专利名称：一种茄根提取物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明提供了一种茄根提取物，是涉及药材茄根的提取物的酸性物质，本发明还提供了该提取物的制备方法和用途。
背景技术：
茄是我国主要蔬菜之一。早在公元六世纪就已广为种植，《齐民要术》记载了详细的栽培技术。茄根，来源于茄科茄Solamum melongenaL.[S.esculentum Dunal；S.melongena L.var.esculentum(Dunal)Nees]的干燥根，入药首载于《开宝本草》，为土家族常用药物之一，本品味甘、微苦、辛，性寒。能祛风利湿、清热止血、散瘀消肿、止痛。主治风湿热痹、牙痛、脚气、血痢、便血、痔血、血淋、妇女阴痒、皮肤瘙痒、冻疮等，用于治疗风湿痹痛、牙痛、冻疮等，具有疗效显著，资源丰富易得，制备简便，毒副作用小等多种优势，具有良好的研究和开发利用价值。
目前对茄根的研究较少，系统研究其药理作用的报道也较少，其抗炎机理研究尚未涉及。茄根的化学成分复杂，根皮中含薯蓣皂甙元(diogenin)，根含香草醛(vanillin)，异东茛菪素(isoscopoletin)，对-氨基苯甲醛(p-aminbenzaldehyde)，咖啡酸乙酯(ethyl caffeate，N-反式-阿魏酰基酪胺(N-trans-feruloyltyramine)，N-反式阿魏酰基去甲辛弗林(N-trans-feruloyoctopamine)，N-反式-对香豆酰基酪胺(N-trans-P-coumaroyltyramine)，N-反式-对-香豆酰基去甲辛弗林(N-trans-P-coumaroyloctoPamine)，反式一阿魏酸(trans-ferulicacid)等，以及水苏碱(stachydrine)、胆碱(choline)、茄碱(solanine)等多种生物碱，目前茄根的临床主要用于治疗风湿痹痛、牙疼、冻疮皲裂，亦可用于治疗荨麻疹等，但有关其药理作用系统研究极少。近年来，汪鋆植等人报道，茄根总生物碱具有镇痛、抗凝血、抗心肌缺血等多种药理作用。朱曲波等人报道茄根醇提物有镇痛、抗炎、改善微循环及抑制子宫和肠道平滑肌的作用，并认为发挥其药理作用的主要成分是生物碱。文献报道的提取物为茄根醇提取物，没有进行系统筛选，也没有明确指出有效成分种类，因此，筛选有效部位，并转化成产品，达到质量稳定、可控是目前需要解决的问题。
现有药物中具有消炎作用，治疗牙周炎的常用药物是抗菌素如甲硝唑、替硝唑、四环素、米诺环素、螺旋霉素、阿莫西林、强力霉素等，非抗菌素如布洛芬、芬必得等，中药如清胃散、玉女煎、固齿丸等，但这些药物易引起菌群失调，且毒副作用大。
发明内容
本发明所要解决的技术方案是提供了一种茄根提取物，更具体地说，是茄根的有效部位群，它是一种酸性物质，本发明还提供了该茄根提取物的制备方法和用途。
本发明提供一种茄根提取物，它是一种酸性物质，在以下条件下，具有如附图1所示的HPLC指纹图谱特征，即同时具有两个明显特征峰，分别是Y1峰保留时间为16.9±1.0min，Y2峰保留时间为18.7±1.0min；其中Y1峰的紫外光谱谱图如附图2所示，分别在λ＝207.8nm，λ＝261.7nm有吸收峰，Y2峰紫外光谱谱图如附图3所示，分别在λ＝203.1nm λ＝247.6nm有吸收峰；采用高效液相色谱法，色谱条件为色谱柱ODS250mm×4.6mm，5μm；柱温30℃；流动相甲醇-水7∶3；进样量20μl；流速1.0ml/min；检测波长207.8nm。
其中所述的茄根来源于茄科植物茄Solamum melongena L.的根和茎。
由于该本发明提取物组分成分复杂，无法用其中的某一已知成分控制质量，因此采用高效液相色谱法，通过对茄根提取物中的共有峰的保留时间的测定，既对提取物的限定，又达到质量控制作用，且实验证明该特征峰物质具有显著的药效。
本发明提供了该茄根提取物的制备方法，其特征在于a、取茄根切片，采用碱提酸沉法提取，得滤液和沉淀；b、将a步骤所得沉淀洗涤，干燥，用乙醇提取，回收乙醇，干燥，即得。
其中步骤a所用的碱液的pH值为7.5～11.5；酸液pH值为5～6。步骤b所用的乙醇浓度为95％v/v。
上述提取方法为碱提酸沉法，说明本发明提取产物并非生物碱类成分，而是酸性组分，为一类新的有效部位群。
本发明还提供了该茄根提取物在制备抗炎药物中的用途。
进一步地，在制备治疗牙周炎的药物中的用途。
本发明还提供该茄根提取物在制备抗菌药物中的用途。
本发明提供一种药物组合物，它含有所述的茄根提取物与药学上接受的辅料制成的制剂。
所述的制剂是固体制剂、液体制剂。进一步地，所述的制剂是胶囊剂、丸剂、颗粒剂、片剂、口服液。
其中人日服剂量为干燥的茄根提取物40～240mg。具体地，人日服剂量为干燥的茄根提取物20～80mg/每次，一日2～3次。
其中本发明茄根提取物HPLC图谱建立方法，它包括下列步骤步骤一供试品制备精确称取经干燥后的酸性组分，加入甲醇提取，甲醇定容至刻度，离心，取上清液作为供试品溶液；步骤二精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定法测定，计算供试品的色谱峰的相对保留时间。
其中步骤二中的色谱条件为色谱柱ODS(250mm×4.6mm，5μm)；柱温30℃；流动相甲醇-水(7∶3)；进样量20μl；流速1.0ml/min；检测波长；207.8nm。
通过药效学试验表明，本发明茄根提取物对急、慢性炎症具有良好的抗炎效应，能阻断牙周组织破坏和牙槽骨的吸收，控制炎症反应，具有治疗牙周炎的作用；具有一定的抗厌氧菌作用，对多种口腔致龋菌和牙周病原菌具抗菌活性，且疗效肯定，用量小、副作用小，特别是胃肠道反应小；来源于天然药物，资源丰富易得，成本低，安全、有效、稳定、可控。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
图1本发明茄根提取物酸性组分色谱2本发明茄根提取物酸性组分中保留时间16.9min的组分的峰光谱3本发明茄根提取物酸性组分中保留时间18.7min的组分的峰光谱4茄根醇提物的色谱图具体实施方式
实施例1茄根抗炎有效部位筛选的药效实验1、实验动物昆明种小鼠(除做急性毒性试验雌、雄各半外)，其余为全雄，体重18～22g；C57BL/6小鼠，全雄，体重20～25g；Wistar全雄大鼠，体重180～250g。由华中科技大学实验动物中心提供，合格证号大鼠TJLA-2003-57，66；小鼠TJLA-2003-41，58，67。
2、实验药材鉴定为茄科植物Solamum melongena L.的根。
3、数据处理各组数据以x±s表示，用SPSS11.0统计软件包处理。两两比较用t检验，多组比较采用方差分析进行统计。
4、茄根抗炎有效部位筛选4.1、有效部位筛选采用溶剂梯度萃取，小鼠足肿胀模型检测，确定有效部位。
分别用水提取、95％v/v乙醇提取、氯仿提取。提取液冰箱放置12h，取上清液回收溶剂，浸膏备用。
取昆明种雄性小鼠(18-22g)，分组灌胃给药(3g/kg)(给药溶积为0.1ml/10g，用吐温-80增溶，吐温用量0.5％)，连续用药三天，末次给前标记并测定小鼠右后足溶积，以两次的平均值为正常值，给药30min后于小鼠右后足足跖部注射20ul/只0.5％的角叉菜胶致炎，致炎后30min、90min、120min、180min分别测定足溶积。计算肿胀率[1]。结果见表1表1茄根不同提取物对小鼠角叉菜胶足肿胀的影响X±S组别动物数剂量 肿胀率％(只)(d)(g/kg) 30min 90min120min 180min水提取物10 3 33.72±12.4757.30±25.17 55.49±26.1149.21±22.75醇提取物10 3 21.88±15.7827.47±20.91*38.71±21.3234.67±17.40氯仿提取物 10 3 31.45±14.6755.63±26.92 58.01±26.3549.58±21.66空白对照10 - 34.32±10.4758.21±28.30 53.56±29.2848.70±21.01*与空白对照组比p＜0.05结果初步显示茄根中的主要抗炎成分为醇溶性成分。从醇提物中制备碱溶组分、酸溶组分、酸碱不溶组分重复上述实验。结果见表2。
表2茄根醇提物不同组分对小鼠角叉菜胶足肿胀的影响X±S组别 动物数 剂量 肿胀率％(只)(d)(mg/kg) 30min 90min 120min 180min酸碱不溶组分 10 20 33.58±12.6757.59±27.35 56.82±25.37 47.39±21.53碱溶组分 10 20 16.19±16.0422.39±17.08*29.00±17.62*28.84±16.79酸溶组分 10 10 19.45±13.6025.04±17.38*28.14±16.63*29.13±16.52空白对照 10 - 35.27±11.1560.34±29.63 57.82±31.18 49.95±22.37*与空白对照组比p＜0.05结果表明碱溶组分、酸溶组分均具有抗炎作用，酸溶组分主要为生物碱，含量低，约为0.12％，毒性大，在实验剂量下动物出现中毒反应或死亡碱溶组分即酸性组分含量高，约为2.2％，抗炎作用强。
用醇提物与碱溶组分重复上述实验，结果见表3。
表3茄根醇提物、碱溶组分对小鼠角叉菜胶足肿胀的影响X±S组别动物数 剂量 肿胀率％(只) (d)(mg/kg) 30min 90min 120min 180min醇提物 10 2034.27±13.2361.12±25.31 56.32±22.67 47.95±22.41醇提物 10 4027.51±18.0644.90±23.84 12.35±23.74 39.69±21.83碱溶组分10 2017.60±15.7824.47±19.28*30.95±17.35*29.16±15.42碱溶纽分10 4016.73±14.6823.52±16.49*26.17±14.33*25.07±12.46*空白对照10 - 35.27±11.4560.34±29.63 57.82±31.18 49.95±22.37
*与空白对照组比p＜0.05通过上述的筛选试验表明，碱溶组分比同剂量的醇提物的抗炎作用强，碱溶组分是茄根中抗炎的主要有效组分，即本发明的酸性组分。
实施例2茄根提取物酸性组分的制备根据实施例1的茄根抗炎有效部位筛选实验，结果表明碱溶组分是茄根中的抗炎的主要有效组分，故本发明的制备方法是先用碱提醇沉法提取，取沉淀，再用乙醇提取，详细制备方法如下取茄根切片，加入1％w/wNaOH溶液(或KOH溶液)pH值为7.5～11.5，80℃浸提2次，每次30min，过滤，将滤液加入10％w/wHCl(盐酸)溶液调pH至5～6放置过液，得滤液和沉淀，将沉淀用蒸馏水洗涤数次，80℃干燥，得干燥物；将干燥物用95％v/vEtOH(乙醇)回流提取二次，每次1h，得提取液，提取液回收EtOH后80℃干燥，即得本发明茄根提取物酸性组分。
实施例3本发明茄根提取物的HPLC实验供试品制备精确称取经80℃干燥后的实施例2制备的本发明茄根提取物酸性组分10mg，置20ml容量瓶中，精确加入甲醇20ml，称定重量，超声处理30min，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，静置。取上清液离心，并用0.45μm滤膜过滤，即得。
采用同样的供试品制备方法，精确称取茄根醇提取物(制备方法为95％乙醇提取，经石油醚脱脂部分，即得)配制供试品对照(高效液相色谱图见附图4)。
色谱条件色谱柱ODS(液相色谱柱)(250mm×4.6mm，5μm)；柱温30℃；流动相甲醇-水7∶3；进样量20μl；流速1.0ml/min；检测波长207.8nm。
从色谱图(附图1、2、3、4)可以初步判断保留时间为16.9分、18.7分的物质在醇提物中含量低，在酸性组分中含量高，是酸性组分中的主要成分。采用上述方法，多次对供试品进行测定，结果为两特征峰的保留时间分别为16.9±1.0min、18.7±1.0min。
实施例4本发明药物片剂的制备取实施例2制备的茄根提取物酸性组分1000g，加入淀粉和1％硬脂酸镁，压片，使每片含本发明茄根提取物酸性组分10-30mg。(所用的辅料可以是微晶纤维素、改性淀粉、乙基纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠等片剂常用的辅料中的一种或几种)。
实施例5本发明药物胶囊剂的制备取实施例2制备的茄根提取物酸性组分1000份g，加入淀粉，制粒，整粒，装胶囊，每粒胶囊中含有本发明茄根提取物酸性组分10-30mg。(所用的辅料可以是微晶纤维素、改性淀粉、乙基纤维素、甲基纤维索、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠等胶囊剂常用的辅料中的一种或几种)。
以下通过具体的药效学试验说明本发明的有益效果。
实验例1本发明药物的抗炎实验1、本发明茄根提取物对急性炎症模型的影响1.1对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性亢进的影响[2]取健康雄性小鼠60只，按体重随机分为6组，连续灌胃给药3天。末次给药后30min，小鼠尾静脉注射1％伊文思蓝0.1ml/10g体重，同时腹腔注射0.6％醋酸溶液0.2ml/只，20min后处死小鼠，用5ml蒸馏水冲洗腹腔，收集冲洗液，离心，取上清液于分光光度计590nm比色，以吸光度(OD)值判断小鼠腹腔毛细血管的通透性。结果见表4(消炎痛为吲哚美辛肠溶片，江苏林海药业有限公司制药分公司，0105211牙痛—粒丸，广州敬修堂(药业)股份有限公司，020204)表4对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性的影响X±S组别动物数 剂量 吸光度(OD)(只) (d)(mg/kg)本发明茄根提取物10 40 0.382±0.102**本发明茄根提取物10 30 0.450±0.117**本发明茄根提取物10 20 0.487±0.143**牙痛—粒丸组10 0.6粒/kg 0.155±0.213**消炎痛组10 10 0.414±0.150**空白对照组 10 -0.676±0.158**与空白对照组比p＜0.01结果显示本发明茄根提取物对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性亢进具有显著抑制作用，其作用随剂量增大而增强。
1.2对鸡蛋清致小鼠足肿胀的影响取健康雄性鼠60只，按体重随机分为6组，每组动物连续灌胃给药3天。末次给前标记并测定小鼠右后足溶积，以两次的平均值为正常值，给药30min后于小鼠右后足足跖部注射20ul/只10％新鲜蛋清至炎，至炎后30min、90min、150min、180min分别测定足溶积。计算肿胀率，并测定肿胀足组织中PGE2(前列腺素E-2)含量，测定方法(取实验小鼠致炎后足，称重后划破皮肤，没于1ml生理盐水中，不时振摇，2小时后取出，将浸泡液离心，取上清液0.2ml，加0.5mol/L KOH一甲醇溶液0.5ml，50℃水浴异构化20min，加甲醇2ml，于278nm波长处测定OD值，以每克炎性组织相当的吸收光密度值表示PGE2的含量)。结果见表5、表6。
表5对小鼠蛋清足肿胀的影响X±S组别动物数 剂量肿胀率％(只) (d)(mg/kg) 30min90min 120min180min本发明茄根提取物10 40 15.15±7.25 18.10±8.32** 17.73±10.84** 17.56±10.52*本发明茄根提取物10 30 19.05±7.68 22.98±9.52*20.63±11.23* 17.96±12.03*本发明茄根提取物10 20 20.89±6.06 24.19±8.73*22.13±11.52* 20.37±11.37*牙痛—粒丸组10 0.6粒/kg 18.21±9.86 25.79±10.3521.05±13.48* 20.88±10.99消炎痛组10 10 16.34±9.78 18.15±10.97** 16.33±9.96** 16.13±9.78**空白对照组 10 -23.19±10.62 36.48±16.4932.69±13.5328.20±8.86*与空白对照组比p＜0.05，**与空白对照组比p＜0.01表6对蛋清致小鼠足肿胀炎性组织中PGE2含量的影响X±S组别动物数 剂量 吸光度(OD)(只) (d)(mg/kg)本发明茄根提取物10 401.089±0.127**本发明茄根提取物10 301.207±0.173**本发明茄根提取物10 201.354±0.186**牙痛—粒声丸组 10 0.6粒/kg 1.218±0.139**消炎痛组10 101.231±0.093**空白对照组 10 - 1.868±0.219**与空白对照组比p＜0.01结果显示本发明茄根提取物对蛋清致小鼠足肿胀有显著抑制作用，对蛋清致小鼠足肿胀炎性组织中PGE2含量升高有显著降低作用，作用随剂量增大而增强。
2、本发明茄根提取物对慢性炎症模型的影响2．1对小鼠棉球肉芽肿的影响[1]取健康雄性小鼠50只(18-22g)，按体重随机分为5组，如下表。给约当日于小鼠腋窝皮下手术值入灭菌棉球(10±0.5mg)，连续灌胃给药7天。7天后处死小鼠，剥离肉芽组织，于60℃烘箱中烘干(4h)，称重，计算肉芽肿重及肉芽指数。结果见表7。
表7对小鼠棉球肉芽肿的影响X±S组别 动物数剂量 肉芽肿重 肉芽指数相馆 (只) (d)(mg／kg) mg本发明茄根提取物 104016.7182±2.46453.1814±1.1227**本发明茄根提取物 103018.6700±1.54563.7817±0.6272**本发明茄根提取物 102019.1100±0.55674.1810±0.3655**牙痛—粒丸组 100.6粒/kg 18.6500±1.26513.9837±0.3655**空白对照组 10- 21.8300±2.67135.6450±1.5416**与模型对照组比p＜0.01结果显示本发明茄根提取物对小鼠棉球肉芽肿有非常显著抑制作用，作用随剂量增大而增强。
2.2对大鼠佐剂性关节炎的影响取合格Wistar大鼠24只，随机分成模型组、雷公藤组(0.06片/kg)(雷公藤片，湖北黄石制药厂，20021107)、本发明茄根提取物组(20mg/kg)三组，每组8只。先测量左右后踝关节周长，然后分别灌服药物，连续给药24天，于第1天给药后1小时，每鼠右后跖皮下注射弗氏完全佐剂0.1ml，此后隔天测量大鼠左右后肢踝关节周长，计算各组动物在不同时间的足肿胀程度。实验显示，本发明茄根提取物对佐剂性关节炎具有良好的抗炎作用，对因迟发型超敏反应所引起的继发性炎症有抑制作用。
28天后处死上述各组动物，于右后足踝关节上1cm处剪下右后足，经X线检查，条件为40kV，500mA0.12S，焦-片距180cm，滤线器(+)。结果骨密度雷公藤片组与本发明茄根提取物组相似，两组均高于模型组，与模型组相比有显著性差异。
3、对下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴的影响[1、2]3.1、对戊巴比妥钠麻醉大鼠蛋清足肿胀的影响取健康雄性wistar大鼠，体重180～220g。随机分为5组，每组动物连续灌胃给药3天。实验前在各鼠右后足踝关节处左标记，用足容积测定仪测定各鼠足容积两次，取平均值作为正常足容积。末次给药后30min，腹腔注射戊巴比妥钠溶液(30mg/kg)。待动物麻醉后，致炎，分别于致炎后30、60、120、180min测定致炎足容积，计算各大鼠致炎前后右后足容积变化值。以足肿胀率表示药物的抗炎效应。结果见表8。(消炎痛为吲哚美辛肠溶片，江苏林海药业有限公司制药分公司，0105211，吲哚美辛为非甾体抗炎药。)表8对麻醉大鼠蛋清足肿胀的影响X±S组别动物数剂量 肿胀率％(只) (d)(mg/kg) 30min 90min 120min180min本发明茄根捉取物8 40 25.29±8.6032.22±10.1326.55±6.43** 26.99±7.90*本发明茄根提取物8 30 25.12±7.9029.89±9.80 24.47±6.34** 25.57±5.14**本发明茄根提取物8 20 28.17±6.5528.14±6.76*25.35±9.88** 27.01±9.79*消炎痛组8 10 24.45±8.8030.90±9.80 26.53±8.47** 26.29±10.00**空白对照组 8 -31.94±5.2338.24±6.58 43.47±10.29 37.88±8.03*与空白对照组比p＜0.05**空白对照组比p＜0.01结果显示本发明茄根提取物对麻醉大鼠蛋清足肿胀有显著抑制作用，作用随剂量增大而增强。
3.2、对去肾上腺小鼠角叉菜胶足肿胀的影响取健康雄性昆明种小鼠，在无菌条件下手术摘除双侧肾上腺。术后肌肉注射庆大霉素抗感染，每日1次，共3日，并以精盐水代替自来水饲养。按动物体重随机分为5组，于术后第5日开始灌胃给药，连续3日。按2.1的方法进行行致炎，分别于致炎后30min、60min、120min、180min分别测定致炎足容积。结果见表9。
表9对去肾上腺小鼠角叉菜胶足肿胀的影响X±S组别 动物数剂量 肿胀率％(只) (d)(mg/kg)30min90min120min 180min本发明茄根提取物 101044.17±9.83 36.87±20.53#38.91±17.42#40.55±26.50#本发明茄根提取物 103039.34±17.56#42.21±21.10#35.32±20.79#44.28±20.14#本发明茄根提取物 102054.49±18.49 60.44±19.85 52.57±17.28#47.41±16.68*消炎痛 101058.34±15.34 49.83±22.46*45.51±16.46#54.15±19.28空白对照组 10- 60.80±14.96 70.74±14.51 74.53±13.09 70.97±20.01*与空白对照组比p＜0.05#与空白对照组比p＜0.01结果显示木发明茄根提取物对去肾上腺小鼠角叉菜胶足肿胀有显著抑制作用，作用随剂量增大而增强。
3.3、对去肾上腺小鼠角叉菜胶肿胀足中PGE2的影响。
取上述实验中小鼠致炎后足，测定PGE2的含量，测定方法同前。结果见表10。PGE2有扩张血管效应，主要作用于微循环，改变血管通透性，导敛炎症局部水肿。PGE2是已知的最强致热物质之一，它还能使其它介质引起痛觉致敏。PGE2是导致牙周炎病变过程中骨组织的破坏吸收最强的物质之一。
表10对去肾上腺小鼠角叉菜胶肿胀足中PGE2含量的影响X±S组别动物数剂量吸光度(OD)(只) (d)(mg/kg)本发明茄根提取物1010 0.949±0.234**本发明茄根提取物1030 0.940±0.127**本发明茄根提取物1020 1.006土0.144**消炎痛 1010 0.990±0.172**空白对照组 10- 1.316±.194**与空白对照组比p＜0.01结果提示，本发明茄根提取物对去肾上腺大鼠角叉菜胶肿胀足中炎症介质PGE2的释放有显著的抑制作用。
3.4、对大鼠肾上腺中VitC和胆同醇含量的影响[2]取健康雄性wistar大鼠，按体重随机分为4组，各组动物连续灌胃给药5天，阳性药物组于第4天开始腹腔注射ACTH(促肾上腺皮质激素)，5U/kg，共2次，各组于末次给药后1小时(19:00)开始断头处死动物。取各组动物右侧肾上腺，称重，置组织匀浆器内，加入5％TCA液3.5ml，制成匀浆，再加入已经酸预处理的炭末100mg，振摇，过滤。取滤液0.5ml置试管中，依次加入5％TCA(三氯醋酸)液1ml，10％硫脲50μl和2，4-二硝基苯肼溶液0.5ml，混匀，置60℃水浴中保温60min。移入冰水浴内，逐滴加入85％硫酸溶液2.5ml，边滴边摇，充分混匀。于分光光度计530mn处测定吸光度，根据所做VitC(维生素C)标准曲线回归方程Y＝361.35x+6.71，r＝0.9983计算肾上腺所含VitC的量，结果见表17。
另取各组动物左侧肾上腺，称重，用4℃生理盐水洗去血液，滤纸吸干，置匀浆器中，加入Bloor’s液(无水乙醇3份∶乙醚1份)2ml磨成匀浆。用2000rpm离心5min取上清液0.2ml置于试管中，于90℃烘箱干燥。然后用2ml无水乙醇溶解。以总胆固醇试剂盒测定胆固醇含量，结果见表11。
表11对大鼠肾上腺中VitC和胆固醇含量的影响X±S组别 动物数 剂量 VitC 胆固醇(只)(d)(mg/kg) mg/100gmg/g本发明茄根提取物 8 40 234.68±32.26 105.97±17.13本发明茄根提取物 8 20 255.8050±34.32109.93±15.69ACTH 8 50 190.41±23.05*83.90±16.49*空白对照组8 -257.07±41.24 111.73±13.58*与空白对照组比p＜0.05结果提示，本发明茄根提取物对大鼠贤上腺中VitC和胆固醇含量无明显影响。
实验证实本发明茄根提取物的抗炎作用不是通过对下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴的影响而发挥作用的，是一种直接作用。
4．本发明茄根提取物对脂类炎症介质的影响4.1、对花生四烯酸代谢途径关键酶COX2(环氧酶2)的影响[3、4]4.1.1、对LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞COX2生成的影响含药血清的制备[5]wistar雄性大鼠按体重随机分为4组。分别为正常血清对照组，阳性对照组，药物大、小剂量组。每日灌胃给药2次，连续5日，末次给药后1小时，股动脉取血，分离血清，56℃水浴灭活30min，0.22μm滤膜除菌，加入DMEM培养基，配成20％含药血清培养液，-20℃保存备用。
腹腔巨噬细胞的培养C57BL/6小鼠腹腔注射1％的可溶性淀粉，每只1ml。3天后断头处死。腹腔注射Hank’s液8ml/只，无菌条件下洗出腹腔细胞1000r/min，离心8min，细胞用Hank’s液洗一次，作细胞计数，用含10％新生小牛血清的DMEM培养基调整细胞浓度至106cell/ml。将细胞接种于96孔培养板中，每孔0.2ml，37℃，5％CO2。培养箱内培养6小时。
COX2活性测定用Hank’s液洗去未贴壁细胞，加入不含新生小牛血清的培养基，饥饿12小时。换液，于培养板中每孔加入200μl含药血清培养基，分组如下空白对照组、模型对照组加入含正常动物血清的培养基，阳性对照组、药物大、小剂量组分别加入含药血清培养基，37℃，5％CO2下培养1h，除空白对照组外，其余各组加入刺激剂LPS，使其终浓度为1μg/ml，培养6h；加入底物花生四烯酸(AA)，使其终浓度为10μmol/L，37℃温孵30min，测定上清液中PGE2量。用PGE2生成量表示COX2活性。以给药组引起的PGE2生成减少反映药物对COX2活性的抑制作用。PGE2的量用3H标记的PGE2放免试剂盒测定。用试剂盒中提供的方法制作标准曲线，根据待测样品测定值从标准曲线中计算出相应的浓度。所得标准曲线为Y＝-1.3765X+1246.3，r＝0.9404，结果见表18。
4.1.2、对小鼠腹腔巨噬细胞COX2生成后的抑制作用含药血清的制备，腹腔巨噬细胞的培养方法同上一个实验，只是细胞经LPS刺激(终浓度为1μg/ml)6h后，换液，培养板中每孔加入200μl含药血清培养基，培养1h，再加入底物花生四烯酸(AA)，使其终浓度为10μmol/L，37℃温孵30min，以后步骤同上一个实验相同。结果见表12。
表12对LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞COX2的影响组别 动物数 剂量 PGE2(pg/ml)前 后本发明茄根提取物 6 20mg/kg497.445±24.971*465.411±77.546*本发明茄根提取物 6 40mg/kg455.325±37.873*421.647±18.650*消炎痛组 6 20mg/kg442.405±89.093*434.884±45.315*正常组6 - 467.842±44.506*469.657±21.183*模型组6 - 592.970±35.489 558.683±62.803
*与模型对照组比p＜0.01可溶性淀粉诱导小鼠腹腔巨噬细胞，在炎症部位或炎症反应发生时，COX2表达显著增加。加入外源性AA，测定其产物PGE2，的含量，可判断COX2的活性、由表18可知，与正常对照组比较模型组PGE2含量显著增高本发明茄根提取物具有降低PGE2含量的作用，能极显著地抑制COX2的生成和COX2生成后的活性。
实验例2对牙周炎的影响1、对大鼠牙周炎的影响1.1、模型制备[6]。丝线结扎+高糖饲料喂养，四周后普通饲料喂养并口饲给药一周，观察治疗前后牙周病变症状。
1.2、病理变化观察分离造模测第一磨牙和牙龈，10％福尔马林固定，牙齿经甲酸脱钙，乙醇系列脱水，HE染色，光镜观察牙周组织病理改变。
正常对照组牙龈上皮和上皮下结缔组织无病理性改变，牙槽骨及骨髓腔均正常。
模型组牙周膜炎症明显，上皮下结缔组织血管扩张充血，并有大量中性粒细胞浸润，牙槽骨骨髓腔中也可见明显的血管扩张充血及大量中性粒细胞浸润。
阳性对照组(替硝唑)牙周膜炎症明显减轻，上皮下结缔组织血管扩张充血不明显，浸润的中性粒细胞明显减少。牙髓腔炎症反应也明显减轻。
高剂量组牙周膜炎症明显减轻，上皮下结缔组织有少量中性粒细胞浸润，牙槽骨骨髓腔中仅少量中性粒细胞浸润。
低剂量组牙周膜炎症明显减轻，上皮下结缔组织有少量中性粒细胞浸润，可见血管扩张充血，牙槽骨骨髓腔中可见中性粒细胞浸润。
1.3、PGE2含量。取实验中大鼠牙分离牙体与牙龈组织，分别没于2ml生理盐水中，不时振摇，2小时后取出，将浸泡液离心，取上清液0.2ml，加0.5mol/L KOH-甲醇溶液0.5ml，50℃水浴异构化20min，加甲醇2ml，于278nm波长处测定OD值，以每克牙体与牙龈组织相当的吸收光密度值表示牙髓与牙龈PGE2的含量，结果见表13、表14。
表13对牙周炎大鼠牙龈组织中PGE2含量的影响X±S组别 动物数 剂量 吸光度(OD)(只)(d)(mg/kg)本发明茄根提取物 8 40 2.3540±0.63171*本发明茄根提取物 8 20 2.7763±0.57525*替硝唑8 400 2.8647±0.45484*空白对照组8 -2.6437±0.44891模型对照组8 -3.4316±0.79322#*与模型对照组比p＜0.05#与空白对照组比p＜0.05表14对牙周炎大鼠牙髓组织中PGE2含量的影响X±S组别 动物数 剂量 吸光度(OD)(只)(d)(mg/kg)本发明茄根提取物 8 400.562±0.085本发明茄根提取物 8 200.574±0.156替硝唑 8 400 0.584±0.104空白对照组 8 - 0.535±0.140模型对照组 8 - 0.653±0.133#*与模型对照组比p＜0.05#与空白对照组比p＜0.05结果显示本发明茄根提取物对大鼠牙周炎牙龈组织中，PGE2含量有显著降低作用。对大鼠牙周炎牙髓组织中PGE2含量有降低作用趋势。但与模型对照组比差异不显著。
2、对自由基类炎症介质的影响2.1、对大鼠牙周炎大鼠牙周组织中NO(一氧化氮)的影响[7]取牙周炎大鼠牙龈组织制成10％匀浆。按一氧化氮试剂盒方法(硝酸还原酶法)测定匀浆液中NO的含量，结果见表15。y＝-1.67×10-3+1.82×10-2，r＝0.9980表15对牙周炎大鼠牙龈组织中NO含量的影响X±S组别 动物数 剂量 NO含量(只)(d)(mg/kg) nmol/100mg本发明茄根提取物 8 40 0.121±0.062本发明茄根提取物 8 20 0.122±0.055替硝唑8 400 0.126±0.046空白对照组8 -0.114±0.040模型对照组8 -0.149±0.042结果显示，本发明茄根提取物对牙周炎大鼠牙周组织中NO的含量有降低作用。但与模型组相比，无显著性差异。
2.2、对大鼠牙周炎牙周组织中MDA(丙二醛)的影响炎症过程中产生大量氧自由基，氧自由基与不饱和脂肪酸反应形成过氧化脂质(LPO)，LPO进一步分解为丙二醛(MDA)，MDA含量能直接反应脂质过氧化的速率和强度，并与自由基浓度呈正相关，因此MDA含量可粗略反映体内氧自由基与脂类反应的情况。用药后MDA含量的变化可揭示药物的抗氧化能力。
取牙周炎大鼠牙龈组织制成10％匀浆。按丙二醛测定试剂盒方法(硫代巴比妥酸法)测定匀浆液中MDA的含量。结果见表16。
表16对牙周炎大鼠牙龈组织中MDA含量的影响X±S组别 动物数 剂量 MDA含量(只)(d)(mg/kg)nmol/mg prot本发明茄根提取物 8 400.772±0.253#本发明茄根提取物 8 200.847±0.266替硝唑8 400 0.867±0.236空白对照组8 - 0.660±0.394t#模型对照组8 - 1.145±0415**与空白对照组比p＜0.05，#与模型对照组比p＜0.05结果显示，本发明茄根提取物对牙周炎大鼠牙周组织中MDA的含量有显著降低作用。(替硝唑，广东彼迪药业有限公司，20030104，替硝唑是临床常用得治疗牙周炎药物)3、本发明茄根提取物对炎症相关细胞因子的影响取牙周炎大鼠牙龈组织制成10％匀浆，用北京北方生物技术研究所提供的放射免疫分析测定盒测定IL-6(白细胞介素-6)、IL-8(白细胞介素-8)、TNFa(肿瘤坏死因子αTNF)，其中白细胞介素-6、白细胞介素-8、肿瘤坏死因子αTNF是一种重要的促炎因子，包括TNFα、TNFβ两种形式。主要由单核巨噬细胞产生。TNF可活化炎症白细胞，增强其吞噬和杀伤细胞活性；活化T细胞和促进B细胞增殖；刺激单核巨噬细胞合成细胞因子，包括IL-1、IL-6、IL-8及TNF本身；诱导血管内皮细胞和成纤维细胞合成CSF(集落刺激因子)抑制肿瘤细胞生长IL-6是单核巨噬细胞在IL-1和TNF等诱导下产生的一多功能细胞因子活化的T细胞、成纤维细胞、上皮细胞、成骨细胞等细胞也可分泌IL-6。IL-6的主要生物学功能为诱导活化的B细胞分化为浆细胞，使其免疫球蛋白的合成增加，并产生自身抗体，参与某些自身免疫性疾病的发病机制。
细胞因子TNFa、IL-1、IL-6和IL-8在牙周病的发病机制中起了重要的作用。本发明提取物药效实验显示，茄根酸性组分能显著对抗牙周炎大鼠牙龈组织中TNFa、IL-6、IL-8的升高，提示茄根酸性组分具有拮抗促炎细胞因子效应，结果见表17。
标准曲线IL-6 y＝0.0394-1.1567x R＝-0.9965IL-8 y＝0.4951-1.0751x R＝-0.9996TNFa y＝2.9789-0.9309x R＝-0.9988表17对牙周炎大鼠牙龈组织细胞因子的影响X±S组别 动物数 剂量IL-6 IL-8 TNFa(只)(d)(mg/kg) ng/g ng/g fmol/g本发明茄根提取物 8 40 6.0856±1.5909*9.3961±2.4133 128.6064±22.9142*本发明茄根提取物 8 20 6.3950±2.6160 9.6573±2.5822 137.8842±30.7195*替硝唑8 400 6.6840±1.5737*9.5276±2.6274 127.3113±31.6626*模型对照 8 - 9.4748±3.3526 11.9376±3.2078170.7210±41.9965空白对照 8 - 6.0466±1.0688*7.8478±2.3218*108.4592±23.6810**与模型对照组比p＜0.05结果显示本发明茄根提取物对牙周炎大鼠牙龈组织中IL-6、TNFa的升高有显著的抑制作用，对IL-8有抑制作用，但与模型组相比，无显著性差异。
4、本发明茄根提取物对牙周炎大鼠龈沟液及牙龈组织SOD酶活性的影响龈沟液采集用10-15mg干燥棉花放入龈沟中1min后取出称重，用棉花增加的重量代表龈沟液的量。棉花浸入1ml生理盐水中。用改良邻苯三酚法测定SOD酶活性。
邻苯三酚自氧化速率测定在25℃取4.5ml 50mmol/L，PH8.3K2HPO4-KH2PO4缓冲液，再加入50μl 50mmol/L的邻苯三酚，迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯，在325nm波长下每隔30s测定一次OD值，要求自氧化速率控制在0.070OD/min左右。
酶活性测定测定方法与测邻苯三酚自氧化速率相同，在加入邻苯三酚前分别加入大鼠龈沟液和10％牙龈组织匀浆上清液0.2ml，反应4min后测定OD值。以10mg龈沟液的OD值变化反应SOD酶活性差异。结果见表18、19。
表18对牙周炎大鼠龈沟液SOD酶活性的影响X±S组别 动物数 剂量 吸光度(OD)(只)(d)(mg/kg)治疗前治疗后本发明茄根提取物 8 100.227±0.0256*0.267±0.0264本发明茄根提取物 8 200.231±0.0260*0.248±0.0250替硝唑8 400 0.229±0.0278*0.261±0.0247空白对照组8 - 0.265±0.0373 0.273±0.0329*与空白对照组比p＜0.05表19对牙周炎大鼠牙龈SOD酶活性的影响X±S组别 动物数 剂量吸光度(OD)(只)(d)(g/kg)本发明茄根提取物 8 40 11.067±3.482本发明茄根提取物 8 20 9.748±2.276替硝唑8 400 10.28±2.59空白对照组8 - 13.056±3.745模型对照组8 - 8.446±2.376**与空白对照组比p＜0.05结果显示牙周炎大鼠龈沟液及牙龈组织SOD酶的活性显著降低。采用本发明茄根提取物治疗后，龈沟液及牙龈组织SOD酶活性的明显升高。
5、对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞NF-KB表达的影响[8]含药血清的制备同前。腹腔巨噬细胞的培养同前。将细胞接种于4孔培养板中，每孔3ml，37℃，5％CO2。培养箱内培养6小时。
NF-kB的测定用Hank’s液洗去未贴壁细胞，加入不含新生小牛血清的培养基，饥饿12小时。换液，于培养板中加入3ml含药血清培养基，分组如下阴性对照组、模型对照组加入含正常动物血清的培养基，阳性对照组、药物大、小剂量组分别加入含药血清培养基；除阴性对照组外，其余各组同时加入刺激剂LPS，使共终浓度为1μg/ml，培养12h每孔加入细胞消化液(0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA1∶1混合)2ml进行消化，待细胞变圆、悬浮后，取消化液1500r/min离心5min；弃上清液，细胞用PBS洗涤2次。加入1∶50兔抗人NF-kB p65 50μl置4℃冰箱内过夜；用PBS洗涤3次，加入1∶100稀释的FITC标记的羊抗兔IgG 50μl，4℃作用2hPBS洗涤2次，细胞移入专用管中，用流式细胞仪检测其平均荧光强度。结果见表20表20 LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞NF-KB表达的影响(X±S)组别 动物数(只)荧光强度(PMT2LOG)本发明茄根提取物 6 6.57±0.58*本发明茄根提取物 6 6.76±0.60*消炎痛6 6.07±0.48*空白对照组6 5.86±0.66*模型对照组6 8.60±0.77*与模型对照组比p＜0.01结果显示本发明茄根提取物对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞NF-KB表达升高有显著的抑制作用。
实验例3本发明茄根提取物对口腔致龋菌和牙周病原菌的抗菌活性初步研究1、实验材料1.1、实验菌株致龋菌10株，牙周病原菌16株，共计26株，由四川大学华西医学院卫生部口腔生物医学工程重点实验室提供，其中变形链球菌(S.mutans)8株，粘性放线菌(A.viscosus)2株、牙龈卜啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)4株、中间普氏菌(Provotella intermedia)9株、具核梭杆菌(F.nucleatum)2株、牙髓卜啉单胞菌(p.endodontalis)株。质控菌脆弱拟杆菌(B.fragilis)。
1.2、实验药品供试药品提取95％乙醇提取，减压浓缩至1∶1(1ml相当于原生药1g)，冰箱放置12h，过滤，滤液浓缩至流浸膏状，石油醚洗涤三次。1％NaHCO3溶解，滤液用10％HCl调PH至5-6，放置沉淀，过滤沉淀，水洗涤后，直空干燥。干燥物经粉碎得浅黄综色粉末。
2、实验方法与结果2.1、待测本发明茄根提取物原液配制用无菌蒸馏水配制1％Na2HPO4和1％NaH2PO4溶液，用Na2HPO4溶液溶解待测样品，以Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液调PH至7.5，配成500mg/ml的实验原液。
2.2、应用液配制采用二倍稀释法用无菌蒸馏水，将实验原液配制成系列实验应用液，浓度分别为500mg/ml、250mg/ml、125mg/ml、62mg/ml、31mg/ml、15.6mg/ml、7.8mg/ml、3.9mg/ml、2mg/ml、1mg/ml(共10个实验应用液)。
2.3、实验平皿制备本实验采用NCCLS推荐的琼脂稀释法药敏试验[9]取不同浓度的实验应用液各1ml，分别加入BHI-S琼脂9ml，充分混匀后倾注平皿备用。各琼脂平皿的含药浓度分别为；50mg/ml、25mg/ml、12.5mg/ml、6.2mg/ml、3.1mg/ml、1.56mg/ml、0.78mg/ml、0.39mg/ml、0.2mg/ml、c.1mg/ml。
2.4、实验菌液的配制用无菌PBS将实验菌配成实验菌液，菌液浓度为108CFU/ml。
2.5、正式实验用微量加样器取实验菌液6μl，点种在含药琼脂平皿表面(0.1mg/ml-50mg/ml含药平皿)。然后将已接种实验菌的含药平皿放置37℃，厌氧条件(80％N2、10CO2、10％H2)孵育48小时。
2.6、结果观察含药平皿上细菌的生长情况，并与不含药的对照平皿比较，以记录待测本发明茄根提取物对26株实验菌和质控菌株的MIC和MBC。
本发明茄根提取物对致龋菌的MIC和MBC为≥50mg/ml，对牙周病原菌的MIC为3.1-25mg/ml，MBC为6.2～50mg/ml。
实验表明本发明茄根提取物具有一定的抗厌氧作用，对多种口腔致龋菌和牙周病原菌具抗菌活性。
实验例4本发明茄根提取物急性毒性初步研究取小鼠60只，雌雄各半，体重18～22g，随机分成6组，分别分次灌服不同浓度本发明茄根提取物0.2ml，组间剂量比为1∶0.7，观察7天内的死亡数。结果见表21
表21本发明茄根提取物不同剂量灌胃给药小鼠死亡情况
结果显示小鼠的最大给药量为3570mg/kg，以人的一日用量为8mg/kg计算，小鼠的最大给药量为人一日量的446倍数。
小鼠腹腔注射LD50测定(改进寇氏法)取小鼠数只，雌雄各半，体重18～22g，随机分组，每组3只，腹腔注射不同浓度本发明茄根提取物0.2ml/10g，组间剂量比为1∶0.7，观察7天内的死亡数。引起小鼠0％和100％死亡的剂量分别为，857mg/kg、7286mg/kg。
取小鼠70只，雌雄各半，体重18～22g，随机分成7组，腹腔注射不同浓度本发明茄根提取物0.2ml/10g，组间剂量比为1∶0.75，观察7天内的死亡数。结果见表22表22本发明茄根提取物不同剂量腹腔给药小鼠死亡情况
本发明茄根提取物腹腔注射的LD50为3337±802.5mg/kg，95％可信限为2622～4227mg/kg，为人口服剂量的417倍。表明本发明茄根提取物口服安全可靠。
本发明茄根提取物发挥抗炎作用的机理主要在于抑制NF-kB的活化，从而控制了细胞因子、炎症相关酶环氧酶、5-脂氧酶等基因的转录及蛋白质的合成，进一步抑制各类炎症介质的分泌与释放。
通过上述实验说明，本发明茄根提取物是酸性组分，而非已有报道的生物碱类，它是抗炎活性很强的非甾体抗炎药，其作用强度与消炎痛相似，但毒副作用低，治疗剂量下未见明显毒副作用，可用于多种感染性炎症或无菌性炎症的治疗，如牙周炎、风湿性关节炎、类风湿性关节炎、扭伤、冻伤等，且疗效肯定，用量小、副作用小，特别是胃肠道反应小；来源于天然药物，资源丰富易得，成本低，安全、有效、稳定、可控。
相关文献1、徐叔云等主编.药理实验方法学.人民卫生出版社.北京.2002，第3版227；535；913-9292、陈奇主编.中药药理实验方法学.人民卫生出版社.北京.1993，3563、Mitchell JA，Akarasereenont P，Thiemerman C，et al.Selectivity ofnonsterodial anti-inflammatory drugs as inhibitors of constitutive andinducible cyclooxygenase.ProcNatl Acad Sci USA.1994，90116934、Engelhardt G，Bogel R，Schnitzer，C，et al.Meloxican influence onarachidonic acid metabolism，part 1.in vitro findings.Biochepharmacol.1996，51215、孟李，王宁生.血清药理学研究含药血清的制备方法研究.中药新药与临床药理1999，10(5)2926、陈铁楼，李秦，周以钧.大鼠实验性牙周炎动物模型研究.临床口腔医学杂志，1996，122047、毛钊，杨俭，曹永安等.老年牙周炎患者牙龈组织NO水平研究.实用口腔医学杂志.2001，17(5)7938、赵锦，吴静安.孙兴才内毒素对体外培养人角膜基质细胞表达核转录因子NFκB的影响.北京医科大学学报1998，3(6)8159、张均田主编.现代药理实验方法学.北京医科大学中国协和医科大学联合出版社.北京.1998，第1版(下册)141权利要求
1.一种茄根提取物，其特征在于它是一种酸性物质，在以下条件下，具有如附图1所示的HPLC指纹图谱特征，即同时具有两个明显特征峰，分别是Y1峰保留时间为16.9±1.0min，Y2峰保留时间为18.7±1.0min；其中Y1峰的紫外光谱谱图如附图2所示，分别在λ＝207.8nm，λ＝261.7nm有吸收峰，Y2峰紫外光谱谱图如附图3所示，分别在λ＝203.1nm λ＝247.6nm有吸收峰；实验条件采用高效液相色谱法，色谱条件为色谱柱ODS250mm×4.6mm，5μm；柱温30℃；流动相甲醇-水7∶3；进样量20μl；流速1.0ml/min；检测波长207.8nm。
2.根据权利要求1所述的茄根提取物，其特征在于所述的茄根来源于茄科植物茄Solamum melongena L.的根和茎。
3.权利要求1所述的茄根提取物的制备方法，其特征在于a、取茄根切片，采用碱提酸沉法提取，得滤液和沉淀；b、将a步骤所得沉淀洗涤，干燥，用乙醇提取，回收乙醇，干燥，即得。
4.根据权利要求3所述的茄根提取物的制备方法，其特征在于步骤a所用的碱液的pH值为7.5～11.5；酸液pH值为5～6；步骤b所用的乙醇浓度为95％v/v。
5.权利要求1所述的茄根提取物在制备抗炎药物中的用途。
6.根据权利要求5所述的茄根提取物的用途，所述的抗炎药物是治疗牙周炎的药物。
7.权利要求1所述的茄根提取物在制备抗菌药物中的用途。
8.一种药物组合物，它是由有效量的权利要求1所述的茄根提取物与药学上接受的辅料制成的制剂。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于所述的制剂是胶囊剂、丸剂、颗粒剂、片剂、口服液。
10.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于人日服剂量为干燥的茄根提取物40～240mg。
全文摘要
本发明提供了一种茄根提取物，它是茄根的有效部位群，是一种酸性物质，具有如附图1所示的HPLC指纹图谱特征，即同时具有两个明显特征峰，分别是Y
文档编号A61K9/16GK1682781SQ20041002228
公开日2005年10月19日 申请日期2004年4月12日 优先权日2004年4月12日
发明者汪鋆植, 叶红 申请人:汪鋆植