专利名称：重组人溶菌酶在制备治疗支气管哮喘的药物中的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种重组人溶菌酶的新用途，特别是涉及制药领域中重组人溶菌酶在制备治疗支气管哮喘的新用途。
背景技术：
哮喘为变态反应性疾病，气道炎症为哮喘发病的重要基础。变应原首次接触有过敏体质的人，经呈递细胞(包括树突状细胞)处理，激活辅助性T淋巴细胞(Th)，其中Th2细胞增殖并释放IL-4、IL-5、IL-13、干细胞因子(SCF)等细胞因子，使B细胞转化为浆细胞，分泌特异性IgE(sIgE)，后者附着于呼吸道黏膜下肥大细胞、嗜碱性哩细胞和巨噬细胞等效应细胞表面而致敏。传统观点认为吸入变应原通过IgE依赖机制作用于肥大细胞表面，当再次吸入同类抗原后，该抗原与已致敏肥大细胞表面的IgE抗体以桥联形式相结合，激活效应细胞，引起脱颗粒和介质释放如组氨和白三烯类，组氨作用于支气管平滑肌受体，引起平滑肌痉挛，患者往往在吸入抗原后数分钟内出现症状，于15～30mim时达高峰，持续约1.5～3.0h，严重者很快窒息。
肺胞巨噬细胞通过多种途径被激活后释放脂类介质如血栓素A2(TXA2)、前列腺素E2(PGE2)、白三烯B4(LTB4)、血小板激活因子(PAF)氧基团和一氧化炭(NO)等及细胞因子如IL-1、IL8、IL-10、TNF-α巨粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)血小板衍化生长因子(PDGF)和MIP-1α等，具有重要的炎症调控作用。过敏体质人的免疫调控和炎症调控作用是引起支气管哮喘的主要原因。
各种特异性或非特异性变应原可通过吸入、摄入或接触，使有过敏体质和家族过敏史者发生哮喘，但以吸入为主要诱因。特异性变应原包括花粉、尘螨、蟑螂、动物皮屑和分泌物、呼吸道病毒感染、霉菌、化妆品、鱼及虾等。尤其随着美化环境大量种植花草，花粉过敏导致支气管哮喘患者大量增加。非特异性包括寒冷空气、大气污染、职业性粉尘、烟雾及精神因素等，导致支气管哮喘发病。
目前用于治疗支气管哮喘的药物多为中、西药，在治疗病症的同时，或多或少都存在着副作用，而且长期服用会产生耐药性。
重组人溶菌酶是一种有效的抗菌剂，全称为1，4-β-N-溶菌酶或者称粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶。它能切断细菌细胞壁的肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4糖苷键的联结，破坏肽聚糖支架，细菌在内部渗透压的作用下细胞胀裂开，引起细菌裂解。人和动物细胞无细胞壁结构亦无肽聚糖，故溶菌酶对人体细胞无毒性作用。重组人溶菌酶除可以直接裂解细菌外，还有抗病毒、抗肿瘤、抗炎和免疫调节作用。
发明内容
本发明的目的是针对各种特异性和非特异性变应原引起的支气管哮喘疾病，提供一种重组人溶菌酶在制备治疗支气管哮喘的药物中的新用途，另一目的是提供该药物的合理剂型。
实际上，本发明涉及重组人溶菌酶在制备治疗由特异性变应原花粉导致支气管哮喘疾病的药物中的应用。
涉及重组人溶菌酶在制备治疗由特异性变应原尘螨、蟑螂、动物皮屑和分泌物导致支气管哮喘疾病的药物中的应用。
涉及重组人溶菌酶在制备治疗由特异性变应原呼吸道病毒感染、霉菌、化妆品、鱼及虾等导致支气管哮喘疾病的药物中的应用。
涉及重组人溶菌酶作为制备治疗由非特异性变应原包括寒冷空气、大气污染、职业性粉尘、烟雾及精神因素等导致支气管哮喘疾病的药物中的应用。
所述的重组人溶菌酶为基因工程表达的重组人溶菌酶或基因工程表达人溶菌酶的氨基端带有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修饰的人溶菌酶或基因工程表达或化学合成突变体重组人溶菌酶。
所述药物剂型为气雾吸入剂，药物含有活性15000u～300万U/ml人溶菌酶。如采用德国菲弗公司出品的每次100ul的气雾泵。
为了更好地理解本发明的实质，下面将用基因重组人溶菌酶的药理、药效试验及结果来说明其在制药领域中的新用途。
基因重组人溶菌酶以配制200毫升培养基为基准，用H3PO44-8毫升、MgSO41-5克，K2SO42-6克，KOH1-3克，CaSO42H2O1-3.5克，加蒸馏水至200毫升，高压灭菌后接种甘油管种子，摇床转数为每分钟250转，培养温度为20-35℃，在恒温床上培养36-48小时。进行种子罐培养后进行生产罐培养。将发酵表达完成的培养液进行提取纯化，对提取纯化的蛋白浓缩液冰冻干燥，测定蛋白量、纯度和溶菌酶活性保存。将合格的基因重组人溶菌酶冻干粉溶于水中制得气雾剂。
气雾剂的制备工艺气雾剂应在避菌环境下配置，各种用具、容器等须用适应的方法清洁、灭菌，在整个操作过程中应注意防止微生物的污染。(在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成)制备工艺流程如下容器与阀门系统的处理和装配→药物的配制和分装→填充抛射剂→质量检查→成品(在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成)。
一、容器的处理在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成洗净、灭菌、烘干气雾剂罐备用。采用德国菲弗公司生产的气雾剂泵，用三氯甲烷熏蒸灭菌备用。
二、药物的配制和分装取重组人溶菌酶纯度95％以上、活性15000u～300万U/ml重组人溶菌酶溶液，司盘85 0.28g，油酸乙酸0.28g，134A 10g，磷酸盐缓冲液10～20mM(pH6.5～7.5)80％、5～25％丙二醇、在常温下混合均质，(在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成)配制成15000u～300万U/ml重组人溶菌酶气雾吸入剂成品。按分散体系配置后，分别经过质量检查，定量分装在已准备好的容器内，安装阀门，扎紧封帽。
三、抛射剂的填充抛射剂的充填方法分为压罐法，将已分装药物的容器装上阀门，扎紧封帽，先抽去容器内的空气，以免影响容器内的压力，然后通过压力灌装机将定量的抛射剂压灌入内。进入成品检定。
一、重组人溶菌酶对小鼠吸入盐酸性肺损伤炎症模型的作用将50只小鼠随机均分五组，每组10只，任意挑选其中四组进行吸入雾化盐酸造模。将造模后的40只小鼠重新合并后再随机分成四组，分别设立三给药组和一模型组。重组人溶菌酶临床雾化治疗时药液的浓度为15000u/ml，初步拟定剂量为15000u/次，每日一次，即0.5mg/次/日。按体表面积推算至小鼠剂量为1.3×10-3mg/只(20g体重计)，由于人通气量9000ml/分相当于小鼠通气量24ml/分的375倍，人用单次剂量0.5mg/70kg相当于小鼠剂量1.3×10-3mg/20g的384倍，以上二者较为接近。所以设定用临床人用浓度0.5mg/ml对小鼠进行雾化治疗，另考虑到临床人用吸入雾化溶菌酶气体利用率较高，而小鼠在雾化缸内只能靠自身呼吸吸入含药气体，故只有延长吸入时间才能确保吸入药量，设定为一小时。在0.5mg/ml为低剂量浓度基础上再配制1.0mg/ml、2.0mg/ml二浓度作为中、高剂量组治疗时的药液浓度。
小鼠置于玻璃干燥器后，用PAR1.BOY压缩喷雾器雾化不同浓度的人溶菌酶液对小鼠进行雾化治疗，每日一次，连续5-10天。
雾化治疗第5天和10天时，每组处理一半动物(5只)，解剖取肺组织称重，并根据体重计算肺脏器系数，肉眼观察肺外观病变情况，取肺组织进行病理切片观察。
实验结果(1)雾化治疗5天后，解剖发现模型组小鼠肺呈暗红色，有个别肺叶颜色更深暗，比正常对照组的肺色泽相比存在明显反差，正常对照组肺呈鲜明淡粉红色。各用药组肺外观色泽有较明显的改观。各组肺脏器系数见表1。
表1雾化治疗5天后各组小鼠肺脏器系数动物数 肺脏器系数组别 体重(g) P值(只) (g/g)×10-3正常对照组 5 30.2±1.6 6.4±0.69模型组5 24.5±2.7 10.5±1.60 ＜0.01(与正常对照组比)高剂量组 5 29.4±3.3 9.1±1.00 ＞0.05(与模型组比)中剂量组 5 29.2±2.4 7.8±0.65 ＜0.01(与模型组比)低剂量组 5 29.6±1.6 7.30±0.43 ＜0.01(与模型组比)由表1可见，雾化治疗5天后，模型组体重仍明显低于正常对照组，用药组使体重恢复。模型组肺脏器系数明显增大，用药组除高剂量组外，中、低二剂量组与模型组比较显著性下降。
病理切片结果显示，模型组肺组织大片弥散分布性肺泡壁明显增厚，致肺泡压闭，其间多量单核细胞及部分中性白细胞浸润。4/5只产生病变；高剂量组有2/5只呈现病变，为细支气管周单核细胞为主浸润，另一只为多处小灶分布肺泡壁增厚伴单核细胞浸润，其余3/5只正常；中剂量组5/5只基本正常；低剂量组4/5只基本正常，有一只为肺泡壁型及细支气管周少许单核细胞浸润。
(2)雾化治疗10天后，解剖发现模型组小鼠肺似呈暗红色，与正常对照组相比较明显存在色泽反差，并且该组动物于第9天有死亡(一只)，解剖肺脏见有重试病变，系暗黑色。各用药组小鼠肺外观有较大程度改观，各组肺脏器系数见表2。
表2 雾化治疗10天后各组小鼠肺脏器系数动物数 肺脏器系数组别 体重(g)值(只) (g/g)×10-3正常对照组5 31.6±2.46.38±0.68模型组4 28.0±1.99.90±0.66 ＜0.01(与正常对照组比)高剂量组 5 31.2±2.08.32±1.84＞0.05(与模型组比)中剂量组 5 30.6±2.28.30±1.40＞0.05(与模型组比)低剂量组 5 30.7±3.07.10±0.61＜0.01(与模型组比)由表2可见，雾化治疗10天，模型组体重的显著性(P＜0.05)低于正常对照组，各用药组体重与正常对照组接近，模型组肺脏器系数显著性(P＜0.01)高于正常对照组，用药组有下降趋势，但只有低剂量组表现显著。
综合以上实验结果分析，重组人溶菌酶治疗小鼠吸入盐酸性肺损伤模型有效，以临床人用浓度进行雾化治疗疗效最佳，其治疗效果与使用剂量无明显量效关系。
二、重组人溶菌酶抑制豚鼠牛血清白蛋白过敏反应试验模型将20只健康豚鼠随机均分四组，每组5只，进行静脉注射牛血清白蛋白造模。将造模后的20只小鼠重新合并后再随机分成四组，分别设立三个给药组和一模型组。重组人溶菌酶临床气雾剂治疗时药液的浓度为15000u/ml，初步拟定剂量为15000u/次，每日3～5次，即0.5mg/次/日。(按体表面积推算至豚鼠剂量为1.3×10-3mg/只(250g体重计)，由于人通气量9000ml/分相当于豚鼠通气量31ml/分的290倍，人用单次剂量0.5mg/70kg相当于小鼠剂量1.3×10-3mg/250g的280倍，以上二者较为接近)。所以设定用临床人用浓度0.5mg/ml对小鼠进行雾化治疗，另考虑到临床人用气雾吸入重组人溶菌酶气体利用率较高，而小鼠在雾化缸内只能靠自身呼吸吸入含药气体，故只有延长吸入时间才能确保吸入药量，设定为一小时。在15000u/ml为低剂量浓度基础上再配制30000u/ml、60000u/ml二浓度作为中、高剂量组治疗时的药液浓度。在第二十一天给每只豚鼠静脉注射牛血清白蛋白前一个小时，将豚鼠置于玻璃干燥器后，用PAR1.BOY压缩喷雾器雾化不同浓度的重组人溶菌酶液对豚鼠进行雾化预防。然后给每只豚鼠静脉注射牛血清白蛋白1mg，肉眼观察豚鼠形态变化情况和死亡数量及时间。
实验结果豚鼠静脉注射牛血清白蛋白后10秒钟模型组出现咳嗽、气促和挠唇现象。30秒钟后模型组豚鼠全部死亡。给药重组人溶菌酶组30小时豚鼠仍然全部存活。给药重组人溶菌酶组和一模型组有明显区别。见表3、见表4表3气雾治疗第1天动物数组别 用药后10秒 用药后30秒用药后60秒(只)模型对照组5只4只0只 0只模型高剂量组 5只5只5只 5只模型中剂量组 5只5只5只 5只模型低剂量组 5只5只5只 5只表4 气雾治疗第二天动物数组别 用药后10小时用药后20小时用药后30小时(只)模型对照组0只 0只0只 0只模型高剂量组 5只 5只5只 5只模型中剂量组 5只 5只5只 5只模型低剂量组 5只 5只5只 5只综合以上实验结果分析，对豚鼠静脉注射牛血清白蛋白进行过敏反应试验重组人溶菌酶雾化保护，有很好的保护预防效果。其保护预防效果与使用剂量无明显量效关系。
具体实施例方式
实施例1基因重组人溶菌酶以配制200毫升培养基为基准，用H3PO44-8毫升、MgS041-5克，K2SO42-6克，KOH1-3克，CaSO42H2O1-3.5克，加蒸馏水至200毫升，高压灭菌后接种甘油管种子，摇床转数为每分钟250转，培养温度为20-35℃，在恒温床上培养36-48小时。进行种子罐培养后进行生产罐培养。将发酵表达完成的培养液进行提取纯化，对提取纯化的蛋白浓缩液冰冻干燥，测定蛋白量、纯度和溶菌酶活性保存。将纯度95％的基因重组人溶菌酶制得300U～300万U/mL，磷酸盐缓冲液10～20mM(pH6.5～7.5)80％、5～25％丙二醇、 万分之五吐温80，司盘85 0.28g，油酸乙酸0.28g，134A 10g，在常温下混合均质，(在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成)制成气雾吸入剂。
实施例2
取重组人溶菌酶纯度95％以上、活性15000u～300万U/ml重组人溶菌酶溶液，司盘85 0.28g，油酸乙酸0.28g，134A 10g，磷酸盐缓冲液10～20mM(pH6.5～7.5)80％、5～25％丙二醇、在常温下混合均质，(在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成)配制成15000u～300万U/ml重组人溶菌酶气雾吸入剂成品。按分散体系配置后，分别经过质量检查，定量分装在已准备好的容器内，安装阀门，扎紧封帽。进入成品检定。
权利要求
1.人溶菌酶在制备治疗由特异性变应原花粉导致支气管哮喘疾病的药物中的应用。
2.人溶菌酶在制备治疗由特异性变应原尘螨、蟑螂、动物皮屑和分泌物导致支气管哮喘疾病的药物中的应用。
3.人溶菌酶在制备治疗由特异性变应原呼吸道病毒感染、霉菌、化妆品、鱼及虾等导致支气管哮喘疾病的药物中的应用。
4.人溶菌酶在制备治疗由非特异性变应原包括寒冷空气、大气污染、职业性粉尘、烟雾及精神因素等导致支气管哮喘疾病的药物中的应用。
5.根据权利要求1、2、3、4所述的人溶菌酶的应用，其特征是人溶菌酶为基因工程表达的重组人溶菌酶、基因工程表达人溶菌酶的氨基端带有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修饰的人溶菌酶或基因工程表达或化学合成突变体重组人溶菌酶。
6.根据权利要求1、2、3或4所述的人溶菌酶的应用，其特征是药物剂型为气雾吸入剂。
7.根据权利要求6所述的人溶菌酶的应用，其特征是药物含有活性15000u～300万U/ml人溶菌酶。
8.根据权利要求6所述的人溶菌酶的应用，其特征是气雾吸入剂采用德国菲弗公司出品的每次100ul的气雾泵。
全文摘要
本发明涉及一种人溶菌酶的新用途，特别是涉及制药领域中人溶菌酶的新用途。本发明提供一种人溶菌酶在制备治疗由各种特异性和非特异性变应原引起的支气管哮喘疾病的药物中的应用。药物剂型为气雾吸入剂，使用安全方便，释药速度快，作用迅速，能够达到理想的临床治疗效果。
文档编号A61K38/48GK1583167SQ20041002073
公开日2005年2月23日 申请日期2004年6月10日 优先权日2004年6月10日
发明者张华 申请人:张华