在Parasitology 73311-326，1976、P.L.Long等人在Folia Veterinaria Latina VI#3，201-217，1976和美国专利6,627,205中所描述的方法，引用其公开的全文作为参考。根据一种方法通过口部饲入合适剂量的孢子形成了的囊合子用目的艾美球虫品种感染2周大小、商业购得的烤子鸡。然后实施从感染的禽类收集和纯化囊合子的熟知方法。对于大多数艾美球虫品种，在感染后5-7天从感染的禽类中收集粪便，混合并过滤除去残渣，然后以能充分沉淀剩余粪便材料的速度进行离心。将所述沉淀在饱和盐溶液中重新悬浮，在所述溶液中囊合子漂浮其中并且通过离心可去除绝大多数污染残渣。然后用更低的盐浓度稀释所述囊合子悬浮物。反复洗涤所述囊合子除去盐分并且重新悬浮于重铬酸钾溶液中(2.5％W/V)。所述囊合子悬浮液于29℃摇动(例如140rpm)孵育约72小时以诱导所述囊合子孢子的形成。或者，可用次氯酸钠处理所述囊合子然后使之形成孢子。使用血球计数器或McMastor载玻片直接计数确定每毫升孢子形成了的囊合子的数目，并且将培养物贮存于冰箱直至需要。
为制备孢子囊，通过反复洗涤囊合子将重铬酸钾从上面描述的囊合子悬浮液中除去，所述洗涤过程包括通过离心和在去离子或蒸馏水中重新悬浮以收集囊合子。当通过缺少微桔黄色着色判断重铬酸盐已被经除去时，将囊合子悬浮液与等体积的次氯酸钠(漂白剂)混合并且在室温下孵育15分钟。通过反复洗涤除去漂白剂并将所述囊合子重新悬浮于生理盐水或去离子水中。使用各种已知的技术破裂囊合子释放孢子囊。例如，通过将囊合子与直径1-4mm的玻璃珠混合并用手、涡旋搅拌器或震荡培养箱摇动或使用手控匀浆器可以破裂囊合子释放孢子囊。通过在50％PERCOLL中使用差速离心可以将未破的囊合子和囊合子壁与释放的孢子囊分离，所述PERCOLL是如Dulski等人在Avian Diseases，32235-239，1988所描述的覆盖有聚乙烯吡咯烷酮的硅颗粒(由Pharmacia Biotech出售)或1M蔗糖的胶状悬浮物。所述孢子囊可以以与未破裂囊合子和囊合子壁混合或从其中分离出来的方式应用于本接种方法中。有利地，将孢子囊药剂与囊合子和囊合子壁分离。
在有利的实施方案中，对可接受的种子培养物的收获具体要求如下。首先，要确定孢子形成了的囊合子对全部囊合子的比例。只有达到或超过＞40％孢子形成的收获物才认为是可接受的。第二，各囊合子收获物的大小、形状和外表必需具有该品种预期产生的特征。例如，被认为确定艾美球虫品种特征的参数包括但不限于基于DNA的技术、DNA浮力密度、酶变异、宿主和位点特异性、免疫学特异性、致病性、显露前期和孢子形成时间(参见例如Long & Joyner，Jprotozool.1984 Nov；31(4)535-41和Shirley，Acta Vet Hung。1997；45(3)331-47，引用其公开的全文作为参考)。
从此处描述的种子培养物中分离的来自堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫和禽艾美球虫早熟株系的孢子形成了的囊合子组合起来形成孢子形成了的囊合子混合物。通常，所述混合物含有约10到1000个堆型艾美球虫囊合子、约10到100个巨型艾美球虫囊合子、约10到1000个和缓艾美球虫囊合子和约10到1000个禽艾美球虫囊合子。有利地，混合物中孢子形成了的囊合子的范围是约125到500个堆型艾美球虫囊合子、约25到100个巨型艾美球虫囊合子、约125到500个和缓艾美球虫囊合子和约25到500个禽艾美球虫囊合子。在一个实施方案中，较低剂量是约125个堆型艾美球虫囊合子、约25个巨型艾美球虫囊合子、约125个和缓艾美球虫囊合子和约25个禽艾美球虫囊合子。在另一个实施方案中，中等剂量是约250个堆型艾美球虫囊合子、约50个巨型艾美球虫囊合子、约250个和缓艾美球虫囊合子和约50个禽艾美球虫囊合子。然而在另一个实施方案中，高剂量是约500个堆型艾美球虫囊合子、约100个巨型艾美球虫囊合子、约500个和缓艾美球虫囊合子和约100个禽艾美球虫囊合子。
本发明也涉及从堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫和禽艾美球虫早熟株系中分离的孢子形成了的囊合子的特定比例，其中堆型艾美球虫∶巨型艾美球虫∶和缓艾美球虫∶禽艾美球虫的比例约是10∶1到2∶10∶2到10(即对于每10个堆型艾美球虫孢子囊，就有1到2个巨型艾美球虫的孢子囊、约10个和缓艾美球虫孢子囊和约2到10个禽艾美球虫孢子囊)。有利地，堆型艾美球虫∶巨型艾美球虫∶和缓艾美球虫∶禽艾美球虫的比例是约5∶1∶5∶1(即10∶2∶10∶2)。
有利地，所述混合物含有约500个堆型艾美球虫囊合子、约50到约100个巨型艾美球虫囊合子、约500个和缓艾美球虫囊合子和约100到约500个禽艾美球虫囊合子。在更有利的实施方案中，所述混合物含有约500个堆型艾美球虫囊合子、约100个巨型艾美球虫囊合子、约500个和缓艾美球虫囊合子和约100禽艾美球虫囊合子。
有利地，所述囊合子悬浮于由含有庆大霉素的0.01M磷酸缓冲盐溶液构成的防腐剂中。在另一个实施方案中，所述囊合子悬浮于任何种类的防腐剂或有机酸中，后者例如但不限于乙酸、柠檬酸、重铬酸钾或丙酸。使用例如但不限于充分灭菌的、含有不超过30mcg/ml庆大霉素的0.01M的磷酸缓冲盐溶液生产2,000剂量展示的每瓶2ml、5,000剂量展示的每瓶5ml、10,000剂量展示的每瓶10ml的药剂。有利地，所述囊合子贮存于灭菌的、硼硅酸盐玻璃小瓶中。例如，但不限于，用半自动或全自动分配器将所述囊合子分别装入疫苗小瓶中，机械地或人工地将塞子插入并且放上并卷曲铝封条而将其封装。
在另一个实施方案中，将囊合子悬浮于含有悬浮剂的灭菌的蒸馏水中，所述悬浮剂例如多醣悬浮剂，例如树胶(例如黄素树胶或阿拉伯树胶)、纤维素衍生物，例如羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或微晶纤维素、鹿角菜胶、藻酸钠、果胶或淀粉；多肽悬浮剂，例如白明胶；合成聚合物悬浮剂，例如聚丙烯酸；或硅酸盐悬浮剂，例如镁铝硅酸盐(参见，例如美国专利5,055,292，引用其公开的全文作为参考)。
本发明也提供鉴定以堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫和禽艾美球虫早熟株系为特征的孢子形成了的囊合子。有利地，所有囊合子都减毒了，因为它们是早熟的。在另一个有利的实施方案中，各囊合子收获物的大小、形状和外表必需具有该品种预期产生的特征。而在另一个有利的实施方案中，对孢子形成了的囊合子混合物的纯度、外来病原体和/或所述测试动物(例如鸡)的死亡或严重损伤进行检测。在Long P.L和Reid W.M.(1982A Guide for the Diagnosis ofCoccidiosis in Chickens；University of Georgia Research Report404)和Joyner L.P(1978Identification and Diagnosis，AvianCoccidiosis，Poultry Science Symposium No.13，British PoultryScience Ltd)中详细描述了各种艾美球虫品种的特征，引用其公开的全文作为参考。
本发明也涉及测试来自堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫和禽艾美球虫早熟株系孢子形成了的囊合子混合物的效力。有利地，所述测试涉及给动物施用约100,000到500,000个堆型艾美球虫囊合子和约10,000到100,000个巨型艾美球虫囊合子、约100,000到500,000个和缓艾美球虫囊合子或约10,000到100,000个禽艾美球虫囊合子的攻击剂量。在更有利的实施方案中，所述攻击剂量是约200,000个堆型艾美球虫囊合子和约20,000到50,000个巨型艾美球虫囊合子、约200,000个和缓艾美球虫囊合子或约20,000到50,000个禽艾美球虫囊合子。
本发明进一步提供确定根据饲料转化率定义的禽类表现，所述饲料转换率是对禽类施用来自堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫和禽艾美球虫早熟株系孢子形成了的囊合子混合物的结果。饲料转化效率定义为产生一磅肉所需要的饲料磅数。普通的结果是约1.90或2.00。在普通行话中饲料转化中的1点是.01，等于约0.5％(百分之一的一半)。如果使用公制系统，所述饲料转化表示为每千克肉需要的饲料千克数，并且仍与上述成比例。
本发明涉及免疫鸡，有利地是烤子鸡。然而，此处描述的制造疫苗的方法可以外推到被艾美球虫感染的其它动物中，特别是禽类例如但不限有于鸡、鸭、鹅、珍珠鸡、孔雀、野鸡、鸽子、鹌鹑和火鸡，或在较不有利的实施方案中是野兔。
本发明包括含有从堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫和禽艾美球虫早熟株系中分离的孢子形成了的囊合子混合物的免疫原性或疫苗组合物。从堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫和禽艾美球虫早熟株系中分离的孢子形成了的囊合子组合起来形成孢子形成了的囊合子组合物。通常，所述混合物含有约10到1000个堆型艾美球虫囊合子、约10到100个巨型艾美球虫囊合子、约10到1000个和缓艾美球虫囊合子和约10到1000个禽艾美球虫囊合子。有利地，组合物中孢子形成了的囊合子的范围是约125到500个堆型艾美球虫囊合子、约25到100个巨型艾美球虫囊合子、约125到500个和缓艾美球虫囊合子和约25到250个禽艾美球虫囊合子。在一个实施方案中，较低剂量是约125个堆型艾美球虫囊合子、约25个巨型艾美球虫囊合子、约125个和缓艾美球虫囊合子和约25个禽艾美球虫囊合子。在另一个实施方案中，中等剂量是约250个堆型艾美球虫囊合子、约50个巨型艾美球虫囊合子、约250个和缓艾美球虫囊合子和约50个禽艾美球虫囊合子。而在另一个实施方案中，高剂量是约500个堆型艾美球虫囊合子、约100个巨型艾美球虫囊合子、约500个和缓艾美球虫囊合子和约100个禽艾美球虫囊合子。
有利地，所述组合物含有约500个堆型艾美球虫囊合子、约50到100个巨型艾美球虫囊合子、约500个和缓艾美球虫囊合子和约100到500个禽艾美球虫囊合子。在更有利的实施方案中，所述组合物含有约500个堆型艾美球虫囊合子、约100个巨型艾美球虫囊合子、约500个和缓艾美球虫囊合子和约100个禽艾美球虫囊合子所述组合物也涉及从堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫和禽艾美球虫早熟株系中分离出来的孢子形成了的囊合子的特定比例，其中堆型艾美球虫∶巨型艾美球虫∶和缓艾美球虫∶禽艾美球虫的比例约是10∶1到2∶10∶2到10(即对于每10个堆型艾美球虫孢子囊，就有1到2个巨型艾美球虫的孢子囊、约10个和缓艾美球虫孢子囊和约2到10个禽艾美球虫孢子囊)。有利地，堆型艾美球虫∶巨型艾美球虫∶和缓艾美球虫∶禽艾美球虫的比例是约5∶1∶5∶1(即10∶2∶10∶2)。
术语“免疫原性组合物”此处涵盖任何组合物，所述组合物一旦给动物例如禽类施用就能引起对抗寄生虫或抗原或免疫原或抗原表位的保护性免疫应答。术语“疫苗”此处涵盖任何组合物，所述组合物一旦给动物例如禽类施用就能诱导对抗病毒的保护性免疫应答或有效地保护动物对抗寄生侵害。
根据本发明免疫原性组合物或疫苗也可以包括病原体或免疫原、所述病原体的抗原或抗原表位和另一病原体、寄生虫或病毒的至少一个免疫原、抗原或抗原表位，即所述球虫病疫苗与另外的禽类疫苗组合。这种免疫原、抗原或抗原表位是例如细菌或其它寄生虫或病毒来源，或病原体、寄生虫或病毒的无活性或减毒形式。本发明也包括制备这些组合的组合物的试剂盒以及制备这些组合物和使用这些组合物的成份制备组合物的方法。因此，本发明涉及制备本发明的免疫原性或疫苗组合物的试剂盒；例如，这类试剂盒包含(a)生物体、病原体或病毒或抗原或其抗原表位(有利地为此处提到的病原体)和(b)不同于(a)中的生物体、病原体或病毒或抗原或其抗原表位(有利地为病毒或免疫原、抗原或其抗原表位，但如此处提到的其它病原体也是可包括的)，所述试剂盒存在于分开的容器中，可选地放入同一个包装盒中和可选地具有混合和/或施用的说明书。
根据本发明的免疫原性组合物和/或疫苗可包括艾美球虫培养物或制备物(例如，灭活或减毒的艾美球虫，或其免疫原或抗原或抗原表位)和另外的禽类病原体(包括但不限于灭活的或减毒形式的病原体)的至少一种免疫原、抗原或抗原表位。对于禽类的多价免疫原性组合物和多价疫苗，其中包括另外的禽类抗原或其免疫原或抗原表位和/或其中通过所述多价免疫原性组合物和多介疫苗表达另外的禽类抗原或免疫原或抗原或抗原表位的额外的禽类病原体是病毒、疾病或马立克氏病病毒(MDV)(例如血清型1和2，有利地是1)、新城疫病毒(NDV)、除了新城疫的副粘病毒(PMV2到PMV7)、感染性支气管炎病毒(IBV)、感染性贫血症病毒或鸡贫血症病毒(CAV)、感染性家禽呼吸气管病病毒(ILTV)；感染性囊症病毒(IBDV)、脑脊髓炎病毒或禽类脑脊髓炎病毒(AEV或禽类白血病病毒ALV)、火鸡出血肠炎病毒(HEV)、肺病毒(TRTV)、家禽瘟疫病毒(禽流感)、鸡积水性心包炎病毒、禽呼肠孤病毒、球虫病、产蛋量下降综合病症(EDS76)、禽痘病毒、内含体肝炎(腺病毒)、火鸡淋巴增生疾病、鸡网状内皮组织增生、火鸡网状内皮组织增生、轮状病毒肠炎和火鸡鼻气管炎、梭菌属(Clostridium spp.)，大肠肝菌、鸡支原体(Mycoplasma gallinarum)、鸡败血支原体(Mycoplasmagallisepticum)、鸟嗜血杆菌(Haemophilus avium)、鸡巴斯德氏菌(Pasterella gallinarum)、多杀巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida gallicida)和其混合物。有利地，对于MDV所述免疫原有利地是gB和/或gD，例如gB和gD，对于NDV所述免疫原有利地是HN和/或F，例如HN和F；对于IBDV所述免疫原有利地是VP2；对于IBV所述免疫原有利地是S(更有利地是S1)和/或M和/或N，例如S(或S1)和M和/或N；对于CAV所述免疫原有利地是VP1和/或VP2；对于ILTV所述免疫原有利地是gB和/或gD；对于AEV所述免疫原有利地是env和/或gag/pro，例如evn和gap/pro或gag/pro；对于HEV所述免疫原有利地是100K蛋白质和/或异己酮；对于TRTV所述免疫原有利地是F和/或G以及对于家禽瘟疫，免疫原有利地是HA和/或N和/或NP，例如HA和N和/或NP。于是，本发明也涉及制造这些组合物及其试剂盒的方法。
根据本发明的也含有这种额外的免疫原性组分(额外的免疫原、抗原或抗原表位)的免疫原性组合物或疫苗具有同时诱导抗多种感染或疾病或其病原体的免疫应答或保护作用。这种额外的免疫原性组分可是减毒的或灭活的微生物、重组构建体或亚基(例如蛋白质、糖蛋白、多肽或抗原表位)。抗原表位决定方法，例如生成交叠肽文库(Hemmer等人，Immunology Today，1998，19(4)，163-168)、肽扫描技术(Geysen H.M.等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，1984，81(13)，3998-40002；Geysen H.M.等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，1985，82(1)，178-182；Van der Zee R.等人，Eur.J.Immunol.，1989，19(1)，43-47；Geysen H.M.，Southeast Asian J.Trop.Med.Public Health，1990，21(4)，523-533；Multipin Peptide SynthesisKits de Chiron)和算法(De Groot A.等人，Nature Biotechnology，1999，17，533-561)，可用于本发明实践以确定免疫原、抗原、多肽、糖蛋白等的抗原表位而不需过多的实验。根据这些信息，人们可以构建编码这种抗原表位的核酸分子，并且根据这些知识和本领域知识，人们可以构建载体或构建体，例如表达免疫原、抗原表位或抗原的重组病毒或载体或质粒；所有这些不需要过多的实验。
药物学上或兽医学上可接受的媒介物或载体或赋形剂对本领域技术人员是熟知的。例如，药物学上或兽医学上可接受的媒介物或载体或赋形剂可以是0.9％氯化钠(例如盐水)溶液或磷酸缓冲液。药物学上或兽医学上可接受的媒介物或载体或赋形剂可以是任何协助载体(或自发明的载体体外表达的蛋白质)施用的化合物或化合物的组合；有利地，媒介物、载体或赋形剂可帮助转染和/或改善载体(或蛋白质)的保存。此处的剂量和剂量体积在免疫和接种方法总述中进行论述，并且也可以通过本领域技术人员根据这些公开的资料结合本领域相关知识进行确定而不需任何过多的实验。
根据本发明的免疫原性组合物和疫苗可以包含或基本上由一种或更多佐剂组成。用于本发明实践中的合适的佐剂有(1)丙烯酸或甲基丙酸烯聚合物、顺丁烯二酸酐和烯烃衍生聚合物，(2)免疫刺激序列(ISS)，例如具有一个或更多非甲基化的CpG单位(Klinman等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，1996，93，2879-2883；WO98/16247)的寡聚脱氧核糖核苷酸序列，(3)水包油乳液，例如“Vaccine Design，The Subunit and Adjuvant Approach”，由M.Powell，M.Newman，Plenum Press 1995发表；其中147页描述的SPT乳液和同一著作中183页所描述的乳液MF59，(4)含有四价铵盐的阳离子脂类，(5)细胞因子，(6)氢氧化铝或磷酸铝或(7)其它在任何本申请引用作为参考的文献中论述的佐剂，或(8)其组合物或混合物。
水包油乳液(3)(特别适合于病毒载体)可以是基于轻的液态石蜡油(欧州药典类型)、类异戊二烯油，例如异三十烷、三十碳六烯、来源于烯烃(例如异丁烯或癸烯)的寡聚化的油、具有直链烃基基团的醇或酸的酯(例如植物油、油酸乙酯、丙二醇、二(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三(辛酸酯/癸酸酯)和丙二醇二油酸酯)、或分枝的脂肪醇或酸的酯，特别是异硬脂酸酯。油与乳化剂结合使用形成了乳剂。乳化剂可以是非离子表面活性剂，例如一方面是山梨聚糖、甘露醇(例如脱水甘露醇油酸)、甘油、多聚甘油或丙二醇的酯，而另一方面是油酸、异硬脂酸、蓖麻油或羟基硬脂酸，所述的任意乙氧基化的酯或聚氧化丙烯-聚氧化乙稀共聚物嵌段，例如聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物(例如L121)。
在类型(1)佐剂聚合物中，优选丙烯酸或甲基丙酸烯交联聚合物，特别是通过糖或多元醇的多聚烯烃酯交联的。这些化合物以名称卡波姆(Pharmeuropa，Vol.8，no.2，June 1996)为人所知。本领域技术人员也可以参考美国专利2,909,462，所述专利提供这种通过多聚羟基化合物交联的丙烯酸聚合物，所述化合物具有至少3个羟基基团，有利地不超过8个这样的基团，至少3个羟基基团的氢原子被不饱和脂肪族基团取代，所述脂肪族基团至少具有2个碳原子。有利的自由基是那些含有2到4个碳原子的基团，例如乙稀基、烯丙基和其它稀基不饱和基团。所述不饱和基也可以含有其它取代基，例如甲基。以名称聚羧乙烯(BF Goodrich，Ohio，USA)销售的产物是特别适合的。它们通过烯丙基蔗糖或烯丙基pentacrythritol交联。其中，参见Carbopol 974P、934P和971P。
至于顺丁烯二酸酐烯烃衍生共聚物，优选EMA(Monsanto)，所述EMA是直链或交联的乙稀基顺丁烯二酸酐共聚物并且它们通过例如联乙烯醚(divinyl ether)交联。参考J.Fields等人，Nature186778-780，6月4日，1960。
关于结构，所述丙烯酸或甲基丙酸烯聚合物和EMA优选由具有下列化学式的基本单位形成 其中-R1和R2，可以相同或不同，代表H或CH3-x＝0或1，优选x＝1-y＝1或2，且x+y＝2对于EMA，x＝0和y＝2并且对于卡波姆x＝y＝1这些聚合物是水或生理盐水溶液(20g/l氯化钠)可溶性的并且pH可通过例如苏打(氢氧化钠)调节到7.3到7.4以提供其中可整合表达载体的佐剂溶液。最终疫苗组合物的聚合物浓度范围在0.01和1.5％w/v之间，有利地是0.05到1％w/v和优选0.1到0.4％w/v。
有利地但不是只专门适合于质粒的、含有四价铵盐的阳离子脂类优选是那些具有下列化学式的脂类 其中R1是具有12到18个碳原子的饱和或不饱和的直链脂肪族基团，R2是另一个具有2个或3个碳原子的脂肪族基团，而X是胺或羟基集团。
在这些阳离子脂质中，优选DMRIE(N-(2-羟乙基)-N，N-二甲基-2，3-二(十四烷氧基)-1-丙烷铵；WO96/34109)，其优选与中性脂相联(优选DOPE)(二油酰-磷脂酰-乙醇胺；Behr J.P.，1994，Bioconjugate Chemistry，5，382-389)形成DMRIE-DOPE。
有利地，临时形成具有佐剂的混合物和优选在施用所述配制品时或之前较短时间内临时形成具有佐剂的混合物；例如在给药之前或之前较短时间内形成质粒-佐剂混合物，这样就有利地给予足够时间在给药之前混合形成复合物，例如在给药前约10和20分钟之间，例如在给药前约30分钟。
当DOPE存在时，DMRIE∶DOPE摩尔比优选是约95∶约5到约5∶约95，更有利地约1∶约1，例如1∶1。
DMRIE或DMRIE-DOPE佐剂质粒重量比可以在约50∶约1和约1∶约10之间，例如约10∶约1和约1∶约5，并且优选约1∶约1和约1∶约2，例如1∶1和1∶2。
所述细胞因子或多种细胞因子(5)可以是免疫原性或疫苗组合物中的蛋白质形式，或可以同免疫原或其抗原表位在宿主中共表达。优选细胞因子既可以与免疫原或其抗原表位在相同的载体上共表达，也可以通过分开的载体共表达。
本发明包括制备这类组合的组合物；例如有利地通过将活性组分与佐剂、载体、细胞因子和或稀释剂混合在一起。
可以用于本发明的细胞因子包括但不限于粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素α(IFNα)、干扰素β(IFNβ)、干扰素γ(IFNγ)、白细胞介素-1α(IL-1α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-5(IL-2)、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-7(IL-7)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-9(IL-9)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-11(IL-11)、白细胞介素-12(IL-12)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、、肿瘤坏死因子β(TNFβ)和转化生长因子β(TGFβ)。应该理解细胞因子可以与本发明的免疫原性或疫苗组合物共同施用和/或相继施用。于是，例如，本发明的疫苗也可以含有在体内表达合适细胞因子的外源核酸分子，所述合适细胞因子是例如与这个被接种的或在其中可引起免疫学反应的宿主细胞匹配的细胞因子(例如，给禽类施用的制剂的禽类细胞因子)。
本发明也提供包括施用有效剂量的免疫原性或疫苗组合以引起免疫应答或诱导免疫学或保护性反应。所述免疫原性或疫苗组合物含有从堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫和禽艾美球虫早熟株系分离出来的孢子形成了的囊合子混合物以引起或诱导动物体内的反应。有利地，所述动物是禽类，例如但不限有于鸡、鸭、鹅、珍珠鸡、孔雀、野鸡、鸽子、鹌鹑和火鸡。在最有利的实施方案中，禽类是鸡，有利地是烤子鸡。引起免疫应答或诱导免疫学应答的方法也可以包括施用佐剂、细胞胞因子或两者同时施用。
引起免疫应答或诱导免疫学或保护性反应的有效量是约10到1000个堆型艾美球虫囊合子、约10到100个巨型艾美球虫囊合子、约10到1000个和缓艾美球虫囊合子和约10到1000个禽艾美球虫囊合子。有利地，引起免疫应答或诱导免疫学或保护性反应的有效量是约500个堆型艾美球虫囊合子、约50到100个巨型艾美球虫囊合子、约500个和缓艾美球虫囊合子和约100到500个禽艾美球虫囊合子。更优选，有效量是约500个堆型艾美球虫囊合子、约100个巨型艾美球虫囊合子、约500个和缓艾美球虫囊合子和约100个禽艾美球虫囊合子。在另一个实施方案中，有效剂量足以对抗约100,000个到500,000个堆型艾美球虫囊合子、约10,000个到100,000个巨型艾美球虫囊合子、约100,000个到500,000个和缓艾美球虫囊合子和约10,000个到100,000个禽艾美球虫囊合子对动物的攻击剂量。更有利地，所述攻击剂量是约200,000个堆型艾美球虫囊合子、约20,000个到50,000个巨型艾美球虫囊合子、约200,000个和缓艾美球虫囊合子和约20,000个到50,000个禽艾美球虫囊合子。
引起免疫应答或诱导免疫学或保护性反应的有效量也涉及从堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫和禽艾美球虫早熟株系中分离出来的孢子形成了的囊合子的特定比例，其中堆型艾美球虫∶巨型艾美球虫∶和缓艾美球虫∶禽艾美球虫的比例约是10∶1到2∶10∶2到10(即对于每10个堆型艾美球虫孢子囊，就有1到2个巨型艾美球虫的孢子囊、约10个和缓艾美球虫孢子囊和约2到10个禽艾美球虫孢子囊)。有利地，堆型艾美球虫∶巨型艾美球虫∶和缓艾美球虫∶禽艾美球虫的比例是约5∶1∶5∶1(即10∶2∶10∶2)。
本发明的另一个方面是分别使用根据本发明的免疫原性组合物或疫苗组合物进行免疫的方法或进行接种的方法。
所述方法至少包括一种对动物施用足够量的根据本发明的免疫原性组合物或疫苗的方法。所述动物可以是雄性的或雌性的。这种给药方法可通过肌内(IM)、皮内(ID)或皮下(SC)注射或通过鼻内或经口给药特别进行，其中经口给药包括但不限于通过饲料或饮水、凝胶体或喷雾施用。根据本发明所述免疫原组合物或疫苗也可以通过注射器或无针头器械(如例如Pigjet或Biojector(Bioject，Oregon，USA))进行给药。在有利的实施方案中，所述给药方法是经口给药。
根据发明所述组合物也可以施用于其它哺乳动物，例如以生产多克隆抗体或为单克隆抗体制备杂交瘤，所述哺乳动物例如小鼠或实验动物。
本发明提供对动物的免疫，有利地是禽类。美国专利4,438,097；4,639,372；4,898,404；5,055,292；5,068,104；5,387,414；5,602,033；5,614,195；5,635,181；5,637,487；5,674,484；5,677,438 5,709,862；5,780,289；5,795,741；5,814,320；5,843,722；5,846,527；5,885,568 5,932,225；6,001,363和6,100,241描述了施用球虫病疫苗的方法，引用其公开的全文作为参考。所述方法包括对动物施以有效免疫剂量的本发明的疫苗。所述疫苗通过任一种本领域技术人员熟知的方法进行施用，例如通过肌内、皮下、腹膜内、静脉内、鼻内、经口、皮内、囊内(intrabursal)(刚好在鸡肛门上方)、在卵内或眼部施用。本领域技术人员熟悉这些施用技术。例如，此处全文引用美国专利5,693,622；5,589,466；5,580,859；和5,566,064作为参考。也可以在喷雾室内对禽类施用疫苗。如美国专利4,458,630和6,627,205所描述的，也可对禽类在卵内施用疫苗，引用其公开的全文作为参考。
有利地，在喷雾室内对禽类施用疫苗，即将鸟放入室内并暴露于含有疫苗的蒸汽中，或通过喷雾方式给药。在另一个有利的实施方案中，所述免疫原性或疫苗组合物通过口部给药。或者，通过将所述免疫原性或疫苗组合物放在饮用水中或饲料中进行给药。
本发明包括含有从堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫和禽艾美球虫早熟株系中分离的孢子形成了的囊合子混合物的免疫原性或疫苗组合物。所述来自堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫和禽艾美球虫早熟株系的孢子形成了的囊合子是从此处描述的种子培养物中分离出来的。一般地，组合物中的孢子形成了的囊合子的剂量范围是约10到1000个堆型艾美球虫囊合子、约10到100个巨型艾美球虫囊合子、约10到1000个和缓艾美球虫囊合子和约10到1000个禽艾美球虫囊合子。有利地，组合物中的孢子形成了的囊合子的剂量范围是约125到500个堆型艾美球虫囊合子、约25到100个巨型艾美球虫囊合子、约125到500个和缓艾美球虫囊合子和约25到500个禽艾美球虫囊合子。在一个实施方案中，较低剂量是约125个堆型艾美球虫囊合子、约25个巨型艾美球虫囊合子、约125个和缓艾美球虫囊合子和约25个禽艾美球虫囊合子。在另一个实施方案中，中等剂量是约250个堆型艾美球虫囊合子、约50个巨型艾美球虫囊合子、约250个和缓艾美球虫囊合子和约50个禽艾美球虫囊合子。而在另一个实施方案中，高剂量是约500个堆型艾美球虫囊合子、约100个巨型艾美球虫囊合子、约500个和缓艾美球虫囊合子和约100个禽艾美球虫囊合子。
有利地，免疫原性或疫苗组合物剂量是含有约500个堆型艾美球虫囊合子、约50到100个巨型艾美球虫囊合子、约500个和缓艾美球虫囊合子和约100到500个禽艾美球虫囊合子。在更有利的实施方案中，所述剂量是约500个堆型艾美球虫囊合子、约100个巨型艾美球虫囊合子、约500个和缓艾美球虫囊合子和约100个禽艾美球虫囊合子本发明也涉及从堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫和禽艾美球虫早熟株系中分离出来的孢子形成了的囊合子的特定比例，其中堆型艾美球虫∶巨型艾美球虫∶和缓艾美球虫∶禽艾美球虫的比例约是10∶1到2∶10∶2到10(即对于每10个堆型艾美球虫孢子囊，就有1到2个巨型艾美球虫的孢子囊、约10个和缓艾美球虫孢子囊和约2到10个禽艾美球虫孢子囊)。有利地，堆型艾美球虫∶巨型艾美球虫∶和缓艾美球虫∶禽艾美球虫的比例是约5∶1∶5∶1(即10∶2∶10∶2)。
有利地，所述囊合子悬浮于由含有庆大霉素的0.01M磷酸缓冲盐溶液构成的防腐剂中。在另一个实施方案中，所述囊合子悬浮于任何种类的防腐剂或有机酸中，后者例如但不限于乙酸、柠檬酸、重铬酸钾或丙酸。使用例如但不限于充分灭菌的、含有不超过30mcg/ml庆大霉素的0.01M的磷酸缓冲盐水生产2ml每瓶2,000剂量展示的、5ml每瓶5,000剂量展示的、10ml每瓶10,000剂量展示的药剂。有利地，所述囊合子贮存于灭菌的、硼硅酸盐玻璃小瓶中。例如，但不限于，用半自动或全自动分配器将所述囊合子分别装入疫苗小瓶中，机械地或人工地将塞子插入并且放置并卷曲封装铝封条。
所述疫苗以多剂量在市场上销售，每瓶含2000剂量、5000剂量、10,000剂量或20,000剂量。所述产品从其功效测试开始的日期到过期日期应该不超过13个月。
可以在任何合适的年龄对动物(有利地是禽类)进行疫苗接种，并且通常第一次接种是在约1到3天大小的之前。有利地，所述动物接种一次。可选地，当使用2剂量疫苗时，正常情况下在动物3天到1周大小时给予第一次接种并且接着根据接种动物的类型再过1到10周进行第二次接种。
在有利的实施方案中对各动物品种给药的使用、剂量和途径如下。将本发明的免疫原性或疫苗组合物给一天或更大一点的健康鸡接种以帮助预防由球虫病引起的疾病。有利地，剂量为通过每100只鸡粗略地喷20ml水雾的方式给每只鸡一剂药。
现通过下列非限制性的实施例进一步描述本发明。
实施例实施例1球菌生产产物组成。所使用的微生物是堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫和禽艾美球虫。所述微生物的贮存培养物来源如下。堆型艾美球虫的亲本于1969年从Hess和Clark实验室的T.K.Jeffer获得并且据认为由USDA，Beltsville，MD的M.Farr博士分离，其源于单一囊合子。所述巨型艾美球虫培养物来源于获自Georgia，Delaware，Maryland，Virginia和Texas的10种纯化分离株的异种交配混合物。和缓艾美球虫的亲本培养物于1978年7月分离自Gainesville，Georgia并且由单一囊合子分离株纯化而来。禽艾美球虫的亲本培养物获自1960年代早期由Patten博士维持在Pennsylvania State University的培养物，并且于1982年由University of Georgia获得。
所使用的各艾美球虫株系是如P.L.Long和Joyce K.Johnson在Avian Pathology，17305-314，1988标题为“Eimeria of AmericanChickensCharacteristics of Six Attenuated Strains Producedby Selection for Precocious Development”中描述的各微生物的早熟株系，引用其公开的全文作为参考。根据该方法通过对其早熟发育的选择对所述微生物进行减毒。
培养物。通过其独特的显微外形、大小和形状以及如Long，P.L.和W.M.Reid，A guide for the diagnosis of cocciodiosis inchickens.Re.Report 404(修改的Report 355)，Athens，GACollegeof Agriculture Experiment Station，Univ.of Georgia；1982中所描述的受感染的鸡小肠或盲肠的带状结构对本产品中所使用的各艾美球虫品种进行鉴定，引用其公开的全文作为参考。
如上所述通对其早熟发育的选择对所述微生物进行减毒。通过使用9 CFR 113.37描述的方法检测确定各培养物不含病原体。上述贮存培养物维持在液氮的液相或气相中。
2到8周大小的鸡用来生产种子培养物。给药途径是经口(即经口部施用)。所有种子都是孢子形成了的囊合子并且由2到8周大小的SPF鸡生产。用专门的设备来维持各艾美球虫品种。将足够量的的孢子形成了的囊合子与不含抗球虫剂的饲料混合，或通过口部强饲法给药以给每只鸡提供表1所列的最低剂量。孢子形成了的囊合子不受限于传代地接连地在2到8周大小的SPF鸡中传代直到囊合子的数目足够作为种子用于生产。为保持活性/感染性，所述培养物不能放置超过12个月。
表1孢子形成了的囊合子(种子)的最小剂量
接种后第3天到第8天每天都收集鸡的排泄物。随机宰杀鸡并且观察除了和缓艾美球虫外的各品种感染的特征。如果有任何外来疾病的迹象就不作收获。
作为参照的贮存培养物维持在液氮里。生产培养物维持在5±3℃并且在2到8周大小的SPF鸡体内传代。
用于播种或接种的悬浮配制品涉及种子培养物在2到8周大小的SPF鸡体内的一系列传代，直到产生充足的囊合子用于生产。
将足够量的孢子形成了的囊合子(种子)与不含抗球虫剂的饲料混合，并且给每只鸡施用列于表1中的最小剂量。接种后第3天到第8天每天都收集鸡的排泄物。随机宰杀鸡并且观察除了和缓艾美球虫外的各品种感染的特征。如果有任何外来疾病的迹象就不作收获。如上述通过对其早熟发育的选择对所述微生物进行减毒。
收获。因为生产目的，在除去微生物以前，鸡被养在设计用来生产单一品种的房间里。用不含抗球虫剂的食物供养鸡并且让其自由接触到水。接种后第3天到第8天每天都收集鸡的排泄物并且于5±3℃下保存直至加工。
使用用于生产目的的收获微生物的技术如下进行收获。将排泄物在水中以约10％(w/v)的比例进行匀浆。将匀浆物通过筛子除去大的颗粒。通过离心、筛选或通过在5±3℃下放置24小时分离固体物。如果通过在5±3℃放置分开固体物，其可进一步通过离心浓缩。弃去上清液，并且将固体物重新悬浮于饱和氯化钠(80％w/v)水溶液。将得到的溶液进行离心。从液体的上部可收集(取得)所述囊合子，并且重新悬浮于水中。最佳地，将剩下的液体用水稀释到20-40％的氯化钠并离心。然后将沉淀重新悬浮于饱和氯化钠溶液中并再离心，直到没有额外的囊合子被回收。对所述囊合子洗涤不超过二次。通过将囊合子悬浮于0.5％的次氯酸钠溶液中10到15分钟然后重复重新悬浮离心循环以洗去囊合子的盐分。接着通过重复(3X)离心和重新悬浮步骤洗去囊合子的次氯酸钠溶液。在2.5％重铬酸钾(K2CrO7)水溶液中制备最终悬浮物。然后将囊合子转到孢子形成容器中。通过在27±3℃下、不超过72小时的时间里用空气喷射悬浮液促进形成孢子。在形成孢子后将所述囊合子于5±3℃下放置直至产生最终产物。
在有利的实施方案中，对可接受的收获的种子培养物具体要求如下。首先，要确定孢子形成了的囊合子对全部囊合子的比例。只有达到或超过＞40％孢子形成的收获物才被认为是可接受的。第二，各囊合子收获物的大小、形状和外表必需具有该品种预期产生的特征。
根据9 CFR 114.15中的方式处理产品中没有使用的弃物。
产物制备。使用大量收获流质组装系列或亚系列终产物。如上面所描述，因为囊合子是早熟的所以所有囊合子都是减毒的。所述囊合子悬浮在由含有不超过30.0mcg庆大霉素的0.01M磷酸缓冲盐溶液组成的防腐剂中。所述产物经标准化产生至少如表2中显示的各品种的孢子形成了的囊合子的最终数目。
表2孢子形成了的囊合子的标准化剂量
如下组装系列产物。在四个艾美球虫品种中，将各品种的大体积悬浮块从5±3℃的贮存状态下取出并且允许在环境室温下搅拌回暖。将足够量的各个块在无菌条件下取出并组合起来以产生不少于上面表2中所列每剂的囊合子数，通过基于对各个品种的大体积悬浮物计数的计算确定其囊合子数。如果需要，将各艾美球虫品种的多个块组合到一起以提供所需要数量的孢子形成了的囊合子。用充分灭菌、含有不超过30mcg/ml庆大霉素的0.01M的磷酸缓冲盐溶液生产每瓶2ml的剂量展示为2,000的、每瓶5ml的剂量展示为5,000的药剂和每瓶10ml的剂量展示为10,000的药剂。在持续搅拌下维持大体积系列。
表3系列体积的例子(基于10,000剂产品的10,000,000剂量批次)
平均10,000剂量的系列变化范围为从20L到40L。装填体积为每1000剂装1.0ml。所述疫苗瓶子是灭菌的硼硅酸盐玻璃小瓶。
装填和密封最终容器的方法和技术如下。用半自动或自动分配器将所述疫苗在无菌条件下装填到疫苗小瓶中。机械或人工地将塞子插入瓶中。放上铝封条并卷曲以封口。
各剂量含有不少于表2中所列的孢子形成了的囊合子剂量，根据对大体积的计数计算其剂量。将一系列数分配给在一次操作中分批处理的和提交的各品种的定量。
检测。使用在9 CFR 113.27(e)中所述的检测方法对各系列的纯度进行检测。在二者中任何一个孵育条件下平均点数应该不超过每剂1个菌落。如果在起始检测中，在二者中任何一个孵育条件下所述平均点数超过每剂1个菌落，任选地用20个未打开的终容器进行一次重新检测。如果在最终的检测中，在二者中任何一个孵育条件下所述平均点数超过每剂1个菌落，所述系列是令人不满意的。
沙门氏菌显示既能被次氯酸钠又能被重铬酸钾有效杀死，于是，不再进行额外的检测。支原体显示能被次氯酸钠有效地杀死，于是不再进行额外的检测。
根据9 CFR 113.37对各系列的外源病原体进行检测。
为检测所述疫苗的安全性，使用10剂疫苗通过喷雾接种对每组至少25只1天大小、无特定病原体的鸡进行接种。每天对鸡进行观察持续21天。检查在此期间死亡的鸡并确定死亡原因。如果至少有20鸡在观察期间没有存活下来，所述检测是无结论的。如果任何疾病和死亡直接由疫苗导致，所述系列是令人不满意的。所述疫苗的结肠损伤特性被认为是正常的，并且在安全评估中不予考虑。如果少于20只鸡在观察期中活下来并且无所述疫苗造成的死亡或严重损伤，任选地再重复一次所述检测。如果不能重复所述检测，表明所述系列是不令人满意的。
将对由各批新的生产种子产生的终产物的第一个系列的潜能进行检测。所述产物将在1到14天大小的SPF或烤子鸡中进行检测。评价从生产种子获得的后继系列的效能，使用上述的配制前的计数和从接种的禽类回收的囊合子。使用不超过70只鸡。用一剂野生疫苗对不超过35只鸡进行经口接种。在初次接种后26到30天对所有的鸡进行单独鉴定和称重记录。用1.0ml如表4中显示的的各攻击剂量通过口部对来自下列各组的不超过10只接种的鸡和10只对照的鸡进行攻击。
表4攻击剂量
也可以根据致病性选择攻击剂量，因为选择水平给出至少为2的最低分值。
攻击后6天，对表4中各组的接种鸡和对照鸡进行宰杀、称重和检查肠和盲肠并对损伤打分。如表5中所显示，根据Johnson和Reid在Experimental Parisitology，Vol.28，p30-36，1970中所描述的球虫病打分系统进行打分，引用其公开的全文作为参考。
表5损伤分值
后预备步骤。所述疫苗以多剂量销售，含每瓶2000剂量、每瓶5000剂量、每瓶10,000剂量或每瓶20,000剂量。根据9 CFR 113.3收集、贮存和提交代表性样品。从开始效力检测的日期到所述产物到期日期不超过13个月并根据9 CFR 114.13确定。
针对各动物品种给药的用途、剂量和途径如下。本产品用于对1天大小或更大的健康鸡进行接种，帮助预防由球虫病引起的疾病。通过粗略的水喷雾对每只鸡施以1剂的剂量，每100只鸡20ml。
实施例2含有禽类球虫减毒株的实验疫苗与商用活球虫病疫苗和盐霉素、用于商业禽类的抗球虫病药物的效用比较。
本实施例的目的是确定与USDA证明是活囊合子的疫苗(Coccivac-B)相比减毒艾美球虫囊合子疫苗的效力，该效力保护烤子鸡免受致死艾美球虫品种的攻击，并且比较减毒疫苗与传统抗球虫病药剂盐霉素的用途。
所述目的变量如下。主要变量是肠损伤分值。当与未免疫的受攻击的对照禽类相比，可接受的标准是更低的攻击后肠球虫病损伤分值。第二个变量是(1)在7周生长阶段期间体重的增加和饲料转化以及(2)死亡率。可接受的标准包括相比于用CoccivacB免疫的或使用抗球虫病药物的禽类，在免疫的禽类中相同的或更高的体重增加和饲料转化并且相比于未免疫的对照禽类、CoccivacB免疫的禽类和抗球虫病药物处理的禽类，在免疫的禽类中较低的死亡率。
材料。表6描述之疫苗。
表6疫苗
表7致死/攻击生物体
表8动物
对动物实行同样的管理并考虑它们的舒适安宁。遵循所有适宜的规则管理动物。
实验设计。实验设计如下。
表9实验处理组
*每100只鸡给予20ml。
时间线如下。第0天，按围栏给鸡称重。如表9中所描述对第1组和第2组中的禽类进行接种，每种疫苗通过食物疗法免疫1300只禽类并将其分配到2个围栏，每个围栏占据各半间屋。第三组中的禽类开始用盐霉素免疫(60g/吨)，所述禽类按照第1组和第2组中所描述的方法分组。围栏上锁。另外的孵化的鸡作为未免疫的鸡保留在铁丝笼里。
第21天，将所有禽类的饲料从起始饲料换为生长饲料。在第3组中继续使用盐霉素。
在第28天，将受攻击的禽类移到铁丝笼子内。在被攻击的第三组禽类中停用盐霉素。将鸟和饲料称重。从来自大笼的各组垃圾中收集新鲜排泄物样品，每个围栏20个样品。按品种对囊合子定量。
第29天，用表7中描述的囊合子数量对笼中的鸟进行攻击。
第35天，终止攻击禽类，对损伤打分，并称量增加的体重。
第42天，将所有组都换成未加药的终止饲料并且称量反馈。
第49天，对所有禽类和饲料称重并结束实验。
实验方法。
疫苗/药物。在半个房间中重复确定为表9中1到3组的三个禽类处理，每个屋3个围栏，每个围栏650只禽类，每个处理共1300只禽类。如表9中描述的对1到3组中禽类进行接种疫苗。另外的处理组(4)分开地供养在干净的笼内作为未接种、未处理对照，只在攻击测试中使用。
给处理组1、2和4提供未加药的饲料。给处理组3从第1天开始一直到第42天提供盐霉素(60克/吨)。在移居到攻击笼后，给要攻击的第3组禽类提供未加药的饲料。起始饲料一直提供到第21天，生长饲料提供到第42天而终止饲料提供到第49天。记录配给的饲料，并且任何剩下未消费的饲料在更换饲料和终止供给时回称重量。
观察。在第0天和第28天将禽类按围栏称重，而在第49天按围栏和性别称重。每天2次收集死亡禽类并且进行验尸以确定死亡原因。于第28天收集排泄物样品以观察活性囊合子并按品种定量。
攻击。在第28天，从各围栏取出10只鸡一组的3个重复(每个处理总共60只)称重并移至层架式鸡笼中用艾美球虫(对应于在疫苗中使用的品种)野生株系进行攻击。在笼内给所有的禽类提供未加药饲料。在第29天，攻击1到4组的禽类然后在第35天停止。记录损伤分值和体重。
在接种前通过从鸡盒中随机拣出动物将动物随机地分配到各处理组中。科学家知道所述处理组，因为要在组之间一直保持严格的安全措施以防止交叉感染。
对有害事件进行一致用药和管理。Coccivac接种的禽类在进入实验14天后开始发病。诊断为坏死性肠炎。对应的致病因子鉴定为索氏梭菌芽孢杆菌(Clostridium sordelli)。实验中所有禽类施用盘尼西林G以减少围栏之间的感染及其影响并消除组间可歪曲球虫病结果的任何处理上的差异。
数据分析。
测量标准。对于地面围栏阶段最主要的变量是第28天和第49天的活体重和第49天的饲料转化率。对于攻击阶段，主要的变量是攻击后6天的体重增加量，和也是在攻击后六天的上部肠、中部肠和盲肠部分的损伤分值。
统计学分析。使用SAS、Cary、NC(8.2版本)进行所有的统计学分析。统计学显著性是基于本研究中接受检验的零假设二尾检测法在p值为0.05或更低时给出。
肠部损伤分值。使用包含处理组和分批(block)因素的对数模型和/或包含处理组和分批(取决于数据的本质)因素的存活分析模型对攻击后肠部球虫损伤的发生率和严重度(按损伤分值分类)进行分析。
死亡率。如果涉及致死艾美球虫品种攻击的死亡发生，用包含处理组和分批因素的ANOVA(即方差分析)确定在各处理组总体死亡率平均值(不箮发生的日期)之间是否存在差异。
体重增量和饲料转化地面围栏阶段。在处理组内，进行成对的t检验(按分批和作为整个组，不考虑分批效应)以确定在各处理组内在活体重平均值上是否存在显著差异。成对比较包括第0天对第28天体重(攻击前)和第28天对第49天体重(攻击后)。
进行成对t检验(按分批和作为整个组，不考虑分批效应)以确定在各处理组内饲料转化平均值上是否存在显著差异。成对比较包括第28天对第49天饲料转化重量(攻击后)和第42天对第49天饲料转化重量(未加药的终止饲料的效应)。
在处理组之间，根据所有天数记录的体重，将重复测量的包含有处理组、天数、分批和组与天数相互作用的因素的ANOVA用于确定在组之间的活体生重平均值上是否存在显著差异。
攻击阶段。在处理组内，进行成对的t检验(按分批和作为整个组，不考虑分批效应)以确定在各处理组内在活体重平均值上是否存在显著差异。成对比较包括第28天对第35天体重(攻击后第6天)。
在处理组之间，利用对地面围栏阶段处理组之间分析的结果对攻击后处理组之间活体重平均值进行分析，所述分析集中在第28天和第3 5天的比较。
结果。
表10第28天总结
*分组的显著统计学差异。
表11第49天总结
表12.攻击结果
每个处理攻击60只禽类。
*表示分组的统计学差异a、b、c和d是Duncan分离平均值。(Duncan检验是分离平均值的统计学hoc检验)。
1是总体损伤分值2是平均总体损伤分值讨论。对于实验疫苗和Coccivac来说，堆型艾美球虫、巨型艾美球虫和和缓艾美球虫的攻击造成的损伤分值没有显著差异。与实验株系相比，对于禽艾美球虫攻击，Coccivac确实具有更低的损伤分值。
重要的是要注意到Coccivac接种的禽类开始感染索氏梭状芽孢杆菌(Clostridium sordelli)。在野外梭菌属疾病一直是和球虫病感染联系在一起的。甚至所述感染会传播到其它处理中，Coccivac接种的禽类受到的影响最大，显示有11.77％的死亡率。
结论。所述实验艾美球虫株系在致死攻击面前显示出有效性。与Coccivac和盐霉素处理的禽类相比，用实验株系接种的禽类在第49天时具有更好的以饲料转化率定义的表现，所述表现对家禽生产者来说对应着经济上的有利方面。
***由于已经如此详细地描述了本发明有利的实施方案，因此应该理解本发明不限于上面描述中所列的具体细节，正如其许多明显的改变可能没有背离本发明的精神和范围。
权利要求
1.免疫原性或疫苗组合物，所述组合物基本上由从堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫和禽艾美球虫的早熟株系分离出来的孢子形成了的囊合子的混合物构成。
2.权利要求1的组合物，其中所述混合物由约500个堆型艾美球虫的囊合子、约50到约100个巨型艾美球虫的囊合子、约500个和缓艾美球虫的囊合子和约100个到约250个禽艾美球虫的囊合子组合而成。
3.权利要求1的组合物，其中所述混合物由约500个堆型艾美球虫的囊合子、约100个巨型艾美球虫的囊合子、约500个和缓艾美球虫的囊合子和约100个禽艾美球虫的囊合子组合而成。
4.免疫原性或疫苗组合物，所述组合物包含从堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫和禽艾美球虫的早熟株系分离出来的孢子形成了的囊合子组成的混合物，其中堆型艾美球虫∶巨型艾美球虫∶和缓艾美球虫∶禽艾美球虫的比例约是10∶1到2∶10∶2到5。
5.权利要求4的组合物，其中堆型艾美球虫∶巨型艾美球虫∶和缓艾美球虫∶禽艾美球虫的比例约是5∶1∶5∶1。
6.引起免疫应答的方法，所述方法包括施用有效剂量的权利要求1的免疫原性或疫苗组合物以诱导鸡中的应答反应。
7.诱导免疫学的或保护性应答的方法，所述方法包括施用有效量的权利要求1的免疫原性或疫苗组合物以诱导鸡中的应答反应。
8.引起免疫应答的方法，所述方法包括施用有效剂量的权利要求4的免疫原性或疫苗组合物以诱导鸡中的应答反应。
9.诱导免疫学的或保护性应答的方法，所述方法包括施用有效量的权利要求4的免疫原性或疫苗组合物以诱导鸡中的应答反应。
10.权利6或7的方法，其中有效剂量是约500个堆型艾美球虫的囊合子、约50个到100个巨型艾美球虫的囊合子、约500个和缓艾美球虫的囊合子和约100个到约250个禽艾美球虫的囊合子。
11.权利6或7的方法，其中有效剂量是约500个堆型艾美球虫的囊合子、约100个巨型艾美球虫的囊合子、约500个和缓艾美球虫的囊合子和约100个禽艾美球虫的囊合子。
12.权利要求8或9的方法，其中有效剂量是堆型艾美球虫∶巨型艾美球虫∶和缓艾美球虫∶禽艾美球虫的比例约为5∶1∶5∶1。
13.权利要求6到9中任一项的方法，其中有效剂量足以对抗约100,000个到500,000个堆型艾美球虫囊合子、约10,000个到100,000个巨型艾美球虫囊合子、约100,000个到500,000个和缓艾美球虫囊合子或约10,000个到约100,000个禽艾美球虫囊合子对动物的攻击剂量。
14.权利要求13的方法，其中所述攻击剂量为约200,000个堆型艾美球虫囊合子、约20,000个到50,000个巨型艾美球虫囊合子、约200,000个和缓艾美球虫囊合子或约20,000个到约50,000个禽艾美球虫囊合子。
全文摘要
本发明涉及用于鸡的球虫病的疫苗，所述疫苗由四种减毒的艾美球虫品种制备而来堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫和禽艾美球虫。所述疫苗在激起对抗球虫病的保护性免疫方面相似于或优于其它抗球虫病药物。
文档编号A61K39/35GK1735429SQ200380108552
公开日2006年2月15日 申请日期2003年12月8日 优先权日2002年12月9日
发明者L·R·麦克杜格尔德, A·L·富勒 申请人:佐治亚州大学研究基金会