专利名称：一种肿瘤－胎盘抗原蛋白及其dna在肿瘤治疗中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种肿瘤抗原蛋白质及其编码DNA的用途，特别是涉及一种肿瘤-胎盘抗原蛋白及其DNA在制备用于治疗肝癌、肠癌、胃癌和肺癌的药物中的应用。
背景技术：
恶性肿瘤是成胁人类健康的一大类疾病。肿瘤的发生是一个非常复杂的过程。肿瘤细胞能够发生和进展的一个重要因素在于其能够逃避机体免疫系统的监视作用，因此，如何激发和唤起机体的免疫系统识别并排斥“非己”成分的肿瘤细胞是寻找新的肿瘤治疗方法的一个突破口。在对肿瘤的免疫治疗研究的初期，人们发展了很多办法来激发机体的免疫系统来排斥“非己”成分的肿瘤细胞，尽管这些方法在动物肿瘤模型的治疗上取得了很好的疗效，但是在人类肿瘤的治疗上仍缺乏显著的效果。
已知人体内的免疫系统，包括体液免疫与细胞免疫，尤其是T细胞免疫对肿瘤的杀伤抑制起着重要作用。随着人们对免疫应答反应本质的认识，人们发现不管免疫应答的过程多么复杂，最终导致T细胞活化而产生杀伤效应的就是与主要组织相容性复合体MHC相结合形成抗原肽复合物和共刺激信号，即细胞毒性T细胞(CTL)通过自身表面的T细胞受体(TCR)，识别表达于肿瘤细胞表面的肿瘤抗原蛋白质/肽与主要组织相容性复合体(MHC)I类抗原相结合形成的复合体，从而攻击杀伤肿瘤细胞。
肿瘤抗原蛋白质/肽的产生是由肿瘤细胞先表达成肿瘤抗原，其在细胞内由各种蛋白酶分解成8～10个氨基酸大小的抗原肽，这些抗原肽与同时在内质网中产生MHC I类分子结合，通过高尔基复合体表达于细胞的表面，最终提呈给肿瘤抗原特异的CTL，从而诱发免疫应答，杀伤清除肿瘤细胞。这种存在于肿瘤细胞中、能与MHC分子结合并诱发机体免疫反应的蛋白质抗原分子即为肿瘤抗原。可以用这些抗原诱导机体产生只针对肿瘤细胞的免疫应答反应，从而特异杀伤体内的肿瘤细胞而达到治疗或者防治肿瘤细胞转移的作用。因此近几十年来，人们把用免疫方法治疗肿瘤的重点放在寻找肿瘤特异和/或相关性抗原上。
在二十世纪五十年代，Foley等人把经化学诱变产生肿瘤的小鼠用灭活的自身肿瘤细胞免疫后，再给该小鼠接种活的肿瘤细胞，这些肿瘤细胞被排斥而不能生长成肿瘤，小鼠则存活；与之对照，没用灭活的自身肿瘤细胞免疫的小鼠接种活的肿瘤细胞后，肿瘤细胞不被排斥而生长成肿瘤，小鼠则死亡。此实验以令人信服的证据证明了化学诱变的肿瘤存在肿瘤特异性抗原，但是这种保护反应有着精确的特异性，即只针对相同类型的肿瘤而不针对不同类型的肿瘤，即使是对用同一致癌剂在同一小鼠上诱导的不同类型肿瘤也没有保护作用。
1991年，T.Boon等首次从人黑色素瘤细胞中鉴定出肿瘤抗原蛋白质，并命名为MAGE(科学，2541643-1647，1991)。随后，人们又鉴定出来其它一些肿瘤抗原蛋白质，可以分为肿瘤-睾丸(CT)抗原蛋白质、分化抗原蛋白质、突变的肿瘤抗原蛋白质、过表达的肿瘤抗原蛋白质和病毒抗原蛋白质五类。其中，应用于临床上最为广泛的是肿瘤-睾丸(CT)抗原蛋白质。
肿瘤-睾丸(CT)抗原蛋白质是目前鉴定的肿瘤抗原中最多的一类，它们编码基因的特点是在很多类型的肿瘤中都有表达，如在黑色素瘤、肺癌、肉瘤和膀胱癌中都有表达，但在除睾丸外的正常组织都不表达，在胎盘、卵巢、胰腺中有一定量的表达。因为睾丸是免疫特许部位，所以这一类抗原在治疗上被认为是肿瘤特异性的抗原，是最有希望用作为肿瘤免疫治疗用途的一类抗原。目前试用于临床上的也主要就是这一类抗原，如MAGE-1和NY-ESO-1即是在一定类型的肿瘤中有高阳性率的表达，又有很好的免疫原性的抗原蛋白质，用于肿瘤的免疫治疗时有很好的前景。同时也有一些肿瘤抗原蛋白质在除胎盘外的任何正常组织中都不表达，即使在睾丸中也不表达，胎盘是只有孕妇才有的组织，从肿瘤免疫治疗应用的角度，这一类抗原在人体具有与肿瘤-睾丸抗原相似的性质，因此也可以归类为肿瘤-睾丸抗原或直接称为肿瘤-胎盘抗原。
到目前为止，最具代表性的鉴定肿瘤抗原蛋白质的方法为基于特异性细胞免疫应答基础上的文库筛选法、基于体液免疫应答基础上的cDNA表达文库筛选法、组合肽文库筛选、酸洗脱法和生物信息学方法。
肝癌、肠癌、胃癌和肺癌是人类肿瘤中最为常见的恶性肿瘤，尤其是近些年来，发病率逐渐增加。这些肿瘤生长迅速，即使发现也难以治愈，目前，主要的治疗方法是传统的手术切除和放疗等局部治疗，但由于大部分患者确诊时肿瘤已经难以控制，并且对放疗与化疗有相当的抵抗性。因此治疗的效果和预后往往较差，病人的一年与五年存活率是很低的。寻找治疗方法上的突破或者是新的治疗方法一直是临床肿瘤学家追求的目标，人们期待着有新的方法来提高肿瘤的早期诊断与病人良好的预后，以及术后清除体内残留的肿瘤细胞和防止肿瘤细胞的转移。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肿瘤抗原蛋白质在制备用于治疗癌症的药物中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种编码肿瘤抗原蛋白质的DNA序列在制备用于治疗癌症的药物中的应用。
本发明的目的是通过如下的技术方案实现的本发明提供了一种肿瘤抗原蛋白质在制备用于治疗癌症的药物中的应用，该蛋白质具有如下(a)或(b)所述的氨基酸序列(a)具有图7所示的氨基酸序列；(b)将(a)中的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代，缺失或添加突变所产生的衍生蛋白质，且该衍生蛋白质与(a)的蛋白质具有相同的功能。
本发明的这种肿瘤抗原蛋白质通过细胞内分解，能产生与主要组织相容性复合体(MHC)-I类分子相结合的、在结合状态能被T细胞所识别的肽片段，激发免疫反应而达到治疗癌症的目的。
本发明的肿瘤抗原蛋白质在制备用于治疗癌症的药物时，优选为治疗肝癌、肠癌、胃癌或肺癌。本发明的肿瘤抗原蛋白质还可作为肿瘤-胎盘抗原而制成疫苗。
另一方面，本发明还提供了一种编码肿瘤抗原蛋白质的DNA序列在制备用于治疗癌症的药物中的应用，其中所编码的肿瘤抗原蛋白质具有如下(a)或(b)所述的氨基酸序列(a)具有序列1所示的氨基酸序列；(b)将(a)中的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代，缺失或添加突变所产生的衍生蛋白质，且该衍生蛋白质与(a)的蛋白质具有相同的功能。
优选所述的DNA在基因文库中登录号为CP1，BC022335，如序列表中SEQ ID No1所示的核苷酸序列。
优选所述的DNA序列用于治疗肝癌、肠癌、胃癌或肺癌。本发明的DNA还可作为肿瘤-胎盘基因，用于制备疫苗。
本发明的优益之处在于本发明首次将CP1基因鉴定为肿瘤-胎盘抗原基因；在使用免疫方法治疗癌症时，可以用本发明的肿瘤抗原蛋白质诱导机体产生只针对肿瘤细胞的免疫应答反应，从而在不杀伤正常细胞的同时，特异杀伤体内的肿瘤细胞而达到治疗或者防治肿瘤细胞转移的作用；同时，可以通过对该肿瘤抗原基因或抗体的检测，对肿瘤的发生、发展以及是否有转移进行诊断。
应用本发明的肿瘤抗原蛋白质可以提供活化抗肿瘤免疫的医药、可提供肿瘤的诊断方法。抗本发明的肿瘤抗原蛋白质的抗体可用于亲和层析、cDNA文库的筛选、免疫学诊断或医药的制备。
图1是编码本发明抗原蛋白质的基因PLAC1在16种成人正常组织的RT-PCR检测结果；其中泳道1～16依次分别代表成人正常组织脾、前列腺、卵巢、小肠、胎盘、大肠、白细胞、睾丸、心脏、肺、肝、脑、肾、骨骼肌、胰腺和胸腺。
图2是编码本发明抗原蛋白质的基因PLAC1在肝癌的癌组织与配对的癌旁组织的RT-PCR结果其中Ca代表肝癌组织，Adj代表配对的癌旁组织。
图3是编码本发明抗原蛋白质的基因PLAC1在肝癌组织与配对的癌旁组织的Northern blot结果其中的Ca代表肝癌组织，Adj代表配对的癌旁组织。
图4是CP1基因重组蛋白质在大肠杆菌中的表达结果其中的N代表没有诱导；1与2代表诱导重组蛋白质表达的大肠杆菌全蛋白，与N比较，在23kD的位置上出现一条蛋白带；3与4代表诱导重组蛋白质表达的大肠杆菌用包涵体洗涤液洗涤后的结果；5与6代表用抗重组蛋白带有的6个组氨酸的单克隆抗体，通过Western杂交方法，对重组蛋白进行鉴定的结果；箭头所示为在大肠杆菌中表达的CP1基因重组蛋白质。
图5是通过ELISA方法检测的本发明抗原蛋白质免疫家兔产生的多克隆抗体的结果其中 分别代表免疫三只不同的家兔产生的三份不同的血清； 代表作为阴性对照的没有用本发明抗原蛋白质免疫的家兔的血清。
图6是通过免疫组织化学的方法检测的本发明抗原蛋白质在胃癌组织中表达的结果其中箭头所示为检测到的本发明抗原蛋白质。
图7本发明肿瘤抗原蛋白质的氨基酸序列。
具体实施例方式
实施例1、肝癌中差异表达cDNA片断PLAC1的发现为了筛选原发性肝细胞癌中差异表达的基因，我们利用Clontech公司的抑制消减杂交技术(suppression subtractive hybridization，SSH)试剂盒(PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit)，采用抑制消减杂交技术，以肝癌组织作为检测者(tester)，相应的癌旁组织作为驱赶者(driver)，进行了抑制消减杂交。
首先以TRIzol试剂盒(Gibco公司)提取肝癌及癌旁组织总RNA，采用Promega公司PolyATract mRNA分离试剂盒(Promega，Madison，WI)分离mRNA，紫外分光光度检测mRNA的浓度和纯度。
SSH操作流程按试剂盒说明，以2μg mRNA合成cDNA第一链及第二链，继而用RsaI酶消化双链cDNA，酚/氯仿抽提纯化cDNA片断，testercDNA分为两份，分别与两种接头(adaptor)于16℃连接过夜，取1μl连接产物稀释于200μl水中，检测连接效率。将连接有不同接头的tester双链DNA各1.5μl分别与1.5μl driver双链DNA及1μl 4×杂交液98℃变性1.5分钟，68℃杂交8小时。然后混合两份杂交样品及过量的新鲜变性的driver，68℃杂交16小时。杂交结束后加入200μl稀释液稀释后作为模板，进行两轮PCR扩增(引物PCR引物15’CTA ATA CGACTC ACT ATA GGG C 3’；巢式PCR引物15’TCG AGC GGC CGCCCG GGC AGG T 3’；巢式PCR引物2R5’AGC GTG GTC GCGGCC GAG GT 3’)，第一次PCR循环参数为75℃5分钟，30循环94℃30秒，66℃30秒，72℃1.5分钟。将第一轮PCR产物1∶10稀释后，取1μl作模板进行巢式PCR(nested PCR)15循环94℃10秒，68℃30秒，72℃1.5分钟。各取第一、二次PCR产物8μl用2％琼脂糖凝胶电泳进行分析。用试剂盒提供的G3PDH(甘油醛3-磷酸脱氢酶)5’及3’引物按试剂盒说明检测消减杂交效率。
将第二轮PCR产物按常规方法克隆入pGEM-T Easy vector，转化入感受态E.coli TOP10F’菌，构成消减文库，随机挑选克隆，提取质粒后用EcoR I酶切鉴定插入片断大小，选取有大小不同的片断，送上海基康公司测序，所得结果用Blast软件与GenBank中的核酸序列进行同源比对，结果其中的一个片断是一个已知的胎盘特异基因PLAC1的一部分。因此，我们发现PLAC1也在肝癌组织中表达。
实施例2、用RT-PCR的方法来证明PLAC1基因在肝癌、肠癌、胃癌和肺癌的表达生物技术公司CLONTECH的16种商品化的人正常组织的cDNA(脾、前列腺、睾丸、卵巢、小肠、大肠、白细胞、心脏、肺、肝、脑、肾、胰腺、胎盘、骨骼肌、胸腺)、来源于39例肝癌病人的癌组织与配对的癌旁组织的cDNA、来源于24例肠癌病人的癌组织与配对的癌旁组织的cDNA、来源于24例胃癌病人的癌组织与配对的癌旁组织的cDNA、与来源于24例肺癌病人的癌组织与配对的癌旁组织的cDNA被用来检测PLAC1基因在正常组织与肿瘤组织的表达情况。
本发明中进行RT-PCR的条件应用CLONTECH公司的advanced热启动DNA聚合酶，94℃15秒；65℃30秒；72℃、40秒，30循环，之后，72℃、6分钟。进行RT-PCR的引物序列，正向引物ctg ttc ctg gcaccc tgt gca tcc；反向引物gat gcc gcc atg ctg ttc acc c。结果发现PLAC1基因在50％的肝癌标本、36％的肠癌、50％的胃癌与40％的肺癌中表达，而与之配对的癌旁组织都不表达；在16种成人重要正常组织中，PLAC1基因仅在胎盘组织中表达(图1、图2)。本实施例证明肿瘤-胎盘抗原基因PLAC1在各种肿瘤组织中广泛表达，我们依据现在已知的PLAC1基因全面的性质将其重新命名为CP1(基因文库中登录号为CP1，BC022335)。
实施例3、用Northern杂交的方法来分析CP1基因在肝癌、肠癌、胃癌与肺癌肿瘤组织中的表达用TRIZOL试剂(PROMEGA)从肿瘤病人的癌组织与配对的癌旁组织中提取总RNA，接着应用mRNA分离试剂盒(PROMEGA)从总RNA中分离mRNA。在甲酰胺、甲醛存在的条件下将2ug的mRNA变性，进行琼脂糖电泳后转到Hybond-N+尼龙膜(Amersham)上，用紫外交联的方法固定。用地高辛DNA探针标记试剂盒(Roche)标记实施例2中扩增出来的DNA片段，以制作DNA探针，按照常规的Northern杂交方法与膜上的mRNA进行杂交，之后进行放射自显影，检测出本发明中的肿瘤-胎盘抗原蛋白质基因CP1的mRNA。然后，将检测出该基因mRNA所用的膜在1％SDS溶液中煮沸，除掉地高辛标记的探针后，用标记的管家基因G3PDH作探针，用同样的方法进行Northern杂交，检测出的mRNA作阳性对照。结果表明，本发明的肿瘤抗原蛋白质基因的mRNA仅在肝癌、肠癌、胃癌与肺癌的癌组织中表达，而配对的癌旁组织不表达(图3)。与肿瘤-胎盘抗原基因的特性一致。
实施例4、CP1基因重组蛋白质在大肠杆菌中的表达应用pQE30原核表达载体(购于INVOTRIGEN公司)，构建表达肿瘤-胎盘抗原CP1的质粒pQE30-CP1，该质粒在大肠杆菌菌株M15(购于INVOTRIGEN公司)中，37℃生长条件下，IPTG诱导重组蛋白质表达6小时。SDS-PAGE蛋白电泳对重组蛋白的表达进行鉴定。之后，应用镍离子亲和层析柱子(购于INVOTRIGEN公司)将重组蛋白质从大肠杆菌全蛋白中分离、纯化出来。用抗重组蛋白带有的6个组氨酸的单克隆抗体(购于INVOTRIGEN公司)，通过Westem杂交方法，对重组蛋白进行鉴定(图4)。结果在预期大小的23kD位置上有预期的蛋白，以抗6个组氨酸的单克隆抗体进行的Western杂交证实了表达的蛋白就是CP1基因的重组蛋白。
实施例5、用Western杂交方法检测肝癌、肠癌、胃癌与肺癌肿瘤病人血清中的抗CP1重组蛋白的抗体参照实验医学杂志，1871349，1998中的方法，筛选CP1 mRNA转录本阳性的肿瘤病人的血清，发现在肿瘤(肝癌、肠癌、胃癌与肺癌)病人的血清中存在抗CP1重组蛋白的抗体。因此，CP1是一个新的肿瘤-胎盘抗原，具有诱导肿瘤病人产生免疫应答，排斥杀伤肿瘤细胞的能力，有应用于肿瘤的临床免疫治疗的潜能。
实施例6、人工抗CP1重组蛋白多克隆抗体的制备参照分子克隆实验指南，第二版(黎孟枫、金冬雁译)852，第十八章的第一、二节中的方法，以纯化的CP1重组蛋白免疫3只家兔4次，第一次免疫后1个月进行第二次免疫，第二次与第三次免疫、第三次与第四次免疫之间间隔2周，第四次免疫后两周收获家兔的血清，抗CP1重组蛋白的多克隆抗体就在这些血清中。将多克隆抗体在1∶500稀释之后，再依次进行3倍的系列稀释，通过ELISA方法，对多克隆抗体进行鉴定。结果显示三只家兔产生的多克隆抗体都能够与CP1重组蛋白发生特异性的反应，而且多克隆抗体的滴度是很高的(图5)。
实施例7、用免疫组织化学的方法检测肝癌、肠癌、胃癌与肺癌病人肿瘤组织中天然的CP1抗原蛋白质的存在参照实验室调查(LABORATORY INVESTIGATION)杂志，831，2003中的方法，用纯化的人工抗CP1重组蛋白多克隆抗体，进行免疫组织化学实验，检测肝癌、肠癌、胃癌与肺癌病人肿瘤组织中是否存在天然的CP1抗原蛋白质，结果发现在这些肿瘤组织中存在天然的CP1蛋白，该蛋白定位在细胞核内。图6显示了CP1抗原蛋白质在胃癌的表达结果。因此，CP1作为一个新的肿瘤-胎盘抗原，在肿瘤组织中的确存在该抗原，这为CP1应用于肿瘤的临床免疫治疗提供了进一步的依据。
实施例8、突变的肿瘤抗原蛋白质的制备及其血清抗体筛选参照分子克隆实验指南，第二版(黎孟枫、金冬雁译)693，第十五章中的方法，制备了如下随机突变的DNA，将序列号2中的第361个碱基由A突变为G，由此也就将序列号1中的第24个氨基酸由S突变为G；将序列号2中的第661个碱基由C突变为A，由此也就将序列号1中的第124个氨基酸由L突变为I。将突变的两个DNA分别克隆到表达载体中，表达突变的肿瘤抗原，详细参照实施例4。应用制备的突变的肿瘤抗原参照实施例5筛选肿瘤病人的血清，发现在肿瘤病人的血清中也存在着这些突变肿瘤抗原的抗体。由于该实施例中的突变位点是随机选定的，这说明在肿瘤病人的血清中也存在针对其它位点的突变产生的肿瘤抗原蛋白质的抗体。该实施例说明突变的肿瘤抗原也有诱导肿瘤病人产生免疫应答，排斥杀伤肿瘤细胞的能力，有应用于肿瘤的临床免疫治疗的潜能。
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权利要求
1.一种肿瘤抗原蛋白质在制备用于治疗癌症的药物中的应用，该蛋白质具有如下(a)或(b)所述的氨基酸序列(a)具有图7所示的氨基酸序列；(b)将(a)中的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代，缺失或添加突变所产生的衍生蛋白质，且该衍生蛋白质与(a)的蛋白质具有相同的功能。
2.根据权利要求1所述的蛋白质的应用，其特征在于所述的癌症为肝癌、肠癌、胃癌或肺癌。
3.根据权利要求1所述的蛋白质的应用，其特征在于所述的药物为所述的蛋白质作为肿瘤-胎盘抗原而制得的疫苗。
4.一种编码肿瘤抗原蛋白质的DNA序列在制备用于治疗癌症的药物中的应用，其中所编码的肿瘤抗原蛋白质具有如下(a)或(b)所述的氨基酸序列(a)具有序列1所示的氨基酸序列；(b)将(a)中的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代，缺失或添加突变所产生的衍生蛋白质，且该衍生蛋白质与(a)的蛋白质具有相同的功能。
5.根据权利要求4所述的DNA的应用，其特征在于所述的DNA序列为基因文库中登录号为CP1，BC022335。
6.根据权利要求4所述的DNA的应用，其特征在于所述的癌症为肝癌、肠癌、胃癌或肺癌。
7.根据权利要求4所述的DNA的应用，其特征在于所述的药物为所述的DNA作为肿瘤-胎盘基因而制得的疫苗。
全文摘要
本发明涉及一种肿瘤－胎盘抗原蛋白在制备用于治疗癌症的药物中的应用。本发明进一步涉及编码该肿瘤－胎盘抗原蛋白的DNA序列在制备用于治疗癌症的药物中的应用。本发明的肿瘤抗原蛋白及其基因对肿瘤的治疗，肿瘤的发生、发展以及是否有转移的诊断提供了一种新的途径。
文档编号A61K39/00GK1663603SQ20041000608
公开日2005年9月7日 申请日期2004年3月2日 优先权日2004年3月2日
发明者陈慰峰, 董学员, 庞学雯 申请人:北京大学