专利名称：一种复方杀病毒制品的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种复方杀病毒制品的制备方法，属于天然产物药理活性和分离与提纯天然产物方法。其商品名为“芩翘”。
背景技术：
自古以来，植物被认为有减轻疼痛和治愈疾病的功能。今天在75％以上药品中，我们仍然依靠植物的治病功能。几个世纪以来，世界各地的科学家已经建立自己的体系去研究开发药用植物以及他们的使用方法。一些方法看起来比较合理和实用。但是，所有的使用方法都是试图战胜疾病和痛苦，提高生活质量。
在诸多疾病中，病毒疾病是引人惊恐的疾病之一。流感病毒十年一次大的变异流行，五年一次小的变异流行，人们无法事先知道未来的流感病毒的变异趋势和具体变异结果，又不得不面对突发而来的流感大流行。病毒侵害人体组织，破坏机体免疫防御系统，造成广泛的疾病伤害，杀灭病毒是医学界渴望解决、又没能彻底解决的难题。
发明内容技术方案包括处方新工艺、工艺流程图及各种毒理、药理综述。
技术解决方案是本发明的目的公开一种复方杀病毒制品的制备方法及提供一种高纯度的原料药，是一种绿色药物属于天然产物药理活性和分离。
黄芩12％、连翘20％、荆芥15％、野菊花15％、玄参15％、水牛角10％、大黄(酒炙)4.5％、皂角刺4.5％、蜂房4％复方杀病毒制品的增效药理活性和制造方法，将水牛角、皂角刺原料和其它原料，分别用蒸汽蒸馏和水煎煮的提取方法，使用大孔树脂吸附技术，将复方杀病毒制品组方中植物原料的有效成分吸附在大孔树脂中，再用65％乙醇，在常温下，将吸附在大孔树脂上的有效成分洗脱至乙醇中，与其它的滤液，油水混合溶液合并后，在85℃条件下，喷雾干燥，用气相层析测定仪进行指痕图谱定量测试后，制成合格原料药。
复方杀病毒制品的制备方法采用先进的大孔树脂吸附有效成份并使用气相指痕光谱定量，保证药品的稳定性和高质量。
本发明的创造性通过临床毒理、药理来体现。
图1本发明的工艺流程图。
图2病毒对照组。
图3复方杀病毒制品组。
图4病毒对照组。
图5复方杀病毒制品组。
其工艺流程描述如下(1)本发明处方黄芩240g、连翘400g、荆芥300g、野菊花300g、玄参300g、水牛角200g、大黄(酒炙)90g、皂角刺90g、蜂房80g。
(2)溶剂水。
(3)提取液棕红色水溶液。
(4)物理参数水蒸汽蒸馏、水提取、树脂吸附、喷雾干燥均为常压；水蒸汽蒸馏、水提取的温度是100℃，树脂吸附的温度是常温，喷雾干燥的温度是80-85℃。
(5)操作过程①水牛角、蜂房加10倍量水煎煮4小时，滤过，得滤液(1)；药渣再加10倍量水煎煮4小时，滤过，得滤液(2)。
②其它药材用水蒸汽蒸馏4小时，得挥发油及油水混合溶液(3)；药渣加8倍量水煎煮3小时，滤过，得滤液(4)；药渣再加8倍量水煎煮2小时，滤过，得滤液(5)。
③合并滤液(4)、(5)静置，取上清液，得提取液(6)。
④将提取液(6)用大孔树脂进行吸附。
⑤用65％乙醇将吸附在树脂上的化学成分洗脱至乙醇中，得洗脱液(7)。
⑥减压回收洗脱液(7)，得浓缩液(8)。
⑦液滤(1)、(2)及(3)与浓缩液(8)进行喷雾干燥，得药粉。
具体实施方式
黄芩12％、连翘20％、荆芥15％、野菊花15％、玄参15％、水牛角10％、大黄(酒炙)4.5％、皂角刺4.5％、蜂房4％复方杀病毒制品的增效药理活性和制造方法，将水牛角、皂角刺原料和其它原料，分别用蒸汽蒸馏和水煎煮的提取方法，使用大孔树脂吸附技术，将复方杀病毒制品组方中植物原料的有效成分吸附在大孔树脂中，再用65％乙醇，在常温下，将吸附在大孔树脂上的有效成分洗脱至乙醇中，与其它的滤液，油水混合溶液合并后，在85℃条件下，喷雾干燥，用气相层析测定仪进行指痕图谱定量测试后，制成合格原料药。
本发明的创造性通过毒理、药理临床来体现，实审时补充提供现简介如下一种复方杀病毒制品的制备方法的药理作用1.受检药物(批号20302)2.病毒流感病毒A1型、A3型、呼吸道合胞病毒(RSV)和腺病毒3型3.细胞Hela细胞、Vero细胞4.鸡胚5.实验动物纯系小鼠，体重14-16g实验方法一、体外实验1.对病毒致细胞病变作用的影响药物对细胞毒性的测定(即无毒限量的的选择)采用微量培养法。用不同浓度药液(受检药或阳性对照药)加等量维持液接种于Hela(或Vero)细胞孔内，每孔0.2ml，每浓度4个孔，同时设细胞对照孔，置37℃5％CO2孵箱培养，72h判定结果，以不出细胞病变的药物最小稀释倍数为无毒限量。
药物对病毒致细胞病变作用的影响(1)取100TCID50病毒液(RSV或腺病毒3型)按每孔0.1ml接种于Hela细胞培养孔中，吸附1h后洗去病毒液，加入不同浓度(维持液稀释)药液复方杀病毒制品0.2ml，每个浓度4孔，同时设病毒对照、细胞对照，置37℃5％CO2孵箱培养，倒置显微镜下观察病变，待病毒对照出现明显细胞病变(CPE)时，判定不出现CPE的药物最高稀释倍数，计算出药物的抑制指数(用抑制病毒最高稀释倍数除以无毒限量)。
(2)流感病毒A1感染用Vero细胞，其他步骤同上。由于细胞病变不明显，故用红细胞吸附试验药抗流感病毒A1的作用。即加药液培养72h后，各孔内加0.08％豚鼠红细胞0.1ml，30分钟后，显微镜下观察各孔细胞吸附红细胞情况，判定不出现红细胞吸附的药物最高稀释倍数并计算出抑制指数。
2.药物在鸡胚内对流感病毒(A1及A3)增殖的影响药物对鸡胚毒性测定取不同稀释药物，复方杀病毒制品为0.2ml分别接种于10日鸡胚尿囊腔，每个浓度4只，设生理盐水对照，35℃孵育72h，记录鸡胚存活数，以不引起鸡胚死亡的药物最小稀释倍数为无毒限量。
药物在鸡胚内的抗流感病毒作用以15LD50的流感病毒液与等量不同浓度药液，与复方杀病毒制品混合后，分别接种于鸡胚尿囊腔中，总量为0.2ml，不同浓度药液各用4只鸡胚，并设病毒对照，35℃孵育72h，4℃过夜，收集尿囊液做血凝试验，判定不发生血凝的药物最高稀释倍数，求出抑制指数。
二、体内实验1.药物对小鼠流感病毒性肺感染的影响随机将小鼠分为杀病毒制品实验组、病毒对照组及正常对照组，每组10只，雌雄各半。给药组于感染前一天开始灌胃给药不同稀释浓度的复方杀病毒制品0.4ml，连续5天，病毒对照组以等量蒸馏水代替。给药后24h，滴鼻感染流感病毒A1肺适应株15LD50。感染96h后进行解剖，取肺称量，以肺重除以体重逐个算出肺指数值。与对照组比较，进行组间t检验。
2.对体内病毒颗粒增殖的影响用肺内含病毒颗粒特异荧光百分率表示。实验鼠肺冰冻切片后，与鼠抗流感病毒抗体反应40分钟，再与抗鼠IgG荧光抗体反应40分钟，洗净晾干后，荧光显微镜下观察并计数各组细支气管内含病毒颗粒特异荧光百分率。
3.观察各组肺腑之言组织切片病理变化，按常规H.E.染色进行组织切片检查。
实验结果1.药物在细胞内抗RSV、腺病毒3型及流感病毒A1的实验结果表明在感染100TCID50病毒情况下，杀病毒制品抑制RSV的最高稀释倍数为1∶256(含生药7.81mg/ml)，抑制指数为4；抑制腺病毒3型的最高稀释倍数1∶512(含生药量3.90mg/ml)。抑制指数为8。抑制流感病毒A1的最高稀释倍数1∶16(含生药量125mg/ml)，抑制指数为8。
复方杀病毒制品对流感病毒A1的最高稀释倍数为1∶16，抑制指数均为8(详见表1)表1 药物抗RSV、腺病毒3型及流感病毒A1作用结果
2.药物在鸡胚内抗流感病毒(A1及A3)的作用结果实验表明，杀病毒制品在鸡胚内抑制流感病毒A1的最高稀释倍数为1∶2；抑制流感病毒A3的最高稀释倍数是1∶4(详见表2)表2 药物在鸡胚内抗流感病毒(A1及A3)作用结果
3.药物在小鼠体内抗流感病毒作用的实验结果(1)小鼠感染病毒96h后解剖称肺重，求肺指数，结果详见表3表3 杀病毒制品在小鼠体内抑流感病毒A1作用结果
结果表明，杀病毒制品按12.5g/kg/d给药时，肺指数8.09±0.17，抑制率22.87％；按25.0g/kg/d给药时，肺指数为7.98±0.23，抑制率为23.92％，其抑制病毒作用与浓度成正比。与病毒对照组比较，均差异显著，P＜0.001，说明药物在体内有明显抑制流感病毒A1的增殖作用。
(2)肺细支气管内含病毒颗粒特异荧光百分率，结果表明，正常对照组未见特异荧光颗粒；病毒对照组出现特异荧光颗粒；荧光百分率为64.35％；杀病毒制品组为20.12％与病毒对照组比较，均有显著差异(P＜0.01)。
(3)鼠肺切片镜下观察病理所见病毒对照组病理变化严重，较多细支气管腔内有中性粒细胞及退变坏死细胞，部分肺泡腔内含有粉染蛋白性液体。复方杀病毒制品组肺内病变程度减轻，只有少数肺泡或细支气管内有少量液体或少量细胞。说明杀病毒制品在小鼠体内对流感病毒A1增殖均有抑制作用。
结论一、通过体外细胞培养法证明复方杀病毒制品对呼吸道细胞病毒(RSV)、腺病毒3型及流感病毒A1增殖均有抑制作用，对RSV及腺病毒3型的抑制指数分别为4和8，对流感病毒A1均有较强的抑制作用，抑制指数均为8，抑制作用相同。
二、通过鸡胚实验证明，复方杀病毒制品对流感病毒A1和A3的增殖有抑制作用，其抑制指数分别为2和4。
三、通过小鼠体内试验看出，肺指数、病毒抑制率、特异荧光百分率及病理变化。复方杀病毒制品组与对照组比较均有显著差异，说明复方杀病毒制品对小鼠感染流感病毒A1有明显的抑制作用。
一种复方杀病毒制品的制备方法治疗急性咽炎、急性扁桃体炎的临床观察效果表表4 综合疗效比较
秩和检验U＝3.24 P＜0.01治疗组总显效率为78.0％，总有效率为92.3％。
表5 综合疗效比较
秩和检验U＝3.65 P＜0.001治疗组总显效率为74.2％，总有效率为87.5％表6 主要症状和体征治疗前后比较
治疗组对主要症状及体征均有明显改善作用，且消退率明显。
表7 主要症状与体征治疗前后比较
治疗组对主要症状及体征均有明显改善作用，其消退率明显。
表8 急性咽炎病情与疗效的关系
表9 急性扁桃体炎病情与疗效的关系
表10 起效时间比较(天)
表11 起效时间比较
表12 治疗急性咽炎病程与疗效的关系
治疗组组内病程为1天与2天疗效比较，经秩和检验，P＜0.01，有非常显著性差异，说明治疗组对不同病程疗效不同，病程为1天者疗效明显优于病程为2天者。
表13 治疗急性扁桃体炎病程与疗效的关系
治疗组组内病程为1天、2天、3天疗效比较，经秩和检验，P＞0.05，无显著性差异，说明治疗组对不同病程疗效相近。
结 论临床观察结果表明，复方杀病毒制品对急性咽炎、急性扁桃体炎，疗效确切。对急性咽炎的总有效率为92.3％，显效以上率为78.0％；对急性扁桃体炎的总有效率为87.5％，显效以上率为74.2％。
鼠肺切片镜下观察病毒对照组病理变化严重，复方杀病毒制品组肺内病变程度减轻。某大学医院做药理实验表明如下复方杀病毒制品(简称杀病毒制品)，抑制RSV的最高稀释倍数为1∶256，抑制指数为4；抑制腺病毒3型最高稀释倍数为1∶512，抑制指数为8；抑制流感病毒A1的最高稀释倍数为1∶16抑制指数为8。实验表明，复方杀疾病制品在鸡胚内抑制流感病毒A1的最高稀释倍数为1∶2；抑制指数为2；抑制流感病毒A3的最高稀释倍数1∶4，抑制指数为4。药理活性实验结果表明，杀病毒制品按12.5g/kg/d给药时，肺指数8.09±0.17，抑制率22.87％；按25.0g/kg/d给药时，肺指数为7.98±0.23，抑制率为23.92％。其抑制病毒作用作用与浓度成正比。说明杀病毒制品在体内有明显抑制流感病毒A1的增殖作用。肺细支气管内含病毒颗粒特异荧光百分率。结果表明，正常对照组未见特异荧光颗粒；病毒对照组出现特异荧光颗粒。荧光百分率为64.35％；复方杀疾毒制品组为20.12％，与病毒对照组比较，均有显著差异。鼠肺切片，镜下观察病理所见，病毒对照组病理变化严重，较多细支气管腔内有中性粒细胞及退变坏死细胞，部分肺泡腔内含有粉染蛋白性液体。复方杀病毒制品组肺内病变程度减轻，只有少数肺泡或细支气管内有少量液体或少量细胞。说明杀病毒制品在小鼠体内对流感病毒A1增殖有抑制作用。
为了证实复方杀病毒制品的药理活性，进行了复方杀病毒制品在治疗人的急性咽炎、急性扁桃体炎的临床观察。治疗急性咽炎总显效率78.0％、总有效率92.3％。治疗急性扁桃体炎总显效率74.2％，总有效率87.5％。临床证实，复方杀病毒制品的药理活性是真实、可靠的。
一种复方杀病毒制品的制备方法的研究综述急性咽炎、急性扁桃体炎属中医“风热喉痹”、“风热乳蛾”范畴。主要是由细菌和病毒引起的感染性炎症。中医临床以清热药物治疗这类常见病，疗效显著。近年来大量研究资料表明，清热药不仅有抗菌、抗病毒作用，而且还具有抗炎、解毒、解热、提高机体免疫功能等广泛的药理作用。以清热药为主的这类中成药与西药抗菌素、抗病毒药相比，不仅疗效较好，而且不良反应较少，无毒副作用。
本复方制品与治疗作用有关的主要药效学试验，是依据本品具有疏风清热，解毒利咽，消肿止痛之功能，研究了该药呼吸道感染的病毒和细菌体外、体内抗病毒、抗菌作用。并以银黄口服液作为阳性对照药。
抗病毒实验结果体外抗病毒实验，通过细胞培养法证明，本品对呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒3型及流感病毒A1的增殖均有抑制作用；体内试验，本品对小鼠感染流感病毒A1有明显抑制作用。本品抗病毒效果强于银黄口服液。
体外抗菌试验结果表明，本品对金黄色葡萄球菌、β-溶血性链球菌和肺炎双球菌呈轻度或中度敏感；银黄口服液对三种细菌均呈抗药性，体内抗菌试验表明，给小鼠灌胃给予本品33g(生药)/kg，可显著延长β-溶血性链球菌和金黄色葡萄球菌感染小鼠和生存时间，且能提高两者的存活率。等效量的银黄口服液能延长两者细菌感染小鼠的存活时间，但仅能提高金黄色葡萄球菌感染小鼠的存活率，对β-溶血性链球菌感染小鼠的存活率无明显的影响。
本实验还研究了抗炎、解热和镇痛的药理作用。并以银黄口服液作阳性对照药。本品对角叉菜胶诱发的大鼠足肿胀呈显著的抑制作用，其抗炎消肿作用可持续4h以上；并对二甲苯诱发的小鼠耳肿有明显的抑制。等效量的银黄口服液对大鼠足肿胀和对二甲苯诱发的小鼠耳肿则无抗炎消肿作用，本品显著抑制伤寒-副伤寒四联菌苗引起的家兔体温升高，其解热作用持续4h以上，等效量的银黄口服液的此种作用持续时间短且较弱；复方制品对伤寒菌苗引起的发热兔的清热作用与银黄口服液作用无明显差异。本品能显著抑制醋酸引起的小鼠扭体反应，提示具有镇痛作用；并对温水刺激小鼠尾部引起的痛反应有一定镇痛作用，而等效量的银黄口服液则无镇痛作用。免疫实验结果表明，本品显著拮抗环磷酰胺所致的巨噬细胞吞噬功能低下、T淋巴细胞减少和血清溶血素降低，明显增加吞噬指数、T淋巴细胞数量和半数溶有血值(HC50)，且恢复或超过正常水平。即本品具有显著增加巨噬细胞吞噬功能及细胞免疫和体液免疫功能的作用。
动物急性毒性试验测定LD50为188.2g/kg，毒性作用小。动物长期毒性试验，连续4周给大鼠灌胃给药，分别略低于成人一日用量10、20和40倍，对大鼠的生长发育、血液系统、肝、肾功能等均无明显的蓄积中毒反应。病理检查结果表明，中高剂量对大鼠肝细胞的轻度损伤是可逆性的。
根据临床前药理、毒理研究结果，本品具有抗炎、清热、镇痛及体内外抗菌、抗病毒作用；且毒性小，服用安全可靠。
权利要求
1.一种复方杀病毒制品的制备方法，其特征在于将以下9位中药黄芩、连翘、荆芥、野菊花、玄参、水牛角、大黄(酒炙)、皂角刺、蜂房，采用先进的大孔树脂吸附有效成份，并使用气相指痕光谱定量；其重量百分比为由黄芩12％、连翘20％、荆齐15％、野菊花15％、玄参15％、水牛角10％、大黄(酒炙)4.5％、皂角刺4.5％、蜂房4％组成。将水牛角和蜂房原料，每100kg，分别加水1000kg、1000kg，在100℃条件下，分别煎煮4小时，将水提取的滤液合并备用；再将其它原料在100℃以上的条件下，用蒸汽蒸馏4小时，吸取蒸馏后的挥发油和水混合溶液备用。将剩余残渣每100kg分别加水800kg、800kg煎煮3小时、2小时，吸取合并水提取的滤液，通过大孔树脂填充的柱子，用大孔树脂吸附有效成份后，再用65％乙醇，将吸附在大孔树脂上的成分洗脱至乙醇中，与备用的合并滤液和备用的挥发油和水混合溶液一并，在85℃条件下喷雾干燥，用气相层析测定仪器，进行指痕图谱定量测定后，制成合格原料药；
2.按照权利要求所述1一种复方杀病毒制品的制备方法，其特征在于所述的原料药可以制备成颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊、口服液及针剂。
全文摘要
本发明涉及一种复方杀病毒制品的制备方法，属于天然产物药理活性和分离与提纯天然产物方法。其处方是黄芩12％、连翘20％、荆芥15％、野菊花15％、玄参15％、水牛角10％、大黄(酒炙)4.5％、皂角刺4.5％、蜂房4％组成。通过大孔树脂填充的柱子，用大孔树脂吸附有效成分后，再用65％乙醇，将吸附在大孔树脂上的成分洗脱至乙醇中，与备用的合并滤液和备用的挥发油和水混合溶液一并，在85℃条件下喷雾干燥，用气相层析测定仪器，进行指痕图谱定量测定后，制成原料药。积极效果是复方杀病毒制品的制备方法采用先进的大孔树脂吸附有效成分并使用气相指痕光谱定量，保证药品的稳定性和高质量。
文档编号A61K9/16GK1650900SQ20041000115
公开日2005年8月10日 申请日期2004年2月2日 优先权日2004年2月2日
发明者姜伟 申请人:姜伟