专利名称：Sars冠状病毒全病毒疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子流行病学领域，具体是针对严重急性呼吸综合征病毒的疫苗及其制备方法。
背景技术：
2003年我国和世界上许多国家遭到了一次大规模的非典型肺炎(Atypicalpneumonias)的侵袭，由非典型肺炎引起的严重急性呼吸综合征(Severe AcuteRespiratory Sydrome，SARS)已经在22个国家和地区发生。世界卫生组织(WorldHealth Organization，WHO)在疫情发生后迅速建立起由全球10个国家的13个实验室组成的协作研究和监测网络。4月16日，WHO正式确认SARS的病原体是一种新型冠状病毒，这是一种单链RNA病毒。
全球已有8000多例非典型肺炎患者，在某些发病区其死亡率达到15％，给人民群众带来了极大的恐慌。医务工作者和生物学领域的研究人员及时开展SARS冠状病毒的病原学以及预防、诊断和治疗的研究，并且对于该病毒的变异过程和各阶段的毒性和传染力的特点都有了一定的了解。但是目前对于SARS病毒疫苗的工作仍然没有显著的进展。
目前报道的疫苗候选株，一般都是来自于SARS危重病人的毒株。由于SARS病毒的危险性强，实验条件要求高，以及在人身上实验的困难，SARS病毒的疫苗很难研究开发。
虽然还有人开发预防和治疗SARS的DNA疫苗和基因工程亚单位疫苗，但是历史经验表明，只要安全性得以保证，全病毒疫苗一直是一种非常有效的疫苗。因此开发全病毒疫苗一直是抗SARS疫苗的研究重点。
然而，人们在体外培养中发现，流行病中晚期的SARS病毒较容易在体外培养从而获得病毒颗粒，而来自于果子狸的SARS病毒颗粒较难在体外培养，因此在制备灭活疫苗和减毒疫苗时，大多采用中晚期的SARS病毒株。
目前已经尝试的用于制备疫苗的SARS病毒株包括BJ-01，02和03(GenBank登录号AY278488、AY278487和AY278490)。国外可能正在尝试的是与TOR2(GenBank登录号AY27419)同类的毒株。由于这些病毒都是中晚期的SARS病毒，毒性强，传染能力强，具有非常高的危险性。而且由于实验动物猴子本身对SARS病毒并不敏感，虽然疫苗在猴体内产生的反应很小，但不等于对中晚期SARS全病毒疫苗的安全性进行了有效的验证。
因此，本领域迫切需要开发能够既可有效产生抗SARS病毒免疫力，又具有安全性的疫苗，尤其是全病毒疫苗。
发明内容
本发明的目的就是提供一种既可有效产生抗SARS病毒免疫力，又具有安全性的SARS全病毒疫苗。
因此，在本发明的一个方面，提供了一种疫苗组合物，其特征在于，该疫苗组合物含有早期SARS病毒的全病毒颗粒和生理学上可接受的载体。
在该方面的一个优选例中，该SARS病毒的核苷酸序列中具有至少一个选自下组的核苷酸减毒变异SEQ ID NO1中9404→C、17564→G、21721→A、22222→C、23823→G、27827→C及其组合。
在该方面的另一个优选例中，该SARS病毒的蛋白具有氨基酸突变，所述的氨基酸突变对应于的选自下组的核苷酸减毒变异SEQ ID NO1中9404→C、17564→G、21721→A、22222→C、23823→G、27827→C及其组合。
在该方面的另一个优选例中，该SARS病毒是GZ-02病毒株，具有GenBank登录号为AY390556的核苷酸序列。
在本发明的另一个优选例中，该SARS病毒是灭活的。
在本发明的还有一个优选例中，该疫苗组合物所含的生物学上可接受的载体是佐剂。
在本发明的另一个方面，提供了上述疫苗组合物用于制备抗SARS的抗体的用途。
在本发明的还有一个方面，提供了上述疫苗组合物用于制备预防SARS病毒感染的药物的用途
图1描述了60种SARS冠状病毒基因组序列的邻近关系，显示了各病毒株的变异来源的树状图。从下至上为早期、中期、晚期的变异。
具体实施例方式
本发明人经过深入研究发现，虽然中晚期的SARS易于培养从而便于获得大量病毒颗粒，但是其毒性太强，传染能力强，具有非常高的危险性，因此安全性难以得到保障。相反，果子狸SARS病毒虽然体外培养较为困难，但是由于毒性较低，传染能力较低，因此预期安全性好。人类早期SARS病毒，可以体外培养，但是，毒性和传染力较弱，因此，是疫苗的较好的候选毒株。此外，研究还证实了，早期SARS全病毒足以产生抗早、中、晚等各个时期的SARS的免疫力，因此用早期SARS病毒制得的全病毒疫苗具有非常好的安全性和保护性免疫力。
本发明中使用的具有减毒突变的SARS病毒(GZ02)序列(Genbank的登录号AY390556)是申请人从广州分离到的SARS病毒早期病毒株，其基因序列保藏在GenBank，具有登录号AY390556。与加拿大分离到的SARS病毒株TOR2的基因序列(Genbank的登录号AY274119)相比，具有一系列突变差异，可能与毒性或传染力相关，特别是选自9404→C、17564→G、21721→A、22222→C、23823→G、27827→C及其组合的减毒突变。
从流行病学分析可见，该突变属于SARS早期的突变，在原始的果子狸序列(SZ16，GenBank登录号AY304488)以及早期病人(GZ02，AY390556)分离到的病毒序列中都具有这些突变。根据临床观察，GZ02这种早期的SARS病毒在人体内毒性小，感染力弱。虽然该GZ02株分离得自一位老年患者的尸检材料，但是，其他早期病人均具有同类的突变，且病情较弱。这表明，用早期病毒进行免疫，会比现在使用的中晚期病毒具有更好的保护性免疫力和更低的毒性。
在本发明之前，有三个依据说明本领域技术人员使用的是中晚期病毒制备疫苗。首先，从流行病史和地域上可见，该地域在SARS传播的路线上已经属于中晚期，因此，这些地区的研究人员所能够获得的SARS病毒的来源是有限的，鉴于运输上的危险性，以及当时并未确定SARS病毒的临床基因变异，这些地域的研究人员只能用当地收集的病毒进行研究。图1是SARS病毒各病毒株变异的树状图，其中可见中晚期的病毒与早期病毒相比经过了多次变异。而且，其中的基因序列也有了很大的不同，下文的表1显示了几种有代表性的SARS病毒核苷酸序列上几个主要位点的变化。
表1 SARS病毒单核苷酸变异的重要位点
其次，如发明背景中所述，中期和晚期的病毒由于感染效力强，在Vero细胞内复制增殖的能力强，因此易于培养。虽然在研究中具有一定的危险性，这依然是最快获得大量病毒颗粒的有效途径。
第三，果子狸和早期的病毒由于感染能力弱，难于培养，因此收集困难。使得研究人员暂时不考虑用其制备疫苗。
本发明的发明人通过对中国SARS流行病学的研究，发现早期病人的SARS病毒分离株与果子狸的冠状病毒非常相似，而且通过培养收集了足以制备疫苗的病毒株，克服了原始的果子狸冠状病毒在目前尚不能培养的困难。将这些减毒的病毒(对于中晚期的SARS病毒来说，该病毒已经属于减毒形式)制备成疫苗，或优选使用其灭活形式制备疫苗，用于免疫动物，产生抗血清。这些抗血清能够和中晚期的SARS病毒结合产生中和反应，说明产生了保护性免疫力。
与感染人和动物宿主的中晚期病毒，例如TOR2和BJ01相比，本发明的早期GZ02减毒病毒表现出毒力显著减弱。减毒程度达到在大多数接受免疫的个体中仅出现轻微的感染症状，传染性非常小并能引发所需的免疫应答类型。
可用该SARS病毒来配制疫苗。为此，将减毒病毒调节到合适的浓度并用合适的疫苗佐剂、稀释剂或载体配制。可将生理学上可接受的介质用作载体。它们包括但不限于合适的等渗液、磷酸盐缓冲液等等。
佐剂可用多种方法分类(Cox和Coulter，1997；Gupta和Siber，1995；Hughes和Babiuk，1994)。广义而言有两大类，颗粒状或非颗粒状佐剂。在颗粒状佐剂中有铝盐、钙盐、油包水乳液、水包油乳液、免疫刺激复合物(ISCOM)和ISCOM基质、脂质体、纳米和微米颗粒、蛋白质体、病毒颗粒、硬酯酰酪氨酸和-菊粉。非颗粒佐剂包括胞壁酰二肽(MDP)和衍生物(如苏氨酰MDP、胞壁肽等)、非离子嵌段共聚物、皂苷(如Quil A和QS21)、脂类A或其衍生物4′一磷酯酰脂A(MPL)、二霉菌酸海藻糖脂(TDM)、各种细胞因子(包括γ-干扰素和白细胞介素2或4)、糖类聚合物、衍生的多糖(如二乙基氨基乙基葡萄糖)等。现代佐剂制剂常常设计成各种成分的组合以产生最大的特异性免疫应答。
在本发明的一个实施方案中，使用减毒病毒或灭活疫苗制备疫苗组合物。减毒病毒可与冷冻防护添加剂或稳定剂混合，例如蛋白质(如白蛋白、明胶)、糖(如蔗糖、乳糖、山梨糖醇)、氨基酸(如谷氨酸钠)、盐水或其它保护剂。将这种混合物维持在液体状态，或然后干燥或冻干以便运输和保存，在使用前再临时与水混合。
包含本发明减毒病毒的制剂可以用来免疫人或动物，以诱导抵抗减毒病毒的相应野生型病毒感染的保护力。
为了激发免疫应答，必须给予个体以合适次数的足量疫苗。本领域熟练技术人员能容易地确定该用量和剂次。给药可以通过任一常规有效方式，例如皮下注射，鼻内、肠胃外、经口或局部施用于粘膜表面，例如通过气溶胶喷雾。较佳的给药方式是肠胃外给药。
在优选例中，可对早期SARS病毒进行进一步灭活后，制备灭活疫苗。目前对病毒灭活的方法有辐照、臭氧、甲醛灭活，高温灭活等。这些方法都是本领域技术人员熟知的。
此外，本发明还提供了用早期SARS全病毒制备抗SARS的抗体的方法。例如，可以用SARS全病毒免疫动物，然后获得抗血清。此外，还可将免疫动物的(如猴)的脾细胞与其它细胞融合，形成杂交瘤，从而制备SARS病毒的单克隆抗体。
为使更好地理解本发明，给出以下实施例。实施例只是为了描述本发明，不能将其理解成限制本发明的范围。
实施例标准分子生物学技术按照Sambrook等，Molecular Cloning，A LaboratoryMannual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，1989使用。
实施例1用SARS早期病毒制备疫苗本实施例使用的SARS早期病毒为GZ-02病毒株，其序列保藏在GenBank，登录号为AY39556。该病毒株购自中国疾病预防控制中心(CDC)。
该病毒株与TOR2相比，其核苷酸序列主要具有六个减毒突变9404→C、17564→G、21721→A、22222→C、23823→G、27827→C。
在临床上，感染该病毒株的病人表现症状轻微。同时，传染力低。因此，该病毒具有作为减毒疫苗的良好特性。
将该病毒株在Vero中培养，取上清液，通过免疫亲和层析技术获得纯化的病毒。将其与常规的佐剂配制成疫苗。
实施例2用SARS早期病毒疫苗免疫动物的评价按照常规免疫方法用实施例1制备的疫苗免疫了恒河猴。
实验所采用的动物是恒河猴，恒河猴实验在哈尔滨畜牧兽医研究所进行。
将实施例1配制的疫苗静脉注射到恒河猴体内，注射次数和剂量由本领域技术人员按照常规而定。免疫过程中，恒河猴没有明显的病毒攻击症状，如发热、肺部感染、咳嗽等症状。免疫结束后，对每只恒河猴取血，血清分析抗体应答。用中晚期的病毒颗粒，例如TOR2和BJ-01病毒(购自中国疾病预防控制中心)作为包被抗原，以间接ELISA试验检测了能与它们结合的抗体。用蚀斑减少中和试验(PRNT)测试了中和抗体，测定与对照相比，导致蚀斑数量至少减少80％时的最高血清稀释度。
ELISA实验的结果表明，用GZ-02全病毒产生的抗血清能够和中晚期的TOR2和BJ-01病毒的S蛋白产生特异性结合。
蚀斑减少中和试验表明，大量的SARS中晚期病毒被中和。抗血清中抗SARS病毒抗体的滴度非常高。
用TOR2和BJ-01病毒攻击经免疫后的恒河猴，均无SARS感染症状。X光片检测未检测出肺部感染，基本上无发热、咳嗽症状。
从上述试验可见，用早期SARS病毒免疫恒河猴具有良好的免疫原性和安全性，能够产生高保护性免疫应答。
还用试验用果子狸进行了相同的实验，实验用果子狸也来自哈尔滨畜牧兽医研究所。获得了相同的实验结果。
因此，我们认为，用早期SARS病毒能够产生良好的免疫原性和安全性，以及高保护性免疫应答，有良好的应用前景。
序列表<110>国家人类基因组南方研究中心广东省疾病预防控制中心<120>SARS冠状病毒全病毒疫苗<130>040486<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>29751<212>DNA<213>SARS病毒(SARS virus)<400>1atattaggtt tttacctacc caggaaaagc caaccaacct cgatctcttg tagatctgtt 60ctctaaacga actttaaaat ctgtgtagct gtcgctcggc tgcatgccta gtgcacctac120gcagtataaa caataataaa ttttactgtc gttgacaaga aacgagtaac tcgtccctct180tctgcagact gcttacggtt tcgtccgtgt tgcagtcgat catcagcata cctaggtttc240gtccgggtgt gaccgaaagg taagatggag agccttgttc ttggtgtcaa cgagaaaaca300cacgtccaac tcagtttgcc tgtccttcag gttagagacg tgctagtgcg tggcttcggg360gactctgtgg aagaggccct atcggaggca cgtgaacacc tcaaaaatgg cacttgtggt420ctagtagagc tggaaaaagg cgtactgccc cagcttgaac agccctatgt gttcattaaa480cgttctgatg ccttaagcac caatcacggc cacaaggtcg ttgagctggt tgcagaaatg540gacggcattc agtacggtcg tagcggtata acactgggag tactcgtgcc acatgtgggc600gaaaccccaa ttgcataccg caatgttctt cttcgtaaga acggtaataa gggagccggt660ggtcatagct atggcatcga tctaaagtct tatgacttag gtgacgagct tggcactgat720cccattgaag attatgaaca aaactggaac actaagcatg gcagtggtgc actccgtgaa780ctcactcgtg agctcaatgg aggtgcagtc actcgctatg tcgacaacaa tttctgtggc840ccagatgggt accctcttga ttgcatcaaa gattttctcg cacgcgcggg caagtcaatg900tgcactcttt ccgaacaact tgattacatc gagtcgaaga gaggtgtcta ctgctgccgt960gaccatgagc atgaaattgc ctggttcact gagcgctctg ataagagcta cgagcaccag 1020acacccttcg aaattaagag tgccaagaaa tttgacactt tcaaagggga atgcccaaag 1080tttgtgtttc ctcttaactc aaaagtcaaa gtcattcaac cacgtgttga aaagaaaaag 1140actgagggtt tcatggggcg tatacgctct gtgtaccctg ttgcatctcc acaggagtgt 1200aacaatatgc acttgtctac cttgatgaaa tgtaatcatt gcgatgaagt ttcatggcag 1260acgtgcgact ttctgaaagc cacttgtgaa cattgtggca ctgaaaattt agttattgaa 1320ggacctacta catgtgggta cctacctact aatgctgtag tgaaaatgcc atgtcctgcc 1380tgtcaagacc cagagattgg acctgagcat agtgttgcag attatcacaa ccactcaaac 1440attgaaactc gactccgcaa gggaggtagg actagatgtt ttggaggctg tgtgtttgcc 1500tatgttggct gctataataa gcgtgcctac tgggttcctc gtgctagtgc tgatattggc 1560tcaggccata ctggcattac tggtgacaat gtggagacct tgaatgagga tctccttgag 1620atactgagtc gtgaacgtgt taacattaac attgttggcg attttcattt gaatgaagag 1680gttgccatca ttttggcatc tttctctgct tctacaagtg cctttattga cactataaag 1740agtcttgatt acaagtcttt caaaaccatt gttgagtcct gcggtaacta taaagttacc 1800aagggaaagc ccgtaaaagg tgcttggaac attggacaac agagatcagt tttaacacca 1860ctgtgtggtt ttccctcaca ggctgctggt gttatcagat caatttttgc gcgcacactt 1920gatgcagcaa accactcaat tcctgatttg caaagagcag ctgtcaccat acttgatggt 1980atttctgaac agtcattacg tcttgtcgac gccatggttt atacttcaga cctgctcacc 2040aacagtgtca ttattatggc atatgtaact ggtggtcttg tacaacagac ttctcagtgg 2100ttgtctaatc ttttgggcac tactgttgaa aaactcaggc ctatctttga atggattgag 2160gcgaaactta gtgcaggagt tgaatttctc aaggatgctt gggagattct caaatttctc 2220attacaggtg tttttgacat cgtcaagggt caaatacagg ttgcttcaga taacatcaag 2280gattgtgtaa aatgcttcat tgatgttgtt aacaaggcac tcgaaatgtg cattgatcaa 2340gtcactatcg ctggcgcaaa gttgcgatca ctcaacttag gtgaagtctt catcgctcaa 2400
agcaagggac tttaccgtca gtgtatacgt ggcaaggagc agctgcaact actcatgcct 2460cttaaggcac caaaagaagt aacctttctt gaaggtgatt cacatgacac agtacttacc 2520tctgaggagg ttgttctcaa gaacggtgaa ctcgaagcac tcgagacgcc cgttgatagc 2580ttcacaaatg gagctatcgt tggcacacca gtctgtgtaa atggcctcat gctcttagag 2640attaaggaca aagaacaata ctgcgcattg tctcctggtt tactggctac aaacaatgtc 2700tttcgcttaa aagggggtgc accaattaaa ggtgtaacct ttggagaaga tactgtttgg 2760gaagttcaag gttacaagaa tgtgagaatc acatttgagc ttgatgaacg tgttgacaaa 2820gtgcttaatg aaaagtgctc tgtctacact gttgaatccg gtaccgaagt tactgagttt 2880gcatgtgttg tagcagaggc tgttgtgaag actttacaac cagtttctga tctccttacc 2940aacatgggta ttgatcttga tgagtggagt gtagctacat tctacttatt tgatgatgct 3000ggtgaagaaa acttttcatc acgtatgtat tgttcctttt accctccaga tgaggaagaa 3060gaggacgatg cagagtgtga ggaagaagaa attgatgaaa cctgtgaaca tgagtacggt 3120acagaggatg attatcaagg tctccctctg gaatttggtg cctcagctga aacagttcga 3180gttgaggaag aagaagagga agactggctg gatgatacta ctgagcaatc agagattgag 3240ccagaaccag aacctacacc tgaagaacca gttaatcagt ttactggtta tttaaaactt 3300actgacaatg ttgccattaa atgtgttgac atcgttaagg aggcacaaag tgctaatcct 3360atggtgattg taaatgctgc taacatacac ctgaaacatg gtggtggtgt agcaggtgca 3420ctcaacaagg caaccaatgg tgccatgcaa aaggagagtg atgattacat taagctaaat 3480ggccctctta cagtaggagg gtcttgtttg ctttctggac ataatcttgc taagaagtgt 3540ctgcatgttg ttggacctaa cctaaatgca ggtgaggaca tccagcttct taaggcagca 3600tatgaaaatt tcaattcaca ggacatctta cttgcaccat tgttgtcagc aggcatattt 3660ggtgctaaac cacttcagtc tttacaagtg tgcgtgcaga cggttcgtac acaggtttat 3720attgcagtca atgacaaagc tctttatgag caggttgtca tggattatct tgataacctg 3780aagcctagag tggaagcacc taaacaagag gagccaccaa acacagaaga ttccaaaact 3840gaggagaaat ctgtcgtaca gaagcctgtc gatgtgaagc caaaaattaa ggcctgcatt 3900gatgaggtta ccacaacact ggaagaaact aagtttctta ccaataagtt actcttgttt 3960gctgatatca atggtaagct ttaccatgat tctcagaaca tgcttagagg tgaagatatg 4020tctttccttg agaaggatgc accttacatg gtaggtgatg ttatcactag tggtgatatc 4080acttgtgttg taataccctc caaaaaggct ggtggcacta ctgagatgct ctcaagagct 4140ttgaagaaag tgccagttga tgagtatata accacgtacc ctggacaagg atgtgctggt 4200tatacacttg aggaagctaa gactgctctt aagaaatgca aatctgcatt ttatgtacta 4260ccttcagaag cacctaatgc taaggaagag attctaggaa ctgtatcctg gaatttgaga 4320gaaatgcttg ctcatgctga agagacaaga aaattaatgc ctatatgcat ggatgttaga 4380gccataatgg caaccatcca acgtaagtat aaaggaatta aaattcaaga gggcatcgtt 4440gactatggtg tccgattctt cttttatact agtaaagagc ctgtagcttc tattattacg 4500aagctgaact ctctaaatga gccgcttgtc acaatgccaa ttggttatgt gacacatggt 4560tttaatcttg aagaggctgc gcgctgtatg cgttctctta aagctcctgc cgtagtgtca 4620gtatcatcac cagatgctgt tactacatat aatggatacc tcacttcgtc atcaaagaca 4680tctgaggagc actttgtaga aacagtttct ttggctggct cttacagaga ttggtcctat 4740tcaggacagc gtacagagtt aggtgttgaa tttcttaagc gtggtgacaa aattgtgtac 4800cacactctgg agagccccgt cgagtttcat cttgacggtg aggttctttc acttgacaaa 4860ctaaagagtc tcttatccct gcgggaggtt aagactataa aagtgttcac aactgtggac 4920aacactaatc tccacacaca gcttgtggat atgtctatga catatggaca gcagtttggt 4980ccaacatact tggatggtgc tgatgttaca aaaattaaac ctcatgtaaa tcatgagggt 5040aagactttct ttgtactacc tagtgatgac acactacgta gtgaagcttt cgagtactac 5100catactcttg atgagagttt tcttggtagg tacatgtctg ctttaaacca cacaaagaaa 5160tggaaatttc ctcaagttgg tggtttaact tcaattaaat gggctgataa caattgttat 5220ttgtctagtg ttttattagc acttcaacag cttgaagtca aattcaatgc accagcactt 5280caagaggctt attatagagc ccgtgctggt gatgctgcta acttttgtgc actcatactc 5340gcttacagta ataaaactgt tggcgagctt ggtgatgtca gagaaactat gacccatctt 5400ctacagcatg ctaatttgga atctgcaaag cgagttctta atgtggtgtg taaacattgt 5460ggtcagaaaa ctactacctt aacgggtgta gaagctgtga tgtatatggg tactctatct 5520tatgataatc ttaagacagg tgtttccatt ccatgtgtgt gtggtcgtga tgctacacaa 5580tatctagtac aacaagagtc ttcttttgtt atgatgtctg caccacctgc tgagtataaa 5640ttacagcaag gtacattctt atgtgcgaat gagtacactg gtaactatca gtgtggtcat 5700tacactcata taactgctaa ggagaccctc tatcgtattg acggagctca ccttacaaag 5760atgtcagagt acaaaggacc agtgactgat gttttctaca aggaaacatc ttacactaca 5820accatcaagc ctgtgtcgta taaactcgat ggagttactt acacagagat tgaaccaaaa 5880ttggatgggt attataaaaa ggataatgct tactatacag agcagcctat agaccttgta 5940
ccaactcaac cattaccaaa tgcgagtttt gataatttca aactcacatg ttctaacaca 6000aaatttgctg atgatttaaa tcaaatgaca ggcttcacaa agccagcttc acgagagcta 6060tctgtcacat tcttcccaga cttgaatggc gatgtagtgg ctattgacta tagacactat 6120tcagcgagtt tcaagaaagg tgctaaatta ctgcataagc caattgtttg gcacattaac 6180caggctacaa ccaagacaac gttcaaacca aacacttggt gtttacgttg tctttggagt 6240acaaagccag tagatacttc aaattcattt gaagttctgg cagtagaaga cacacaagga 6300atggacaatc ttgcttgtga aagtcaacaa cccacctctg aagaagtagt ggaaaatcct 6360accatacaga aggaagtcat agagtgtgac gtgaaaacta ccgaagttgt aggcaatgtc 6420atacttaaac catcagatga aggtgttaaa gtaacacaag agttaggtca tgaggatctt 6480atggctgctt atgtggaaaa cacaagcatt accattaaga aacctaatga gctttcacta 6540gccttaggtt taaaaacaat tgccactcat ggtattgctg caattaatag tgttccttgg 6600agtaaaattt tggcttatgt caaaccattc ttaggacaag cagcaattac aacatcaaat 6660tgcgctaaga gattagcaca acgtgtgttt aacaattata tgccttatgt gtttacatta 6720ttgttccaat tgtgtacttt tactaaaagt accaattcta gaattagagc ttcactacct 6780acaactattg ctaaaaatag tgttaagagt gttgctaaat tatgtttgga tgccggcatt 6840aattatgtga agtcacccaa attttctaaa ttgttcacaa tcgctatgtg gctattgttg 6900ttaagtattt gcttaggttc tctaatctgt gtaactgctg cttttggtgt actcttatct 6960aattttggtg ctccttctta ttgtaatggc gttagagaat tgtatcttaa ttcgtctaac 7020gttactacta tggatttctg tgaaggttct tttccttgca gcatttgttt aagtggatta 7080gactcccttg attcttatcc agctcttgaa accattcagg tgacgatttc atcgtacaag 7140ctagacttga caattttagg tctggccgct gagtgggttt tggcatatat gttgttcaca 7200aaattctttt atttattagg tctttcagct ataatgcagg tgttctttgg ctattttgct 7260agtcatttca tcagcaattc ttggctcatg tggtttatca ttagtattgt acaaatggca 7320cccgtttctg caatggttag gatgtacatc ttctttgctt ctttctacta catatggaag 7380agctatgttc atatcatgga tggttgcacc tcttcgactt gcatgatgtg ctataagcgc 7440aatcgtgcca cacgcgttga gtgtacaact attgttaatg gcatgaagag atctttctat 7500gtctatgcaa atggaggccg tggcttctgc aagactcaca attggaattg tctcaattgt 7560gacacatttt gcactggtag tacattcatt agtgatgaag ttgctcgtga tttgtcactc 7620cagtttaaaa gaccaatcaa ccctactgac cagtcatcgt atattgttga tagtgttgct 7680gtgaaaaatg gcgcgcttca cctctacttt gacaaggctg gtcaaaagac ctatgagaga 7740catccgctct cccattttgt caatttagac aatttgagag ctaacaacac taaaggttca 7800ctgcctatta atgtcatagt ttttgatggc aagtccaaat gcgacgagtc tgcttctaag 7860tctgcttctg tgtactacag tcagctgatg tgccaaccta ttctgttgct tgaccaagct 7920cttgtatcag acgttggaga tagtactgaa gtttccgtta agatgtttga tgcttatgtc 7980gacacctttt cagcaacttt tagtgttcct atggaaaaac ttaaggcact tgttgctaca 8040gctcacagcg agttagcaaa gggtgtagct ttagatggtg tcctttctac attcgtgtca 8100gctgcccgac aaggtgttgt tgataccgat gttgacacaa aggatgttat tgaatgtctc 8160aaactttcac atcactctga cttagaagtg acaggtgaca gttgtaacaa tttcatgctc 8220acctataata aggttgaaaa catgacgccc agagatcttg gcgcatgtat tgactgtaat 8280gcaaggcata tcaatgccca agtagcaaaa agtcacaatg tttcactcat ctggaatgta 8340aaagactaca tgtctttatc tgaacagctg cgtaaacaaa ttcgtagtgc tgccaagaag 8400aacaacatac cttttagact aacttgtgct acaactagac aggttgtcaa tgtcataact 8460actaaaatct cactcaaggg tggtaagatt gttagtactt gttttaaact tatgcttaag 8520gccacattat tgtgcgttct tgctgcattg gtttgttata tcgttatgcc agtacataca 8580ttgtcaatcc atgatggtta cacaaatgaa atcattggtt acaaagccat tcaggatggt 8640gtcactcgtg acatcatttc tactgatgat tgttttgcaa ataaacatgc tggttttgac 8700gcatggttta gccagcgtgg tggttcatac aaaaatgaca aaagctgccc tgtagtagct 8760gctatcatta caagagagat tggtttcata gtgcctggct taccgggtac tgtgctgaga 8820gcaatcaatg gtgacttctt gcattttcta cctcgtgttt ttagtgctgt tggcaacatt 8880tgctacacac cttccaaact cattgagtat agtgattttg ctacctctgc ttgcgttctt 8940gctgctgagt gtacaatttt taaggatgct atgggcaaac ctgtgccata ttgttatgac 9000actaatttgc tagagggttc tatttcttat agtgagcttc gtccagacac tcgttatgtg 9060cttatggatg gttccatcat acagtttcct aacacttacc tggagggttc tgttagagta 9120gtaacaactt ttgatgctga gtactgtaga catggtacat gcgaaaggtc agaagtaggt 9180atttgcctat ctaccagtgg tagatgggtt cttaataatg agcattacag agctctatca 9240ggagttttct gtggtgttga tgcgatgaat ctcatagcta acatctttac tcctcttgtg 9300caacctgtgg gtgctttaga tgtgtctgct tcagtagtgg ctggtggtat tattgccata 9360ttggtgactt gtgctgccta ctactttatg aaattcagac gtgtttttgg tgagtacaac 9420catgttgttg ctgctaatgc acttttgttt ttgatgtctt tcactatact ctgtctggta 9480
ccagcttaca gctttctgcc gggagtctac tcagtctttt acttgtactt gacattctat 9540ttcaccaatg atgtttcatt cttggctcac cttcaatggt ttgccatgtt ttctcctatt 9600gtgccttttt ggataacagc aatctatgta ttctgtattt ctctgaagca ctgccattgg 9660ttctttaaca actatcttag gaaaagagtc atgtttaatg gagttacatt tagtaccttc 9720gaggaggctg ctttgtgtac ctttttgctc aacaaggaaa tgtacctaaa attgcgtagc 9780gagacactgt tgccacttac acagtataac aggtatcttg ctctatataa caagtacaag 9840tatttcagtg gagccttaga tactaccagc tatcgtgaag cagcttgctg ccacttagca 9900aaggctctaa atgactttag caactcaggt gctgatgttc tctaccaacc accacagaca 9960tcaatcactt ctgctgttct gcagagtggt tttaggaaaa tggcattccc gtcaggcaaa 10020gttgaagggt gcatggtaca agtaacctgt ggaactacaa ctcttaatgg attgtggttg 10080gatgacacag tatactgtcc aagacatgtc atttgcacag cagaagacat gcttaatcct 10140aactatgaag atctgctcat tcgcaaatcc aaccatagct ttcttgttca ggctggcaat 10200gttcaacttc gtgttattgg ccattctatg caaaattgtc tgcttaggct taaagttgat 10260acttctaacc ctaagacacc caagtataaa tttgtccgta tccaacctgg tcaaacattt 10320tcagttctag catgctacaa tggttcacca tctggtgttt atcagtgtgc catgagacct 10380aatcatacca ttaaaggttc tttccttaat ggatcatgtg gtagtgttgg ttttaacatt 10440gattatgatt gcgtgtcttt ctgctatatg catcatatgg agcttccaac aggagtacac 10500gctggtactg acttagaagg taaattctat ggtccatttg ttgacagaca aactgcacag 10560gctgcaggta cagacacaac cataacatta aatgttttgg catggctgta tgctgctgtt 10620atcaatggtg ataggtggtt tcttaataga ttcaccacta ctttgaatga ctttaacctt 10680gtggcaatga agtacaacta tgaacctttg acacaagatc atgttgacat attgggacct 10740ctttctgctc aaacaggaat tgccgtctta gatatgtgtg ctgctttgaa agagctgctg 10800cagaatggta tgaatggtcg tactatcctt ggtagcacta ttttagaaga tgagtttaca 10860ccatttgatg ttgttagaca atgctctggt gttaccttcc aaggtaagtt caagaaaatt 10920gttaagggca ctcatcattg gatgctttta actttcttga catcactatt gattcttgtt 10980caaagtacac agtggtcact gtttttcttt gtttacgaga atgctttctt gccatttact 11040cttggtatta tggcaattgc tgcatgtgct atgctgcttg ttaagcataa gcacgcattc 11100ttgtgcttgt ttctgttacc ttctcttgca acagttgctt actttaatat ggtctacatg 11160cctgctagct gggtgatgcg tatcatgaca tggcttgaat tggctgacac tagcttgtct 11220ggttataggc ttaaggattg tgttatgtat gcttcagctt tagttttgct tattctcatg 11280acagctcgca ctgtttatga tgatgctgct agacgtgttt ggacactgat gaatgtcatt 11340acacttgttt acaaagtcta ctatggtaat gctttagatc aagctatttc catgtgggcc 11400ttagttattt ctgtaacctc taactattct ggtgtcgtta cgactatcat gtttttagct 11460agagctatag tgtttgtgtg tgttgagtat tacccattgt tatttattac tggcaacacc 11520ttacagtgta tcatgcttgt ttattgtttc ttaggctatt gttgctgctg ctactttggc 11580cttttctgtt tactcaaccg ttacttcagg cttactcttg gtgtttatga ctacttggtc 11640tctacacaag aatttaggta tatgaactcc caggggcttt tgcctcctaa gagtagtatt 11700gatgctttca agcttaacat taagttgttg ggtattggag gtaaaccatg tatcaaggtt 11760gctactgtac agtctaaaat gtctgacgta aagtgcacat ctgtggtact gctctcggtt 11820cttcaacaac ttagagtaga gtcatcttct aaattgtggg cacaatgtgt acaactccac 11880aatgatattc ttcttgcaaa agacacaact gaagctttcg agaagatggt ttctcttttg 11940tctgttttgc tatccatgca gggtgctgta gacattaata ggttgtgcga ggaaatgctc 12000gataaccgtg ctactcttca ggctattgct tcagaattta gttctttacc atcatatgcc 12060gcttatgcca ctgcccagga ggcctatgag caggctgtag ctaatggtga ttctgaagtc 12120gttctcaaaa agttaaagaa atctttgaat gtggctaaat ctgagtttga ccgtgatgct 12180gccatgcaac gcaagttgga aaagatggca gatcaggcta tgacccaaat gtacaaacag 12240gcaagatctg aggacaagag ggcaaaagta actagtgcta tgcaaacaat gctcttcact 12300atgcttagga agcttgataa tgatgcactt aacaacatta tcaacaatgc gcgtgatggt 12360tgtgttccac tcaacatcat accattgact acagcagcca aactcatggt tgttgtccct 12420gattatggta cctacaagaa cacttgtgat ggtaacacct ttacatatgc atctgcactc 12480tgggaaatcc agcaagttgt tgatgcggat agcaagattg ttcaacttag tgaaattaac 12540atggacaatt caccaaattt ggcttggcct cttattgtta cagctctaag agccaactca 12600gctgttaaac tacagaataa tgaactgagt ccagtagcac tacgacagat gtcctgtgcg 12660gctggtacca cacaaacagc ttgtactgat gacaatgcac ttgcctacta taacaattcg 12720aagggaggta ggtttgtgct ggcattacta tcagaccacc aagatctcaa atgggctaga 12780ttccctaaga gtgatggtac aggtacaatt tacacagaac tggaaccacc ttgtaggttt 12840gttacagaca caccaaaagg gcctaaagtg aaatacttgt acttcatcaa aggcttaaac 12900aacctaaata gaggtatggt gctgggcagt ttagctgcta cagtacgtct tcaggctgga 12960aatgctacag aagtacctgc caattcaact gtgctttcct tctgtgcttt tgcagtagac 13020
cctgctaaag catataagga ttacctagca agtggaggac aaccaatcac caactgtgtg 13080aagatgttgt gtacacacac tggtacagga caggcaatta ctgtaacacc agaagctaac 13140atggaccaag agtcctttgg tggtgcttca tgttgtctgt attgtagatg ccacattgac 13200catccaaatc ctaaaggatt ctgtgacttg aaaggtaagt acgtccaaat acctaccact 13260tgtgctaatg acccagtggg ttttacactt agaaacacag tctgtaccgt ctgcggaatg 13320tggaaaggtt atggctgtag ttgtgaccaa ctccgcgaac ccttgatgca gtctgcggat 13380gcatcaacgt ttttaaacgg gtttgcggtg taagtgcagc ccgtcttaca ccgtgcggca 13440caggcactag tactgatgtc gtctacaggg cttttgatat ttacaacgaa aaagttgctg 13500gttttgcaaa gttcctaaaa actaattgct gtcgcttcca ggagaaggat gaggaaggca 13560atttattaga ctcttacttt gtagttaaga ggcatactat gtctaactac caacatgaag 13620agactattta taacttggtt aaagattgtc cagcggttgc tgtccatgac tttttcaagt 13680ttagagtaga tggtgacatg gtaccacata tatcacgtca gcgtctaact aaatacacaa 13740tggctgattt agtctatgct ctacgtcatt ttgatgaggg taattgtgat acattaaaag 13800aaatactcgt cacatacaat tgctgtgatg atgattattt caataagaag gattggtatg 13860acttcgtaga gaatcctgac atcttacgcg tatatgctaa cttaggtgag cgtgtacgcc 13920aatcattatt aaagactgta caattctgcg atgctatgcg tgatgcaggc attgtaggcg 13980tactgacatt agataatcag gatcttaatg ggaactggta cgatttcggt gatttcgtac 14040aagtagcacc aggctgcgga gttcctattg tggattcata ttactcattg ctgatgccca 14100tcctcacttt gactagggca ttggctgctg agtcccatat ggatgctgat ctcgcaaaac 14160cacttattaa gtgggatttg ctgaaatatg attttacgga agagagactt tgtctcttcg 14220accgttattt taaatattgg gaccagacat accatcccaa ttgtattaac tgtttggatg 14280ataggtgtat ccttcattgt gcaaacttta atgtgttatt ttctactgtg tttccaccta 14340caagttttgg accactagta agaaaaatat ttgtagatgg tgttcctttt gttgtttcaa 14400ctggatacca ttttcgtgag ttaggagtcg tacataatca ggatgtaaac ttacatagct 14460cgcgtctcag tttcaaggaa cttttagtgt atgctgctga tccagctatg catgcagctt 14520ctggcaattt attgctagat aaacgcacta catgcttttc agtagctgca ctaacaaaca 14580atgttgcttt tcaaactgtc aaacccggta attttaataa agacttttat gactttgctg 14640tgtctaaagg tttctttaag gaaggaagtt ctgttgaact aaaacacttc ttctttgctc 14700aggatggcaa cgctgctatc agtgattatg actattatcg ttataatctg ccaacaatgt 14760gtgatatcag acaactccta ttcgtagttg aagttgttga taaatacttt gattgttacg 14820atggtggctg tattaatgcc aaccaagtaa tcgttaacaa tctggataaa tcagctggtt 14880tcccatttaa taaatggggt aaggctagac tttattatga ctcaatgagt tatgaggatc 14940aagatgcact tttcgcgtat actaagcgta atgtcatccc tactataact caaatgaatc 15000ttaagtatgc cattagtgca aagaatagag ctcgcaccgt agctggtgtc tctatctgta 15060gtactatgac aaatagacag tttcatcaga aattattgaa gtcaatagcc gccactagag 15120gagctactgt ggtaattgga acaagcaagt tttacggtgg ctggcataat atgttaaaaa 15180ctgtttacag tgatgtagaa actccacacc ttatgggttg ggattatcca aaatgtgaca 15240gagccatgcc taacatgctt aggataatgg cctctcttgt tcttgctcgc aaacataaca 15300cttgctgtaa cttatcacac cgtttctaca ggttagctaa cgagtgtgcg caagtattaa 15360gtgagatggt catgtgtggc ggctcactat atgttaaacc aggtggaaca tcatccggtg 15420atgctacaac tgcttatgct aatagtgtct ttaacatttg tcaagctgtt acagccaatg 15480taaatgcact tctttcaact gatggtaata agatagctga caagtatgtc cgcaatctac 15540aacacaggct ctatgagtgt ctctatagaa atagggatgt tgatcatgaa ttcgtggatg 15600agttttacgc ttacctgcgt aaacatttct ccatgatgat tctttctgat gatgccgttg 15660tgtgctataa cagtaactat gcggctcaag gtttagtagc tagcattaag aactttaagg 15720cagttcttta ttatcaaaat aatgtgttca tgtctgaggc aaaatgttgg actgagactg 15780accttactaa aggacctcac gaattttgct cacagcatac aatgctagtt aaacaaggag 15840atgattacgt gtacctgcct tacccagatc catcaagaat attaggcgca ggctgttttg 15900tcgatgatat tgtcaaaaca gatggtacac ttatgattga aaggttcgtg tcactggcta 15960ttgatgctta cccacttaca aaacatccta atcaggagta tgctgatgtc tttcacttgt 16020atttacaata cattagaaag ttacatgatg agcttactgg ccacatgttg gacatgtatt 16080ccgtaatgct aactaatgat aacacctcac ggtactggga acctgagttt tatgaggcta 16140tgtacacacc acatacagtc ttgcaggctg taggtgcttg tgtattgtgc aattcacaga 16200cttcacttcg ttgcggtgcc tgtattagga gaccattcct atgttgcaag tgctgctatg 16260accatgtcat ttcaacatca cacaaattag tgttgtctgt taatccctat gtttgcaatg 16320ccccaggttg tgatgtcact gatgtgacac aactgtatct aggaggtatg agctattatt 16380gcaagtcaca taagcctccc attagttttc cattatgtgc taatggtcag gtttttggtt 16440tatacaaaaa cacatgtgta ggcagtgaca atgtcactga cttcaatgcg atagcaacat 16500gtgattggac taatgctggc gattacatac ttgccaacac ttgtactgag agactcaagc 16560
ttttcgcagc agaaacgctc aaagccactg aggaaacatt taagctgtca tatggtattg 16620ccactgtacg cgaagtactc tctgacagag aattgcatct ttcatgggag gttggaaaac 16680ctagaccacc attgaacaga aactatgtct ttactggtta ccgtgtaact aaaaatagta 16740aagtacagat tggagagtac acctttgaaa aaggtgacta tggtgatgct gttgtgtaca 16800gaggtactac gacatacaag ttgaatgttg gtgattactt tgtgttgaca tctcacactg 16860taatgccact tagtgcacct actctagtgc cacaagagca ctatgtgaga attactggct 16920tgtacccaac actcaacatc tcagatgagt tttctagcaa tgttgcaaat tatcaaaagg 16980tcggcatgca aaagtactct acactccaag gaccacctgg tactggtaag agtcattttg 17040ccatcggact tgctctctat tacccatctg ctcgcatagt gtatacggca tgctctcatg 17100cagctgttga tgccctatgt gaaaaggcat taaaatattt gcccatagat aaatgtagta 17160gaatcatacc tgcgcgtgcg cgcgtagagt gttttgataa attcaaagtg aattcaacac 17220tagaacagta tgttttctgc actgtaaatg cattgccaga aacaactgct gacattgtag 17280tctttgatga aatctctatg gctactaatt atgacttgag tgttgtcaat gctagacttc 17340gtgcaaaaca ctacgtctat attggcgatc ctgctcaatt accagccccc cgcacattgc 17400tgactaaagg cacactagaa ccagaatatt ttaattcagt gtgcagactt atgaaaacaa 17460taggtccaga catgttcctt ggaacttgtc gccgttgtcc tgctgaaatt gttgacactg 17520tgagtgcttt agtttatgac aataagctaa aagcacacaa ggataagtca gctcaatgct 17580tcaaaatgtt ctacaaaggt gttattacac atgatgtttc atctgcaatc aacagacctc 17640aaataggcgt tgtaagagaa tttcttacac gcaatcctgc ttggagaaaa gctgttttta 17700tctcacctta taattcacag aacgctgtag cttcaaaaat cttaggattg cctacgcaga 17760ctgttgattc atcacagggt tctgaatatg actatgtcat attcacacaa actactgaaa 17820cagcacactc ttgtaatgtc aaccgcttca atgtggctat cacaagggca aaaattggca 17880ttttgtgcat aatgtctgat agagatcttt atgacaaact gcaatttaca agtctagaaa 17940taccacgtcg caatgtggct acattacaag cagaaaatgt aactggactt tttaaggact 18000gtagtaagat cattactggt cttcatccta cacaggcacc tacacacctc agcgttgata 18060taaagttcaa gactgaagga ttatgtgttg acataccagg cataccaaag gacatgacct 18120accgtagact catctctatg atgggtttca aaatgaatta ccaagtcaat ggttacccta 18180atatgtttat cacccgcgaa gaagctattc gtcacgttcg tgcgtggatt ggctttgatg 18240tagagggctg tcatgcaact agagatgctg tgggtactaa cctacctctc cagctaggat 18300tttctacagg tgttaactta gtagctgtac cgactggtta tgttgacact gaaaataaca 18360cagaattcac cagagttaat gcaaaacctc caccaggtga ccagtttaaa catcttatac 18420cactcatgta taaaggcttg ccctggaatg tagtgcgtat taagatagta caaatgctca 18480gtgatacact gaaaggattg tcagacagag tcgtgttcgt cctttgggcg catggctttg 18540agcttacatc aatgaagtac tttgtcaaga ttggacctga aagaacgtgt tgtctgtgtg 18600acaaacgtgc aacttgcttt tctacttcat cagatactta tgcctgctgg aatcattctg 18660tgggttttga ctatgtctat aacccattta tgattgatgt tcagcagtgg ggctttacgg 18720gtaaccttca gagtaaccat gaccaacatt gccaggtaca tggaaatgca catgtggcta 18780gttgtgatgc tatcatgact agatgtttag cagtccatga gtgctttgtt aagcgcgttg 18840attggtctgt tgaataccct attataggag atgaactgag ggttaattct gcttgcagaa 18900aagtacaaca catggttgtg aagtctgcat tgcttgctga taagtttcca gttcttcatg 18960acattggaaa tccaaaggct atcaagtgtg tgcctcaggc tgaagtagaa tggaagttct 19020acgatgctca gccatgtagt gacaaagctt acaaaataga ggaactcttc tattcttatg 19080ctacacatca cgataaattc actgatggtg tttgtttgtt ttggaattgt aacgttgatc 19140gttacccagc caatgcaatt gtgtgtaggt ttgacacaag agtcttgtca aacttgaact 19200taccaggctg tgatggtggt agtttgtatg tgaataagca tgcattccac actccagctt 19260tcgataaaag tgcatttact aatttaaagc aattgccttt cttttactat tctgatagtc 19320cttgtgagtc tcatggcaaa caagtagtgt cggatattga ttatgttcca ctcaaatctg 19380ctacgtgtat tacacgatgc aatttaggtg gtgctgtttg cagacaccat gcaaatgagt 19440accgacagta cttggatgca tataatatga tgatttctgc tggatttagc ctatggattt 19500acaaacaatt tgatacttat aacctgtgga atacatttac caggttacag agtttagaaa 19560atgtggctta taatgttgtt aataaaggac actttgatgg acacgccggc gaagcacctg 19620tttccatcat taataatgct gtttacacaa aggtagatgg tattgatgtg gagatctttg 19680aaaataagac aacacttcct gttaatgttg catttgagct ttgggctaag cgtaacatta 19740aaccagtgcc agagattaag atactcaata atttgggtgt tgatatcgct gctaatactg 19800taatctggga ctacaaaaga gaagccccag cacatgtatc tacaataggt gtctgcacaa 19860tgactgacat tgccaagaaa cctactgaga gtgcttgttc ttcacttact gtcttgtttg 19920atggtagagt ggaaggacag gtagaccttt ttagaaacgc ccgtaatggt gttttaataa 19980cagaaggttc agtcaaaggt ctaacacctt caaagggacc agcacaagct agcgtcaatg 20040gagtcacatt aattggagaa tcagtaaaaa cacagtttaa ctactttaag aaagtagacg 20100
gcattattca acagttgcct gaaacctact ttactcagag cagagactta gaggatttta 20160agcccagatc acaaatggaa actgactttc tcgagctcgc tatggatgaa ttcatacagc 20220gatataagct cgagggctat gccttcgaac acatcgttta tggagatttc agtcatggac 20280aacttggcgg tcttcattta atgataggct tagccaagcg ctcacaagat tcaccactta 20340aattagagga ttttatccct atggacagca cagtgaaaaa ttacttcata acagatgcgc 20400aaacaggttc atcaaaatgt gtgtgttctg tgattgatct tttacttgat gactttgtcg 20460agataataaa gtcacaagat ttgtcagtga tttcaaaagt ggtcaaggtt acaattgact 20520atgctgaaat ttcattcatg ctttggtgta aggatggaca tgttgaaacc ttctacccaa 20580aactacaagc aagtcaagcg tggcaaccag gtgttgcgat gcctaacttg tacaagatgc 20640aaagaatgct tcttgaaaag tgtgaccttc agaattatgg tgaaaatgct gttataccaa 20700aaggaataat gatgaatgtc gcaaagtata ctcaactgtg tcaatactta aatacactta 20760ctttagctgt accctacaac atgagagtta ttcactttgg tgctggctct gataaaggag 20820ttgcaccagg tacagctgtg ctcagacaat ggttgccaac tggcacacta cttgtcgatt 20880cagatcttaa tgacttcgtc tccgacgcag attctacttt aattggagac tgtgcaacag 20940tacatacggc taataaatgg gaccttatta ttagcgatat gtatgaccct aggaccaaac 21000atgtgacaaa agagaatgac tctaaagaag ggtttttcac ttatctgtgt ggatttataa 21060agcaaaaact agccctgggt ggttctatag ctgtaaagat aacagagcat tcttggaatg 21120ctgaccttta caagcttatg ggccatttct catggtggac agcttttgtt acaaatgtaa 21180atgcatcatc atcggaagca tttttaattg gggctaacta tcttggcaag ccgaaggaac 21240aaattgatgg ctataccatg catgctaact acattttctg gaggaacaca aatcctatcc 21300agttgtcttc ctattcactc tttgacatga gcaaatttcc tcttaaatta agaggaactg 21360ctgtaatgtc tcttaaggag aatcaaatca atgatatgat ttattctctt ctggaaaaag 21420gtaggcttat cattagagaa aacaacagag ttgtggtttc aagtgatatt cttgttaaca 21480actaaacgaa catgtttatt ttcttattat ttcttactct cactagtggt agtgaccttg 21540accggtgcac cacttttgat gatgttcaag ctcctaatta cactcaacat acttcatcta 21600tgaggggggt ttactatcct gatgaaattt ttagatcaga cactctttat ttaactcagg 21660atttatttct tccattttat tctaatgtta cagggtttca tactattaat catacgtttg 21720gcaaccctgt catacctttt aaggatggta tttattttgc tgccacagag aaatcaaatg 21780ttgtccgtgg ttgggttttt ggttctacca tgaacaacaa gtcacagtcg gtgattatta 21840ttaacaattc tactaatgtt gttatacgag catgtaactt tgaattgtgt gacaaccctt 21900tctttgctgt ttctaaaccc atgggtacac agacacatac tatgatattc gataatgcat 21960ttaattgcac tttcgagtac atatctgatg ccttttcgct tgatgtttca gaaaagtcag 22020gtaattttaa acacttacga gagtttgtgt ttaaaaataa agatgggttt ctctatgttt 22080ataagggcta tcaacctata gatgtagttc gtgatctacc ttctggtttt aacactttga 22140aacctatttt taagttgcct cttggtatta acattacaaa ttttagagcc attcttacag 22200ccttttcacc tgctcaagac atttggggca cgtcagctgc agcctatttt gttggctatt 22260taaagccaac tacatttatg ctcaagtatg atgaaaatgg tacaatcaca gatgctgttg 22320attgttctca aaatccactt gctgaactca aatgctctgt taagagcttt gagattgaca 22380aaggaattta ccagacctct aatttcaggg ttgttccctc aggagatgtt gtgagattcc 22440ctaatattac aaacttgtgt ccttttggag aggtttttaa tgctactaaa ttcccttctg 22500tctatgcatg ggagagaaaa aaaatttcta attgtgttgc tgattactct gtgctctaca 22560actcaacatt tttttcaacc tttaagtgct atggcgtttc tgccactaag ttgaatgatc 22620tttgcttctc caatgtctat gcagattctt ttgtagtcaa gggagatgat gtaagacaaa 22680tagcgccagg acaaactggt gttattgctg attataatta taaattgcca gatgatttca 22740tgggttgtgt ccttgcttgg aatactagga acattgatgc tacttcaact ggtaattata 22800attataaata taggtatctt agacatggca agcttaggcc ctttgagaga gacatatcta 22860atgtgccttt ctcccctgat ggcaaacctt gcaccccacc tgctcttaat tgttattggc 22920cattaaatga ttatggtttt tacaccacta ctggcattgg ctaccaacct tacagagttg 22980tagtactttc ttttgaactt ttaaatgcac cggccacggt ttgtggacca aaattatcca 23040ctgaccttat taagaaccag tgtgtcaatt ttaattttaa tggactcact ggtactggtg 23100tgttaactcc ttcttcaaag agatttcaac catttcaaca atttggccgt gatgtttctg 23160atttcactga ttccgttcga gatcctaaaa catctgaaat attagacatt tcaccttgcg 23220cttttggggg tgtaagtgta attacacctg gaacaaatgc ttcatctgaa gttgctgttc 23280tatatcaaga tgttaactgc actgatgttt ctacagcaat tcatgcagat caactcacac 23340cagcttggcg catatattct actggaaaca atgtattcca gactcaagca ggctgtctta 23400taggagctga gcatgtcgac acttcttatg agtgcgacat tcctattgga gctggcattt 23460gtgctagtta ccatacagtt tctttattac gtagtactag ccaaaaatct attgtggctt 23520atactatgtc tttaggtgct gatagttcaa ttgcttactc taataacacc attgctatac 23580ctactaactt ttcaattagc attactacag aagtaatgcc tgtttctatg gctaaaacct 23640
ccgtagattg taatatgtac atctgcggag attctactga atgtgctaat ttgcttctcc 23700aatatggtag cttttgcaca caactaaatc gtgcactctc aggtattgct gctgaacagg 23760atcgcaacac acgtgaagtg ttcgctcaag tcaaacaaat gtacaaaacc ccaactttga 23820aatattttgg tggttttaat ttttcacaaa tattacctga ccctctaaag ccaactaaga 23880ggtcttttat tgaggacttg ctctttaata aggtgacact cgctgatgct ggcttcatga 23940agcaatatgg cgaatgccta ggtgatatta atgctagaga tctcatttgt gcgcagaagt 24000tcaatggact tacagtgttg ccacctctgc tcactgatga tatgattgct gcctacactg 24060ctgctctagt tagtggtact gccactgctg gatggacatt tggtgctggc gctgctcttc 24120aaataccttt tgctatgcaa atggcatata ggttcaatgg cattggagtt acccaaaatg 24180ttctctatga gaaccaaaaa caaatcgcca accaatttaa caaggcgatt agtcaaattc 24240aagaatcact tacaacaaca tcaactgcat tgggcaagct gcaagacgtt gttaaccaga 24300atgctcaagc attaaacaca cttgttaaac aacttagctc taattttggt gcaatttcaa 24360gtgtgctaaa tgatatcctt tcgcgacttg ataaagtcga ggcggaggta caaattgaca 24420ggttaattac aggcagactt caaagccttc aaacctatgt aacacaacaa ctaatcaggg 24480ctgctgaaat cagggcttct gctaatcttg ctgctactaa aatgtctgag tgtgttcttg 24540gacaatcaaa aagagttgac ttttgtggaa agggctacca ccttatgtcc ttcccacaag 24600cagccccgca tggtgttgtc ttcctacatg tcacgtatgt gccatcccag gagaggaact 24660tcaccacagc gccagcaatt tgtcatgaag gcaaagcata cttccctcgt gaaggtgttt 24720ttgtgtttaa tggcacttct tggtttatta cacagaggaa cttcttttct ccacaaataa 24780ttactacaga caatacattt gtctcaggaa attgtgatgt cgttattggc atcattaaca 24840acacagttta tgatcctctg caacctgagc ttgactcatt caaagaagag ctggacaagt 24900acttcaaaaa tcatacatca ccagatgttg atcttggcga catttcaggc attaacgctt 24960ctgtcgtcaa cattcaaaaa gaaattgacc gcctcaatga ggtcgctaaa aatttaaatg 25020aatcactcat tgaccttcaa gaattgggaa aatatgagca atatattaaa tggccttggt 25080atgtttggct cggcttcatt gctggactaa ttgccatcgt catggttaca atcttgcttt 25140gttgcatgac tagttgttgc agttgcctca agggtgcatg ctcttgtggt tcttgctgca 25200agtttgatga ggatgactct gagccagttc tcaagggtgt caaattacat tacacataaa 25260cgaacttatg gatttgttta tgagattttt tactcttaga tcaattactg cacagccagt 25320aaaaattgac aatgcttctc ctgcaagtac tgttcatgct acagcaacga taccgctaca 25380agcctcactc cctttcggat ggcttgttat tggcgttgca tttcttgctg tttttcagag 25440cgctaccaaa ataattgcgc tcaataaaag atggcagcta gccctttata agggcttcca 25500gttcatttgc aatttactgc tgctatttgt taccatctat tcacatcttt tgcttgtcgc 25560tgcaggtatg gaggcgcaat ttttgtacct ctatgccttg atatattttc tacaatgcat 25620caacgcatgt agaattatta tgagatgttg gctttgttgg aagtgcaaat ccaagaaccc 25680attactttat gatgccaact actttgtttg ctggcacaca cataactatg actactgtat 25740accatataac agtgtcacag atacaattgt cgttactgaa ggtgacggca tttcaacacc 25800aaaactcaaa gaagactacc aaattggtgg ttattctgag gataggcact caggtgttaa 25860agactatgtc gttgtacatg gctatttcac cgaagtttac taccagcttg agtctacaca 25920aattactaca gacactggta ttgaaaatgc tacattcttc atctttaaca agcttgttaa 25980agacccaccg aatgtgcaaa tacacacaat cgacggctct tcaggagttg ctaatccagc 26040aatggatcca atttatgatg agccgacgac gactactagc gtgcctttgt aagcacaaga 26100aagtgagtac gaacttatgt actcattcgt ttcggaagaa acaggtacgt taatagttaa 26160tagcgtactt ctttttcttg ctttcgtggt attcttgcta gtcacactag ccatccttac 26220tgcgcttcga ttgtgtgcgt actgctgcaa tattgttaac gtgagtttag taaaaccaac 26280ggtttacgtc tactcgcgtg ttaaaaatct gaactcttct gaaggagttc ctgatcttct 26340ggtctaaacg aactaactat tattattatt ctgtttggaa ctttaacatt gcttatcatg 26400gcagacaacg gtactattac cgttgaggag cttaaacaac tcctggaaca atggaaccta 26460gtaataggtt tcctattcct agcctggatt atgttactac aatttgccta ttctaatcgg 26520aacaggtttt tgtacataat aaagcttgtt ttcctctggc tcttgtggcc agtaacactt 26580gcttgttttg tgcttgctgc tgtctacaga attaattggg tgactggcgg gattgcgatt 26640gcaatggctt gtattgtagg cttgatgtgg cttagctact tcgttgcttc cttcaggctg 26700tttgctcgta cccgctcaat gtggtcattc aacccagaaa caaacattct tctcaatgtg 26760cctctccggg ggacaattgt gaccagaccg ctcatggaaa gtgaacttgt cattggtgct 26820gtgatcattc gtggtcactt gcgaatggcc ggacactccc tagggcgctg tgacattaag 26880gacctgccaa aagagatcac tgtggctaca tcacgaacgc tttcttatta caaattagga 26940gcgtcgcagc gtgtaggcac tgattcaggt tttgctgcat acaaccgcta ccgtattgga 27000aactataaat taaatacaga ccacgccggt agcaacgaca atattgcttt gctagtacag 27060taagtgacaa cagatgtttc atcttgttga cttccaggtt acaatagcag agatattgat 27120tatcattatg aggactttca ggattgctat ttggaatctt gacgttataa taagttcaat 27180
agtgagacaa ttatttaagc ctctaactaa gaagaattat tcggagttag atgatgaaga 27240acctatggag ttagattatc cataaaacga acatgaaaat tattctcttc ctgacattga 27300ttgtatttac atcttgcgag ctatatcact atcaggagtg tgttagaggt acgactgtac 27360tactaaaaga accttgccca tcaggaacat acgagggcaa ttcaccattt caccctcttg 27420ctgacaataa atttgcacta acttgcacta gcacacactt tgcttttgct tgtgctgacg 27480gtactcgaca tacctatcag ctgcgtgcaa gatcagtttc accaaaactt ttcatcagac 27540aagaggaggt tcaacaagag ctctactcgc cactttttct cattgttgct gctctagtat 27600ttttaatact ttgcttcacc attaagagaa agacagaatg aatgagctca ctttaattga 27660cttctatttg tgctttttag cctttctgct attccttgtt ttaataatgc ttattatatt 27720ttggttttca ctcgaaatcc aggatctaga agaaccttgt accaaagtct aaacgaacat 27780gaaacttctc attgttttga cttgtatttc tctatgcagt tgcatatgca ctgtagtaca 27840gcgctgtgca tctaataaac ctcatgtgct tgaagatcct tgtaaggtac aacactaggg 27900gtaatactta tagcactgct tggctttgtg ctctaggaaa ggttttacct tttcatagat 27960ggcacactat ggttcaaaca tgcacaccta atgttactat caactgtcaa gatccagctg 28020gtggtgcgct tatagctagg tgttggtacc ttcatgaagg tcaccaaact gctgcattta 28080gagacgtact tgttgtttta aataaacgaa caaattaaaa tgtctgataa tggaccccaa 28140tcaaaccaac gtagtgcccc ccgcattaca tttggtggac ccacagattc aactgacaat 28200aaccagaatg gaggacgcaa tggggcaagg ccaaaacagc gccgacccca aggtttaccc 28260aataatactg cgtcttggtt cacagctctc actcagcatg gcaaggagga acttagattc 28320cctcgaggcc agggcgttcc aatcaacacc aatagtggtc cagatgacca aattggctac 28380taccgaagag ctacccgacg agttcgtggt ggtgacggca aaatgaaaga gctcagcccc 28440agatggtact tctattacct aggaactggc ccagaagctt cacttcccta cggcgctaac 28500aaagaaggca tcgtatgggt tgcaactgag ggagccttga atacacccaa agaccacatt 28560ggcacccgca atcctaataa caatgctgcc accgtgctac aacttcctca aggaacaaca 28620ttgccaaaag gcttctacgc agagggaagc agaggcggca gtcaagcctc ttctcgctcc 28680tcatcacgta gtcgcggtaa ttcaagaaat tcaactcctg gcagcagtag gggaaattct 28740cctgctcgaa tggctagcgg aggtggtgaa actgccctcg cgctattgct gctagacaga 28800ttgaaccagc ttgagagcaa agtttctggt aaaggccaac aacaacaagg ccaaactgtc 28860actaagaaat ctgctgctga ggcatctaaa aagcctcgcc aaaaacgtac tgccacaaaa 28920cagtacaacg tcactcaagc atttgggaga cgtggtccag aacaaaccca aggaaatttc 28980ggggaccaag acctaatcag acaaggaact gattacaaac attggccgca aattgcacaa 29040tttgctccaa gtgcctctgc attctttgga atgtcacgca ttggcatgga agtcacacct 29100tcgggaacat ggctgactta tcatggagcc attaaattgg atgacaaaga tccacaattc 29160aaagacaacg tcatactgct gaacaagcac attgacgcat acaaaacatt cccaccaaca 29220gagcctaaaa aggacaaaaa gaaaaagact gatgaagctc agcctttgcc gcagagacaa 29280aagaagcagc ccactgtgac tcttcttcct gcggctgaca tggatgattt ctccagacaa 29340cttcaaaatt ccatgagtgg agcttctgct gattcaactc aggcataaac actcatgatg 29400accacacaag gcagatgggc tatgtaaacg ttttcgcaat tccgtttacg atacatagtc 29460tactcttgtg cagaatgaat tctcgtaact aaacagcaca agtaggttta gttaacttta 29520atctcacata gcaatcttta atcaatgtgt aacattaggg aggacttgaa agagccacca 29580cattttcatc gaggccacgc ggagtacgat cgagggtaca gtgaataatg ctagggagag 29640ctgcctatat ggaagagccc taatgtgtaa aattaatttt agtagtgcta tccccatgtg 29700attttaatag cttcttagga gaatgacaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 2975权利要求
1.一种疫苗组合物，其特征在于，该疫苗组合物含有早期SARS病毒的全病毒颗粒和生理学上可接受的载体。
2.如权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的SARS病毒的核苷酸序列中具有至少一个选自下组的核苷酸减毒变异SEQ ID NO1中9404→C、17564→G、21721→A、22222→C、23823→G、27827→C及其组合。
3.如权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的SARS病毒的蛋白具有氨基酸突变，所述的氨基酸突变对应于的选自下组的核苷酸减毒变异SEQ IDNO1中9404→C、17564→G、21721→A、22222→C、23823→G、27827→C及其组合。
4.如权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述SARS病毒是GZ-02病毒株，具有GenBank登录号为AY390556的核苷酸序列。
5.如权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的SARS病毒是灭活的。
6.如权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述生物学上可接受的载体是佐剂。
7.如权利要求1所述的疫苗组合物的用途，其特征在于，该疫苗组合物用于制备抗SARS的抗体。
8.如权利要求1所述的疫苗组合物的用途，其特征在于，该疫苗组合物用于制备预防SARS病毒感染的药物。
全文摘要
公开了一种疫苗组合物，该疫苗组合物含有早期SARS病毒的全病毒颗粒和生理学上可接受的载体；以及该疫苗组合物用于制备抗SARS的抗体和预防SARS病毒感染的药物的用途。
文档编号A61P11/00GK1647823SQ20041001606
公开日2005年8月3日 申请日期2004年1月29日 优先权日2004年1月29日
发明者赵国屏, 林锦炎, 宋怀东, 郑焕英, 王升跃, 何剑峰, 任双喜, 鄢心革, 李亦学, 万卓越, 孔祥银, 许锐恒, 郝沛, 吴新伟, 顾伯伟, 侯金林, 陈竺, 闵军, 缪有刚, 徐军, 傅刚, 陆家海, 张树义, 王小宁 申请人:国家人类基因组南方研究中心, 广东省疾病预防控制中心