用含自身c5氨基酸区段和非自身氨基酸区段的多肽治疗炎性疾病的方法和材料的制作方法

专利名称：用含自身c5氨基酸区段和非自身氨基酸区段的多肽治疗炎性疾病的方法和材料的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗炎性疾病的方法和材料。
背景技术：
类风湿性关节炎是一种影响外周关节的自身免疫性炎性疾病。胶原诱导的关节炎动物模型帮助人们确定了与类风湿性关节炎相关的基因。对于类风湿性关节炎疾病的引发和维持非常重要的主要组织相容性复合物(MHC)二类基因(在小鼠中为Aq)已得到鉴定。此基因在功能上对应于人类的HLA-DR基因DR*0401，提示T细胞介导的对关节特异性抗原的自身免疫识别参与了这类疾病的发生。
还发现MHC区域之外的基因对于类风湿性关节炎疾病的引发和维持也很重要。其中一个基因区域位于小鼠的二号染色体中，包含编码补体因子C5的基因。C5的一种活性成分是C5a，其在补体结合到免疫复合物时被释放出来。C5a的释放触发了几个不同的路径从而导致了类风湿性炎性。炎性关节中局部产生的C5a可结合于巨噬细胞和中性粒细胞上的受体，使炎性细胞渗入关节。C5a还在如下补体介导的过程中发挥中枢作用，例如败血症、心肌缺血/重灌注性损伤、成人呼吸窘迫综合征、肾炎和移植排异反应，以及补体介导的炎性疾病，例如类风湿性关节炎、哮喘、炎性大肠疾病、多发性硬化、动脉硬化和脉管炎。
发明概述本发明涉及治疗如下炎性疾病的方法和材料，例如，哺乳动物的败血症、心肌缺血/重灌注性损伤、成人呼吸窘迫综合征、肾炎、移植排异反应、类风湿性关节炎、哮喘、炎性肠疾病、多发性硬化、动脉硬化和脉管炎。具体说，本发明提供了治疗炎性疾病的多肽、分离的核酸、宿主细胞以及方法。本发明的多肽可以是免疫原性的。一方面，本发明提供了免疫原性的多肽，这些多肽包含自身和非自身氨基酸区段。例如，本发明提供的一种多肽包含自身C5a氨基酸区段和一个或多个非自身T细胞表位。另一方面，本发明提供了分离的核酸，其编码的免疫原性多肽适于治疗患有炎性疾病的哺乳动物。另外，本发明提供的宿主细胞包含编码本文提供多肽的分离的核酸，例如，这些宿主细胞可用来生产大量的编码多肽。
一方面，本发明的特征是一种包含多肽的组合物，其中，所述多肽包含自身C5氨基酸区段和非自身氨基酸区段，该非自身区段长度小于350个氨基酸(例如，小于300个氨基酸，小于250个氨基酸或小于200个氨基酸)。给哺乳动物施用此多肽可诱导该哺乳动物产生抗C5应答反应，该哺乳动物的基因组可包含编码自身C5氨基酸区段的核酸。该非自身氨基酸区段可以是细菌的氨基酸区段(例如，MBP氨基酸区段)。该非自身氨基酸区段可以是C5氨基酸区段。该非自身氨基酸区段可以是非自然产生的。该非自身氨基酸区段可以包含至少两个T细胞表位。该非自身氨基酸区段可以是脊椎动物(例如哺乳动物)的C5氨基酸区段。该脊椎动物的非自身C5氨基酸区段可以包含至少两个T细胞表位。该非自身氨基酸区段可以是病毒或真菌的氨基酸区段。
本发明还提供了治疗患有炎性疾病哺乳动物(例如人)的方法。此方法可包含给哺乳动物施用一种多肽，该多肽能在哺乳动物中诱导抗C5应答反应，该多肽包含自身C5氨基酸区段和非自身氨基酸区段，其中，该哺乳动物的基因组包含编码自身C5氨基酸区段的核酸。所述炎性疾病可以是败血症、心肌缺血/重灌注性损伤、成人呼吸窘迫综合征、肾炎、移植排异反应、类风湿性关节炎、哮喘、炎性肠疾病、多发性硬化、动脉硬化和/或脉管炎。该多肽可以是MBP-C5a。该自身C5氨基酸区段可以包含C5a序列的一部分。该非自身氨基酸区段可以包含C5序列的一部分。该非自身氨基酸区段可以是病毒、细菌、真菌、哺乳动物的氨基酸区段，和/或非自然产生的氨基酸区段。该非自身氨基酸区段可以包含至少两个T细胞表位。
另一方面，本发明的特征是一种包含多肽的组合物，这种多肽包含自身C5氨基酸区段和非自身C5氨基酸区段。该多肽施用于哺乳动物时，可在该哺乳动物中诱导抗C5的应答反应，该哺乳动物基因组中可含有编码自身C5氨基酸区段的核酸。所述非自身C5氨基酸区段可以是非自然产生的。所述非自身C5氨基酸区段可含至少两个T细胞表位。
另一方面，本发明的特征是一种包含多肽的组合物，该多肽含自身C5氨基酸区段和非自身脊椎动物C5氨基酸片段。该多肽施用于哺乳动物时，可在该哺乳动物中诱导抗C5的应答反应，该哺乳动物基因组中可含有编码自身C5氨基酸区段的核酸。所述非自身脊椎动物的氨基酸区段可以是哺乳动物的氨基酸区段。所述非自身C5氨基酸区段可含至少两个T细胞表位。
另一方面，本发明的特征是一种包含多肽的组合物，这种多肽包含自身C5氨基酸区段和非自身氨基酸区段，其中，非自身氨基酸区段的长度小于350个(例如小于300，小于250或小于200个)氨基酸残基。给哺乳动物施用该多肽可以诱导该哺乳动物抗C5应答反应，该哺乳动物的基因组可包含编码自身C5氨基酸区段的核酸。所述非自身氨基酸区段可以是病毒、细菌、真菌、哺乳动物的氨基酸区段，和/或非自然产生的氨基酸区段。该非自身氨基酸区段可包含至少两个T细胞表位。
另一方面，本发明的特征是一种含有多肽和佐剂的组合物，其中，所述多肽包含自身氨基酸区段和细菌的氨基酸区段。该细菌氨基酸区段可以是MBP。
另一方面，本发明的特征是一种包含具有自身C5氨基酸区段和真菌氨基酸区段的多肽的组合物。
另一方面，本发明的特征是一种包含具有自身C5氨基酸区段和病毒氨基酸区段的多肽的组合物。
另一方面，本发明的特征是一种分离的核酸，该核酸编码的多肽包含自身C5氨基酸区段和非自身C5氨基酸区段。
另一方面，本发明的特征是一种分离的核酸，这种核酸编码的多肽包含自身C5氨基酸区段和非自身脊椎动物氨基酸区段。
另一方面，本发明的特征是一种分离的核酸，这种核酸编码的多肽包含自身C5氨基酸区段和非自身氨基酸区段，该非自身氨基酸的长度小于360个(例如小于300，小于250或小于200个)氨基酸残基。
另一方面，本发明的特征是一种分离的核酸，该核酸编码的多肽包含自身C5氨基酸区段和细菌氨基酸区段，其中，该多肽在C5氨基酸区段和细菌氨基酸区段之间缺少Xa因子的切割位点。所述非自身细菌氨基酸区段可以是MBP。
另一方面，本发明的特征是一种分离的核酸，该核酸编码的多肽包含自身C5氨基酸区段和真菌氨基酸区段。
另一方面，本发明的特征是一种分离的核酸，该核酸编码的多肽包含自身C5氨基酸区段和病毒氨基酸区段。
另一方面，本发明的特征是一种宿主细胞，该细胞包含(1)一种分离的核酸，在宿主细胞中该分离的核酸编码的多肽含有自身C5氨基酸区段和非自身C5氨基酸区段；(2)一种分离的核酸，在宿主细胞中该分离的核酸编码的多肽含有自身C5氨基酸区段和非自身脊椎动物氨基酸区段；(3)一种分离的核酸，在宿主细胞中该分离的核酸编码的多肽含有自身C5氨基酸区段和非自身氨基酸区段，非自身氨基酸区段的长度小于350个(例如，小于300，小于250或小于200个)氨基酸残基；(4)一种分离的核酸，在宿主细胞中该分离的核酸编码的多肽含有自身C5氨基酸区段和非自身细菌氨基酸区段；(5)一种分离的核酸，在宿主细胞中该分离的核酸编码的多肽含有自身C5氨基酸区段和非自身真菌氨基酸区段；和/或(6)一种分离的核酸，在宿主细胞中该分离的核酸编码的多肽含有自身C5氨基酸区段和非自身病毒氨基酸区段。所述宿主细胞可以表达这种多肽。
另一方面，本发明的特征是一种可施用于哺乳动物的组合物。此组合物可包含一种多肽，其中，对于哺乳动物，该多肽可以包含自身C5氨基酸区段和非自身C5氨基酸区段。给哺乳动物施用此多肽可以诱导该哺乳动物抗C5应答反应，其中，该哺乳动物的基因组包含编码自身C5氨基酸区段的核酸。所述非自身氨基酸区段可以是非自然产生的。该非自身C5氨基酸区段可以包含至少两个T细胞表位。
另一方面，本发明的特征是一种可施用于哺乳动物的组合物。此组合物包含一种多肽，其中，对于哺乳动物，该多肽包含自身C5氨基酸区段和非自身脊椎动物氨基酸区段。给哺乳动物施用此多肽可以诱导该哺乳动物抗C5应答反应，其中，该哺乳动物的基因组包含编码自身C5氨基酸区段的核酸。脊椎动物的非自身氨基酸区段可以是哺乳动物的氨基酸区段。该脊椎动物的非自身氨基酸区段可以包含至少两个T细胞表位。
另一方面，本发明的特征是可施用于哺乳动物的组合物。此组合物可包含一种多肽，其中，对于哺乳动物，该多肽包含自身C5氨基酸区段和非自身氨基酸区段，所述非自身氨基酸区段的长度小于350个(例如小于300，小于250或小于200个)氨基酸残基。给哺乳动物施用此多肽可以诱导该哺乳动物抗C5应答反应，其中，该哺乳动物的基因组包含编码自身C5氨基酸区段的核酸。所述非自身氨基酸区段可以是病毒、细菌、真菌或哺乳动物的。该非自身氨基酸区段可以是非自然产生的。该非自身C5氨基酸区段可以包含至少两个T细胞表位。
另一方面，本发明的特征是一种可施用于哺乳动物的组合物。此组合物包含一种多肽和佐剂，其中，对于哺乳动物，该多肽包含自身C5氨基酸区段和细菌氨基酸区段(例如MBP)。
另一方面，本发明的特征是一种可施用于哺乳动物的组合物。此组合物包含一种多肽，其中，对于哺乳动物，该多肽包含自身的C5氨基酸区段和真菌氨基酸区段。
另一方面，本发明的特征是可施用于哺乳动物的组合物。此组合物包含一种多肽，其中，对于哺乳动物，该多肽包含自身C5氨基酸区段和病毒氨基酸区段。
另一方面，本发明的特征是一种分离的核酸，其中，该分离的核酸编码可施用于哺乳动物的一种多肽，其中对于哺乳动物，该多肽包含自身C5氨基酸区段和非自身C5氨基酸区段。
本发明的另一特征是一种分离的核酸，其中，该分离的核酸编码可施用于哺乳动物的一种多肽，其中对于哺乳动物，该多肽包含自身C5氨基酸区段和非自身脊椎动物氨基酸区段。
另一方面，本发明的特征是一种分离的核酸，其中，分离的核酸编码可施用于哺乳动物的一种多肽，其中对于哺乳动物，该多肽包含自身C5氨基酸区段和非自身氨基酸区段，其中，该非自身氨基酸区段的长度小于350个(例如小于300，小于250或小于200个)氨基酸残基。
另一方面，本发明的特征是一种分离的核酸，其中，该分离的核酸编码可施用于哺乳动物的一种多肽，其中对于哺乳动物，该多肽包含自身C5氨基酸区段和细菌氨基酸区段。其中，该多肽在C5氨基酸区段和细菌氨基酸区段之间缺少Xa因子切割位点。所述细菌的氨基酸区段可以是MBP。
另一方面，本发明的特征是一种分离的核酸，其中，该分离的核酸编码可施用于哺乳动物的多肽，其中，对于哺乳动物，该多肽包含自身C5氨基酸区段和真菌氨基酸区段。
本发明另一特征是一种分离的核酸，其中，该分离的核酸编码可施用于哺乳动物的一种多肽，其中，对于哺乳动物，该多肽包含自身C5氨基酸区段和病毒氨基酸区段。
本发明的另一特征是一种宿主细胞，该细胞包含(1)一种分离的核酸，其中，该分离的核酸编码可施用于哺乳动物的一种多肽，其中，对于哺乳动物，该多肽包含自身C5氨基酸区段和非自身C5氨基酸区段。(2)一种分离的核酸，其中，该分离的核酸编码可施用于哺乳动物的一种多肽，其中，对于哺乳动物，该多肽包含自身C5氨基酸区段和非自身脊椎动物氨基酸区段。(3)一种分离的核酸，其中，该分离的核酸编码可施用于哺乳动物的一种多肽，其中，对于哺乳动物，该多肽包含自身C5氨基酸区段和非自身氨基酸区段，所述非自身氨基酸区段的长度小于350个(例如小于300，小于250或小于200个)氨基酸残基。(4)一种分离的核酸，其中，该分离的核酸编码可施用于哺乳动物的一种多肽，其中，对于哺乳动物，该多肽包含自身C5氨基酸区段和非自身细菌氨基酸区段。(5)一种分离的核酸，其中，该分离的核酸编码可施用于哺乳动物的一种多肽，其中，对于哺乳动物，该多肽包含自身C5氨基酸区段和非自身真菌氨基酸区段。和/或(6)一种分离的核酸，其中，该分离的核酸编码可施用于哺乳动物的一种多肽，其中，对于哺乳动物，该多肽包含自身C5氨基酸区段和非自身病毒氨基酸区段。所述宿主细胞可以表达这种多肽。
另一方面，本发明的特征是一种可施用于哺乳动物的组合物。此组合物可包含一种多肽，其中，对于哺乳动物，该多肽包含自身C5氨基酸区段和非自身氨基酸区段，其中，所述自身C5氨基酸区段至少90％与哺乳动物的C5序列相同。
除非另有说明，本文所有的技术和科学术语具有与本领域一般技术人员的通常理解相同的含义。虽然可采用与本文描述相似或相等的方法和材料来实施或验证本发明专利，但是下面描述了适宜的方法和材料。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都以参考文献的形式完整地引入本文。如有冲突，本说明书，包括定义，将给予控制。另外，材料、方法和实施例只是用来说明而非限制性的。
通过下面的附图和详细描述以及权利要求书，将会明白本发明的其他特征和优点。


图1显示了小鼠pro-C5 DNA序列(SEQ ID No1)。
图2显示了小鼠pro-C5氨基酸序列包含信号肽(SEQ ID No2)。
图3图示一种核酸载体，设计用于表达包含麦芽糖结合蛋白(MBP)和小鼠C5a的融合蛋白。
图4MBP-C5a PCR产物的核酸序列(SEQ ID No3)。
图5MBP-C5a融合多肽的氨基酸序列(SEQ ID No4)图6曲线图，表示在对照小鼠(空心菱形)和MBP-C5a融合多肽接种小鼠(实心圆)中胶原诱导的关节炎的发病率。*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.005。
图7曲线图，表示在对照小鼠(空心圆)和MBP-C5a融合多肽接种的小鼠(实心圆)中胶原诱导的平均关节炎评分。*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.005。
图8曲线图，表示在对照小鼠和MBP-C5a融合多肽接种的小鼠中胶原诱导的关节炎的平均最大关节炎评分。**，p＜0.01。
图9曲线图表示关节炎评分数据曲线下的区域面积，数据获自以胶原注射然后用PBC(对照)或MBP-C5a融合多肽治疗的小鼠。***，p＜0.005。
图10曲线图，表示在对照小鼠(实心圆)和MBP-C5a融合多肽接种小鼠(空心菱形)中胶原诱导的慢性关节炎的发病百分率。*，p＜0.05；**，p＜0.01；。
图11曲线图，表示在对照小鼠(实心圆)和MBP-C5a融合多肽接种小鼠(空心圆)中胶原诱导的慢性关节炎的平均评分。*，p＜0.05。
发明详述本发明提供治疗炎性疾病的方法和材料。本文所用的术语“炎性疾病”指疾病、疾病状态、综合征或由炎症引起的其他疾病。例如，类风湿性关节炎和哮喘是炎性疾病。炎性疾病的其他实例包括但不限于败血症、心肌缺血/重灌注性损伤、成人呼吸窘迫综合征、肾炎、移植排异反应、炎性大肠疾病、多发性硬化、动脉硬化和/或脉管炎。本发明提供了多肽、分离的核酸、宿主细胞以及方法，用于在哺乳动物中诱导针对某种抗原例如C5或C5a的抗体应答反应。例如，本文所描述的方法和材料可用于在哺乳动物中通过减少C5a的总量和/或受体结合的C5a的量来降低C5a的作用。
多肽本发明提供可用于治疗炎性疾病的多肽。这些多肽可具有免疫原性。“免疫原性”多肽是能在哺乳动物中有效地诱导抗体应答反应的任何多肽。例如，一种免疫原性多肽可以是能在哺乳动物中有效诱导抗自身C5抗体产生的多肽。
本发明的多肽包含至少一个氨基酸区段，此氨基酸区段认为是接受该多肽的哺乳动物自身所没有的。例如，一种能诱导抗自身C5抗体产生的多肽可以包含自身C5氨基酸区段和非自身氨基酸区段(例如，非自身C5氨基酸区段)。自身C5氨基酸区段可提供抗自身C5抗体应答反应的特异性，而该非自身氨基酸区段可以加强多肽的免疫原性。而非自身氨基酸区段(例如，非自身C5氨基酸区段)可以包含至少两个T细胞表位。或者，该非自身氨基酸区段可以稳定免疫原性多肽从而诱导特异性抗自身C5抗体的应答反应。多肽的自身C5氨基酸区段可以是能直接与C5a受体相互作用的C5的一部分。此类自身C5氨基酸区段包含但不限于，C5a或C5a区段。另外，多肽的自身C5氨基酸区段可以是能间接影响C5a和C5a受体作用的C5的一部分。例如，含有C5的C5转化酶识别序列的多肽可以诱导产生能结合于C5的C5转化酶识别序列的抗体，从而通过C5转化酶抑制C5转化为C5a。
本文所用的术语“氨基酸区段”指多肽中一段毗连的氨基酸。例如，在有一百个氨基酸残基的多肽中的30-40个氨基酸残基可认为是一个氨基酸区段。一个氨基酸区段可以是多于8个氨基酸残基的任何长度(例如，大于9、10、15、20、25、30、40、50、75、100、150、200、500、1000或更多的氨基酸残基)。因此，一个氨基酸区段可以是C5、C5的整个C5a区域或C5a的一部分。在有些实施方式中，氨基酸区段可以小于1000个氨基酸残基(例如，小于500，小于400，小于300，小于200或小于100个氨基酸残基)。在其他实施方式中，氨基酸区段可以长20-200个氨基酸残基(例如，30-180个氨基酸残基，或40-150个氨基酸残基)。
对于一个氨基酸区段和具体的哺乳动物，本文所用的术语“自身”一般指该具体哺乳动物内源所拥有的任何氨基酸区段。如果一个氨基酸区段来源于某种动物的一个成员并被引入同一种动物内源拥有这种氨基酸区段的另一成员，那么该特定氨基酸区段被认为是自身氨基酸区段。例如，小鼠的C5氨基酸区段，当被引入同一只小鼠、遗传上相同的小鼠或遗传上不相同但是内源拥有该相同氨基酸区段的小鼠时，此C5氨基酸区段是自身氨基酸区段。
对于一个氨基酸区段和具体的哺乳动物，本文所用的术语“非自身”一般指该具体哺乳动物内源所不拥有的任何氨基酸区段。如果一个氨基酸区段来源于第一种动物的一个成员并被引入内源不拥有这种氨基酸区段的第二种动物的一个成员中，那么该特定的氨基酸区段被认为是非自身氨基酸区段。例如，小鼠的C5氨基酸区段，当被引入人体中，可认为是非自身氨基酸区段。另一个例子，如果一种多肽含有小鼠的C5a区段和人的C5b区段，此多肽被引入小鼠中，可认为C5a氨基酸区段是自身C5a氨基酸区段而C5b氨基酸区段是非自身氨基酸区段。或者，如果将同样的多肽引入人体，可认为C5a氨基酸区段是非自身C5a氨基酸区段而C5b氨基酸区段是自身氨基酸区段。如果认为一种动物一个成员的氨基酸区段对于同一种动物的另一成员是多态性的，那么可认为此氨基酸区段对于同一物种但没有此多态性的成员是非自身氨基酸区段。例如，某人的C5氨基酸区段具有某种多态性，当此氨基酸区段被引入不具此多态性的第二个人，那么对于第二个人，可认为此C5氨基酸区段是非自身氨基酸区段。也可以理解，隐蔽的T细胞表位(即正常情况下在MHC分子上的表达水平不足以使T细胞识别的自身多肽)可认为是非自身的。
非自身和自身氨基酸区段可以是相同或不同的自然产生的多肽。例如，如果一个多肽含有人C5的自身氨基酸区段，那么非自身氨基酸区段可以是同类型的多肽(例如，大鼠C5)或不同类型的多肽(例如，大鼠白蛋白)。在另一实施方式中，一种多肽可含有自身C5氨基酸区段和MBP提供的一个或多个非自身T细胞表位。另外，氨基酸区段可以来自任何类型的多肽，包含但不限于，细菌多肽(例如MBP)，真菌多肽，病毒多肽或哺乳动物多肽。
本文提供的自身区段通常与要施以多肽治疗的哺乳动物中的该多肽区段至少90％相同(例如至少91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同)。在有些实施方式中，自身区段可与要施以多肽治疗的哺乳动物的该多肽区段100％相同。因此，本发明提供的多肽所含的氨基酸区段具有(1)长度和(2)此长度中与某个参考氨基酸区段(例如，某特定哺乳动物的氨基酸序列)的相同百分率。本发明还提供分离的核酸分子，这些核酸分子包含的核酸序列编码的多肽所含的氨基酸区段具有(1)长度和(2)此长度中与某哺乳动物氨基酸序列的相同百分率。典型地，该哺乳动物的氨基酸或核酸序列称为参考序列，而与该哺乳动物序列作比较的氨基酸或核酸序列称为目标序列。例如，所述哺乳动物的序列可以是具有SEQ ID为NO2所示序列的参考序列。
对于任何氨基酸或核酸序列的长度和在此长度上的相同百分率可用如下方式确定。第一，采用卓越版BLASTZ中的BLAST 2 Sequence(B12seq)程序，将一个氨基酸或核酸序列与待治疗哺乳动物的某氨基酸或核酸序列作比较。卓越版的BLASTZ包含BLASTN 2.0.14版本和BLASTP 2.0.14版本。卓越版的BLASTZ可以在以下网址获得，Fish&Richardson的网址(www.fr.com/blast)，美国政府国家生物信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov)，或纽约州立大学的OldWestbury图书馆(QH497.m6714)。可以在BLASTZ中的readme文档找到如何应用B12seq程序的说明。
Bl2seq应用BLASTN或BLASTP算法比较两个序列。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。为比较两个核酸序列，选项按如下设置-i设为含有第一个需比较的核酸序列的文档(例如，C\seq1.txt)；-j设为含有第二个需比较的核酸序列的文档(例如，C\seq2.txt)；-p设为blastn；o设为任何所需的文件名(例如，C\output.txt)；-q设为-1；r设为2；所有其他选项设为默认。例如，下面的指令可用于产生含有两个序列比较结果的输出文档C\Bl2seq-i c\seq1.txt-j c\seq2.txt-p blastn-oc\output.txt-q-1-r2。为比较两个氨基酸序列，选项按如下设置-i设为含有第一个需比较的氨基酸序列的文档(例如，C\seq1.txt)；-j设为含有第二个需比较的氨基酸序列的文档(例如，C\seq2.txt)；-p设为blastp；-o设为任何所需的文件名(例如，C\output.txt)；所有其他选项设为默认。例如，下面的指令可用于产生含有两个氨基酸序列比较结果的输出文档C\Bl2seq-i c\seq1.txt-j c\seq2.txt-p blastp-o c\output.txt。如果目标序列与该哺乳动物序列的任何部分有同源性，那么该命令的输出的文档将把那些同源区域作为排列对比的序列。如果目标序列与该哺乳动物序列的任何部分都没有同源性，那么该命令的输出文档将不提供排列对比序列。
一旦进行了排列对比，计算出与该哺乳动物序列对比的目标序列的连续核酸或氨基酸残基的数目，从而确定长度。相匹配的位置是在目标和哺乳动物序列中都存在的相同的核酸或氨基酸残基的位置。目标序列中存在的空格不计算入内，因为空格不是核酸或氨基酸残基。同样地，该哺乳动物序列中存在的空格也不计入内，因为需要计算的是目标序列核酸或氨基酸残基而非哺乳动物序列中的核酸或氨基酸残基。
对确定长度的相同性百分比可通过计算在此长度中相匹配位置的数目，除以该长度数，然后将得出的数值乘以100来确定。例如，如果(1)将一个300个氨基酸的目标序列与参考序列进行比较，(2)Bl2seq程序提供200个与参考序列某区域相对比的目标序列的连续的氨基酸，和(3)这200个对比的氨基酸中相匹配数目是180，因此这个300个氨基酸的目标序列含有某个氨基酸区段的长度为200，此长度中的相同性百分比为90(即，180，200*100＝90)。
需要注意的是，序列相同性百分比的数值被舍入到最近的十分位。例如，75.11，75.12，75.13，75.14不进位舍入为75.1，而75.15，75.16，75.17，75.18和75.19进位为75.2。还需注意的是，长度值总是一个整数。
此处提供的多肽的非自身区段与要施以多肽治疗的哺乳动物的该多肽区段的相同性小于95％(例如，小于94、93、92、91、90、85、80、75、70、65、60、55或50的相同性百分比)。
可用任何方法来制备多肽，包括，例如，原核系统表达，真核系统表达以及化学合成技术。可用任何方法来纯化多肽，包括但不限于，分级、离心和层析。例如，含有麦芽糖结合蛋白(MBP)的多肽可以用直链淀粉亲和层析进行纯化。
核酸本发明提供分离的编码如本文所述多肽的核酸(例如含有自身和非自身氨基酸区段的多肽)。例如，本发明的核酸可编码含有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽。或者，本发明的核酸可编码含有SEQ ID NO2所示氨基酸序列一部分的多肽。在另一个实施方式中，本发明的核酸可编码含有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的多肽。分离的核酸也可编码含有自身C5氨基酸区段和非自身氨基酸区段(例如，非自身C5氨基酸区段，或非自身脊椎动物、细菌、真菌或病毒的氨基酸区段)的多肽。该分离的核酸编码的自身区段可以包含与要施以多肽治疗的哺乳动物中存在的该多肽某氨基酸序列相同性至少为90％(例如至少91、92、93、94、95、96、97、98或99％的相同性百分比，或100％相同)的氨基酸区段。该分离的核酸编码的非自身区段可以包含与要施以多肽治疗的哺乳动物中存在的该多肽的某氨基酸序列相同性小于95％(例如小于94、93、92、91、90、85、80、75、70、65、60、55或50％的相同性百分比)的氨基酸区段。
本文所用术语“核酸”包括RNA和DNA，包括cDNA，基因组DNA和合成(例如化学合成)的DNA。这些核酸可以是双链或单链的。当为单链时，核酸可以是正义链或反义链。另外，核酸可以是环状或链状。
对于核酸本文所用的术语“分离的”指自然产生的、但一端或两端不与其在来源的生物体自然产生的基因组中直接连接的序列相连接的(一端为5’末端，一端为3’末端)核酸。例如，分离的核酸可以是但不限于任何长度的重组DNA，只要在自然产生的基因组中正常时与其直接侧接的核酸序列中的一个被去除或缺失。因此，分离的核酸包括但不限于，独立于其他序列(例如cDNA或PCR或限制性内切酶处理产生的基因组DNA)的重组DNA，以及掺入到载体、自主复制质粒、病毒(例如逆转录病毒、腺病毒或疱疹病毒)中或原核或真核基因组DNA中的重组DNA。此外，分离的核酸可以包括是杂交或融合核酸序列一部分的重组DNA。
对于核酸本文所用的术语“分离的”还包括非自然产生的核酸，因为非自然产生的核酸序列在自然界中找不到并且在自然产生的基因组中没有与其直接连接的序列。例如，非自然产生的核酸例如工程改造的核酸可认为是分离的核酸。工程改造的核酸可以用常规的分子克隆或化学核酸合成技术制备。分离的非自然产生的核酸可独立于其他序列，或者被掺入到载体、自主复制质粒、病毒(例如逆转录病毒、腺病毒或疱疹病毒)中或原核或真核基因组DNA中。此外，非自然产生的核酸可以包括是杂交或融合核酸序列一部分的核酸。
存在于几百或几百万种其他核酸中的，例如存在于cDNA或基因组文库，或含有基因组限制性酶消化凝胶切片中的核酸不认为是一种分离的核酸。
对于核酸和特定的细胞，本文所用术语“外源的”指在自然界中不是起源于该特定细胞的任何核酸。因此，任何非自然产生的核酸一旦被引入细胞，都认为对于该细胞是外源的。很重要需注意的是，只要作为整体，非自然产生的核酸在自然界中不存在，它可以包含自然界存在的核酸序列或核酸序列区段。例如，在某表达载体中含基因组DNA的某核酸是一种非自然产生的核酸，当该核酸作为整体(基因组DNA加载体DNA)在自然界中是不存在的，那么此核酸一旦被引入细胞中则对于该细胞是外源的。所以，任何作为整体在自然界中不存在的载体、自主复制型质粒或病毒(例如，逆转录病毒、腺病毒或疱疹病毒)都可认为是非自然产生的核酸。PCR或限制性内切酶处理产生的基因组DNA区段和cDNA都认为是非自然产生的核酸，因为他们是在自然界中未发现的独立分子。含有在自然界中未发现的任何排列方式的启动子序列和多肽编码序列(例如，cDNA或基因组DNA)的核酸都是非自然产生的核酸。
自然产生的核酸序列对于某具体的细胞可以是外源的。例如，从人X的细胞分离得到的整个染色体一旦被引入到人Y的细胞中，那么此染色体对于人Y是外源性核酸。
分离的核酸可以但不限于用常规的分子克隆和化学核酸合成技术获得。例如，可以用PCR获得分离的核酸，使其含有与SEQ ID NO1给出的序列相似的核酸序列。PCR指一种程序或技术，其中目标核酸扩增的方式与美国专利No.4,683,195中描述的方式相似，本文对其程序做了一些后续改进。通常可利用感兴趣区域两端或之外的序列信息来设计寡聚核酸引物，该引物序列与待扩增模板的相反链相同或相似。利用PCR，可以扩增RNA或DNA的核酸序列。例如，可以用PCR扩增总的细胞RNA、总的基因组DNA或cDNA和噬菌体序列、质粒序列、病毒序列等分离得到核酸。当使用RNA作为模板来源时，可用反转录酶合成互补DNA链。
分离的核酸也可以通过诱变得到。例如，一个含有SEQ ID NO1给出序列的核酸可以用常规的分子克隆技术突变(例如，定点突变)。可能的突变包括但不限于，删除、插入和取代，以及删除、插入和取代相组合。
此外，可以利用核酸和氨基酸数据库(例如GenBank)得到分离的核酸。例如，可采用与SEQ ID NO1给出的序列具有一些同源性的任何核酸序列，或与SEQ ID NO2给出的序列具有一些同源性的任何氨基酸序列作为查询来检索GenBank数据库。
另外，可利用核酸杂交技术得到分离的核酸。简短地说，可利用与SEQ IDNO1给出的序列具有一些同源性的任何核酸序列作为探针，在中度或高度严格的条件下杂交来鉴定相似的核酸。一旦得到鉴定，可将该核酸纯化、测序和分析以确定其是否属于本文所述的本发明范围。
杂交可以通过Southern或Northern分析来分别鉴定与探针杂交的DNA或RNA序列。探针可以用生物素、地高辛、酶或放射性同位素例如32P标记。
待分析的DNA或RNA可在琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，转移到硝酸纤维素膜、尼龙膜或其他合适的膜上，用该领域熟知的标准技术使其与探针杂交，标准技术见《分子克隆》7.39-7.52章节所述，Sambrook等，(1989)，《分子克隆》，第二版，冷泉港实验室，Plainview，纽约。
另外，可以利用任何方法指导编码多肽的某特定分离核酸的转录和翻译。这些方法包括但不限于，构建一个核酸以使调控元件促进编码多肽的核酸的表达。一般，调控元件是能在转录水平上调控其他DNA序列表达的DNA序列。所以，调控元件包括但不限于，启动子、增强子等。
宿主细胞本发明提供的宿主细胞至少包含本文所述的一种分离的核酸。这些细胞可以是原核或真核细胞。需要注意的是，含有本发明范围内的分离的核酸的细胞不一定必须表达多肽。另外，可将该分离的核酸整合入细胞的基因组或以游离状态存在。因此，宿主细胞可以用含有本发明分离核酸的构建物稳定或瞬时转染。
本文提供的宿主细胞可以包含编码多肽的外源核酸。例如，该细胞可以包含编码自身C5氨基酸区段和非自身氨基酸区段的核酸。另外，该宿主细胞可表达编码的多肽。
可以利用任何方法将分离的核酸导入体内或体外的细胞。例如，磷酸钙沉淀、电穿孔、热击、脂转染、显微注射和病毒介导的核酸转移都是可用来将分离的核酸导入细胞的常规方法。另外，可将裸露的DNA直接输送入体内的细胞，如其他文献所述(见，例如，美国专利Nos.5,580,859和5,589,466，以及其拓展)。此外，可通过产生转基因动物将分离的核酸引入细胞。
转基因动物可以是水生动物(例如鱼、鲨鱼、海豚等)，牲畜(例如猪、山羊、绵羊、牛、马、兔等)，非人灵长类(例如狒狒、猴子和黑猩猩)和家养动物(例如狗和猫)。可利用该领域已知的几种技术将分离的核酸导入动物产生转基因动物的创始系(founder lines)。这些技术包括但不限于，原核显微注射(美国专利No.4,873,191)；逆转录病毒介导的基因转移入生殖细胞系(Van derPutten等，Proc.Natl.Acad.Sci.，美国，826148(1985))；在胚胎干细胞中转入基因(Gossler等，Proc.Natl.Acad.Sci.，美国，839065-9069(1986))；基因靶向转染入胚胎干细胞(Thompson等，Cell，56313(1989))；体细胞核的核转移(Schnieke等，Science 2782130-2133(1997))；胚胎电穿孔(LoMol.Cell Biol.，31803-1814(1983))。一旦获得转基因动物可用传统的繁育方法或动物克隆方法复制。
可以利用任何方法鉴定含有本发明分离的核酸的细胞。这些方法包括但不限于，PCR和核酸杂交技术例如Northern和Southern分析。有些情况下，可以用免疫组织化学和生物化学技术通过检测特定核酸编码的多肽的表达来确定一个细胞是否含有该特定的分离的核酸。
治疗炎性疾病的方法本文提供的多肽可用于制造治疗炎性疾病的药物或组合物。因此，本发明提供了治疗炎性疾病的方法。这些方法包括但不限于给哺乳动物施用一种组合物。该组合物可以包含在所需的免疫应答反应中充当抗原的多肽。另外，该组合物可以包含多个多肽或不同多肽的任意组合。例如，该组合物可以包含病毒多肽和哺乳动物多肽。需注意的是组合物中的每种多肽可以有相同的氨基酸序列。此外，组合物中的多肽可以包含不同的氨基酸区段，每区段可作为所需免疫应答反应的特定抗原单位。因此，组合物中的多肽可以包含不同的氨基酸区段，这些区段对应于多肽的任何区域，包括但不限于，受体结合区、配体结合区、酶的活性位点、多肽底物的酶切割位点、抗体的抗原结合位点和抗体识别的表位。例如，组合物中的多肽可以包含三种不同的氨基酸区段，各对应于C5的C5转化酶识别序列。此外，不同的或相同的氨基酸区段在某同一多肽中可以是串联的也可以是纵列的。通常，施用该多肽会导致形成对于某表位或表位组合具有特异性的抗体，此组合物中的一个或多个多肽中的氨基酸区段形成了此种表位或表位组合。
该组合物可包含分离的核酸，当将其导入宿主细胞后可表达特定的多肽。例如，可以设计一种分离的核酸使其编码含有自身C5a氨基酸区段和一个或多个非自身T细胞表位的多肽。一旦构建成功，可将分离的核酸引入宿主细胞表达其编码的多肽。可以使用任何宿主细胞包括但不限于原核细胞(例如细菌)和真核细胞(如人的细胞)。一旦产生多肽可将其纯化和用于接种哺乳动物。或者，给哺乳动物施用含有能表达特定多肽的分离核酸的组合物以使该多肽能够在动物体内表达。
可以组合本文提供的任何多肽(例如免疫原性多肽)或分离的核酸(例如编码免疫原性多肽的核酸)与药学上可接受的运载体来制备该组合物。这些运载体包括但不限于，灭菌的水性或非水性溶液，悬液和乳液。非水性溶剂的例子包括矿物油、丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射的有机酯。水性运载体包括但不限于，水、醇、盐水和缓冲液。也可有防腐剂、调味剂和其他添加剂例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。显然本文所述的任何将施用于哺乳动物的材料可以包含一种或多种药学上可接受的运载体。
该组合物还可以包含佐剂。“佐剂”是能增强针对特定抗原例如多肽的免疫应答反应的免疫化合物。佐剂例如明矾或其他含铝的化合物(例如Al2O3)可以与含自身氨基酸区段(例如自身C5氨基酸区段)的多肽组合形成组合物，当将该组合物施用于哺乳动物时可诱导抗自身免疫反应。可以从很多商品供应商处获得含铝化合物。例如，REHYDRAGEL佐剂可从Reheis公司获得(BerkeleyHeights，NJ)。REHYDRAGEL佐剂以晶体氢氧化物铝为基础，是含有晶体颗粒的水合凝胶，表面积很大(约525m2/g)。它们的Al2O3含量一般约为2％到10％。例如Rehydragel LG，Al2O3含量为6％，轻微搅拌可流动。Rehydragel LG的蛋白质结合能力为1.58(即，每1mg Al2O3可结合1.58mg牛血清蛋白)；钠含量为0.02％，氯化物含量为0.28％，检测不到硫酸盐，砷酸水平小于3ppm，重金属含量低于15ppm，pH为6.5，粘度为1090cp。Rehydragel LG可与多肽溶液(例如PBS中的多肽)结合产生Al(OH)3。另外，可以用ALHYDROGELTM，一种羟基铝凝胶佐剂(Alhydroge11.3％，Alhydrogel2.0％，Alhydrogel“85”)，由BrenntagStinnes Logistics提供。
另外，可将MN51与本文提供的多肽组合形成组合物，当将此组合物施用于哺乳动物时可诱导抗自身免疫应答反应。MN51(MONTANIDE不完全SEPPIC佐剂(ISA)51)和MN720可购自Seppic(巴黎，法国)。MN51含有溶于矿物油溶液(Drakeol 6 VR)的油酸二缩甘露醇(MONTANIDE80，也称为无水硬脂酸甘露醇)。MONTANIDE80是一种澄清的液体，最大酸度为1，皂化价为164-172，羟值为89-100，碘值为67-75，最大过氧化价为2，重金属值低于20ppm，最大含水量为0.35％，最大色价为9，25℃时粘度约为300mPas。MONTANIDE与油类(例如，矿物油、植物油、低凝点高级润滑油、鲨烯)结合被称为MONTANIDEISA。Drakenol 6VR是一种药学级的矿物油。Drakenol 6VR不含有不饱和或芳香簇碳氢化物，A.P.I.重量度为36.2-36.8，25℃时比重为0.834-0.838，100°F时的粘度为59-61SSU或10.0-10.6厘斯托克(centistoke)，25℃时折射指数为1.458-1.463，好于最小酸度测试，360nm荧光检测为阴性，可见悬浮物质为阴性，ASTM倾倒测试值为0-15°F，最小ASTM闪蒸点为295°F，符合RN对轻质矿物油和紫外吸收的所有要求。MN51含有约8％至12％的无水硬脂酸甘露醇和约88-92％的矿物油。MN51是澄清的黄色液体，最大酸度值为0.5，皂化价为16-20，羟值为9-13，最大过氧化价为2，碘值为5-9，最大含水量为0.5％，25℃时折射指数为1.455-1.465，20℃时密度约为0.85，20℃时粘度约为50mPas。50∶50的MN51和盐水混合物的导电系数低于10μScm-1。
其他佐剂还包含免疫刺激复合体(ISCOMs)，它可以包含胆固醇和皂素等成分。可以用本文所述方法制备ISCOM基块并使其与Cu2+共轭。FCA，FIA，MN51，MN720和Al(OH)3等佐剂可从商业公司例如Seppic、DifcoLaboratories(Detroit，MI)和Superfos Biosecter A/S(Vedbeak，Demark)等获得。
在有些实施方式中，该组合物还可以包含一种或多种其他的免疫刺激成分。这些成分包括但不限于，胞壁酰二肽(例如N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷酰胺；MDP)，单磷酸脂A(MPL)，包含三肽的甲酰基甲硫氨酸例如N-甲酰基-甲硫氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸。这些化合物可通过商业途径例如从SigmaChemical公司(St.Louis，MO)和RIBI ImmunoChem Research公司(Hamilton，MT)获得。
本文提供的组合物可含有任何比例的佐剂和多肽。例如，佐剂抗原的比例可以是50∶50(体积/体积)。或者，佐剂抗原的比例可以是但不限于90∶10，80∶20，70∶30，64∶36，60∶40，55∶45，40∶60，30∶70，20∶80或90∶10。
可给予宿主任何有效剂量的本文提供的组合物。本文所用术语“有效的”指能在宿主中诱导所需的免疫应答反应但不诱导明显毒性的任何剂量。这种剂量可通过评估施用已知剂量特定组合物之后宿主的免疫应答反应来确定。另外，如果有任何毒性的话，可通过评估施用已知剂量特定组合物之前和之后宿主的临床症状来确定毒性水平。需要注意的是，可根据所需的结果和宿主的反应以及毒性水平，来调整施用于宿主的特定组合物的有效剂量。明显的毒性对于每个特定宿主是不同的，并且取决于多种因素，包括但不限于宿主的疾病状态，年龄和对疼痛的忍耐程度。
另外，可将本文所述的任何组合物施用于宿主身体的任何部位。可将组合物输送到但不限于，哺乳动物的关节、鼻粘膜、血、肺、小肠、肌肉组织、皮肤或腹膜腔。此外，该组合物可通过静脉、腹腔、肌肉内、皮下、鞘内或皮内注射，口服或鼻给药，吸入或长时间缓慢输液。在另一个实施例中，该组合物的气雾剂可通过吸入给予宿主。本文提供的任何组合物的治疗期可以是任何时间长度，短到一天，长至该宿主的整个生存期间(例如很多年)。例如，可以施用该多肽，三个月内每月一次，或十年内每年一次。需注意的是治疗的频率是可以不同的。例如，可以每日、每月或每年一次(或两次、三次等)施用该多肽。
可以用任何方法检测是否诱导了特定的免疫应答反应。例如，抗特定抗原的抗体应答反应可用免疫试验(例如，ELISA)测定。在这种试验中，可用C5包被微量滴定板孔，然后与用经该组合物治疗的哺乳动物的血清一起温育，而该组合物可在此哺乳动物中产生抗-C5抗体。抗-C5抗体存在与否可以用标记的抗大鼠IgG来检测。此外，可采用能评定特定疾病状态的临床方法来检测是否诱导了所需的免疫应答反应。例如，用可产生抗-C5抗体的组合物治疗的病人炎症减轻可以表明产生了所需的免疫应答反应。为了确证产生了所需的免疫应答反应，可用上述的ELISA技术来测量此病人血液样品中的抗-C5抗体水平。
制品本文所提供的多肽和组合物可用于生产药物(例如，治疗炎性疾病的药物)。此外，本发明提供的制品可包括本文提供的多肽和组合物。生产制品的组分和方法是众所周知的。一种制品可包括例如，一种或多种可诱导产生抗C5抗体的多肽(例如，一种或多种包含自身C5氨基酸区段和非自身氨基酸区段例如非自身C5氨基酸区段的多肽)。此外该制品可以包括例如，治疗或监测炎性疾病的缓冲液或其他控制试剂。在有些实施例中，这类制品可包括标签或说明书来表明其中所含的多肽对于治疗炎性疾病是有效的。
具体实施例方式
实施例实施例1小鼠C5a多肽的生产和纯化图1所示为小鼠的pro-C5DNA序列(SEQ ID NO1)，图2所示为小鼠pro-C5的氨基酸序列包含信号肽(SEQ ID NO2)。通过PCR扩增小鼠肝脏的总cDNA文库分离得到了小鼠C5a的编码区。将PCR片段与细菌表达载体pMAL-p2x(图3；New England Biolabs，Beverly，MA)相连接，毗邻于编码麦芽糖结合蛋白(MBP)一部分的序列。然后，用PCR从此载体中扩增MBP-C5a融合多肽的编码区。为有助于该融合蛋白最后的纯化，该5’PCR引物还编码六个组氨酸残基。此外，为了克隆，此5’引物包含一个EcoRI位点，3’引物包含一个SalI位点。将PCR产物(序列如图4所示)转入哺乳动物表达载体，保持游离的pCEP-Pu2含有免疫球蛋白可变区的信号肽。将PCR产物的SalI位点连接入pCEP-Pu2载体的XhoI位点，从而破坏了两个位点。编码该融合多肽的PCR产物的核酸序列如SEQ ID NO3所示，该融合多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO4所示。
实施例2哺乳动物细胞MBP-C5a的表达和纯化将含有6His-MBP-C5a融合多肽的pCEP-Pu2载体转染入293-EBNA细胞以进行该分泌性融合多肽的过表达和纯化。哺乳动物EBNA-293细胞用脂转染法转染，在Dublecco改进的Eagle培养基(DMEM)上培养，，此培养基添加了5％的胎牛血清，0.5μg/ml嘌呤霉素，50μg/ml庆大霉素，100μg/ml硫酸庆大霉素。扩增生长中的细胞，每隔4-5天收集条件培养基。离心除去细胞和碎片。
该融合多肽含有六个组氨酸残基使其可用Ni-NTA琼脂糖纯化。Ni-NTA琼脂糖浆液(QIAGEN GmbH，德国)在20％乙醇中含有约0.35ml小珠，每500ml条件培养基添加0.75ml等分的这种浆液。在摇床上4℃温育过夜后，2000g离心10分钟将Ni-NTA琼脂糖制成丸状，然后入柱。按照厂家说明，用含1M NaCl和0.1％Tween-20的PBS，pH7.4，洗涤小珠，然后用含100mM咪唑(Merck，德国)0.1M NaCl的20mM Tris，pH8.0，洗脱。将含多肽的组分合并，用截留分子量为12,000-14,000Da的膜(Spectra/Por膜，Spectrum Laboratories公司，Rancho Dominguez，CA)，以PBS，pH7.4透析。如果需要，可用Mactosep10K离心装置(PALL Gelman Laboratory)浓缩样品。多肽的最终浓度用Bradford试验(BIO-RAD Protein Assay，BIO-RAD laboratories，Hercules，CA)检测。细胞产生的6His-MBP-C5a融合多肽的水平约为2mg/L。用Rainbow蛋白质分子量标记(Amersham International，Buckinghamshire，英格兰)测定多肽大小。该多肽的大小为预期的53kD，该融合多肽的氨基酸序列见图5。
实施例3MBP-C5a对鼠胶原诱导的关节炎的作用在临用前，将溶于PBS的纯化6His-MBP-C5a多肽与弗氏完全佐剂(CFA)或弗氏不完全佐剂(IFA)以1∶1的比例混合。在配有18号针头的Hamilton针筒(Hamilton公司，Reno，NE)中反复上下抽动混合此溶液，直到形成流变特征类似于软膏的白色乳液。为施用此混合物在该针筒上安装23号针头。还制备了含有相同体积的PBS和CFA或IFA的对照混合物。
将12周龄的雄性QB(Balb/c X B10.Q)F1小鼠分为两组，每组各有14或16个动物，然后在第-21天，在肩胛骨间皮下注射100μg用CFA乳化的MBP-C5a或对照混合物。-21天时取血样，血清保存于-20℃。在第-3天和第28天分别给动物进行加强注射50μg用IFA乳化的MBP-C5a或对照混合物。通常注射量为100-200μL。
为了诱生关节炎，第0天在小鼠尾根部皮内注射100μg胃蛋白酶消化的1∶1比例用CFA乳化的CII。预期在第28天和56天之间发生关节炎。第35天给动物加强注射IFA乳化的CII，并采血样。第14天直到第90天，即此实验结束时，一周至少检查动物三次。用一种评分系统对这些动物进行盲法评分，根据每只爪子上发炎的关节数评分。发炎定义为肿胀和发红。在此评分系统中，每个发炎的脚趾或钩爪记为一分，而发炎的肘或踝记为五分。这样，每只爪得分为0-15(5个脚趾+5个钩爪+1个肘/踝)，每只小鼠得分为0-60分。此实验在第90天时结束，或根据关节炎的发展确定适宜的结束日期。除了通常与预期关节炎疾病有关的症状之外，没有小鼠出现异常的毛发状态、刻板的或行为改变、感染或其他严重的或未预料到的副作用。用恩氟烷(Forene)/氧气麻醉动物，通过眼窝(reorbital puncture)穿刺采血。收集血清并保存于-20℃。用ELISA方法评价第-21天、第35天和该实验结束时收集的血清的抗CII和抗C5a抗体的水平。
用Mann-Whitney测验分析评分数据，用曲线下的区域和卡方值分析关节炎发病率的显著性。在第一次胶原处理后的第28天，对照组14只小鼠中有七只(50％)出现炎症，而用MBP-C5a预治疗的16只小鼠只有2只(12.5％)出现了关节炎(图6)。此数据的卡方值P为0.025。在第67天时累计炎症发病率，对照组14只小鼠中有14只，而用MBP-C5a预治疗的16只小鼠中有11只(P＝0.022)。因此，两组之间胶原诱导的关节炎的发病率有显著差异。
绘制第1天和第90天之间各组基于炎症数目的平均关节炎评分图(图7)。各组最高的单只小鼠评分是60。该实验结束时，对照组的最大严重性平均值为38.6，而用MBP-C5a预治疗的组中此平均值为19.0(P＝0.0085；图8)。对照组曲线下的区域平均值为485.9，用MBP-C5a预治疗的组为168.9(P＝0.0012；图9)。这些结果表明，用MBP-C5a融合多肽进行治疗降低了这些动物中胶原诱导的关节炎的发病率和严重性。
实施例4MBP-C5a对QB-BC小鼠胶原诱导的慢性关节炎的作用将溶于PBS的纯化MBP-C5a多肽如上述与CFA或IFA混合。同时制备含有相同体积PBS和CFA或IFA的对照混合物。
将8-10周龄的雄性QB-BC(B10.Q(Balb/c X B10.Q))小鼠尾根部皮内注射100μg胃蛋白酶消化的1∶1比例用IFA乳化的CII。35天后，小鼠接受第二次注射50μg胃蛋白酶消化的用IFA乳化的CII。然后，至少一周三次对小鼠慢性关节炎的发生情况进行评分。很多但并非所有的小鼠都发生了慢性复发性疾病，特征是活动性关节炎的复发。这种复发的出现不能预测，每次持续几个星期，似乎是终生都可能发生。对鼠群中关节炎作用的不同主要是因为遗传的异质性(由于该实验旨在模拟人的遗传状况，所用小鼠是N2动物)。
为了使复发性疾病的复发相协调，在慢性复发阶段，用CII再次免疫小鼠。当小鼠12-14月龄时，将患有慢性复发性疾病但当时并没有活动性疾病复发的动物随机混和分为四个同样大小的组。为了诱导可控制的关节炎复发，第-21天(第一次CII免疫后的第259天)，在小鼠的肩胛骨之间皮下注射100μg溶于PBS的MBP-C5a(n＝24)或只注射PBS，MBP-C5a或PBS都以1∶1的比例用CFA乳化。第-3天时，以50μg溶于PBS中的MBP-C5a或PBS(各用CFA乳化)加强注射动物。第0天(第一次CII免疫后的第280天)，两组动物均在尾根部皮内注射50μg胃蛋白酶消化的1∶1比例用IFA乳化入的CII。第21天(第一次CII免疫后的第301天)，以50μg溶于PBS中的MBP-C5a或PBS对动物进行第二次加强注射。此外，在第-21天和第0天时，眼窝穿刺(reorbital puncture)采血样。
用上述的评分系统对动物进行盲法评分，每只小鼠的关节炎评分在0-60之间。该实验在第一次CII免疫后的第358天结束。这些研究显示，虽然所有的对照小鼠都出现了关节炎症状，尤其是在40天左右时，然而用MBP-C5a免疫的小鼠只有50％出现了慢性关节炎(P＜0.05；图10)。此外，测定了两组动物在研究开始(即从第一次注射CII)至研究结束即超过358天和关节炎重新诱导或复发之后78天(图11)的过程中平均关节炎评分。用MBP-C5a免疫之前两组的平均关节炎评分没有显著差别，而用MBP-C5a免疫之后治疗组的平均关节炎评分显著低于对照组(P＜0.05；图11)。这些结果表明，在被治疗的动物中，MBP-C5a融合多肽能降低慢性复发性关节炎的发病率。
其他实施方式应理解，虽然对本发明作了详细的描述，但上面的描述只用于说明而非限制本发明的范围，本发明的范围是由附加的权利要求来确定的。本发明的其他方面、优点和改动都在下面权利要求的范围中。
权利要求
1.一种治疗患有炎性疾病动物的方法，其特征是，此方法包括给所述哺乳动物施用一种多肽，该多肽能在所述哺乳动物中诱导抗C5应答反应，所述多肽包含自身C5氨基酸区段和非自身氨基酸区段，所述哺乳动物的基因组含有编码此自身C5氨基酸区段的核酸。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述的哺乳动物是人。
3.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述的炎性疾病选自败血症、心肌缺血/重灌注性损伤、成人呼吸窘迫综合征、肾炎、移植排异反应、类风湿性关节炎、哮喘、炎性大肠疾病、多发性硬化、动脉硬化和脉管炎。
4.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述的多肽是MBP-C5a。
5.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述的自身C5氨基酸区段包含C5a序列的一部分。
6.权利要求1的方法，其特征是，所述的非自身氨基酸区段包含C5序列的一部分。
7.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述的非自身氨基酸区段是病毒的。
8.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述的非自身氨基酸区段是细菌的。
9.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述的非自身氨基酸区段是真菌的。
10.权利要求1的方法，其特征是，所述的非自身氨基酸区段是哺乳动物的。
11.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述的非自身氨基酸区段是非自然产生的氨基酸区段。
12.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述的非自身氨基酸区段包含至少两个T细胞表位。
13.一种包含多肽的组合物，其特征是，所述的多肽包含自身C5氨基酸区段和非自身C5氨基酸区段。
14.如权利要求13所述的组合物，其特征是，所述多肽施用于哺乳动物时，可诱导哺乳动物产生抗C5的应答反应，所述哺乳动物的基因组中包含编码自身C5氨基酸区段的核酸。
15.如权利要求13所述的组合物，其特征是，所述的非自身C5氨基酸区段是非自然产生的。
16.如权利要求13所述的组合物，其特征是，所述的非自身C5氨基酸区段包含至少两个T细胞表位。
17.一种包含多肽的组合物，其特征是，所述多肽包含自身C5氨基酸区段和非自身脊椎动物氨基酸区段。
18.如权利要求17所述的组合物，其特征是，所述多肽施用于哺乳动物时，可诱导哺乳动物产生抗C5的应答反应，所述哺乳动物的基因组中包含编码此自身C5氨基酸区段的核酸。
19.如权利要求17所述的组合物，其特征是，所述非自身脊椎动物的氨基酸区段是哺乳动物氨基酸区段。
20.如权利要求17所述的组合物，其特征是，所述非自身脊椎动物的氨基酸区段包含至少两个T细胞表位。
21.一种包含多肽的组合物，其特征是，所述多肽包含自身C5氨基酸区段和非自身氨基酸区段，所述非自身氨基酸区段的长度小于350个氨基酸残基。
22.如权利要求21所述的组合物，其特征是，所述的多肽适用于哺乳动物时，可诱导此哺乳动物产生抗C5应答反应，所述哺乳动物的基因组中包含编码此自身C5氨基酸区段的核酸。
23.如权利要求21所述的组合物，其特征是，所述非自身氨基酸区段是病毒的。
24.如权利要求21所述的组合物，其特征是，所述非自身氨基酸区段是细菌的。
25.如权利要求21所述的组合物，其特征是，所述非自身氨基酸区段是真菌的。
26.如权利要求21所述的组合物，其特征是，所述非自身氨基酸区段是哺乳动物的。
27.如权利要求21所述的组合物，其特征是，所述非自身氨基酸区段是非自然产生的。
28.如权利要求21所述的组合物，其特征是，所述非自身哺乳动物氨基酸区段包含至少两个T细胞表位所述。
29.如权利要求21所述的组合物，其特征是，所述非自身哺乳动物氨基酸区段的长度小于300个氨基酸残基。
30.如权利要求21所述的组合物，其特征是，所述非自身哺乳动物氨基酸区段的长度小于250个氨基酸残基。
31.如权利要求21所述的组合物，其特征是，所述非自身哺乳动物氨基酸区段的长度小于200个氨基酸残基。
32.一种包含多肽和佐剂的组合物，其特征是，所述多肽包含自身C5氨基酸区段和细菌氨基酸区段。
33.如权利要求32所述的组合物，其特征是，所述细菌氨基酸区段是MBP。
34.一种包含多肽的组合物，其特征是，所述多肽包含自身C5氨基酸区段和真菌氨基酸区段。
35.一种包含多肽的组合物，其特征是，所述多肽包含自身C5氨基酸区段和病毒氨基酸区段。
36.一种分离的核酸，其特征是，它编码包含自身C5氨基酸区段和非自身C5氨基酸区段的多肽。
37.一种分离的核酸，其特征是，它编码包含自身C5氨基酸区段和非自身脊椎动物氨基酸区段的多肽。
38.一种分离的核酸，其特征是，它编码包含自身C5氨基酸区段和非自身氨基酸区段的多肽，所述非自身氨基酸区段的长度小于350个氨基酸残基。
39.如权利要求38所述的分离的核酸，其特征是，所述非自身氨基酸区段的长度小于300个氨基酸残基。
40.如权利要求38所述的分离的核酸，其特征是，所述非自身氨基酸区段的长度小于250个氨基酸残基。
41.如权利要求38所述的分离的核酸，其特征是，所述非自身氨基酸区段的长度小于200个氨基酸残基。
42.一种分离的核酸，其特征是，它编码包含自身C5氨基酸区段和细菌氨基酸区段的多肽，所述多肽缺少位于C5氨基酸区段和细菌氨基酸区段之间的Xa因子切割位点。
43.如权利要求42所述的分离的核酸，其特征是，所述非自身的细菌氨基酸区段是MBP。
44.一种分离的核酸，其特征是，它编码包含自身C5氨基酸区段和真菌氨基酸区段的多肽。
45.一种分离的核酸，其特征是，它编码包含自身C5氨基酸区段和病毒氨基酸区段的多肽。
46.一种包含权利要求36、37、38、42、44或45所述核酸的宿主细胞。
47.如权利要求46所述的宿主细胞，其特征是，该宿主细胞能表达所述多肽。
48.一种可施用于哺乳动物的包含多肽的组合物，其特征是，对于所述哺乳动物而言，此多肽包含自身C5氨基酸区段和非自身C5氨基酸区段。
49.如权利要求48所述的组合物，其特征是，所述多肽施用于哺乳动物时，可诱导哺乳动物产生抗C5的应答反应，所述哺乳动物的基因组中包含编码此自身C5氨基酸区段的核酸。
50.如权利要求48所述的组合物，其特征是，所述非自身氨基酸区段是非自然产生的。
51.如权利要求48所述的组合物，其特征是，所述非自身氨基酸区段包含至少两个T细胞表位。
52.一种可施用于哺乳动物的包含多肽的组合物，其特征是，对于所述哺乳动物而言，此多肽包含自身C5氨基酸区段和非自身脊椎动物氨基酸区段。
53.如权利要求52所述的组合物，其特征是，所述多肽施用于哺乳动物时，可诱导哺乳动物产生抗C5的应答反应，所述哺乳动物的基因组中包含编码此自身C5氨基酸区段的核酸。
54.如权利要求52所述的组合物，其特征是，所述非自身脊椎动物氨基酸区段是哺乳动物氨基酸区段。
55.如权利要求52所述的组合物，其特征是，所述非自身脊椎动物氨基酸区段包含至少两个T细胞表位。
56.一种可施用于哺乳动物的包含多肽的组合物，其特征是，对于所述哺乳动物而言，此多肽包含自身C5氨基酸区段和非自身氨基酸区段，所述非自身氨基酸区段的长度小于350个氨基酸残基。
57.如权利要求56所述的组合物，其特征是，所述多肽施用于哺乳动物时，可诱导哺乳动物产生抗C5的应答反应，所述哺乳动物的基因组中包含编码此自身C5氨基酸区段的核酸。
58.如权利要求56所述的组合物，其特征是，所述非自身氨基酸区段是病毒的。
59.如权利要求56所述的组合物，其特征是，所述非自身氨基酸区段是细菌的。
60.如权利要求56所述的组合物，其特征是，所述非自身氨基酸区段是真菌的。
61.如权利要求56所述的组合物，其特征是，所述非自身氨基酸区段是哺乳动物的。
62.如权利要求56所述的组合物，其特征是，所述非自身氨基酸区段是非自然产生的。
63.如权利要求56所述的组合物，其特征是，所述非自身氨基酸区段包含至少两个T细胞表位。
64.如权利要求56所述的组合物，其特征是，所述非自身氨基酸区段的长度小于300个氨基酸区段。
65.如权利要求56所述的组合物，其特征是，所述非自身氨基酸区段的长度小于250个氨基酸区段。
66.如权利要求56所述的组合物，其特征是，所述非自身氨基酸区段的长度小于200个氨基酸区段。
67.一种可施用于哺乳动物的包含多肽和佐剂的组合物，其特征是，对于所述哺乳动物而言，此多肽包含自身C5氨基酸区段和细菌氨基酸区段。
68.如权利要求67所述的组合物，其特征是，所述细菌氨基酸区段是MBP。
69.一种可施用于哺乳动物的组合物，其特征是，对于所述哺乳动物而言，此多肽包含自身C5氨基酸区段和真菌氨基酸区段。
70.一种可施用于哺乳动物的包含多肽的组合物，其特征是，对于所述哺乳动物而言，此多肽包含自身C5氨基酸区段和病毒氨基酸区段。
71.一种分离的核酸，其特征是，它编码可施用于哺乳动物的多肽，对于所述哺乳动物而言，此多肽包含自身C5氨基酸区段和非自身C5氨基酸区段。
72.一种分离的核酸，其特征是，它编码可施用于哺乳动物的多肽，对于所述哺乳动物而言，此多肽包含自身C5氨基酸区段和非自身脊椎动物氨基酸区段。
73.一种分离的核酸，其特征是，它编码可施用于哺乳动物的多肽，对于所述哺乳动物而言，此多肽包含自身C5氨基酸区段和非自身氨基酸区段，所述非自身氨基酸区段的长度小于350个氨基酸残基。
74.如权利要求73所述的分离的核酸，其特征是，非自身氨基酸区段的长度小于300个氨基酸残基。
75.如权利要求73所述的分离的核酸，其特征是，所述非自身氨基酸区段的长度小于250个氨基酸残基。
76.如权利要求73所述的分离的核酸，其特征是，所述非自身氨基酸区段的长度小于200个氨基酸残基。
77.一种分离的核酸，其特征是，它编码可施用于哺乳动物的多肽，对于所述哺乳动物而言，此多肽包含自身C5氨基酸区段和细菌氨基酸区段，所述多肽缺少位于C5氨基酸区段和细菌氨基酸区段之间的Xa因子切割位点。
78.如权利要求77所述的分离的核酸，其特征是，所述非自身细菌氨基酸区段是MBP。
79.一种分离的核酸，其特征是，它编码可施用于哺乳动物的多肽，对于所述哺乳动物而言，此多肽包含自身C5氨基酸区段和真菌氨基酸区段。
80.一种分离的核酸，其特征是，它编码可施用于哺乳动物的多肽，对于所述哺乳动物而言，此多肽包含自身C5氨基酸区段和病毒氨基酸区段。
81.一种包含权利要求71、72、73、77、79或80所述核酸的宿主细胞。
82.如权利要求81所述的宿主细胞，其特征是，该宿主细胞能表达所述的多肽。
83.一种可施用于哺乳动物的包含多肽的组合物，其特征是，对于所述哺乳动物而言，此多肽包含自身C5氨基酸区段和非自身氨基酸区段，所述自身C5氨基酸区段至少有90％与此哺乳动物的C5序列相同。
全文摘要
本发明提供治疗炎性疾病的方法和材料。具体说，本发明提供用于在哺乳动物中诱导针对抗原例如C5或C5a的抗体应答反应的多肽、分离的核酸、宿主细胞和方法。例如，可用本文描述的方法和材料通过减少哺乳动物中C5a的总量以及与受体结合的C5a的量来降低哺乳动物中C5a的作用。
文档编号A61P29/00GK1745098SQ200380109403
公开日2006年3月8日 申请日期2003年12月1日 优先权日2002年12月2日
发明者L·T·赫尔曼, R·霍姆达尔 申请人:瑞希斯顿蒂亚药品股份公司