一种苦参总黄酮提取物及其制备方法和用途的制作方法

专利名称：一种苦参总黄酮提取物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种植物提取物，尤其是涉及一种具有TNFα和IL-1β抑制作用的苦参总黄酮提取物、其制备方法和含有该提取物的药物组合物以及该提取物的制药用途。
背景技术：
炎症是机体对各种致炎症因子引起的损伤所发生的以防御为主的反应，炎症的局部表现为红，肿，热，痛及功能障碍。这些表现在急性体表炎症时较为明显，而内脏的炎症和慢性炎症则多不明显。炎症不仅表现在局部，而且也常引起全身反应。常见的全身反应有发热，血液中的白细胞数目增多以及心，肝，肾等实质性器官可出现不同程度的变性，坏死等病变。
按病理分类，炎症可分为变质性炎、浆液性炎、纤维素性炎、化脓性炎、出血性炎、卡他性炎、增生性炎和慢性肉芽肿性炎。
TNFα是一种前体炎症细胞因子，主要由单核细胞和巨噬细胞产生，参与许多炎症反应的过程。内毒素(LPS)是TNFα的诱导剂。研究发现，TNFα具有多种生物学活性1)杀伤或抑制肿瘤细胞；2)提高中性粒细胞的吞噬能力，增加过氧化物阴离子产生，参与炎症反应；3)抗感染等。据文献报道，TNFα抑制剂可用于类风湿性关节炎、幼年型类风湿关节炎、骨性关节炎、脊柱关节病、炎性肠病、心力衰竭、糖尿病、系统性红斑狼疮、硬皮病、结节病、皮肌炎、银屑病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、急性髓型白血病、帕金森氏症、艾滋病痴呆综合征、早老性痴呆、抑郁症、脓毒症、坏疽性脓皮病、败血症、感染性休克、白塞氏病、移植物抗宿主病、葡萄膜炎、Wegener′s肉芽肿、休格连氏干燥症、慢性阻塞性肺病、哮喘、急性胰腺炎、牙周病、恶病质、癌症、中枢神经系统损伤、呼吸道病毒感染、肥胖等多种病症的治疗(1-25)(1.Ogata H，Hibi T.et al Curr Pharm Des.2003；9(14)1107-13.2.Moller DR.et alJ Intern Med.2003 Jan；253(1)31-40.3.Taylor PC.Et al Curr Pharm Des.2003；9(14)1095-106.4.Wilkinson N et al Arch Dis Child.2003 Mar；88(3)186-91.5.Nishimura F et al J Periodontol.2003 Jan；74(1)97-102.6.Weinberg J M et alCutis.2003 Jan；71(1)41-5.7.Burnham E et al Crit Care Med.2001 Mar；29(3)690-1.8.Sack M.et al Pharmacol Ther.2002 Apr-May；94(1-2)123-35.9.BarnesPJ.Et al Annu Rev Pharmacol Toxicol.2002；4281-98.10.Mageed RA et al Lupus.2002；11(12)850-5.11.Tsimberidou AM et al Expert Rev Anticancer Ther.2002Jun；2(3)277-86.12.Muller T.et al Curr Opin Investig Drugs.2002 Dec；3(12)1763-7.13.Calandra T et al Curr Clin Top Infect Dis.2002；221-23.14.Girolomoni G et al Curr Opin Investig Drugs.2002 Nov；3(11)1590-5.15.Tutuncu Z et al Clin Exp Rheumatol.2002 Nov-Dec；20(6 Suppl 28)S146-51.16.Braun J et al Best Pract Res Clin Rheumatol.2002 Sep；16(4)631-51.17.BarnesPJ.Et al Novartis Found Symp.2001；234255-67；discussion 267-72.18.Brady M，et al Baillieres Best Pract Res Clin Gastroenterol.1999 Jul；13(2)265-89.19.Goldring MB.et al Expert Opin Biol Ther.2001 Sep；1(5)817-29.20.Mariette X.Rev Prat.2003 Mar 1；53(5)507-11.21.Sharma R et al Int J Cardiol.2002 Sep；85(1)161-71.22.Wang CX et al Prog Neurobiol.2002 Jun；67(2)161-72.23.VanReeth K et al Vet Immunol Immunopathol.2002 Sep 10；87(3-4)161-8.24.Leonard BE et al Int J Dev Neurosci.2001 Jun；19(3)305-12.25.Hays SJ et alCurr Pharm Des.1998 Aug；4(4)335-48.)。Marc Feldmann等报道TNFα已被用作筛选类风湿性关节炎以及其他自身免疫性疾病治疗药物的药靶(26)(26.MarcFeldmann et al.Nature Medicine.2003 Oct；9(10)1245-50)。
IL-1β是由单核巨噬细胞、树突状细胞、纤维母细胞等产生的一种细胞因子。它能刺激T细胞和B细胞的增殖和分化、刺激造血以及参与炎症反应。据文献报道，IL-1β抑制剂可用于类风湿性关节炎、败血症、牙周病、心力衰竭、皮肌炎、急性胰腺炎、慢性阻塞性肺病、早老性痴呆、骨性关节炎、细菌感染、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、葡萄膜炎、中枢神经系统损伤、呼吸道病毒感染、哮喘、抑郁症、硬皮病等多种病症的治疗(27-46)(27.Taylor PC.et al Curr Pharm Des.2003；9(14)1095-106.28.Dellinger RP et al Clin Infect Dis.2003 May 15；36(10)1259-65.29.Takashiba S et al J Periodontol.2003 Jan；74(1)103-10.30.Diwan A，et al Curr Mol Med.2003 Mar；3(2)161-82.31.Lundberg IE，et al Rheum Dis Clin North Am.2002 Nov；28(4)799-822.32.Makhija R，et al JHepatobiliary Pancreat Surg.2002；9(4)401-10.33.Chung KF.Et al Eur Respir JSuppl.2001 Dec；3450s-59s.34.Hallegua DS，et al Ann Rheum Dis.2002 Nov；61(11)960-7.35.Goldring MB.Et al Expert Opin Biol Ther.2001 Sep；1(5)817-29.36.Mrak RE，Griffin WS.Et al Neurobiol Aging.2001 Nov-Dec；22(6)903-8.37.Brady M，et al Baillieres Best Pract Res Clin Gastroenterol.1999 Jul；13(2)265-89.38.Van der Meer JW，et al Ann N Y Acad Sci.1998 Sep 29；856243-51.39.Rameshwar P et al Acta Haematol.2003；109(1)1-10.40.deKozak Y et al Int Rev Immunol.2002 Mar-Jun；21(2-3)231-53.41.Wang CX et alProg Neurobiol.2002 Jun；67(2)161-72.42.Van Reeth K et al Vet ImmunolImmunopathol.2002 S ep 10；87(3-4)161-8.43.Stirling R G et al Br M ed B ull.2000；56(4)1037-53.44.Leonard BE et al Int J Dev Neurosci.2001 Jun；19(3)305-12.45.Allan SM et al Ann N Y Acad Sci.2000；91784-93.46.Cafagna D et alMinerva Med.1998 May；89(5)153-61.)。
传统中药苦参(Sophora flavescens Ait)为豆科槐属植物，其性寒味苦，有清热解毒、明目止泪、祛风杀虫、安五脏、转身定志的作用。从中分离出的主要化学成分可分为两大类，即苦参生物碱和苦参黄酮。有人已从苦参根、茎、叶和花中分离出了23种生物碱及32种黄酮与异黄酮类化合物(47)(47.苗抗立，张建中等，天然产物研究与开发，2000，13(2)69～73)。
苦参酮(Kurarinone)的主要植物来源为豆科的苦参(Sophora flavescensAit)和龙胆科的秦艽(Gentiana macrophylla Pall)，其化学结构式为 分子式C26H30O6，分子量438.52，熔点121～123℃2’-甲氧基-苦参酮(2’-methoxy-Kurarinone)又名异苦参酮(Isokurarinone)，为黄色晶体，其化学结构式为 分子式C27H32O6，分子量438，熔点102-104℃槐黄烷酮G(Sophoraflavanone G)又名降苦参酮(Norkurarinone)，为无色针晶(苯)，其化学结构式为
分子式C25H28O6，分子量424.49，熔点173-175℃未见现有文献关于苦参酮、2-甲氧基-苦参酮和槐黄烷酮可抑制TNFα和IL-1β表达的报道。

发明内容
本发明涉及一种具有TNFα和IL-1β抑制作用的苦参总黄酮提取物。该提取物包含如下重量比成分苦参酮20～40％、2-甲氧基-苦参酮1～5％和槐黄烷酮1～10％。特别是，该提取物可含有30％苦参酮、2％2’-甲氧基-苦参酮和5％槐黄烷酮。
本发明还涉及一种包含上述苦参总黄酮提取物的药物组合物。
本发明还涉及上述苦参总黄酮提取物的制备方法。
本发明还涉及上述苦参总黄酮提取物在制备TNFα抑制剂和IL-1β抑制剂中的用途。
所述“TNFα抑制剂”可用于治疗下列病症，包括但不限于脊柱关节病、炎性肠病、心力衰竭、糖尿病、系统性红斑狼疮、硬皮病、结节病、皮肌炎、银屑病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、急性髓型白血病、帕金森氏症、早老性痴呆、抑郁症、艾滋病痴呆综合征、脓毒症、坏疽性脓皮病、败血症、感染性休克、白塞氏病、移植物抗宿主病、葡萄膜炎、Wegener′s肉芽肿、休格连氏干燥症、慢性阻塞性肺病、哮喘、急性胰腺炎、牙周病、恶病质、中枢神经系统损伤或肥胖。
所述“IL-1β抑制剂”可用于治疗下列病症，包括但不限于败血症、牙周病、心力衰竭、皮肌炎、急性胰腺炎、慢性阻塞性肺病、早老性痴呆、骨性关节炎、细菌感染、骨髓增生异常综合征、葡萄膜炎、中枢神经系统损伤、哮喘、抑郁症或硬皮病。
本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述，本发明的其他特点、目的和优势将会更为明显。
本发明的问世部分是基于这样一个意外的发现苦参酮、2’-甲氧基-苦参酮和槐黄烷酮G以特定的比例存在于具有TNFα和IL-1β抑制活性的苦参总黄酮提取物中。因此，该苦参总黄酮提取物可用于制备TNFα抑制剂和IL-1β抑制剂。
所述“TNF-α抑制剂”可用于治疗下列病症，包括但不限于脊柱关节病(spondyloarthropathies)、炎性肠病(inflammatory bowel disease)、心力衰竭(heart failure)、糖尿病(diabetes mellitus)、系统性红斑狼疮(systemic lupuservthematosus)、硬皮病(scleroderma)、结节病(sarcoidosis)、皮肌炎(polymyositis/dermatomyositis)、银屑病(psoriasis)、骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome)、急性髓型白血病(acute myelogenous leukemia)、帕金森氏症(Parkinson′s disease)、艾滋病痴呆综合征(AIDS dementia complex)、早老性痴呆(Alzheimer′s disease)、抑郁症(depression)、脓毒症(sepsis)、坏疽性脓皮病(pyoderma gangrenosum)、败血症(hematosepsis)、感染性休克(septic shock)、白塞氏病(Behcet′s syndrome)、移植物抗宿主病(graft-versus-host disease)、葡萄膜炎(uveitis)、Wegener′s肉芽肿(Wegener′sgranulomatosis)、休格连氏干燥症(Sjogren′s syndrome)、慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease)、哮喘(asthma)、急性胰腺炎(acutepancreatitis)、牙周病(Periodontal disease)、恶病质(cachexia)、中枢神经系统损伤(central nervous system injury)、肥胖(obesity)等。
所述“IL-1β抑制剂”可用于治疗下列病症，包括但不限于败血症(hematosepsis)、牙周病(Periodontal disease)、心力衰竭(heart failure)、皮肌炎(polymyositis/dermatomyositis)、急性胰腺炎(acute pancreatitis)、慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease)、早老性痴呆(Alzheimer′sdisease)、骨性关节炎(osteoarthritis)、细菌感染(Bacterial infections)、骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome)葡萄膜炎(uveitis)、中枢神经系统损伤(central nervous system injury)、哮喘(asthma)、抑郁症(depression)、硬皮病(scleroderma)等。
术语“脊柱性关节病”(spondyloarthropathies)是指一组具有内在联系的多系统炎症性疾病。因此类疾病患者其血中的类风湿因子(rheumatoid factor)为阴性，所以又称为“血清阴性脊柱关节病(seronegative spondyloarthropathies)。本病可累及脊柱、外周关节、关节周围结构或三者均累及，并伴有各种特征性的关节外表现，如急慢性胃肠或泌尿生殖系统炎症(有时可为感染)、眼前部炎症、银屑病性皮肤、指甲损害等。本组疾病主要包括强直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis)、瑞特氏综合症(Reiter′s syndrome)、银屑病性关节炎(Psoriatic arthropathy)、炎性肠病性关节炎(Inflammatory bowel diseasearthritis)、未分化型脊柱关节病(Undifferentiated spondyloarthropathy)等。
术语“炎性肠病”(inflammatory bowel disease)是克隆病(Crohn’s disease)、和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)两种非特异性肠炎的统称。
术语“慢性阻塞性肺病”(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是指具有气流阻塞特征的慢性支气管炎和/或肺气肿(美国胸科学会(ATS)和中华医学会呼吸系统学会定义)。某些支气管哮喘，在疾病进程中发展为不可逆性气流阻塞，当支气管哮喘与慢性支气管炎和/或肺气肿重叠存在或难以鉴别时，也可列入COPD范围。COPD的主要特征是慢性进行性气流阻塞。
本发明的苦参总黄酮提取物中包含如下重量比成分苦参酮20～60％、2’-甲氧基-苦参酮1～5％和槐黄烷酮G1～12％；优选的，该提取物含有苦参酮35～45％、2’-甲氧基-苦参酮2～4％和槐黄烷酮G5～8％；特别是，该提取物可含有苦参酮45％、2-甲氧基-苦参酮2％和槐黄烷酮6％。该提取物可按本发明的方法制备，即苦参经乙醇、乙酸乙酯等有机溶剂提取、浓缩，所得粗提物溶解于5％～50％C1～C4醇水溶液，再用有机溶剂萃取，合并有机相，浓缩得产物。所述C1～C4醇水溶液可以是甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇或丁醇水溶液；所述C1～C4醇水溶液的浓度为5％～50％，优选20～40％，最优选30％；所述有机溶剂选自乙酸乙酯、氯仿、丙酮、乙醚或其混合物。
本发明的苦参总黄酮提取物里可加入可药用载体以促进其给药。较佳的，本发明的药物组合物含有0.1-99.9％重量比的提取物或其活性成份。“可药用载体”不会破坏本发明的苦参总黄酮提取物或其活性成份的药学活性，同时其有效用量，即能够起到药物载体作用时的用量对人体无毒。
“可药用载体”包括但不限于离子交换材料、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、自乳化药物传递系统(SEDDS)如d-alpha-维生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯、吐温(Tweens)或其他类似聚合介质等药物制剂用的表面活化剂、血清蛋白如人血清白蛋白、缓冲物质如磷酸盐、氨基乙酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸部分甘油酯混合物、水、盐、电解质如硫酸盐精蛋白、磷酸氢二纳、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅胶、硅酸镁等。聚乙烯吡咯酮、纤维素物质、聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠、聚丙稀酸酯、乙烯-聚氧乙烯-嵌段聚合物和羊毛酯、环糊精如α-、β-及γ-环糊精或其经化学修饰的衍生物如2-和3-羟丙基-β-环糊精等羟烷基环糊精或其他可溶性衍生物等均可用于促进本发明的苦参总黄酮提取物或其活性成份的药物传递。
其他可药用辅料如填充剂(如无水乳糖、淀粉、乳糖珠粒和葡萄糖)、粘合剂(如微晶纤维素)、崩解剂(如交联羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素和交联PVP)、润滑剂(如硬酯酸镁)、吸收促进剂、香味剂、甜味剂、稀释剂、赋形剂、润湿剂、溶剂、增溶剂和着色剂等也可加入本发明的药物组合物中。
上述苦参总黄酮提取物、其活性成份以及药物组合物可通过肠道或者非肠道途径给药。肠道给药制剂包括丸剂、颗粒剂、胶囊剂、悬浮液或溶液。非肠道给药制剂包括注射剂、霜剂、膏剂、贴剂或喷雾剂。非肠道给药途径包括皮下、皮内、动脉、静脉、肌肉、关节、滑液、胸骨、鞘内、病灶内、颅内注射或滴注。其它给药途径可包括局部、直肠、经鼻、经颊、阴道、舌下、粘膜、气管或尿道。苦参总黄酮提取物、其活性成份以及药物组合物还可以通过气雾吸入或植入蓄积或针刺等方式给药。
本发明的苦参总黄酮提取物、其活性成份以及药物组合物的口服制剂包括但不限于胶囊、片剂、乳剂、水悬浮剂、胶体液、溶液、微胶囊、丸剂、锭剂、颗粒剂、粉剂。常用于片剂的可药用载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还会加入硬脂酸镁等润滑剂。常用于胶囊剂的可药用载体包括乳糖和干玉米淀粉。当制成口服水悬浮剂和/或乳剂时，本发明的苦参总黄酮提取物或其活性成份可悬浮或溶解于油相里并与乳化剂或悬浮剂相结合。如果需要，也可以加入一些甜味剂和/或香味剂和/或增色剂。
本发明的苦参总黄酮提取物、其活性成份和药物组合物可被制成无菌注射剂，如无菌水相或油相悬浮液。该悬浮液可按本领域的常规方法即使用适宜的分散剂或湿润剂(如Tween 80)及悬浮剂等制得。其还可以是在可肠道外给药的无毒稀释剂或溶剂中的水溶液或悬浮液，如在1，3-丁二醇中的溶液。相关的可用载体或溶剂包括甘露醇、水、林格氏液、等渗氯化钠等。另外，无菌的固定油常被作为溶剂或悬浮剂的媒介，因而包括合成甘油单酯或甘油二酯在内的多种柔和的固定油(bland fixed oil)均适用。脂肪酸，如十八烯酸及其甘油酯衍生物(如橄榄油或蓖麻油，特别是其聚氧乙烯基衍生物)等可用于制备所述注射剂。所述油溶液或悬浮液还可包含一种长链的乙醇稀释剂或分散剂或羧甲基纤维素或类似的其他分散剂，此类物质常用于制备可药用乳剂和/或悬浮剂。其它一些制剂常用的表面活性剂如Tweens或Spans和/或其他类似的乳化剂或生物利用度促进剂等也同样可用于制备本制剂。
本发明的苦参总黄酮提取物、其活性成份以及药物组合物可制成栓剂通过直肠给药，方法是将苦参总黄酮提取物或其活性成份与适宜的非刺激性赋形剂混合，后者在室温下为固体而在直肠温度下为液体，因而该栓剂可融解于直肠中并释放出活性成份。此类赋形剂包括但不限于可可油、蜂蜡和聚乙烯。本发明的苦参总黄酮提取物、其活性成份以及药物组合物的局部给药制剂(如油膏)可直接用于患处。此类局部制剂含有活性成份及可药用载体，后者包括但不限于矿物油、液体石油、白石油、丙二醇、聚氧乙烯或聚氧丙稀化合物、乳化腊或水。另外，本发明的药物组合物还可制成洗剂或油剂。适用的载体包括但不限于矿物油、三梨醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、鲸腊酯、十六烷醇、2-十八烷醇、苯甲基乙醇或水。本发明的苦参总黄酮提取物或其活性成份还可制成灌肠剂等用于直肠局部给药。局部透皮贴剂亦在本发明的保护范围之内。本发明的苦参总黄酮提取物、其活性成份以及药物组合物亦可经鼻喷雾或者吸入给药，即按本领域的常规方法，使用苯甲基乙醇或其他防腐剂、吸收促进剂、碳氟化合物和/或其他增溶剂或分散剂制得盐溶液。
本发明的苦参总黄酮提取物、其活性成份以及药物组合物还可通过植入给药。采用植入给药方式可达到在给药对象体内持续，定时释放本发明的苦参总黄酮提取物、其活性成份以及药物组合物的效果。另外，植入给药还能在局部组织和器官定位给药(Negrin et al.，Biomaterials 22(6)563，2001)定时释放技术亦可用于本发明苦参总黄酮提取物、其活性成份以及药物组合物的给药中，如基于聚合体技术的定时释药胶囊、缓释技术和制剂包裹技术(如聚合体和脂质体)等。
贴剂同样包括在本发明的范围之内。其包括基层(如聚合体、布、纱和绷带)和本发明的药物组合物。基层的一边可设有一保护层以防止活性成份的流出。所述贴剂还可含有一用于固定的粘合剂，后者可以是一种自然的或者合成的物质，当其与给药对象的皮肤接触时可暂时粘附于皮肤上。粘合剂可以是防水的。
当本发明的苦参总黄酮提取物、其活性成份、药物组合物和制剂可与一种或多种附加的治疗药物或预防药物混合。附加药剂可作为独立的剂型与本发明的苦参总黄酮提取物、其活性成份以及药物组合物分别给药。附加药剂也可和本发明的苦参总黄酮提取物、其活性成份以及药物组合物一起以单一剂型给药。
为了便于理解本发明，特列举以下实施例。其作用应被理解为是对本发明的诠释而非对本发明的任何方式的限制。以上所列的各参考文献均以全篇引入本文作为参考。


图1苦参酮(0912)、苦参总黄酮提取物对LPS诱导的TNFa表达的抑制作用；图2苦参酮(0912)、苦参总黄酮提取物对LPS诱导的IL-1β表达的抑制作用；图3苦参总黄酮提取物HPLC色谱图；具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。但并不意味着本发明仅限于此。
实施例1用酸水和乙酸乙酯制备苦参总黄酮提取物500克的苦参干药材用9000毫升95％的乙醇室温浸提3次，提取液合并，经真空浓缩蒸干，得粗提物195克。提取物经30％乙醇水和乙酸乙酯(1∶1)分配三次，合并乙酸乙酯溶液，浓缩蒸干得88.7克苦参总黄酮(收率45.5％)。
实施例2苦参黄酮三种成分的分离与鉴定苦参酮的分离和鉴定分离500克的苦参干药材用3000毫升95％的乙醇室温浸提3次，提取液合并，经真空浓缩蒸干，得粗提物65克。提取物经6％甲醇水和氯仿分配三次，合并氯仿溶液，浓缩蒸干得30克浸膏。浸膏经LH-20柱层析，以甲醇为洗脱剂，得10克的粗品。粗品依次用硅胶柱层析，洗脱剂丙酮/石油醚＝1∶2，及反相材料(RP-18)柱层析，以甲醇/水＝65∶35洗脱得2克苦参酮(得率0.4％)。
鉴定1H NMR(DMSO-d6，400MHz)10.2(2’-OH)，9.4(4’-OH)，9.2(7-OH)，7.4(1H，d，J＝8.4Hz，H-6’)，6.32(1H，d，J＝2.28Hz，H-3’)，6.25(1H，dd，J＝8.2，2.4Hz，H-5’)，6.12(1H，s，H-6)，5.4(1H，dd，J＝2.6，13.1Hz，H-2)，4.9(1H，t，J＝1.4Hz，H-4”)，4.55(1H，brs，H-9”a)，4.47(1H，brs，H-9”b)，3.7(3H，s)，2.8(1H，dd，J＝13.1，16.3Hz，H-3a)，2.4(3H，m)，1.9(2H，m)，1.6(3H，s)，1.57(3H，s)，1.42(3H，s).
13C NMR(DMSO-d6，75MHz)188.5，162.1，161.7，159.2，157.7，154.9，147.6，130.3，127.0，123.1，116.1，110.5，106.7，106.0，104.1，102.1，92.3，73.4，55.2，46.3，44.3，30.7，26.9，25.5，18.6，17.6。
ESIMS(m/z)439。
2’-甲氧基苦参酮的分离和鉴定分离500克的苦参干药材用3000毫升95％的乙醇室温浸提3次，提取液合并，经真空浓缩蒸干，得粗提物65克。提取物经40％丙醇水和乙醚分配三次，合并乙醚溶液，浓缩蒸干得30克浸膏。12克浸膏经LH-20柱层析，以甲醇为洗脱剂，得50毫克的粗品。粗品依次用硅胶柱层析，洗脱剂丙酮/石油醚＝1∶3，及反相材料(RP-18)柱层析，以甲醇/水＝75∶25洗脱得20mg 2’-甲氧基苦参酮(得率0.01％)，为黄色晶体，mp 102-104℃。
鉴定1H NMR(CDCl3，400MHz)7.4(1H，d，J＝8.2Hz，H-6’)，6.48(1H，dd，J＝8.21，2.34Hz，H-5’)，6.44(1H，d，J＝2.35Hz，H-3’)，6.08(1H，s，H-6)，5.62(1H，m，H-2)，5.0(1H，m)，4.72(1H，brs)，4.66(1H，brs)，3.8(3H，s)，3.76(3H，s)，2.84(1H，m，H-3a)，2.4(3H，m)，1.67(3H，s)，1.63(3H，s)，1.6(2H，m)，1.52(3H，s)。
ESIMS(m/z)451(M-1)。
UV(MeOH)λmax(logε)286(4.3)nm，IR(KBr)vmax3291，2955，2920，1650，1590，1500，1465，1410，1280cm-1。
槐黄烷酮G的分离和鉴定分离500克的苦参干药材用3000毫升95％的乙醇室温浸提3次，提取液合并，经真空浓缩蒸干，得粗提物65克。提取物经25％异丙醇水和乙酸乙酯分配三次，合并乙酸乙酯溶液，浓缩蒸干得30克浸膏。浸膏经LH-20柱层析，以甲醇为洗脱剂，得15克的总黄酮。粗品用依次用硅胶柱层析，洗脱剂丙酮/石油醚＝1∶3，得到Norkurarinone粗品500mg，接着反相材料(RP-18)柱层析，以甲醇/水＝70∶30洗脱得300mg的槐黄烷酮G(得率0.06％)。
鉴定1H NMR(DMSO-d6，400MHz)12.1(s，5-OH)，9.6(4’-OH)，9.4(7-OH)，7.22(1H，d，J＝8.4Hz，H-6’)，6.33(1H，d，J＝2.3Hz，H-3’)，6.26(1H，dd，J＝8.4，2.5Hz，H-5’)，5.92(1H，s，H-6)，5.50(1H，dd，J＝2.8，13.3Hz，H-2)，4.89(1H，t，J＝6.8Hz，H-4”)，4.55(1H，brs)，4.47(1H，brs)，3.1(1H，dd，J＝13.3，17.2Hz，H-3a)，2.62(1H，dd，J＝2.9，17.2Hz，H-3b)，2.4(3H，m)，1.9(2H，m)，1.56(3H，s)，1.52(3H，s)，1.43(3H，s)。
ESIMS(m/z)423。
实施例3苦参总黄酮提取物HPLC色谱图及定量分析用HPLC系统对苦参总黄酮提取物(实施例1)进行定量分析。仪器Agilent1100，设定波长为280nm，分析柱为Zorbax SB-C18 4.6*150mm，流速为1ml/分钟。流动相为CH3CN和H2O溶液。梯度洗脱，梯度状况为CH3CN在25分钟内从30％递增到80％。在随后的5分钟内，CH3CN递增到100％。得附图3所示HPLC图谱。
苦参酮，2’-甲氧基苦参酮，槐黄烷酮G的对照品均在本实验室内分离纯化。经HPLC分析，纯度均在96％以上。
结果测得本发明的苦参总黄酮提取物(实施例1)中含苦参酮40.1％(保留时间16.87分钟)，2’-甲氧基-1苦参酮1.8％(保留时间19.99分钟)，槐黄烷酮G6.2％(保留时间20.65分钟)。
实施例4在细胞水平上检测苦参总黄酮提取物和苦参酮对LPS诱导的PBMC细胞中TNFα及IL-1β表达的抑制作用。
实验材料
1.细胞外周血单核细胞2.受试药物苦参总黄酮提取物(实施例1)和苦参酮(091-2)3.阳性对照地塞米松(DEX)4.试剂Ficoll-Paque Plus(Amersham Bioscience)；内毒素(LPS)和地塞米松(CalBiochem.)；TNFαELISA Kit及IL-1βELISA Kit(晶美生物工程公司)；DMSO(Sigma)。
5.方法与结果●新鲜血液以EDTA为抗凝剂，分离外周血单核细胞，悬浮在含10％FBS的RPMI 1640培养基中。在96孔板中加入100μl密度为1×105细胞/ml新分离的细胞，每孔细胞总数为104个。每个样品作3个孔。
●在细胞中加入指定浓度的测试样品(终浓度分别为10，30，和100μg/ml，加样量为10μl)和阳性对照(地塞米松，10μM)。置于37℃，含5％ CO2的培养箱中保温15分钟。
●加入10μl浓度为100μg/ml的LPS，置于37℃，含5％ CO2的培养箱中保温16小时。
●与1000rpm离心15分钟，将上清转移入新的96孔板中，测定TNFα及IL-1β浓度，或冻藏于-20℃，避免反复冻融。
●根据生产者所述方法，利用试剂盒测定细胞培养基中TNFα和IL-1β浓度。
6.结果计算根据TNFa和IL-1β检测试剂盒测定的标准曲线计算LPS刺激及药物处理后细胞分泌至培养液中两细胞炎症因子的浓度，表达抑制率根据以下公式进行计算
实验结果苦参总黄酮提取物及苦参酮对炎症因子表达的抑制作用

权利要求
1.一种苦参总黄酮提取物，其特征在于，它包含如下重量比成分苦参酮20～60％、2’-甲氧基-苦参酮1～5％和槐黄烷酮G 1～12％。
2.权利要求1的苦参总黄酮提取物，其特征在于，它包含苦参酮35～45％、2’-甲氧基-苦参酮2～4％和槐黄烷酮G 5～8％。
3.权利要求2的苦参总黄酮提取物，其特征在于，它包含苦参酮45％、2’-甲氧基-苦参酮2％和槐黄烷酮G 6％。
4.权利要求1的苦参总黄酮提取物的制备方法，其特征在于，它包括如下步骤苦参经有机溶剂提取、浓缩，所得粗提物溶解于5％～50％C1～C4醇水溶液，再用有机溶剂萃取，合并有机相，浓缩得产物。
5.权利要求4的方法，其中所述C1～C4醇水溶液为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇或丁醇水溶液。
6.权利要求4的方法，其中所述C1～C4醇水溶液的浓度为20～40％。
7.权利要求6的方法，其中所述C1～C4醇水溶液的浓度为30％。
8.一种药物组合物，它包含权利要求1的苦参总黄酮提取物。
9.权利要求1的苦参总黄酮提取物在制备TNFα抑制剂中的用途。
10.权利要求9的用途，其中所述TNFα抑制剂可用于治疗下组病症中的一种或多种类风湿性关节炎、幼年型类风湿关节炎、骨性关节炎、脊柱关节病、炎性肠病、心力衰竭、糖尿病、系统性红斑狼疮、硬皮病、结节病、皮肌炎、银屑病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、急性髓型白血病、帕金森氏症、早老性痴呆、抑郁症、艾滋病痴呆综合征、脓毒症、坏疽性脓皮病、败血症、感染性休克、白塞氏病、移植物抗宿主病、葡萄膜炎、Wegener′s肉芽肿、休格连氏干燥症、慢性阻塞性肺病、哮喘、急性胰腺炎、牙周病、恶病质、中枢神经系统损伤或肥胖。
11.权利要求1的苦参总黄酮提取物在制备IL-1β抑制剂中的用途。
12.权利要求11的用途，其中所述IL-1β抑制剂可用于治疗下组病症中的一种或多种类风湿性关节炎、败血症、牙周病、心力衰竭、皮肌炎、急性胰腺炎、慢性阻塞性肺病、早老性痴呆、骨性关节炎、细菌感染、骨髓增生异常综合征、葡萄膜炎、中枢神经系统损伤、哮喘、抑郁症或硬皮病。
全文摘要
本发明涉及一种具有TNFα和IL－1β抑制作用的苦参总黄酮提取物、其制备方法和用途以及含有该提取物的药物组合物。
文档编号A61P1/18GK1676520SQ20041003093
公开日2005年10月5日 申请日期2004年4月1日 优先权日2004年4月1日
发明者严孝强, 崔玉敏, 王滔, 马志明, 潘柯, 张维权, 黄伟晖, 洪建荣, 段继峰, 蔡宇 申请人:和记黄埔医药企业有限公司