专利名称：矿化丝蛋白/高分子复合多孔材料及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于骨修复的矿化丝蛋白/高分子复合多孔材料及其制备方法，属于生物医用材料领域。
背景技术：
天然骨是一个具有精密分级结构的复杂生物矿化系统，其有机成分主要是I型胶原纤维，其无机成分主要是钙磷盐和少量的碳酸磷灰石。胶原分子以相互错开四分之一的阵列规则排列构成胶原纤维，并形成孔区与重叠区相互交替的周期性结构，周期大约为67纳米。孔区提供矿物形核位点并规范矿物的取向。骨中的钙磷盐主要为形状不规则的片状纳米晶，晶体厚度为4-6纳米，宽度约30-45纳米，临近的片状纳米晶构成晶体层。
中国专利(申请号01136246.4)公开了一种纳米相钙磷盐/胶原/聚乳酸复合多孔材料的制备方法，该材料所使用的钙磷盐和胶原在纳米尺度上具有重复片层结构，周期为10-15纳米，由胶原层和钙磷盐层交替排列而成，该材料从成分和结构上仿天然骨。该多孔材料，具有良好的生物相容性，并已经取得良好的临床修复效果。该材料中含有胶原，目前国内医用胶原多依赖进口，再加上胶原蛋白提纯工艺复杂，成本较高；而国外所生产的胶原蛋白的来源主要是动物，如牛、猪等，存在一定的安全性问题。
本发明在已经制备矿化丝蛋白材料的基础上，进一步将其和高分子材料复合以制备骨修复用框架材料。
发明内容
本发明的目的是提供一种成本低、制备工艺简单，可适合规模生产的可用于骨修复的矿化丝蛋白/高分子复合多孔材料以及该多孔材料的制备方法。
本发明提出的生物矿化丝蛋白/高分子复合多孔材料，其特征在于，该材料主要含有矿化丝蛋白和高分子材料，所述高分子材料为聚乳酸、乳酸和羟基乙酸的共聚物、海藻酸盐、透明质酸、壳聚糖、明胶或它们的衍生物中的任何一种。
在上述复合多孔材料中，所述材料中还包含一种或多种骨生长因子。
在上述复合多孔材料中，所述骨生长因子可以为骨形态发生蛋白、转化生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、生长激素中的任何一种或两种以上的组合。
本发明提出的生物矿化丝蛋白高分子复合多孔材料的制备方法，其特征在于，该方法依次包括以下步骤(1)在丝蛋白溶液中滴加含有钙离子的溶液，使溶液中丝蛋白的质量百分比浓度最终为0.3％-30％，钙离子的摩尔浓度最终为0.01～2mol/L，滴加过程中需要不断搅拌；在搅拌状态下继续向溶液按摩尔比Ca∶P＝1～2∶1的量滴加加入磷酸根离子，最后调节至pH值为7.4～13；(2)将上述溶液搅拌后静置，待沉淀与上清分层后，除去上清，离心分离出沉淀，用去离子水反复洗涤至中性，将沉淀放入冻干机内冷冻干燥，待干燥后研磨成粉；(3)用溶剂溶解高分子，然后将上述步骤(2)中制备的干粉分散在高分子溶液中，得到混合溶液；(4)将混合溶液倒入模具，处理后冷冻干燥；(5)将上述步骤(4)中的成型材料脱模，将脱模后的材料经过水洗后，加入一种或多种生长因子，待材料干燥后用环氧乙烷蒸气消毒2～4小时，或用Co60辐照消毒，包装保存，即得矿化丝蛋白高分子复合多孔材料。
在上述制备方法中，所述在步骤(3)中，当选用的高分子为聚乳酸、乳酸和羟基乙酸的共聚物时，溶剂选用1，4-二氧六环、氯仿或二甲基亚砜中的任何一种。
在上述制备方法中，所述在步骤(3)中，当选用的高分子为海藻酸钠、透明质酸、明胶时，选用水做溶剂。
在上述制备方法中，所述在步骤(3)中，当选用的高分子为壳聚糖时，选用稀酸溶液作为溶剂。
在上述制备方法中，所述在步骤(4)中，当高分子选用壳聚糖、透明质酸、明胶时，可以交联，也可以不交联；选用的交联剂为甲醛、乙二醛和戊二醛、己二酸二酰肼、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺。
在上述制备方法中，所述在步骤(4)中，当高分子选用海藻酸盐时，用氯化钙作交联剂。
用本发明的方法制备的框架材料，具有良好的生物相容性和生物降解性，可用于临床骨修复。其成本低，工艺简单，适合于产业化生产。
图1为本发明的多孔材料孔形态结构的SEM图。
图2为本发明的多孔材料孔壁的SEM图。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明本发明中所用的丝蛋白来源可以为昆虫丝、蜘蛛丝或转基因丝，昆虫丝可以为家蚕、野蚕、柞蚕、天蚕、蓖麻蚕、樗蚕、蓑袋蛾昆虫丝等，使用前要将丝中的丝胶蛋白脱除，发明中优选家蚕丝和柞蚕丝。将脱胶的家蚕丝素蛋白溶于沸腾的质量浓度为40-50％的氯化钙溶液中或者将脱胶的柞蚕丝溶解于120℃的6-8mol/L的硝酸钙，都可以使丝素蛋白溶解，然后将溶解的丝素蛋白经过脱盐、浓缩处理。本发明所用的丝蛋白即经脱胶处理后的丝素蛋白。
本发明中所用的含磷酸根离子的溶液为磷酸和磷酸盐，所用的磷酸盐可以为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二氨、磷酸二氢氨；所用的含钙离子的溶液可以为氢氧化钙和钙盐，钙盐可以为硝酸钙、氯化钙；所用的碱液可以为碱金属氢氧化物或氢氧化铵，试验中一般选用氢氧化钠；冰醋酸；戊二醛；海藻酸钠(Acros Co.)；聚乳酸(山东济南医疗器械研究所)、乳酸和羟基乙酸的共聚物(山东济南医疗器械研究所)、透明质酸(山东福瑞达生物化工有限公司或大连泛邦化工技术开发有限公司)、壳聚糖(山东青岛海普生物技术公司)、明胶。除标明来源的试剂，其余均购自北京化学试剂公司，分析纯。
本发明提出的框架材料的制备方法主要在矿化丝蛋白材料的基础上，进一步复合高分子材料以制备骨修复用框架材料。
主要包括下列步骤(1)在丝蛋白溶液中滴加含有钙离子的溶液，使溶液中丝蛋白的质量百分比浓度最终为0.3％-30％，钙离子的摩尔浓度最终为0.01～2mol/L，滴加过程中需要不断搅拌；在搅拌状态下继续向溶液按摩尔比Ca∶P＝1～2∶1的量滴加加入磷酸根离子，最后调节至pH值为7.4～13；(2)将上述溶液搅拌后静置，待沉淀与上清分层后，除去上清，离心分离出沉淀，用去离子水反复洗涤至中性，将沉淀放入冻干机内冷冻干燥，待干燥后研磨成干粉。
(3)用溶剂将高分子溶解，然后将上述步骤(2)中制备的干粉分散在高分子溶液中混匀，得到混合溶液。
(4)将上述步骤(3)中的混合溶液倒入模具，处理后冷冻干燥。
(5)将上述(4)中的成型材料脱模，将脱模后的材料经过水洗后，加入一种或多种骨生长因子。将材料干燥后或者直接用环氧乙烷蒸气消毒2～4小时，或用Co60辐照消毒，包装保存，即得本发明的丝蛋白/钙磷盐/高分子复合多孔材料。
现进一步对上述多孔材料的制备步骤加以说明。
步骤(3)中，当选用的高分子为聚乳酸(PLA)、乳酸和羟基乙酸的共聚物(PLGA)时，聚合物的分子量为5000～1500000，溶剂可以选用1，4-二氧六环、氯仿或二甲基亚砜中的任何一种，配制成的溶质质量体积浓度为0.02～0.15g/ml；当选用的高分子为海藻酸钠、透明质酸、明胶时，可以选用水等做溶剂，配制成的溶质浓度为0.01～5％；当选用的高分子为明胶时，选用水等做溶剂，配制成的溶质浓度为0.1～10％；当选用的高分子为壳聚糖时，可以选用2％醋酸作为溶剂，壳聚糖在醋酸中的浓度为0.2～5％。
步骤(4)中，模具在冷冻干燥前，可以在含有交联剂的溶液中浸泡，以交联其中的高分子。当高分子选用PLA、PLGA时，可以不用交联。当高分子选用壳聚糖、透明质酸、明胶时，可以交联，也可以不交联；海藻酸盐则用氯化钙进行交联，交联剂浓度为0.5％～10％；实施例1
1)在调好的浓度为0.9％的500ml丝蛋白溶液中，滴加500ml浓度为0.25mol/的Ca(OH)2溶液后，继续缓慢加入浓度为0.25mol/L的NaH2PO4溶液300ml，滴加过程中需要不断搅拌并调节pH为13。
2)将上述体系搅拌、静置，除去上清，离心分离出沉淀，用去离子水反复洗涤去掉其中的盐分并达到到中性后，放入冻干机内冷冻干燥，随后将干燥物研磨制得干粉。
3)称取1.0gPLA置于烧瓶中，加入10ml 1，4-二氧六环得到10％的溶液，混合物在常温下搅拌2小时，加入1.0g制得的矿化丝蛋白，然后混合均匀。
4)将混合液倒入模具，冷冻后，置于冷冻干燥机内冷冻干燥。
5)将上述成型材料脱模，将脱模后的材料经过水洗后，加入骨形态发生蛋白2，待材料干燥后，用环氧乙烷蒸气消毒2小时，包装保存。
实施例21)在调好的浓度为33％的900ml丝蛋白溶液中，加入50ml浓度为0.2mol/L的CaCl2溶液后，继续缓慢滴加浓度为0.2mol/L的Na2HPO4溶液50ml，滴加的同时用搅拌器混合均匀。在上述第一步的溶液中边搅拌边缓慢滴加NaOH溶液，直至pH值稳定为7.4。
2)将上述体系搅拌、静置，除去上清，离心分离出沉淀，用去离子水反复洗涤去掉其中的盐分并达到到中性后，放入冻干机内冷冻干燥，随后将干燥物研磨制得干粉。
3)称取1.5g海藻酸钠，加入1.0g制得的矿化丝蛋白，然后混合均匀。
4)将混合液倒入模具，将模具放入5％的氯化钙溶液中交联12小时，然后脱膜，在蒸馏水中浸泡24小时后，在其中加入成纤维细胞生长因子，将样品冷冻干燥。
5)干燥后的样品用Co60消毒，包装保存。
实施例31)在调好的浓度为10％的100ml丝蛋白溶液中，加入浓度为2mol/L的KH2PO4溶液500ml，继续缓慢滴加400ml浓度为5mol/L的Ca(NO3)2溶液后，滴加的同时用搅拌器混合均匀。在上述第一步的溶液中边搅拌边缓慢滴加KOH溶液，直至pH值为8.0。
2)将上述体系搅拌、静置，除去上清，离心分离出沉淀，用去离子水反复洗涤去掉其中的盐分并达到到中性后，放入冻干机内冷冻干燥，随后将干燥物研磨制得干粉。
3)称取1.0g PLGA置与烧瓶中，加入20ml氯仿得到10％的溶液，混合物在常温下搅拌4小时，加入2.0g制得的矿化丝蛋白，然后混合均匀。
4)将混合液倒入模具，在-4℃冷冻后，置于冷冻干燥机内冷冻干燥。
5)将上述成型材料脱模，用Co60消毒，包装保存。
实施例41)调好的浓度为25％的900ml丝蛋白溶液中，加入50ml浓度为0.2mol/L的CaCl2溶液后，继续缓慢滴加浓度为0.2mol/L的NH3H2PO4溶液50ml，滴加的同时用搅拌器混合均匀。在上述第一步的溶液中边搅拌边缓慢滴加NaOH溶液，直至pH值稳定为10.0。
2)将上述体系搅拌、静置，除去上清，离心分离出沉淀，用去离子水反复洗涤去掉其中的盐分并达到到中性后，放入冻干机内冷冻干燥，随后将干燥物研磨制得干粉。
3)称取1.0gPLGA置与烧瓶中，加入10ml二甲基亚砜得到10％的溶液，混合物在常温下搅拌8小时，得到均匀分散的溶液；加入0.5g制得的矿化丝蛋白，然后混合均匀。
4)将混合液倒入模具，在-4℃冷冻后，置于冷冻干燥机内冷冻干燥。
5)将上述成型材料脱模，将脱模后的材料经过水洗后，加入骨形态发生蛋白2，用Co60消毒，包装保存。
实施例51)调好的浓度为25％的200ml丝蛋白溶液中，加入浓度为2mol/L的K2HPO4溶液500ml，继续缓慢滴加300ml浓度为5mol/L的Ca(NO3)2溶液后，滴加的同时用搅拌器混合均匀。在上述第一步的溶液中边搅拌边缓慢滴加KOH溶液，直至pH值为9.0。
2)将上述体系搅拌、静置，除去上清，离心分离出沉淀，用去离子水反复洗涤去掉其中的盐分并达到到中性后，放入冻干机内冷冻干燥，随后将干燥物研磨制得干粉。
3)称取1.5g壳聚糖，用15ml 2％醋酸溶解后，加入1.0g制得的矿化丝蛋白，然后混合均匀。
4)将混合液倒入模具，在pH为12的NaOH溶液中浸泡24小时后，再在蒸馏水中浸泡48小时，冷冻后进行冷冻干燥，脱膜，将脱模后的材料经过水洗后，加入生长激素，将样品冷冻干燥。
5)干燥后的样品用Co60消毒，包装保存。
实施例61)在调好的浓度为15％的200ml丝蛋白溶液中，加入500ml浓度为0.2mol/L的CaCl2溶液后，继续缓慢滴加浓度为0.2mol/L的H3PO4溶液300ml，滴加的同时用搅拌器混合均匀。在上述第一步的溶液中边搅拌边缓慢滴加NaOH溶液，直至pH值达到9.0。
2)将上述体系搅拌、静置，除去上清，离心分离出沉淀，用去离子水反复洗涤去掉其中的盐分并达到到中性后，放入冻干机内冷冻干燥，随后将干燥物研磨制得干粉。
3)称取1.0g透明质酸，加40ml水溶解后，加入5.0g制得的矿化丝蛋白，混合均匀，加入5倍量己二酸二酰肼，混合液倒入模具，交联1小时后，加去离子水并超声清洗0.5小时。
4)加入骨形态发生蛋白和转化生长因子，将样品冷冻干燥。
5)干燥后的样品用Co60消毒，包装保存。
实施例71)调好的浓度为30％的200ml丝蛋白溶液中，加入500ml浓度为1mol/L的CaCl2溶液后，继续缓慢滴加浓度为0.7mol/L的NaH2PO4溶液300ml，滴加的同时用搅拌器混合均匀。在上述第一步的溶液中边搅拌边缓慢滴加NaOH溶液，直至pH值达到12.0。
2)将上述体系搅拌、静置，除去上清，离心分离出沉淀，用去离子水反复洗涤去掉其中的盐分并达到到中性后，放入冻干机内冷冻干燥，随后将干燥物研磨制得干粉。
3)称取3.0g明胶，用20ml去离子水60℃溶解后，加入1.0g制得的矿化丝蛋白，得到混合溶液。
4)将混合液倒入模具，用浓度5％的戊二醛进行交联2小时后，将模具置入流动的蒸馏水中浸泡48小时，然后冷冻干燥，脱膜，加入骨形态发生蛋白和转化生长因子，将样品冷冻干燥。
5)干燥后的样品用Co60消毒，包装保存。
实施例81)调好的浓度为25％的450ml丝蛋白溶液中，加入25ml浓度为1mol/L的Ca(NO3)2溶液后，继续缓慢滴加浓度为1mol/L的KH2PO4溶液25ml，滴加的同时用磁力搅拌器混合均匀。在上述第一步的溶液中边搅拌边缓慢滴加NaOH溶液，直至pH值稳定为8.5。
2)将上述体系搅拌、静置，除去上清，离心分离出沉淀，用去离子水反复洗涤去掉其中的盐分并达到到中性后，放入冻干机内冷冻干燥，随后将干燥物研磨制得干粉。
6)称取3.0g明胶，用20ml去离子水60℃溶解后，加入1.0g制得的矿化丝蛋白，得到混合溶液。
7)将混合液倒入模具，用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺进行交联，交联后将模具置入流动的蒸馏水中浸泡48小时，然后冷冻干燥，脱膜，将样品冷冻干燥。
8)干燥后的样品用Co60消毒，包装保存。
权利要求
1.生物矿化丝蛋白/高分子复合多孔材料，其特征在于，该材料主要含有矿化丝蛋白和高分子材料，所述高分子材料为聚乳酸、乳酸和羟基乙酸的共聚物、海藻酸盐、透明质酸、壳聚糖、明胶或它们的衍生物中的任何一种。
2.根据权利要求1所述的复合多孔材料，其特征在于，所述材料中还可包含一种或多种骨生长因子。
3.根据权利要求1或2所述的复合多孔材料，所述骨生长因子可以为骨形态发生蛋白、转化生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、生长激素中的任何一种或两种以上的组合。
4.制备如权利要求1所述的生物矿化丝蛋白高分子复合多孔材料的方法，其特征在于，该方法依次包括以下步骤(1)在丝蛋白溶液中滴加含有钙离子的溶液，使溶液中丝蛋白的质量百分比浓度最终为0.3％-30％，钙离子的摩尔浓度最终为0.01～2mol/L，滴加过程中需要不断搅拌；在搅拌状态下继续向溶液按摩尔比Ca∶P＝1～2∶1的量滴加加入磷酸根离子，最后调节至pH值为7.4～12；(2)将上述溶液搅拌后静置，待沉淀与上清分层后，除去上清，离心分离出沉淀，用去离子水反复洗涤至中性，将沉淀放入冻干机内冷冻干燥，待干燥后研磨成粉；(3)用溶剂溶解高分子，然后将上述步骤(2)中制备的干粉分散在高分子溶液中，得到混合溶液；(4)将混合溶液倒入模具，处理后冷冻干燥；(5)将上述步骤(4)中的成型材料脱模，将脱模后的材料经过水洗后，加入一种或多种生长因子，待材料干燥后用环氧乙烷蒸气消毒2～4小时，或用Co60辐照消毒，包装保存，即得矿化丝蛋白高分子复合多孔材料。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述在步骤(3)中，当选用的高分子为聚乳酸、乳酸和羟基乙酸的共聚物时，溶剂选用1，4-二氧六环、氯仿或二甲基亚砜中的任何一种。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述在步骤(3)中，当选用的高分子为海藻酸钠、透明质酸、明胶时，选用水做溶剂。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述在步骤(3)中，当选用的高分子为壳聚糖时，选用稀酸溶液作为溶剂。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述在步骤(4)中，当高分子选用壳聚糖、透明质酸、明胶时，可以交联，也可以不交联；选用的交联剂为甲醛、乙二醛和戊二醛、己二酸二酰肼、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述在步骤(4)中，当高分子选用海藻酸盐时，用氯化钙作交联剂。
全文摘要
本发明涉及生物矿化丝蛋白/高分子复合多孔材料及其制备方法，属于生物医用材料领域。首先制备水溶性的脱胶丝蛋白，搅拌状态下向此溶液中加入含钙离子溶液，随后缓慢注入含磷酸根离子的溶液，调节反应体系pH值，维持搅拌一定时间后将体系静置，离心、洗涤，重复此过程使洗脱液至中性，将分离的沉淀真空干燥。将干燥的沉淀研磨后进一步和生物相容性较好的高分子复合，得到多孔框架材料。所用的高分子为聚乳酸、乳酸和羟基乙酸的共聚物、海藻酸钠、透明质酸、壳聚糖、明胶。用本方法制备的框架材料，具有良好的生物相容性和生物降解性，可用于临床骨修复。
文档编号A61L27/44GK1562389SQ20041000345
公开日2005年1月12日 申请日期2004年3月19日 优先权日2004年3月19日
发明者崔福斋, 孔祥东, 张伟 申请人:清华大学