专利名称：一种用于促进伤口愈合的药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种其有效成分其来自天然植物提取物的药物组合物，特别涉及一种用于促进伤口愈合的药物。
背景技术：
创伤愈合(wound healing)是指机体遭受外力作用后，皮肤等组织出现断裂和缺损后的愈复过程。此过程是各种组织的再生和肉芽组织的增生、瘢痕形成的复杂组合。从创伤愈合现代概念的描述可以看到它是一个错综复杂的病理过程。其基础是炎症细胞和修复细胞的一系列活动。在软组织损伤中，主要的炎症细胞包括单核-巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等；主要的修复细胞包括成纤维细胞、内皮细胞、表皮细胞等。这些细胞的活动受到局部和全身因素的影响。根据创伤愈合的现代理论，多种体液介质和细胞介质均能影响炎症细胞和修复细胞的行为，从而参与调控创伤愈合过程。
目前，临床处理创伤的方法似乎仍停留在缝合术、清创术、皮肤移植及抗感染等治疗措施，尚缺乏加速伤口愈合的有效办法。现代创伤修复的概念认为，当机体受到损伤时，损伤部位周围的组织或细胞分泌多种促创伤愈合的因子，这些因子虽然含量甚微，但在创伤修复中起着极其重要的作用。
动物实验证明，许多细胞因子作为药物应用，可以加速正常组织的修复和逆转修复不良状态，这是因为利用基因工程的方法，可以产生这些细胞因子；这些细胞因子刺激修复所需要的细胞，如血小板、巨噬细胞、内皮细胞和成纤维细胞，这些细胞是伤口愈合的物质基础。巨噬细胞是使细胞因子促进修复之源，它合成细胞因子/生长因子，包括TGF-β，FGF，VEGF和MCP-1/JE。伤口巨噬细胞的缺乏将严重损害修复。许多细胞因子如PDGF，刺激炎症并且增加巨噬细胞在伤口浸润，从而促进修复。伤口的巨噬细胞释放的TGF-β，作为成纤维细胞胶原和其他基质蛋白沉积的激活剂。局部应用TGF-β在巨噬细胞缺乏的伤口中刺激修复，并且直接作用于成纤维细胞胶原代谢。新的血管生长带来了氧和营养，bFGF随着细胞外基质的分解而释放，并且和来自炎症细胞释放的VEGF一起刺激血管生成，增加内皮细胞增生。通过表皮细胞产生的KGF刺激再上皮化，KGF局部应用，刺激上皮再生，因此，组织修复是通过特异的多肽介质促进的细胞连锁反应。认识这一系列机制，就可以在临床进行修复的治疗性控制，以提纯的多肽生长因子，细胞因子和基质分子作为药物，加速正常组织的修复和修复不良的逆转，特别是对慢性不愈的伤口，包括褥疮、静脉淤血性溃疡的糖尿病性溃疡等的治疗。
能够刺激伤口修复过程的物质是有限的，尽管近来，研究报道多种生长因子可促进伤口愈合，但这些物质价格昂贵，其中最重要的是剂量和安全问题。由于多肽生长因子受体具有下调效应，因而使用时必须注意剂量不可过高，同时，生长因子类多数为细胞的分裂原，在体内使用时是否含有致癌作用，也是科学家关注的问题。
纵观世界新药的研究方向，80年代以前主要是研究开发单一的化学药物及其制剂，80年代以后开始发展生物技术和天然植物药物，药物研究方向趋于多样性。经过对中药成分进行筛选提取和复配得到的制剂，其副作用小，安全性高，具有化学合成药不能比拟的优势。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种来自不同天然植物的有效成分的药物组合，由两种有效成分复配而成，可用于促进创伤愈合。
申请人的天然药物研究与工程中心从陕西地道药材红毛七中提取分离纯化得到了一种生物碱-塔斯品碱，初步证实它可促进伤口愈合，而且国外文献报道其盐酸盐有抗炎作用；同时，已知中药黄连中提取得到的盐酸小檗碱(黄连素)有很好的抗菌作用。因为红毛七、黄连资源丰富，塔斯品碱易于纯化，因此将其按一定比例组成药物组合物，可望成为生长因子的替代品，并发挥抗菌作用，用于创伤愈合。
本发明的药物组合物中包括塔斯品碱和黄连素，其均来自中药原料，即所述药物组合物中含有红毛七中提取分离纯化得到的一种纯生物碱-塔斯品碱和黄连中提取分离的盐酸小檗碱。
根据本发明的优选方案，所述塔斯品碱可以来自红毛七(类叶牡丹)中提取分离的塔斯品碱及盐酸盐，所述黄连素则为黄连原料药的单体有效成分。
本发明尤其提供了一种可用于促进皮肤创伤愈合的药物组合物，其中塔斯品碱或盐酸盐与黄连素的比例为1∶1～1∶4，优选为大约1∶2。
本发明所称塔斯品碱(Taspine，thaspine)是指从本领域内公知的红毛七(Radia Caulophylli)或称葳岩仙，黑汉腿，红毛三七，海椒七，鸡骨升麻(四川)等小檗科植物类叶牡丹Leontice robustum(Maxim)Diels[Caulophyllumrobustum Maxim]根和根茎中提取的生物碱。
化学名[1]Benzopyrano[5，4，3-cde][1]benzopyran-5，10-dio-ne，1-[2-(diemthylamino)ethyl]-3，8-dimethoxy-结构式 分子式及分子量C20H19NO6；369.36物理性状熔点370℃，白色无定形粉末。
盐酸塔斯品碱与黄连素的组合物能明显促进皮肤创伤愈合，并发挥抗感染作用。
具体实施例方式
以下结合发明人给出的实施例和药效学实验对本发明作进一步的详细说明。
1.塔斯品碱的提取红毛七根茎及根粉碎，用85％乙醇(8倍量)提取两次，回收乙醇，浓缩得黑色粘稠状浸膏，经1％酸水提取近无色，得酸水液。酸水液用氨水调pH＝9～10，24小时，氯仿萃取，得总碱的氯仿提取液。回收，浓缩，得总碱的氯仿浓缩液，通入氯化氢气体，得生物碱的盐酸盐，用热水溶解，氨水调pH＝9～10，氯仿萃取，浓缩，硅胶拌样，得样品(1)。
2.分离(硅胶柱层析分离)样品(1)上直径8cm层析柱，以1∶10进行硅胶柱层析，流动相为氯仿-甲醇-氨水(3∶1∶0.2)，得黄带，回收溶剂，浓缩，得浓缩液，硅胶拌样，得样品(2)，上直径3cm层析柱，流动相为氯仿-甲醇-氨水(20∶1∶1)，收集无色且无荧光产生部分，回收，静置，冷却，得塔斯品碱(Taspine，TA)，塔斯品碱溶于氯仿中，通入氯化氢气体，得到盐酸塔斯品碱(taspine hydrochloride，TAY)。
药效学实验采用按照实施方案得到的塔斯品碱及其盐完成了体外体内实验，并与黄连素配伍组成组合物(1∶2)，证明本发明的药物有促伤口愈合作用。
1、盐酸塔斯品碱与黄连素组合物对大鼠皮肤损伤模型的影响SD大鼠100只，在同一部位用特制打孔器将背部皮肤圆形全层切除直径约1.8cm，面积约2.54cm2，形成机械损伤动物模型，随机分为5组①模型组和溶媒对照组(二甲基亚砜)；②阳性对照药碱性成纤维细胞生长因子组(bFGF)；③盐酸塔斯品碱与黄连素大剂量组(2mg+4mg)/mL；④中剂量组(1mg+2mg)/mL⑤小剂量组(0.5mg+1mg)/mL。每天给药2次，每次0.05mL，连续给药21天。术后每天观察表皮、肉芽组织生长情况，测量创面面积大小，计算愈合率。创伤后3、7、14、21天处死动物，每个时相点各取5只动物，处死取材。取伤口皮肤组织，10％福尔马林液固定，常规进行脱水，包埋及石蜡切片。其中取7d2只做电镜取材，戊二醛固定后放入二甲砷酸钠缓冲液，经锇酸固定清洗、脱水、浸透、包埋、做超薄切片，在光学显微镜、电子显微镜下观察记录。
结果模型组和溶媒对照组在术后3，5，7，10，14，18d天，创面愈合率没有显著性差异，说明溶媒对促进创面愈合没有影响。bFGF和给药组大、中剂量组与溶媒组比，在不同时期创面愈合率均有显著性差异。小剂量组对创面愈合率影响没有显著性。此实验表明盐酸塔斯品碱(2mg/mL，1mg/mL)与黄连素按1∶2的比例组成的组合物，能明显促进皮肤创伤愈合，并发挥抗感染作用。
2.MTT法观察塔斯品碱对成纤维细胞增殖的影响为探讨红毛七中生物碱在治疗皮肤粘膜创伤愈合中的作用，我们观察了TA、TAY对体外培养鼠成纤维细胞(FB)增殖的影响。
小鼠成纤维细胞来源L929(NCTC克隆929)来源于美国的ATCC。塔斯品碱、盐酸塔斯品碱实验前用适量二甲基亚砜溶解，加生理盐水配制成浓度为1mg/mL的溶液，过微孔滤膜除菌待用。
FB增殖状况的检测 采用MTT方法检测FB细胞增殖状况。将FB以1×105细胞/mL的密度接种于96孔板中，每孔200μL。培养24小时后，加入含不同浓度塔斯品碱、盐酸塔斯品碱培养液，药物的最终浓度为0、0.1、0.5、1、5、10、25、50、100μg/mL。培养48h后每孔加入MTT溶液20μL，37℃继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔内加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，振动10-15min，使结晶物充分溶解，选择490nm波段，在酶联免疫检测仪中测定各孔光密度值，记录结果。
结果不同浓度的塔斯品碱及其盐作用24h后，0.1和0.5μg/mL浓度组，成纤维细胞的形态基本正常，增生活跃，细胞数量较多，体积较大，排列紧密，对成纤维细胞的生长无明显影响；当浓度大于1μg/mL时，出现抑制作用；当药物浓度过高(大于5μg/mL)，细胞形态发生改变，呈圆形或不规则椭圆形，细胞贴壁减少，细胞内颗粒增多，表现出强烈的细胞毒作用；浓度在5～100μg/mL间，随浓度的增大细胞毒作用增强，且有呈剂量依赖关系。
当进一步降低塔斯品碱及其盐酸盐的浓度为0.01～0.5μg/mL时，并对其培养液进行乳酸脱氢酶的含量测定，结果证明上述浓度对L929成纤维细胞无毒性，并且不影响其增殖作用，细胞形态也无变化；当浓度≥0.5μg/mL时，部分细胞形态发生改变，细胞内颗粒增多，对成纤维细胞增殖有一定的抑制作用。
说明塔斯品碱促伤口愈合作用与成纤维细胞增殖没有关系，可能与促进成纤维细胞趋化性有关。
3.盐酸塔斯品碱对体外培养成纤维细胞自分泌生长因子的影响探讨盐酸塔斯品碱(TAY)作用于成纤维细胞，促进伤口愈合的作用机制。体外培养L929成纤维细胞，经不同浓度TAY(0.05、0.1、0.2、0.4μg/mL)作用后；以及加入TAY(浓度0.4μg/mL)作用不同时间(1、2和3天)后，采用ELISA法测定其自分泌转化生长因子-β1(TGF-β1)及表皮生长因子(EGF)的变化规律。
实验分浓度组和作用时间组两部分，均设阴性对照组。每个样本取3瓶FB测定，实验重复两次。
浓度组选呈对数生长期的L929 FB细胞，以细胞2.5×105/瓶接种于25mL培养瓶，每瓶2mL，共15瓶，置37℃、5％CO2培养箱中培养18小时后，吸出原培养液。TA组依次换含有浓度0.05、0.1、0.2及0.4μg/mL的TAY培养液(n＝3)；对照组仅加入MEM培养液(n＝3)；继续培养3天后，0.25％胰蛋白酶消化并计数，分别调整细胞数为1.0×105/瓶，再加入不含TAY的MEM培养基2mL/瓶，继续培养。24小时后取上清夜，-20℃冻存备用。测定时，融化，分别取50μL和100μL上清液，用间接酶联免疫吸附实验(ELISA)测TGF-β1和EGF，实验按试剂盒说明进行。
作用时间组共12瓶，同上法培养FB18小时后，吸出原培养液，实验组加入含TAY 0.4μg/mL的培养液，第2～4天每天均取3瓶作为实验组(即TA作用时间分别为1、2及3天)；对照组与浓度组对照样本共用。所有培养瓶均用0.25％胰蛋白酶消化并计数，均调整细胞数为1.0×105/瓶，再加入MEM培养液2mL/瓶，培养1天后取上清液，分别测定TGF-β1和EGF。
结果不同浓度TA作用后，随着浓度的增加，相同数量的FB自分泌TGF-β1呈逐渐增加的趋势，且在浓度为0.4μg/mL时，促进分泌作用最强，与对照组相比有统计学意义(P＜0.01)。EGF的自分泌在浓度为0.4μg/mL时，促分泌作用与对照组相比有显著性意义(P＜0.05)，其他浓度对EGF的分泌无显著影响。
TAY浓度为0.4μg/mL的作用于FB不同时间后，相同数量的FB自分泌TGF-β1增加，各实验组与对照组相比均有统计学意义(P＜0.01，0.05)，但随作用时间的延长，促进作用无明显变化；相同数量的FB自分泌EGF作用增强，随作用时间的延长分泌作用增强，第2d、3d，实验组与对照组相比有显著性(P＜0.05，P＜0.01)。
成纤维细胞是结缔组织中最活跃的细胞，在损伤的刺激下，受损处的FB能够分裂增生，产生基质和胶原，并构成肉芽组织的主要成分，从而促进创伤愈合。同时还可自分泌生长因子调控修复过程，因此FB功能的变化对创伤愈合起着十分重要的作用。
生长因子是由细胞分泌的一类调节细胞功能的生物活性多肽，其参与创伤修复与组织再生的作用已获得许多基础与临床研究的证实。生长因子主要来源于修复细胞的自分泌和旁分泌机制，FB可自分泌胰岛素样生长因子、血小板衍生生长因子、TGF-β1和EGF等。其中TGF-β1是创伤修复过程中的重要因子，它能提供正常愈合的信号物质，影响愈合过程的所有阶段。TGF-β1是巨噬细胞与中性粒细胞的有力趋化剂，主要功能是促进FB增殖和细胞基质的合成，促进角化细胞迁移，减少创伤体积，加速愈合速度。适量的TGF-β1有益于组织愈合，过度表达却有可能导致瘢痕和纤维化形成.。
本实验结果显示，TAY可明显影响FB的功能。FB经TAY不同浓度及不同时间作用后，自分泌的TGF-β1均增加，且随作用浓度增大、作用时间延长其促分泌作用增强。TGF-β1自分泌的增加，促进FB增殖，有利于炎性细胞向创伤部位移动，还可降低细胞间基质蛋白的合成，抑制金属蛋白酶的活性，有助于胶原蛋白的沉积，促进伤口愈合。
EGF也是创伤愈合中的重要生长因子之一，在体外培养中，EGF能刺激角化细胞、FB等的生长，是表皮细胞和成纤维细胞的趋化剂并能促进分裂增殖，但无刺激体外培养的FB合成胶原的作用。本研究提示，当TAY浓度为0.4μg/mL，可使FB自分泌EGF显著增加，且随作用时间的延长，分泌作用增强。
因研究者前期实验证明及文献报道，TAY对FB细胞增殖无影响，所以本研究结果提示，一定浓度的TAY在创伤愈合中，可促进组织中FB自分泌TGF-β1和EGF，对修复细胞及炎性细胞产生趋化性作用，促进细胞外基质的沉积，促进伤口愈合。同时，前期在体实验证明，TAY没有引起瘢痕增生的现象。因为红毛七资源丰富，塔斯品碱及其盐酸盐易于分离纯化，因此可望成为生长因子的替代品用于创伤愈合。
结论盐酸塔斯品碱与黄连素的组合物可促进伤口愈合，并可预防和治疗感染伤口；塔斯品碱及其盐酸盐促愈合作用机制可能与其促成纤维细胞自分泌生长因子有关。
权利要求
1.一种促进伤口愈合的药物，其特征在于，该药物的成分由塔斯品碱或盐酸塔斯品碱和盐酸小檗碱复配而成，其比例为1∶2～1∶4。
2.如权利要求1所述的促进伤口愈合的药物，其特征在于，所述塔斯品碱来自中药原料红毛七中，其化学结构式为 分子式及分子量C20H19NO6；369.36物理性状熔点370℃，白色无定形粉末。
全文摘要
本发明公开了一种促进伤口愈合的药物，该药物的成分由塔斯品碱或盐酸塔斯品碱和盐酸小檗碱复配而成，其塔斯品碱来自中药原料红毛七中，其化学结构式为右式，分子式及分子量C
文档编号A61K31/4353GK1593406SQ200410026259
公开日2005年3月16日 申请日期2004年6月24日 优先权日2004年6月24日
发明者贺浪冲, 董亚琳, 陈方, 李义平, 王怀荟 申请人:西安交通大学