专利名称：一种利用植物油佐剂制备动物病毒性、细菌性疫苗的方法
技术领域：
本发明涉及利用植物油佐剂生产疫苗的方法，特别是利用植物油佐剂制备动物病毒性、细菌性疫苗的方法。
背景技术：
佐剂作为一种能协助抗原提升免疫反应的物质，可以帮助抗原在注射部位缓慢释放，以增加免疫刺激的效果。在现有的技术中，矿物油佐剂在动物疫苗的应用中较为普遍，但在近年来在动物矿物油佐剂疫苗的免疫预防中，由于时常出现免疫反应过大，引起部分注苗动物数天高热、减食、废食、流产及生产性能下降，如奶畜产奶量减少，青年动物增重减慢等不良反应，尤其是极少数动物因发生过敏反应而导致死亡，不利于畜牧业的发展。另外，矿物油(白油)是一种利用化学方法从原油中提取的物质，把其作为疫苗佐剂注入动物体内，长期缓慢代谢，甚至极少量成分滞留在局部，既影响动物肉品质量，又影响人体健康。因此研究一种新型佐剂，使其既不影响疫苗的免疫效力，又能降低疫苗的不良反应，同时又有利于生产安全的肉食品，则是摆在我们面前的一个重要课题。
发明的内容本发明的目的在于提供一种利用植物油佐剂制备动物病毒性、细菌性疫苗的方法，以解决上述存在的问题，从而获得既不影响疫苗的免疫效力，又能降低疫苗的不良反应，同时又有利于生产安全的肉食品的动物疫苗。
本发明的目的是按如下技术方案实现的。本发明利用植物油佐剂制备动物病毒性、细菌性疫苗的方法，其特征在于它包括以下步骤(1)制作抗原剂，将制苗毒(菌)株用敏感细胞或培养基复制，灭活后，获得抗原；并将所述的抗原制成抗原剂；可按本行业常规方法制备。
(2)制作植物油佐剂；(3)混匀，将所述的抗原剂按比例与所述的植物油佐剂混合，均质，制成疫苗。
在步骤(1)中，所述的制苗毒(菌)株为下列中的任一或二种O型口蹄疫病毒Akesu/58毒株、OMIII毒株、以及OZ毒株、狂犬病病毒-CVS毒株、传染性胃肠炎(TEGV-TS株)、流行性腹泻病毒(PEDV-QD株)、亚型禽流感毒株H5N1、亚型禽流感毒株H9N2、鸡白痢沙门氏菌；此外，还可采用其他的动物病毒性、细菌性疫苗。
所述的敏感细胞为下列中的任一种BHK-21细胞系和IB-RS-2细胞、Vero细胞、PK-细胞、293细胞、ST-细胞、Hela-细胞；还可采用其他的敏感细胞。
所述的培养基为下列中的任一种LB、硫代硫酸钠琼脂、普通肉汤、普通琼脂平皿。还可采用其他的培养基。
在步骤(1)中，所述的抗原剂为抗原与灭菌的吐温-80混合物；在步骤(2)中，所述的植物油佐剂为植物油与司盘-80的混合物。
所述的植物油为下列中的任一种菜籽油、豆油、花生油、蓖麻油、胡麻油等植物油。还可采用其他的对人畜无害的食用油。
在所述的步骤(1)中，将所述的抗原制成抗原剂为把抗原与灭菌的吐温-80按10-40∶1的比例混合，制成抗原剂；在所述的步骤(2)中，制作植物油佐剂为将植物油与司盘-80按5-15∶1的比例混合，经消毒，制成植物油佐剂；在所述的步骤(3)中，所述的抗原剂按比例与所述的植物油佐剂混合为将所述的抗原剂与植物油佐剂按0.5-1.5∶1的比例混合，搅拌，形成均匀的初乳；所述的均质为用高压均质机将所述的初乳进行高速剪切和乳化均质。
在所述的步骤(3)中，所述的抗原剂与植物油佐剂混合时，先将部分的抗原剂加到全部植物油佐剂中，边加边搅拌，使其形成均匀的初乳；再将其余的抗原剂加入到所述的均匀的初乳中。
本发明采用植物油作为佐剂的组分，制成植物油佐剂。植物油是从植物籽实中提取的一种天然物质，把其作为佐剂注入动物体内既不影响动物性食品质量，又不影响食用该动物产品的人的健康，同时又具有矿物油佐剂的性能①它能增加抗原的表面面积，易为巨噬细胞所吞噬；②延长抗原在体内的存留期，增加与免疫细胞接触的机遇；③诱发抗原注射部位及其局部淋巴结的炎症反应，有利于刺激免疫细胞的增殖作用。因此，植物油佐剂，在疫苗的开发过程中，必将是矿物油佐剂的最佳替代品。
综上所述，本发明采用新型佐剂来制备动物病毒性、细菌性疫苗，使其应用时，既不影响疫苗的免疫效力，又能降低疫苗的不良反应，同时又有利于生产安全的食品肉类；与现有技术相比，具有明显的优点。本发明适于各种动物病毒性、细菌性疫苗使用。
具体实施例方式
实施例1本实施例为利用植物油佐剂制备的动物病毒性亚型禽流感H5N1和H9N2植物油佐剂灭活混合疫苗，其制备方法包括以下步骤(1)制作抗原剂，将制苗毒株用敏感细胞或培养基复制，灭活后，获得抗原并将所述的抗原制成抗原剂；其中1)毒株制苗用流行毒株H5N1和H9N2(按1∶1配比)，制苗毒株的生物学特性鸡胚半数感染量(EID50)为8.25log2/ml，即种毒的病毒含量为每ml含有8.25个EID50；鸡胚平均死亡时间(MDT)为尿囊腔接种0.1ml后72小时；血凝(HA)滴度即收获的鸡胚尿囊液灭活前对1％SPF鸡红细胞的HA≥8log2；纯净程度为无任何外源病毒和细菌污染。
2)病毒的复制和灭活尿囊腔接种9-11日龄的SPF鸡胚0.1ml，72小时HA试验检测鸡胚尿囊液的HA滴度，收获HA≥8log2的鸡胚尿囊液，加入甲醛溶液，37℃灭活，形成抗原。
灭活后的抗原接种适当的培养基(普通琼脂平皿)，进行细菌、霉菌和支原体检验，灭活后的尿囊液0.1ml经尿囊腔接种9-11日龄鸡胚，连续盲传3代。
3)把灭活后的尿囊液与高压灭菌的吐温-80按25∶1的比例混合制成抗原剂，(2)制作植物油佐剂；将植物油(豆油)与司盘-80按10∶1的比例混合乳化，经1.5Mpa，30min高压消毒，制成植物油佐剂；(3)将所述的抗原剂按比例与所述的植物油佐剂混合，均质，制成疫苗。将所述的抗原剂与植物油佐剂按1∶1的比例混合，本实施例中，先将40-60％灭活后的抗原剂加到植物油佐剂中，边加边搅拌，使其形成均匀的初乳，然后在制成油包水乳剂的基础上，再其余的抗原剂加到植物油佐剂中，进一步乳化。然后再经高压均质机高速的剪切和乳化，制成外观为乳白色的疫苗。
实施例2本实施例为利用植物油佐剂制备的猪O型口蹄疫灭活疫苗，其制备方法包括以下步骤(1)制作抗原剂，将制苗毒株用敏感细胞或培养基复制，灭活后，获得抗原并将所述的抗原制成抗原剂；其中1)毒株制苗毒株为猪O型口蹄疫病毒OZ毒株制苗毒株的生物学特性制苗毒株应符合O型口蹄疫病毒特性。乳鼠毒用O型口蹄疫病猪水泡皮毒通过6-8日龄喂乳小白鼠，4-5代的乳鼠肌肉毒，以PH7.6-7.8的磷酸缓冲液稀释，颈背部皮下注射3-4日龄乳鼠0.2ml/只，每个滴度不少于4只，观察5天判定，其LD50不得低于8.5。
制苗毒种复壮细胞毒种应复壮不少于3代，应符合标准。连续生产的代数不得超过14代。纯净程度为无任何外源病毒和细菌污染。
2)病毒的复制和灭活用3-14代的制苗细胞毒种，接种已形成良好单层的BHK-21细胞系和IB-RS-2细胞，收取细胞毒液。经无菌检验和毒价测定符合标准的进行灭活。用灭活剂BEI按一定的量加到除去细胞碎片的毒液中，升温至30℃，灭活28小时，灭活终止后，立即用除菌的硫代硫酸钠溶液组断，形成抗原，放入5℃的条件下保存。
灭活后的抗原接种肉汤，进行细菌、霉菌和支原体检验。灭活后的抗原颈部皮下注射3-4日龄乳鼠4-5只，0.2ml/只，，设健康空白对照鼠2只，观察7天，全部乳鼠均不得出现口蹄疫症状和发病死亡。
3)把灭活后的抗原与高压灭菌的吐温-80按25∶1的比例混合制成抗原剂。
(2)制作植物油佐剂；将植物油(豆油)与司盘-80按10∶1的比例混合乳化，经1.5Mpa，30min高压消毒，制成植物油佐剂；(3)将所述的抗原剂按比例与所述的植物油佐剂混合，均质，制成疫苗。
将所述的抗原剂与植物油佐剂按1∶1的比例混合，本实施例中，先将40-60％灭活后的抗原剂加到植物油佐剂中，边加边搅拌，使其形成均匀的初乳，然后在制成油包水乳剂的基础上，再其余的抗原剂加到植物油佐剂中，进一步乳化。然后再经高压均质机高速的剪切和乳化，制成外观为乳白色的疫苗。
实施例3
本实施例为利用植物油佐剂制备的牛O型口蹄疫灭活疫苗，其制备方法包括以下步骤(1)制作抗原剂，将制苗毒(菌)株用敏感细胞或培养基复制，灭活后，获得抗原并将所述的抗原制成抗原剂；其中1)毒株制苗毒株为牛O型口蹄疫病毒Akesu/58毒株制苗毒株的生物学特性制苗毒株应符合O型口蹄疫病毒特性。将毒种用PBS(磷酸盐缓冲液)进行1∶1000倍稀释，上醇划痕和舌面涂擦无口蹄疫O型血清抗体的2-4岁黄牛2ml，于24-48小时内，试验牛应出现典型的口蹄疫次发性病损。
制苗毒种复壮细胞毒种应复壮不少于3代，应符合标准。连续生产的代数不得超过14代。纯净程度为无任何外源病毒和细菌污染。
2)病毒的复制和灭活用3-14代的制苗细胞毒种，接种已形成良好单层的BHK-21细胞系和IB-RS-2细胞，收取细胞毒液。经无菌检验和毒价测定符合标准的进行灭活。用灭活剂BEI按一定的量加到除去细胞碎片的毒液中，升温至30℃，灭活28小时，灭活终止后，立即用除菌的硫代硫酸钠溶液组断，形成抗原，放入5℃的条件下保存。灭活后的抗原接种普通琼脂平皿，进行细菌、霉菌和支原体检验。灭活后的抗原颈部皮下注射3-4日龄乳鼠4-5只，0.2ml/只，，设健康空白对照鼠2只，观察7天，全部乳鼠均不得出现口蹄疫症状和发病死亡。
3)把灭活后的抗原与高压灭菌的吐温-80按25∶1的比例混合制成抗原剂，(2)制作植物油佐剂；将植物油(豆油)与司盘-80按10∶1的比例混合乳化，经1.5Mpa，30min高压消毒，制成植物油佐剂；(3)将所述的抗原剂按比例与所述的植物油佐剂混合，均质，制成疫苗。
将所述的抗原剂与植物油佐剂按1∶1的比例混合，本实施例中，先将40-60％灭活后的抗原剂加到植物油佐剂中，边加边搅拌，使其形成均匀的初乳，然后在制成油包水乳剂的基础上，再其余的抗原剂加到植物油佐剂中，进一步乳化。然后再经高压均质机高速的剪切和乳化，制成外观为乳白色的疫苗。
实施例4本实施例为利用植物油佐剂制备的猪O型口蹄疫灭活疫苗(浓缩型)，其制备方法包括以下步骤(1)制作抗原剂，将制苗毒(菌)株用敏感细胞或培养基复制，灭活后，获得抗原并将所述的抗原制成抗原剂；其中1)毒株制苗毒株为猪O型口蹄疫病毒OZ毒株制苗毒株的生物学特性制苗毒株应符合O型口蹄疫病毒特性。乳鼠毒用O型口蹄疫病猪水泡皮毒通过6-8日龄喂乳小白鼠，4-5代的乳鼠肌肉毒，以PH7.6-7.8的磷酸缓冲液稀释，颈背部皮下注射3-4日龄乳鼠0.2ml/只，每个滴度不少于4只，观察5天判定，其LD50不得低于8.5。
制苗毒种复壮细胞毒种应复壮不少于3代，应符合标准。连续生产的代数不得超过14代。纯净程度为无任何外源病毒和细菌污染。
2)病毒的复制和灭活用3-14代的制苗细胞毒种，接种已形成良好单层的BHK-21细胞系和IB-RS-2细胞，病毒培养液的加入量按每平方厘米细胞单层0.1-0.3ml，收取细胞毒液。经无菌检验和毒价测定符合标准的进行灭活。用灭活剂BEI按一定的量加到除去细胞碎片的毒液中，升温至30℃，灭活28小时，灭活终止后，立即用除菌的硫代硫酸钠溶液组断，形成抗原，放入5℃的条件下保存。
灭活后的抗原接种适当的培养基(肉汤)，进行细菌、霉菌和支原体检验。灭活后的抗原颈部皮下注射3-4日龄乳鼠4-5只，0.2ml/只，，设健康空白对照鼠2只，观察7天，全部乳鼠均不得出现口蹄疫症状和发病死亡。
3)把灭活后的抗原与高压灭菌的吐温-80按25∶1的比例混合制成抗原剂。
(2)制作植物油佐剂；将植物油(花生油)与司盘-80按10∶1的比例混合乳化，经1.5Mpa，30min高压消毒，制成植物油佐剂；(3)将所述的抗原剂按比例与所述的植物油佐剂混合，均质，制成疫苗。将所述的抗原剂与植物油佐剂按1∶1的比例混合，本实施例中，先将50％灭活后的抗原剂加到植物油佐剂中，边加边搅拌，使其形成均匀的初乳，然后在制成油包水乳剂的基础上，再其余的抗原剂加到植物油佐剂中，进一步乳化。然后再经高压均质机高速的剪切和乳化，制成外观为乳白色的疫苗。
权利要求
1.一种利用植物油佐剂制备动物病毒性、细菌性疫苗的方法，其特征在于它包括以下步骤(1)制作抗原剂，将制苗毒(菌)株用敏感细胞或培养基复制，灭活后，获得抗原；并将所述的抗原制成抗原剂；(2)制作植物油佐剂；(3)混匀，将所述的抗原剂按比例与所述的植物油佐剂混合，均质，制成疫苗。
2.根据权利要求1所述的利用植物油佐剂生产动物病毒性、细菌性疫苗的方法，其特征在于在所述的步骤(1)中，所述的制苗毒(菌)株为下列中的任一或二种O型口蹄疫病毒Akesu/58毒株、OMIII毒株、以及OZ毒株、狂犬病病毒-CVS毒株、传染性胃肠炎(TEGV-TS株)、流行性腹泻病毒(PEDV-QD株)、亚型禽流感H5N1毒株、亚型禽流感H9N2毒株、鸡白痢沙门氏菌；所述的敏感细胞为下列中的任一种BHK-21细胞系和IB-RS-2细胞、Vero细胞、PK-细胞、293细胞、ST-细胞、Hela-细胞；所述的培养基为下列中的任一种LB、硫代硫酸钠琼脂、普通肉汤、普通琼脂平皿。
3.根据权利要求1所述的利用植物油佐剂生产动物病毒性、细菌性疫苗的方法，其特征在于在所述的步骤(1)中，所述的抗原剂为抗原与灭菌的吐温-80混合物；在所述的步骤(2)中，所述的植物油佐剂为植物油与司盘-80的混合物。
4.根据权利要求3所述的利用植物油佐剂生产动物病毒性、细菌性疫苗的方法，其特征在于所述的植物油为下列中的任一种菜籽油、豆油、花生油、蓖麻油、胡麻油等植物油。
5.根据权利要求3所述的利用植物油佐剂生产动物病毒性、细菌性疫苗的方法，其特征在于在所述的步骤(1)中，将所述的抗原制成抗原剂为把抗原与灭菌的吐温-80按10-40∶1的比例混合，制成抗原剂；在所述的步骤(2)中，制作植物油佐剂为将植物油与司盘-80按5-15∶1的比例混合，经消毒，制成植物油佐剂；在所述的步骤(3)中，所述的抗原剂按比例与所述的植物油佐剂混合为将所述的抗原剂与植物油佐剂按0.5-1.5∶1的比例混合，搅拌，形成均匀的初乳；所述的均质为用高压均质机将所述的初乳进行高速剪切和乳化均质。
6.根据权利要求5所述的利用植物油佐剂生产动物病毒性、细菌性疫苗的方法，其特征在于在所述的步骤(3)中，所述的抗原剂与植物油佐剂混合时，先将部分所述的抗原剂加到全部所述的植物油佐剂中，边加边搅拌，使其形成均匀的初乳；再将其余所述的抗原剂加入到所述的均匀的初乳中。
全文摘要
一种利用植物油佐剂制备动物病毒性、细菌性疫苗的方法，其特征在于它包括以下步骤(1)制作抗原剂，将制苗毒(菌)株用敏感细胞或培养基复制，灭活后，获得抗原；并将所述的抗原制成抗原剂；(2)制作植物油佐剂；(3)混匀，将所述的抗原剂按比例与所述的植物油佐剂混合，均质，制成疫苗。所述的抗原剂为抗原与灭菌的吐温－80混合物；所述的植物油佐剂为植物油与司盘－80的混合物。本发明采用新型佐剂来制备动物病毒性、细菌性疫苗，使其应用时，既不影响疫苗的免疫效力，又能降低疫苗的不良反应，同时又有利于生产安全的食品肉类；与现有技术相比，具有明显的优点。本发明适于各种动物病毒性、细菌性疫苗使用。
文档编号A61K39/39GK1669584SQ20041000892
公开日2005年9月21日 申请日期2004年3月15日 优先权日2004年3月15日
发明者柳纪省, 殷相平, 黄银君, 白银梅, 牟克斌, 李宝玉, 杨联, 李志勇, 王辉, 兰喜, 张兴旺 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所