专利名称：一种抗血栓疾病的中药制剂及其制备方法
技术领域：
本发明属于中药制药领域，具体涉及一种抗血栓疾病的中药制剂及其制备方法。
背景技术：
水蛭，为环节动物水蛭科蚂蟥的干燥全体，又名蚂蟥。味咸苦、性平、有毒，入肝经。功专破血逐瘀通经，为临床常用的活血祛瘀药。药理研究证实本药含水蛭素，组织胺样物质，有抗凝血、扩张血管、降低血液的粘稠度的作用。临床应用较广，疗效较佳。近几十年来化学成分研究，国外从鲜活日本医蛭中提取活性成分，其中最重要的是水蛭素(hirdin)，它是迄今为止，世界上最强的凝血酶特效抑制剂，其药效学、药代动力学、临床实验及毒副作用方面都进行了广泛深入的研究。国内水蛭成分研究几近空白，只有贾元印等初步探讨过从活水蛭中提取抗凝血物质的方法，张莅峡等对干水蛭进行了微量元素和氨基酸的分析，水蛭药材的成分研究尚无报道。国内近年来实验研究表明，水蛭药材至少具有下列药理作用对血液系统具抗凝、纤溶、抑制血小板聚集、降低比粘度、降血脂、抗血栓等作用。水蛭素是迄今为止发现的最强有力的凝血酶抑制剂，还有很强的抗血栓作用，对多种实验性血栓模型有阻抑作用。水蛭素对于各种血栓疾病如静脉血栓、弥散性血管内凝血、脑凝血、血栓静脉炎及冠状动脉血栓都有预防和治疗效果，尤其是静脉血栓和弥漫性血管内凝血的治疗；也可用于外科手术后预防动脉血栓的形成，预防溶解血栓后或血管再造后血栓的形成；改善体外血液循环和血液透析过程，在显微外科手术中常因为吻合处血管栓塞而导致失败，采用水蛭素可促进伤口愈合。
世界抗血栓药物的市场有不断上升的趋势。据世界卫生组织(WHO)统计，全世界每年大约有1200万人死于心脑血管病，而随着人口平均寿命的延长，生活环境和膳食习惯变化，心脑血管病的发病率和死亡率正在逐年增高。Datamonitor的一项新的市场研究报告指出，世界抗血栓药物市场将从1998年的67亿美元增加至2005年的93亿美元，增长37％。作为抗凝的特效药，水蛭素的市场前景可见一斑。
专利申请号为03113566和申请号为95117701的专利公开了水蛭提取纯化水蛭素的方法，采用凝胶过滤柱层析和亲合色谱法纯化水蛭素，这两种方法能够得到水蛭素，但在实际应用过程中，步骤麻烦，只适用于实验室，不能进一步中试发大和生产，因此，采用该工艺方法不能开发成新药，不适合推广。
发明内容
基于上述原因，本发明采用乙醇提取、超滤法和离子交换法纯化得到水蛭醇提有效部位，该方法适合生产与推广，适合新药开发工艺。水蛭醇提有效部位和药物辅料混合制备成冻干粉针剂，药理实验结果表明，该粉针剂具有很好的抗血栓作用，与市售同类品种比较具有更强的药理作用。
本发明是通过以下方案实现的。
一.工艺制法取水蛭，用70％-90％乙醇浸泡过夜，放入中药多功能提取罐中，控制温度40℃-70℃，提取1-3小时，提取2-4次，合并提取液，回收乙醇至尽，得到浸膏；取浸膏，用水溶解完全后，用0.1-0.65um微孔滤膜进行过滤，滤液先用截取分子量1000-3000的中空纤维柱进行超滤，超滤至原体积的1/2-1/3，加热水至原体积，保持温度为40℃-60℃，超滤时透过液弃去，循环液超滤3-5次，最后一次浓缩至密度为1.10-1.50，得到浓缩液；取浓缩液上样到经过缓冲液平衡过的阴离子交换柱，穿透液弃去，用0-1.0mol/l的氯化钠梯度洗脱，洗脱液浓缩备用。取备用原料，按比例加入冻干粉针剂药用辅料，用注射用水溶解完全，进行无菌过滤，注入无菌处理的托盘中，将托盘放入冻干机中，进行冷冻干燥，冻干机控制温度为0℃-零下70℃，压力为1.01*105Pa-04*105Pa，冷冻干燥后，将干燥无菌原料放入无菌处理的粉碎机中进行粉碎，将粉碎后的原料在百极操作间，进行分装，制备成一种抗血栓疾病的中药制剂。
二.药理实施例实施例1体外抗凝实验方法体外抗凝活性的测定参照Markwardt的凝血酶滴定方法进行。于酶标板小孔中加0.5％牛血纤维蛋白原(50mmol/L Tris HCl缓冲液(pH7.4)配制)200μl，再加入100μl本发明冻干粉针剂，充分混匀。用微量进样器吸取标准的凝血酶溶液(100NIH单位/ml)进行滴定，每次滴定量为5μl(0.5NIH单位)，时间间隔为1min，若在1min内纤维蛋白原发生凝固，即说明已达到滴定终点。由凝血酶的消耗量可以换算出本发明冻干粉针剂的单位数。由于水蛭素与凝血酶是1∶1结合，故每消耗一个凝血酶单位(NIHU)相当于一个抗凝血酶单位(ATU)，结果纯化后测得比活为8000ATU/mg实施例2对抗大鼠血栓形成的作用药品本发明冻干粉针剂(北京乾露春科技有限公司实验室提供)水蛭注射液(吉林省药物研究所提供)动物Wistar大鼠，购自北京中医中药研究院动物室。
方法取Wistar雄性大鼠45只，体重230～280g，随机分为3组，每组15只生理盐水对照组、本发明冻干粉针剂组、水蛭注射液。各组均腹腔注射给药，每日1次，连续7d，于未次给药30min后，以3％戊巴比妥钠30mg·kg-1麻醉大鼠。采用大鼠体外颈总动脉-颈外静脉旁路法，将大鼠仰卧固定，分离气管并插管，并分离右颈总动脉及左颈外静脉，在三段聚乙烯管的中段放入一根6cm丝线，将肝素生理盐水(50IU/ml)充满聚乙烯管，当管的一端插入左颈外静脉后，由聚乙烯管准确注入肝素(50IU/kg)抗凝，然后将聚乙烯管的另一端插入右颈总动脉。打开动脉夹，血液从右颈总动脉流至聚乙烯管，返回左颈外静脉。放开血流15min后中断血流，迅速取出丝线称重。总重量-丝线重＝血栓湿重，并计算抑制率。抑制率＝(对照组血栓湿重-给药组血栓湿重)/对照组血栓湿重组*100％，结果计算见表1表1各组制剂抗血栓比较
*P＜0.01，**P＜0.01，**与*比较P＜0.05实施例3对小鼠ADP诱导的血栓性死亡的影响药品本发明冻干粉针剂(北京乾露春科技有限公司实验室提供)市售银杏达莫注射液(南京金陵制药股份有限公司生产，购自北京白塔寺医药批发公司)生理盐水(北京乾露春科技有限公司实验室提供)方法取健康小鼠60只，雌雄各半，随机分成3组生理盐水组、本发明冻干粉针剂组、市售银杏达莫注射液组每日灌胃，连续7d，于末次给药后1h尾静脉注射ADP480mL/kg，记录动物死亡情况。见表2表2各组制剂对小鼠ADP诱导的血栓性死亡的影响比较
*P＜0.01，**P＜0.01，**与*比较P＜0.05
结论通过以上药理实验表明，本发明的中药冻干粉针剂具有很好的溶栓作用，对血栓具有较强溶解作用，与市售同类品种比较具有更强的药理作用。
三.制备实施例实施例1取水蛭1000克，用70％乙醇浸泡过夜，放入中药多功能提取罐中，控制温度40℃，提取1小时，提取2次，合并提取液，回收乙醇至尽，得到浸膏；取浸膏，用水溶解完全后，用0.1um微孔滤膜进行过滤，滤液先用截取分子量1000的中空纤维柱进行超滤，超滤至原体积的1/3，加热水至原体积，保持温度为40℃，超滤时透过液弃去，循环液超滤3次，最后一次浓缩至密度为1.10，得到浓缩液；取浓缩液上样到经过Tris-HCl缓冲液平衡过的弱阴离子交换柱，穿透液弃去，用0-1.0mol/l的氯化钠梯度洗脱，洗脱液浓缩，得到水蛭醇提有效部位6.89克，与药用辅料甘露醇146.36克混合，取备用原料，用注射用水溶解完全，进行无菌过滤，注入无菌处理的托盘中，将托盘放入冻干机中，进行冷冻干燥，冻干机控制温度为零下40℃，压力为05*105Pa，冷冻干燥后，将干燥无菌原料放入无菌处理的粉碎机中进行粉碎，将粉碎后的原料在100级操作间，进行分装，制备成一种抗血栓疾病的中药制剂。
实施例2取水蛭500克，用90％乙醇浸泡过夜，放入中药多功能提取罐中，控制温度70℃，提取3小时，提取4次，合并提取液，回收乙醇至尽，得到浸膏；取浸膏，用水溶解完全后，用0.65um微孔滤膜进行过滤，滤液先用截取分子量3000的中空纤维柱进行超滤，超滤至原体积的1/2，加热水至原体积，保持温度为60℃，超滤时透过液弃去，循环液超滤5次，最后一次浓缩至密度为1.50，得到浓缩液；取浓缩液上样到经过磷酸一氢钠-磷酸二氢钠缓冲液平衡过的强阴离子交换柱，穿透液弃去，用0-1.0mol/l的氯化钠梯度洗脱，洗脱液浓缩得到水蛭醇提有效部位3.77克，与药用辅料甘露醇、蔗糖共36.32克混合，取备用原料，用注射用水溶解完全，进行无菌过滤，注入无菌处理的托盘中，将托盘放入冻干机中，进行冷冻干燥，冻干机控制温度为零下50℃，压力为0.6*105Pa，冷冻干燥后，将干燥无菌原料放入无菌处理的粉碎机中进行粉碎，将粉碎后的原料在100级操作间，进行分装，制备成一种抗血栓疾病的中药制剂。
实施例3取水蛭800克，用80％乙醇浸泡过夜，放入中药多功能提取罐中，控制温度50℃，提取2小时，提取3次，合并提取液，回收乙醇至尽，得到浸膏；取浸膏，用水溶解完全后，用0.22um微孔滤膜进行过滤，滤液先用截取分子量2000的中空纤维柱进行超滤，超滤至原体积的1/2，加热水至原体积，保持温度为50℃，超滤时透过液弃去，循环液超滤4次，最后一次浓缩至密度为1.30，得到浓缩液；取浓缩液上样到经过Tris-HCl缓冲液平衡过的强阴离子交换柱，穿透液弃去，用0-1.0mol/l的氯化钠梯度洗脱，洗脱液浓缩得到水蛭醇提有效部位6.29克，与药用辅料甘露醇90.48克混合，取备用原料，用注射用水溶解完全，进行无菌过滤，注入无菌处理的托盘中，将托盘放入冻干机中，进行冷冻干燥，冻干机控制温度为零下55℃，压力为0.45*105Pa，冷冻干燥后，将干燥无菌原料放入无菌处理的粉碎机中进行粉碎，将粉碎后的原料在100级操作间，进行分装，制备成一种抗血栓疾病的中药制剂。
实施例4取水蛭1500克，用75％乙醇浸泡过夜，放入中药多功能提取罐中，控制温度45℃，提取2小时，提取4次，合并提取液，回收乙醇至尽，得到浸膏；取浸膏，用水溶解完全后，用0.45um微孔滤膜进行过滤，滤液先用截取分子量3000的中空纤维柱进行超滤，超滤至原体积的1/3，加热水至原体积，保持温度为45℃，超滤时透过液弃去，循环液超滤5次，最后一次浓缩至密度为1.40，得到浓缩液；取浓缩液上样到经过磷酸一氢钠-磷酸二氢钠缓冲液平衡过的弱阴离子交换柱，穿透液弃去，用0-1.0mol/l的氯化钠梯度洗脱，洗脱液浓缩得到水蛭醇提有效部位12.50克，与药用辅料蔗糖、乳糖共154.17克混合，取备用原料，用注射用水溶解完全，进行无菌过滤，注入无菌处理的托盘中，将托盘放入冻干机中，进行冷冻干燥，冻干机控制温度为零下60℃，压力为0.4*105Pa，冷冻干燥后，将干燥无菌原料放入无菌处理的粉碎机中进行粉碎，将粉碎后的原料在100级操作间，进行分装，制备成一种抗血栓疾病的中药制剂。
实施例5取水蛭2000克，用85％乙醇浸泡过夜，放入中药多功能提取罐中，控制温度65℃，提取2小时，提取2次，合并提取液，回收乙醇至尽，得到浸膏；取浸膏，用水溶解完全后，用0.22um微孔滤膜进行过滤，滤液先用截取分子量2000的中空纤维柱进行超滤，超滤至原体积的1/3，加热水至原体积，保持温度为55℃，超滤时透过液弃去，循环液超滤4次，最后一次浓缩至密度为1.40，得到浓缩液；取浓缩液上样到经过磷酸一氢钠-磷酸二氢钠缓冲液平衡过的弱阴离子交换柱，穿透液弃去，用0-1.0mol/l的氯化钠梯度洗脱，洗脱液浓缩得到水蛭醇提有效部位17.36克，与药用辅料蔗糖298.25克混合，取备用原料，用注射用水溶解完全，进行无菌过滤，注入无菌处理的托盘中，将托盘放入冻干机中，进行冷冻干燥，冻干机控制温度为零下45℃，压力为0.4*105Pa，冷冻干燥后，将干燥无菌原料放入无菌处理的粉碎机中进行粉碎，将粉碎后的原料在100级操作间，进行分装，制备成一种抗血栓疾病的中药制剂。
权利要求
1.一种抗血栓疾病的中药制剂，其特征在于该中药制剂是由水蛭有效部位4.5重量份-9.5重量份，冻干粉针剂药用辅料90.5重量份-95.5重量份组成的。
2.一种抗血栓疾病的中药制剂的制备方法，其特征包括以下步骤(1)取水蛭，用70％-90％乙醇浸泡过夜，放入中药多功能提取罐中，控制温度40℃-70℃，提取1-3小时，提取2-4次，合并提取液，回收乙醇至尽，得到浸膏；(2)取浸膏，用水溶解完全后，用0.1-0.65um微孔滤膜进行过滤，滤液先用截取分子量1000-3000的中空纤维柱进行超滤，超滤至原体积的1/2-1/3，加热水至原体积，保持温度为40℃-60℃，超滤时透过液弃去，循环液超滤3-5次，最后一次浓缩至密度为1.10-1.50，得到浓缩液；(3)取浓缩液上样到经过缓冲液平衡的阴离子交换柱，穿透液弃去，用0-1.0mol/l的氯化钠梯度洗脱，洗脱液浓缩备用即为水蛭的有效部位；(4)取备用原料，按比例加入冻干粉针剂药用辅料，用注射用水溶解完全，进行无菌过滤，注入无菌处理的托盘中；(5)将托盘放入冻干机中，进行冷冻干燥；(6)冷冻干燥后，将干燥无菌原料放入无菌处理的粉碎机中进行粉碎；(7)将粉碎后的原料在100级操作间，进行分装，制备成一种抗血栓疾病的中药制剂。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其中阴离子交换树脂为弱阴离子或强阴离子交换树脂。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其中缓冲液为Tris-HCl溶液或磷酸一氢钠—磷酸二氢钠溶液中的的一种。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其中冻干机控制温度0℃--70℃，压力为1.01×105Pa-0.4×105Pa。
6.根据权利要求1或2所述的中药制剂，其中冻干粉针剂的药用辅料为甘露醇、蔗糖或乳糖中的一种或二种的混合物。
全文摘要
本发明公开了一种抗血栓疾病的中药制剂及其制备方法，其特征在于它是由单味中药水蛭的有效部位和药用辅料组成，采用醇提方法提取水蛭，得到水蛭醇提有效部位粗品；采用超滤法和离子交换法纯化得到水蛭醇提有效部位精制品。水蛭醇提有效部位精制品加入药用辅料制备成一种抗血栓疾病的中药冻干粉针制剂，药理实验结果表明，该粉针剂具有很好的抗血栓作用，与市售同类品种比较具有更强的药理作用。
文档编号A61P9/00GK1559474SQ200410006490
公开日2005年1月5日 申请日期2004年3月10日 优先权日2004年3月10日
发明者张正生 申请人:张正生