专利名称：冬凌草及其提取物在制备抗艾滋病药物上的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及艾滋病防治药物，具体涉及具有艾滋病毒抑制活性的天然植物药提取物，更具体地涉及冬凌草及其提取物在制备抗艾滋病药物上的应用。
背景技术：
艾滋病是由其致病源艾滋病毒(HIV)引起的一种对人类健康造成巨大危害的传染病，又称世纪绝症。现已共识，要从根本上防治艾滋病，疫苗是最好的选择。一个理想的疫苗应该是广谱、高效、低毒、价廉。然而由于艾滋病毒的高度变异及强大的逃逸功能，使得疫苗的研究变得十分艰难，在可预见的将来，这样的疫苗要获得成功还有十分长的路要走。因此抗艾滋病毒药物的研究并使其投向市场服务于感染病毒的患者是一个十分迫切的任务。
迄今为止，由美国FDA公布正式上市的抗艾滋病毒药物为23个，包括三种类型a、病毒逆转录酶抑制剂；b、病毒蛋白酶的抑制剂；c、阻断细胞与病毒融合的短肽(表1，见下页)。
表1抗逆转录病毒药物
另有三十多个新的候选药物分别在临床I，II，III期开发中(表2，见下页)。
表2开发中的新的抗HIV药物
临床用药的经验表明，单个药物的应用很容易对病毒产生耐药性。根据患者的症状选用不同类别的药物进行组合的高效抗逆转录病毒疗法(HAART)(俗称“鸡尾酒疗法” )的发明及运用在很大程度上缓解了患者的发病进程，改善了生活品质，延长了生命。因此，扩大可选择的新药阵容是保证治疗质量而面临的新任务。参见如下文献(这些文献均引入本说明书作为参考)1.Johnston MLHIV/AIDS疫苗开发——挑战、进步和未来方向，Reviews in Medical Virology，6(3)123-140，1996。
2.www.ARAS.AB.CA/haart.html3.www.hivandhepatitis.com4.www.fdg.gov通常开发一个新药至上市需要8～10年，资金达上亿美元。一般情况下，一个患者的药物花费每年在$8,000～12,000之间，个别药物甚至高达$15,000～20,000。这对大部分普通患者来说是难以承受的，特别对发展中国家的患者来说，更是难以消受。这样，另辟新径，寻找一条适合发展中国家的创新药物同样迫切与重要。从天然植物药的提取物中筛选抗HIV的有效成份或有效部位，使其最终成为新药，是一条可能和可行的道路。同时也为这一领域的研究开辟了一条新路。
本发明者经体外抗艾滋病毒试验，从大量天然植物药中筛选到具有艾滋病毒抑制活性的冬凌草，并从冬凌草提取物中得到活性部位。
冬凌草为唇形科植物碎米桠Rabdosia rubescens(Hemsl.)Hara的干燥地上部分。夏、秋二季采割，晒干。本品茎呈方柱形，长80～70cm，表面红褐色，有柔毛；质硬，断面淡绿色或黄白色。页对生，有柄；叶片皱缩，展平后呈卵形或宽卵形，长6.5～13cm，宽3～6cm；先端渐尖，基部宽楔形、截形或近心形，急缩下延至柄，边缘有粗锯齿；上表面绿棕色，有腺点，下表面绿色，沿叶脉披疏柔毛。聚伞状圆锥花序顶生，花小，花萼筒状钟形，5齿裂，花冠二唇形。小坚果宽倒卵形，顶端无毛。气微香，味苦、甘，微寒。具有清热解毒，活血止痛功效。用于咽喉肿痛，扁桃体炎，蛇虫咬伤(中国药典一部，1977版)。
资料表明，冬凌草茎叶含挥发油，油中成份为α-蒎烯(α-Pinene)、β-蒎烯0.16～1％、柠檬烯(Limonene)0.16％、1.8桉油素(Cineole)0.33％、对-聚伞花素(P-Cymene)0.16％、王醛(Nonaldehyde)1.33％、癸醛(Decanal)1％b-、β-榄香烯(β-Elemene)20.23％、棕榈酸(Palmatic acid)6.6％。还得到两种二萜冬凌草甲素(Oridinin)、乙素(Ponicidin)、丙素C20H26O6、丁素C20H30O6、己素、戊素C23H32O6、庚素、辛素以及α-香树脂醇(α-Amyrin)和五个未知结构成份。此外，根、茎和叶尚含微量元素铁、锌、锰、铜、铬、镍、钴、钼、硒等。
中国发明专利和专利申请CN94110281.4、95100286.4、95113606.2、95112013.1、97121836.6、98111550.0、0113767.3、01115446.2、02125611.x涉及抗肿瘤中药，其中包含冬凌草；中国发明专利申请CN03118782.x涉及抗炎、抗病毒的中药，其中也包含冬凌草。然而，这些专利申请揭示的都是一些复方方剂，而且无一提及冬凌草的抗艾滋病毒作用。
发明内容
本发明的目的是提供冬凌草及其提取物在制备抗艾滋病药物上的应用。
一、冬凌草提取物的制备冬凌草干燥后粉碎成粉末状，用乙醇迴流或室温浸泡去除叶绿素等溶解于乙醇中的物质。残留物经水提和乙醇沉淀后制成粗提物DBSHH和DBSHE。粗提物DBSHH用凝胶层析柱Sephadex-G75分离得到DBSHH1、DBSHH2、DBSHH3、DBSHH4四个组分。
二、冬凌草提取物的细胞毒性试验在一96孔培养板中，将制备物系列稀释，每三孔为一样品，然后加入适量实验室T-细胞株MT-2。在CO2培养箱37℃培养3天后，对细胞进行染色，测定OD值，经阅读软件转换成活细胞生存百分率。如果制备物毒性很强，则细胞会全部或大部死亡，活细胞生存百分率为零或很低；反之，制备物无毒性或低毒性，活细胞生存百分率则接近100或很高。从此实验，可以确定制备物在抗病毒试验中的最大起始浓度。
三、抗艾滋病毒试验(一)在96孔培养板中，将上述试验得到的制备物最大起始浓度作系列稀释。加适量滴度的实验室艾滋病毒株(HIV-IIIB)与细胞株MT-2。在CO2培养箱37℃培养6天左右后，对细胞进行染色，测OD值，经阅读软件转换成未感染细胞百分率。如果制备物对病毒无抑制作用，则被感染的细胞最终成多核巨细胞而破裂死亡(合胞体)；如有抗病毒作用，则有不同程度的未感染细胞存活。以存在50％未感染细胞的制备物浓度为有效浓度。
四、抗艾滋病毒试验(二)用植物血凝素(PHA)刺激正常人外周血单核淋巴细胞(hPBMC)一天。
将制备物在96孔培养板中系列稀释，加适量已刺激过的正常人外周血单核淋巴细胞(hPBMC)与从病人血中分离到并经培养的艾滋病毒(Isolate)共同在CO2培养箱37℃培养若干小时后，洗去制备物与病毒，加入培养液继续在CO2培养箱37℃培养。自第二天后，每天收集培养板孔中的样品上清液，至第八天。测定上清液P24(艾滋病毒核壳蛋白)含量。
将所得结果制成曲线与阳性对照曲线比较，判别制备物有无抗病毒作用及抗病毒作用的程度。
上述程序的筛选和抗病毒试验证明，冬凌草的提取物DBSHH和DBSHE均有体外抗HIV活性，以DBSHH为佳。
将粗提物DBSHH用凝胶层析柱Sephadex-G75分离纯化后得到4个组分，用此4个组分别进行细胞毒性试验，结果显示DBSHH1、DBSHH2和DBSHH4在浓度小于200微克/毫升时，细胞存活率＞50％；而DBSHH3显示出一定的细胞毒性，当浓度小于12.5微克/毫升时，细胞生存率＞50％。DBSHH2CC50为200微克/毫升。
体外抗HIV活性试验(一)的结果显示DBSHH2样品在浓度为2.5～200微克/毫升之间有抗病毒活性作用，未感染细胞百分率＞50％(EC50＝2.5微克/毫升)；DBSHH1无活性，DBSHH3在浓度为200微克/毫升时，对细胞有一定毒性，在10～100微克/毫升时有病毒抑制作用；DBSHH4在50～200微克/毫升时有病毒抑制活性。AZT为阳性对照药物叠氮胸苷(齐多夫定)，有稳定的病毒抑制活性(0.01～1微克/毫升)。
图1显示冬凌草提取物对MT-2的细胞毒性。
图2显示冬凌草提取物在MT-2细胞中抗爱滋病的活性。
图3显示冬凌草提取物DBSHH2组分在人外周血淋巴单核细胞培养中的抗原代病毒试验结果。
具体实施例方式下面结合实施例和试验例对本发明作进一步阐述，但这些实施例和试验例绝非对本发明有任何限制。本领域技术人员在本说明书的启示下对本发明实施中所作的任何变动都将落在权利要求书的范围内。
实施例1 冬凌草粗提物的制备在40克冬凌草粉末中加入250毫升95％乙醇，37％摇床过夜。将混合物于3,000rpm低速离心20分钟，弃去上清液，沉淀中加入200毫升水煮20分钟，冷却至室温后，于3,000rpm离心20分钟，弃去沉淀，上清液再于4,000rpm离心20分钟，取上清液(约200毫升)加2倍体积95％乙醇，4℃过夜后，于4,000rpm离心20分钟。上清液减压干燥得DBSHE 2.2克，沉淀减压干燥得DBSHH 1.2克。
实施例2 冬凌草粗提物的纯化将15克Sephadex-G75(Sigma cat.no.G-75-120)混匀于400毫升双蒸消毒水中，使其浸泡膨胀过夜。将浸泡的Sephadex-G75混匀液缓缓地装入20毫米×500毫米玻璃柱中。
将120毫克实施例1所得的DBSHH溶于1.2毫升双蒸水，取1毫升溶液加于柱中，用双蒸水洗脱样品，流速为每分钟0.5毫升。根据样品洗脱的颜色分别收集得到四个部分DBSHH1、DBSHH2、DBSHH3、DBSHH4。减压干燥所得样品，于4℃储存。
试验例1 冬凌草提取物的细胞毒性试验在一96孔培养板中，每孔加入一定量的培养液(含2mM谷氨酰胺和25mMHEPES的RPMI1640)。分别在3～5纵行底部的三个孔中加入浓度为200微克/毫升的冬凌草提取物100微升，在6～8和9～11纵行的底部三孔中加入其他稀释的样品或对照样品(如AZT等)，使每孔中的液量为200微升，混匀。将孔中的混合液系列二倍稀释，得到一系列三平行孔的含二倍稀释药物稀释液的培养液。加100微升MT-2混悬液(细胞计数为～5×105/毫升)至第1、第3～11纵行的每一孔中。置培养板于37℃、CO2培养箱中培养3天。取出培养板，在每孔中取100微升细胞混悬液进行1％醋酸/乙醇溶液染色。在孔板读数仪上读数。
试验例2 冬凌草提取物的抗艾滋病毒试验之一在一96孔培养板中，每孔加入100微升RPMI1640(含12％小牛血清)培养液。
在3～5纵行底部的三孔中加入100微升DBSHH(200微克/毫升)，在6～8、9～11纵行的底部三孔中加入其他样品或对照样品(如AZT等)，使每孔中的液量为200微升。
将样品孔中的混合液作系列二倍稀释。
在2～11纵行的每一孔中加50微升经适当稀释的艾滋病毒(HIV-IIIB)。
在1～11纵行的每一孔中加100微升MT-2细胞混悬液(～5×104/毫升)。
加培养液于1和12纵行，使每孔液为250微升。
置培养板于5％CO2培养箱37℃约6天，更换培养液。
自培养约6天后孔板的每孔中，取100微升混悬液加到预先用氢溴化赖氨酸处理过的96孔板中。
加100微升含10％中性红培养液于每孔中。
于37℃培养箱保温1～1.5小时。
用PBS洗孔板两次。
每孔中加100微升1％醋酸/乙醇溶液染色。
在孔板读数仪上读数。
试验例3 冬凌草提取物的抗艾滋病毒试验之二用适量的植物血凝素(PHA)刺激人外周血单核淋巴细胞(hPBMC)一天(培养液为20％小牛血清+血细胞介导素(IL-2)+RPMI1640)第二天，用上述培养液洗去培养瓶中PHA，用10毫升新鲜培养液混匀细胞，并加100微升细胞混悬液于一96孔板的每孔中。按试验例1的方法，将提取物制备成系列二倍稀释液，加于3～5纵行，6～8、9～11纵行加其他样品或对照样品。加50微升经hPBMC培养得到的阳性病人的艾滋病毒于2～11纵行。最终每孔液为250微升。
置培养板于5％CO2培养箱中保温3～6小时后，用培养液洗去病毒。
用上述同样方法加新鲜配置的系列提取物和其他样品或对照样品稀释液。
置孔板于5％CO2培养箱中培养。从第2天起，每天从孔板中收集50微升上清液，并补充孔板的培养液。共收集6～8天。
用0.5％Triton-X100裂解收集的样品中的病毒。
做p24免疫分析试验(HIV p24ELISA kit)。
读数并制成图表，将提取物与对照样品比较，转换成提取物抑制艾滋病毒的百分率。
权利要求
1.冬凌草及其提取物在制备抗艾滋病药物上的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其中冬凌草提取物是用乙醇迴流或室温浸泡、低速离心所得沉淀再经水提和酒精沉淀后制成的粗提物DBSHE和DBSHH。
3.如权利要求1所述的应用，其中冬凌草提取物是将权利要求2所述粗提物DBSHH用凝胶层析柱Sephadex-G75进一步分离得到的DBSHH1、DBSHH2、DBSHH3和DBSHH4。
全文摘要
本发明提供冬凌草及其提取物在制备抗艾滋病药物上的应用。冬凌草粉末用乙醇迴流或室温浸泡，低速离心所得沉淀再经水提和乙醇沉淀后制成粗提物DBSHH和DBSHE。两者均有体外抗HIV活性，以DBSHH为佳。用凝胶层析柱Sephadex－G75将DBSHH进一步分离得到DBSHH－1、DBSHH－2、DBSHH－3和DBSHH－4，抗HIV活性以DBSHH－2为佳。
文档编号A61P31/18GK1682774SQ20041001762
公开日2005年10月19日 申请日期2004年4月12日 优先权日2004年4月12日
发明者周金涛 申请人:深圳市博爱生科技开发有限公司