专利名称：猪白细胞介素－4、6融合基因抗病制剂的制作方法
技术领域：
1.生物技术 2.分子免疫学具体包括猪白细胞介素-4和6基因的克隆、融合及其真核表达质粒的构建、壳聚糖纳米颗粒对藏猪白细胞介素-4、6融合基因真核表达质粒的分子包装及其增强动物免疫应答和免疫保护力的应用技术。
背景技术：
增强动物抗感染免疫应答能力，提高疫苗保护率是人类防治传染性疾病最可靠的简便途径。由于传统的药物治疗和常规疫苗接种不能充分保障现代畜牧业的健康高效发展，动物免疫抑制和疫苗免疫应答及保护水平下降已严重制约对传染性疾病的防治。我国当前畜牧业动物传染病的发病率为15％-25％、死亡率高达8％-12％，由此造成的直接经济损失每年达400多亿元。因此，研制和应用新型高效动物免疫调节剂，增强动物的抗感染能力对控制动物的传染性疾病具有非常重要的社会和经济意义。
近年来，随着生物学技术和免疫学技术的发展，细胞因子的研究取得了令人瞩目的成就。利用基因工程技术发展某些新型的细胞因子融合蛋白，已成为其中重要的研究方向。融合基因是指将两个或多个基因的编码区首尾相连，置于同一套调控序列(包括启动子、增强子、核糖体结合序列、终止子等)控制之下，构成的嵌合基因。融合基因的表达产物为融合蛋白。融合蛋白可以优化蛋白性能，甚至产生新功能。融合蛋白可以有多种融合方式，分别在免疫反应的各个阶段发挥作用。由于细胞因子的作用具有多向性、网络性的特点，它们不仅可以单独发挥生物学活性，而且不同的细胞因子之间还有相互协调和相互制约的作用。两种细胞因子融合成一种新的蛋白，两者可以取长补短，也可兼两者之长，发挥其双因子抗癌和增强免疫的综合效应，或使其某些活性显著提高，出现双因子简单合用所不具备的生物学效应。所以细胞因子融合蛋白不仅保留了融合前各因子的功能，而且还可能产生更强、更新的生物学效应。
白细胞介素4(IL-4)具有多种生物学功能可以作用于T细胞、B细胞、胸腺细胞、肥大细胞、巨噬细胞等多种靶细胞，激活的B细胞产生的抗体主要是IgG和IgE，是机体体液免疫的重要调节因子，也在粘膜免疫中也发挥着重要作用。IL-4可以刺激肥大细胞和B细胞的增殖，促进嗜酸性的富集和浸润。IL-4还是CD4+Th幼稚前体细胞分化发育成Th2细胞的重要信号。
白细胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)是迄今发现的功能最为广泛的细胞因子之一，能够刺激B细胞的分化和IgG的产生，亦能刺激外周T细胞(peripheral T cell)和胸腺T细胞(thymic T cell)成熟分化为细胞毒型T细胞(Cytotoxic T Lymphocyte，CTL)，能够抑制人成纤维细胞及羊膜细胞的多种病毒，抗成纤维细胞有丝分裂，诱导特异性干扰素-激活基因，刺激由SPA-Cowan-I型激活的正常B细胞分泌IgM和IgG，诱导EB病毒转化的B细胞分泌IgM和IgG，刺激肝细胞，诱导急性期蛋白的表达，在机体免疫应答、骨髓造血、自身免疫和机体防御等方面均起到重要作用。IL-6可由各种淋巴细胞和非淋巴细胞受各种刺激所分泌，成纤维细胞、单核细胞、某些T细胞系等都可以产生IL-6。
壳聚糖是天然生物多糖甲壳质的脱乙酰基衍生物，具有很好的生物相容性、可被体内多种酶类降解、降解产物安全无毒，并能被生物体完全吸收；而且由于其具有独特的聚阳离子特性，已有的研究结果显示它是一种具有很大潜力的缓释材料。近年来，在基因转染表达研究领域已出现了基于壳聚糖的纳米颗粒系统。大量研究表明，壳聚糖可包裹浓缩DNA，形成小的分散颗粒，将壳聚糖DNA复合物用于基因运载和转染表达时，能有效携带目的基因进入靶细胞中。包封于壳聚糖颗粒中的物质，其释放率主要决定于壳聚糖的生物降解和溶蚀，因此物质释放明显延长。初步研究结果发现基于壳聚糖的颗粒系统在生物医学方面具有广阔的应用前景。此外，壳聚糖还具有多种生物学功能，尤其是可作为药物增效剂。
由于壳聚糖纳米颗粒良好的生物相容性使其在DNA制剂的包裹应用中显示了广阔的前景，本发明在克隆猪IL-4、IL-6基因的基础上，构建了IL-6和IL-4融合基因的真核表达质粒(VPIL-46)及猪IL-4、IL-6基因真核表达质粒(VPIL-4、VPIL-6)，深入研究其对实验动物和本动物免疫调节活性和在疫苗免疫应答中的作用，为研制新型的高效分子免疫佐剂，提高猪的免疫应答能力，增强其抗感染力奠定了坚实的基础。
本发明制备了壳聚糖纳米颗粒分子，首次以其包装猪白细胞介素-4、6融合基因真核表达质粒(VPIL46)，发现对动物免疫机能和免疫保护有显著的增强作用，可作为高效安全、活性持久和效应广谱的新型动物免疫抗病剂。
发明内容
本发明解决的技术问题具体包括猪白细胞介素-4、6基因的融合及其真核表达质粒的构建、壳聚糖纳米颗粒对猪白细胞介素-4、6融合基因真核质粒的分子包装及其增强动物免疫应答和免疫保护力的应用技术。主要包括下列步骤1、猪白细胞介素-4、6基因的克隆、融合应用淋巴细胞分离技术，分离了猪外周血液淋巴细胞进行体外培养，在Con A的刺激下培养24-72h后，提取培养的淋巴细胞总RNA，应用RT-PCR扩增出猪淋巴细胞白细胞介素-4、6基因的cDNA，克隆到pMD18-T载体上，并进行了序列分析；将所获的序列在GenBank和EMBL数据库中进行同源比较，证明成功克隆到猪白细胞介素-4和6的cDNA。
设计融合基因引物，分别扩增猪IL4和IL6基因，连接入相应的pMD18-T载体，双酶切后，先将PIL6连接到同样双酶切的pGEX4T-1质粒上，再将从载体双酶切获得的PIL4片段与重组的pGPIL6连接，转化感受态细胞，筛选阳性转化子，酶切鉴定获得融合的pGPIL6/4重组质粒。
2、猪白细胞介素-4、6融合基因的真核表达与活性检测将猪白细胞介素-4、6融合基因亚克隆到真核分泌型表达载体VR1020上，命名为VPIL46；猪淋巴母细胞增殖实验证明VPIL46在转染Cos7细胞株后，成功表达出有生物活性的IL-46，能刺激猪淋巴母细胞显著增殖；此结果表明已成功构建了能正确表达PIL-46的真核表达质粒，其表达产物具有正常的生物学活性，为研究其体内基因转染表达的免疫调节奠定了基础。
3、壳聚糖纳米颗粒的制备和分子包装将pH5.5的壳聚糖溶液和VPIL46质粒(含适当浓度三聚磷酸盐)溶液分别50℃水浴恒温25min，均匀混合质粒溶液和壳聚糖溶液，即得VPIL46质粒壳聚糖纳米颗粒样品液。取少量质粒壳聚糖纳米样品液于透射电子显微镜下观察纳米颗粒形态并拍照。另取纳米颗粒样品液适量，加双蒸水稀释后用Zetasizer 3000HS/IHPL纳米粒度分析仪测定粒径、分散度及Zeta电位，结果发现本法获得的颗粒直径平均为50-65nm，颗粒的zeta电位达到+27.2mV；凝胶电泳阻滞实验发现壳聚糖纳米颗粒分子(CNP)包装的VPIL46均未移出电泳点样孔，表明所制备的CNP成功完成了VPIL46的分子包装。
4、猪白细胞介素-4、6融合基因抗感染DNA制剂的应用本研究首次将猪白细胞介素-4、6融合基因用壳聚糖纳米颗粒包装后通过口服接种的简便方式免疫BALB/c小鼠，检测了壳聚糖包装猪白细胞介素-4、6融合基因对小鼠的体液免疫和细胞免疫水平的影响情况，并对巴氏杆菌、沙门氏菌和链球菌疫苗等常规疫苗在猪白细胞介素-4、6融合基因分子免疫佐剂协同作用下细胞免疫和体液免疫应答的变化，进行了较为系统的分析；小鼠免疫前及免疫后每周自尾静脉采血，分离血清，用以检测体液免疫应答(IgG、IgA及IgM的含量、特异性抗体的测定)、细胞免疫反应(细胞因子和外周血免疫细胞数量)的动态变化；并在小鼠免疫35天后，以链球菌、巴氏杆菌口服感染实验小鼠，观察发病情况；49天时对所有存活的小鼠进行解剖，观察各种器官组织的病变情况，检测免疫保护效应。
结果显示猪白细胞介素-4、6融合基因纳米颗粒能显著提高小鼠的非特异和特异性免度应答水平，增强小鼠对强毒病原感染的免疫抵抗力和保护率；以壳聚糖纳米颗粒作为免疫基因包装分子，具有减少质粒用量、增强体液免疫和细胞免疫的优点。
在应用中发现，壳聚糖包装猪白细胞介素4、6融合基因质粒口服接种的方式能有效提高免疫小鼠对常规疫苗的免疫应答水平，其原因可能是壳聚糖纳米颗粒包裹质粒DNA后，有效地防止了体液核酸酶对DNA的降解和VRIL46被体内其它组织蛋白的吸附，同时又促进VRIL46进入细胞，使质粒DNA缓慢释放，将目的基因DNA转运到靶细胞中，发挥基因转录表达，分泌更多的细胞因子，增强对免疫应答的上调效应，提高体液和细胞免疫水平。这在将来的实际应用上有较大的价值，意味着较少的质粒用CNP包裹后也可刺激较强的免疫反应，减少质粒用量，降低成本。这些结果表明壳聚糖纳米颗粒包裹猪白细胞介素4、6融合基因接种可提高机体特异性和非特异性的细胞免疫和体液免疫水平，增强特异免疫应答及免疫保护力和非特异防御抗病力，可望作为猪的新型高效抗感染免疫调节剂，具有潜在的广泛应用前景。
图1壳聚糖纳米颗粒包装VPIL-46质粒透射电镜图(x50000)图2壳聚糖纳米颗粒粒径分布图3FPIL-6，FPIL-4 cDNA的PCR扩增电泳图谱(1.0％琼脂糖凝胶)Lane1PCR product of pMD18-T/P3+P4 Lane2PCR product of IL-4geneLane3PCR product of IL-6gene Lane4PCR product of pMD18-T/P1+P2Lane MDL2000marker图4IL-4连pMD18-T重组子酶切鉴定电泳图谱(1.0％琼脂糖凝胶)Lane1pMDT18-IL4质粒LaneMDL2000markerLane2pMDT18-IL4/PmaCI Lane3pMDT18-IL4/SalI+XhoI图5IL-6连pMD18-T重组子酶切鉴定电泳图谱(1.0％琼脂糖凝胶)Lane1pMDT18-IL6质粒 LaneMDL2000markerLane2pMDT18-IL6/PstILane3pMDT18-IL6/BamHI+SalI图6PIL-4cDNA片段413bp核苷酸序列及其编码的氨基酸序列图7PIL-6cDNA片段核苷酸序列及推测的氨基酸序列图8FpIL-6cDNA，FpIL-4cDNA片段酶切回收检测电泳图谱(1.0％琼脂糖凝胶)Lane1FpUIL-4cDNA片段酶切回收 LaneMDL2000markerLane2FpUIL-6cDNA片段酶切回收图9IL-6插入PGEX4T-1的酶切电泳图谱(1.0％琼脂糖凝胶)Lane1pGIL-6/BamHI+SalI LaneMDL2000Lane2pGIL-6/BamHILane3pGIL-6/SalILane4pGIL-6/XhoI Lane5pGIL-6质粒图10IL-4插入pGEX-IL6的酶切电泳图谱(1.0％琼脂糖凝胶)Lane1pGEX-IL6/IL4/PstI LaneMDL2000MarkerLane2pGEX-IL6/IL4/BaMHI+XhoI Lane3pGEX-IL6/IL4/SalI+XhoILane4pGEX-IL6/IL4/BamHI+SalI图11pGEX-IL6/IL4质粒PCR电泳图谱(1.0％琼脂糖凝胶)Lane1pGEX-4T-1质粒PCR/P1+P4 LaneMDL2000MarkerLane2pGEX-IL6/IL4质粒PCR/P3+P4 Lane3pGEX-IL6/IL4质粒PCR/P1+P2Lane4pGEX-IL6/IL4质粒PCR/P1+P4图12重组质粒原核表达的RT-PCR电泳分析Lane1RT-PCR of pGFPIL-6/IL-4，4h LaneMDL2000Lane2RT-PGR of pGEX4T-1.4h图13重组质粒原核表达产物SDS-PAGE(11％)Lane1.3Expression products of pGFPIL-6/IL-4 not induced by IPTGLane2Expression products of pGFPIL-6/IL-4 induced by IPTG in DH5αLane4Expression products of pGFPIL-6/IL-4 induced by IPTG in BL21Lane5Expression products of pGPIL-6 induced by IPTGLane6Expression products of pGPIL-6 not induced by IPTG
Lane7Expression products of pGEX-4T-1 induced by IPTGLane8Expression products of pGEX-4T-1 not induced by IPTG图14重组VTPIL-4质粒的菌落PCR筛选1阴性菌落； 2、3阳性菌落； MDL2,000图15PIL-4在VR1020插入方向酶切电泳图谱1pVTPIL-4/BglII和PmacI双酶切正向重组子2pVTPIL-4/BamHI Mφ1743pVTPIL-4/BglII和PmacI双酶切反向重组子图16重组VPIL-6质粒的菌落PCR筛选1λDNA/EcoRI+HindIII；2、3阳性菌落图17PIL-6在VR1020插入方向酶切电泳图谱1Mark3、6pVPIL-6/PstI，正向重组子；2、4、5、7、8、9pVPIL-6/PstI，反向重组子图18a非特异免疫组小鼠血清IgG含量图18b非特异免疫组小鼠血清IgM含量图18c非特异免疫组小鼠血清IgA含量图19a非特异免疫组小鼠血清IL-2含量图19b非特异免疫组小鼠血清IL-4含量图19c非特异免疫组小鼠血清IL-6含量图20a非特异免疫组小鼠白细胞数量变化图20b非特异性免疫组小鼠单核细胞数量变化图20c非特异免疫组小鼠淋巴细胞数量变化图20d非特异免疫组小鼠中性粒细胞数量变化图21a疫苗免疫组小鼠血清IgG含量图21b疫苗免疫组小鼠血清IgA含量图21c疫苗免疫组小鼠血清IgM含量图22a疫苗免疫组小鼠血清巴氏杆菌特异性抗体含量图22b疫苗免疫组小鼠血清链球菌特异性抗体含量图22c疫苗免疫组小鼠血清沙门氏菌特异性抗体含量图23a疫苗免疫组小鼠血清IL-2含量图23b疫苗免疫组小鼠血清IL-4含量图23c疫苗免疫组小鼠血清IL-6含量图24a疫苗免疫组小鼠白细胞数量变化图24b疫苗免疫组小鼠单核细胞数量变化图24c疫苗免疫组小鼠淋巴细胞数量变化图24d疫苗免疫组小鼠中性粒细胞数量变化
具体实施例方式
1.猪白细胞介素-4基因的克隆及序列分析从猪前腔静脉无菌采血，应用淋巴细胞分离技术，分离了猪外周血液淋巴细胞进行体外培养，在Con A的刺激下培养36h后，提取培养的淋巴细胞总RNA，提取藏猪总RNA，设计一对猪IL-4基因cDNA扩增引物。引物序列如下引物1CGG GAT CCC TAT TCA TGG GTC TCA CCT C引物2CGG GAT CCT CAG CTT CAA CAC TTT以总RNA为模板，在50μl反应体系中加10×RT-PCR反应缓冲液5μl，25mM MgCl210μl，l0mM dNTP5μl，RNase Inhibitor(40units/μl)lμl，AMV RNase XL(5units/uL)lμl，AMV-Optimized Taq(5units/uL)lμl，5′和3′引物各20uM，总RNAl~2μl，补水至50μl。RT-PCR循环参数为50℃，30min；94℃，2min，然后进行30个PCR循环(94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸60s)后继续在72℃延伸l0min，4℃保存。
回收cDNA片段，克隆到pMD-T18载体中，转化感受态细胞，筛选和鉴定含重组质粒的菌落，小规模提取质粒DNA，酶切及电泳观察质粒DNA，进行序列测定。
2.猪白细胞介素-6基因的克隆及序列分析应用淋巴细胞分离技术，分离了猪外周血液淋巴细胞进行体外培养，在Con A的刺激下培养36h后，提取培养的淋巴细胞总RNA，提取藏猪总RNA，设计一对猪IL-6基因cDNA扩增引物。引物序列如下引物1CGG GAT CCA CCA GGA ACG AAA GAG AG引物2CGG GAT CCA GGT TTC TGA CCA GAG GAG以总RNA为模板，在50μl反应体系中加l0×RT-PCR反应缓冲液5μl，25mM MgCl210μl，l0mM dNTP5μl，RNase Inhibitor(40units/μl)lμl，AMV RNase XL(5units/uL)1μl，AMV-Optimized Taq(5units/uL)1μl，5′和3′引物各20uM，总RNA1~2μl，补水至50μl。RT-PCR循环参数为50℃，30min；94℃，2min，然后进行30个PCR循环(94℃变性60s，58℃退火30s；72℃延伸60s)后继续在72℃延伸10min，4℃保存。
回收cDNA片段，克隆到pMD-T18载体中，转化感受态细胞，筛选和鉴定含重组质粒的菌落，小规模提取质粒DNA，酶切及电泳观察质粒DNA，进行序列测定。
3.融合基因引物的设计与合成根据分别编码IL-4和IL-6成熟肽的cDNA碱基序列，设计并人工合成了四条引物P15’CGGGATCCACC AGG AAC GAA AGA GAG 3’P2 5’TTGTCGACCATTATCCGAATGGCCCT 3’P35’ATGTCGAC GGC TCC TCT ACT GGTCTCACCTCCCAACTG 3’P45’CGCTCGAGTCAACACTTTGAGTATT 3’4.融合基因的构建应用PCR技术对猪的IL-6和IL-4基因分别加以改造。去除IL-6的终止密码子，并在两端引入BamHI和SalI酶切位点，去除IL-4的起始密码子，并在两端引入SalI和XhoI酶切位点，同时在二者之间加上Gly-Ser-Ser-Thr柔性连接肽序列，克隆PCR产物，将其克隆到pMD18-T载体中，酶切筛选鉴定重组质粒。
5.猪IL-4/IL-6融合基因原核表达质粒的构建及表达活性分析将猪白介素-4与pMD18-T重组的质粒(pUPIL-4)；猪白介素-6与pUC18重组的质粒(pUPIL-6)酶切，电泳回收IL-4、IL-6DNA片段。将元和表达载体pGEX4T-1进行BamHI，SalI酶切，同回收来的pUFPIL-6cDNA片段进行连接，筛选重组质粒，选取正确的重组子，命名为pG-FPIL6。将pGEX4T-1-IL6酶切，与回收的酶切过的pUFPIL-4cDNA片段进行连接，筛选重组质粒。
将已构建的IL-6/IL-4融合蛋白表达载体质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，用2×YTA培养基培养，以IPTG诱导融合蛋白表达，并作RT-PCR及SDS-PAGE分析表达情况；融合蛋白的表达产物以包涵体形式存在，将包涵体经过变性，稀释、透析复性处理后用MTT法测定重组蛋白刺激猪淋巴母细胞增殖反应活性。
6.猪IL-4/IL-6融合基因真核表达质粒的构建将获得的猪IL-4\IL-6融合基因原核表达质粒进行酶切，切下的猪IL-4\IL-6融合基因与酶切处理去磷酸化的真核表达载体VR1020连接，转化，筛选重组真核表达质粒。
7.猪IL-4基因真核表达质粒的构建将克隆测序得到的猪IL-4基因片段与酶切、脱磷酸化的VR1020质粒连接，转化DH5α感受态细胞，菌落PCR鉴定转化子，进一步酶切筛选插入方向正确的重组表达质粒。
8.猪IL-6基因真核表达质粒的构建将克隆测序得到的猪IL-6基因片段与酶切、脱磷酸化的VR1020质粒连接，转化DH5α感受态细胞，菌落PCR鉴定转化子，进一步酶切筛选插入方向正确的重组表达质粒。
9.免疫用质粒DNA的大量制备按亚精胺沉淀方法制备质粒，溶解于灭菌生理盐水，用紫外分光光度计测其浓度。
10.纳米颗粒的制备以分子量150000，脱乙酰度95％以上的壳聚糖分散在1％醋酸溶液中(A液)将VPIL-46质粒、VPIL-4质粒、VPIL-6质粒溶解于三聚磷酸盐溶液(B液)。将A液、B液置于50℃水浴分别恒温20min，将DNA溶液按一定比例(氨基摩尔数与DNA的磷酸酯基摩尔数比)加入壳聚糖溶液，磁力搅拌使其充分混合，静置过滤得到粒径40-60nm的复合物微粒。即是VPIL-46质粒、VPIL-4质粒、VPIL-6质粒壳聚糖纳米颗粒样品液。
11.纳米颗粒的形态、粒径及Zeta电位测定取少量质粒壳聚糖纳米样品液于透射电子显微镜下观察纳米颗粒形态并拍照。另取纳米颗粒样品液适量，加双蒸水稀释后用Zetasizer3000HS/IHPL纳米颗粒度分析仪测定粒径、分散度及Zeta电位。
E)醇酸树脂/三聚氰胺烤漆Alftalat AC 451 70％/Maprenal MF800
用二甲苯调节到25秒，闪蒸20分钟烘干140℃下30分钟2K清漆丙烯酸/异氰酸酯Macrynal SM 510/Desmodur N 3390
透明清漆硬化剂溶液2∶1擦去测试的结果
15.免疫动物外周血免疫细胞数量的动态变化常规法计白细胞总数；血涂片Giemsa染色，镜检分类计数中性粒细胞、单核细胞核、淋巴细胞。
16.实验动物免疫保护检测免疫35天后，以巴氏杆菌强毒菌(C-44-8株)和猪链球菌2型口服攻毒实验小鼠，每只小鼠口服两种菌液各0.4ml进行攻毒(浓度分别为3×104/ml和3×109/ml)，观察小鼠的保护情况；49天时用常规方法对所有未死亡动物进行观察解剖，记录器官组织的病交情况。
17.数据分析上述各种数据均用方差分析进行差异显著性比较，以P＜0.05为差异显著性标准。
实验结果3.1猪白细胞介素-4和6基因克隆及序列分析应用RT-PCR扩增出猪淋巴细胞白细胞介素-4、6基因的cDNA(图3)，回收cDNA片段，克隆到pMD-T18载体中，转化感受态细胞，筛选和鉴定含重组质粒的菌落，小规模提取质粒DNA，酶切及电泳观察质粒DNA(图4、5)，确定重组质粒中的插入片段的大小同目的片段的大小一样后，进行序列测定，序列测定结果(图6、7)。用M13通用引物对含有目的基因片断的pMPIL-4、pMPIL-6质粒进行正反向测序，通过重叠序列的拼接，得到了完整的PIL-4、PIL-6基因的cDNA序列，并用DNA tools 5.1对其编码氨基酸进行了分析，PIL-4 cDNA长度为423个碱基，开放阅读框为402个碱基，编码134个氨基酸，分子量为15.0kD；PIL-6基因的cDNA序列长度为675个碱基，开放阅读框为645个碱基，编码215个氨基酸，分子量为24.0kD。
3.3猪IL-4/IL-6融合基因原核表达质粒的构建及表达活性分析将克隆到pMD18-T载体上的PIL-6cDNA片段酶切回收(结果见图8)，与酶切处理的pGEX4T-1载体连接转化，酶切和PCR鉴定得到含PIL-6cDNA片段的重组质粒pGIL6(结果见图9)。进一步将pGPIL6酶切与回收的PIL-4cDNA片段连接，用SalI，XhoI酶切和PCR鉴定，得到含PIL-6cDNA和PIL-4cDNA片段的重组质粒，命名为pG PIL-6/IL-4(结果见图10、11)。
将pG PIL-6/IL-4诱导培养，以诱导pGEX4T-1空载转化子作为对照。在加入IPTG 4小时后取样，分别提取重组子总RNA和空载表达蛋白总RNA。RT-PCR结果(见图12)显示，重组子经诱导后出现了1119bp的特异性条带，而pGEX4T-1空载转化子经诱导没有此特异带出现，说明经过诱导，IL-6/IL-4融合基因已得到了转录。
以经四小时诱导的pGEX4T-1，pGPIL6及pGPIL-6/IL-4和未被诱导的pGEX4T-1，pG-FPIL6及pGPIL-6/IL-4的细菌总蛋白进行电泳分析。经IPTG诱导的pGEX4T-1在E.coliDH5α中的表达样品在26KDa处出现GST蛋白带，而未经IPTG诱导的pGEX4T-1没有26KDa带；经IPTG诱导的pGPIL6表达样品在46KDa处明显出现新的蛋白带，为26KD的GST带和20KD的IL-6蛋白共同构成的融合蛋白；经IPTG诱导的pGPIL-6/IL-4表达样品在64KDa处明显出现新的蛋白带。在BL21宿主菌内，配合用2×YTA培养基诱导表达的融合蛋白量远大于在DH5α宿主菌，用LB培养基诱导表达的量。其表达量可占总蛋白量的30％，此带正是由26KD的GST和38KD的IL-6加IL-4蛋白共同构成的融合蛋白，而26KD处的GST带消失。表达融合蛋白SDS-PAGE图谱见图13。
回收融合蛋白包涵体，将包涵体经过变性，稀释、透析复性处理后用MTT法测定重组蛋白刺激猪淋巴母细胞增殖反应活性。以包涵体经变性，复性回收的融合蛋白为样品，以相同浓度的复性重组猪IL-6蛋白、IL-4蛋白和GST蛋白胶块磨碎后的上清为对照，进行猪淋巴母细胞增殖刺激活性检测，结果如表3。结果表明，回收的融合蛋白对猪淋巴母细胞有显著的刺激增殖作用，且与相同浓度的重组猪IL-6和IL-4比较，经复性处理的融合蛋白促进猪淋巴母细胞增殖反应活性显著增强(P＜0.05)。
表3回收融合蛋白对猪淋巴母细胞增殖刺激活性检测结果
3.4猪IL-4/IL-6融合基因真核表达质粒的构建将pGPIL-6/IL-4重组质粒酶切，电泳回收PIL-4/IL-6融合基因片段，与酶切、脱磷酸化的VR1020载体连接，菌落PCR鉴定转化子，进一步酶切筛选插入方向正确的重组表达质粒，命名为VPIL-46。
3.5猪IL-4基因真核表达质粒的构建将PIL-4片段与BamHI酶切、脱磷酸化的VR1020质粒DNA连接，转化经菌落PCR鉴定，得到含有目的PIL-4片段的重组质粒的菌落，菌落PCR见图14。PmacI和BagII双酶切筛选出正确方向插入的重组表达质粒，命名为VPIL-4(图15)。
3.6猪IL-6基因真核表达质粒的构建将PIL-6片段与酶切、脱磷酸化处理的VR1020质粒DNA连接，转化经菌落PCR鉴定，得到含有目的PIL-6片段的重组质粒的菌落，菌落PCR见图16。酶切筛选出正确方向插入的重组表达质粒，命名为VPIL-6(图17)。
3.7纳米颗粒的形态、粒径及zeta电位透射电镜观察结果表明壳聚糖纳米颗粒多呈球形(图1)。纳米颗粒度分析仪测定结果为平均粒径为48nm；多分散度为0.285(图2)；zeta电位为+25.8。
3.8壳聚糖纳米颗粒包装免疫基因质粒对小鼠非特异性免疫应答的影响从图18、19、20可见以壳聚糖包装VPIL-46质粒纳米颗粒，壳聚糖包装VPIL-4质粒联合壳聚糖包装VPIL-6质粒免疫小鼠时，免疫组小鼠血清中IgG、IgA、IgM含量和IL-2、IL-4、IL-6等细胞因子水平较壳聚糖包装VR1020空质粒对照组显著升高(P＜0.05)；同时，白细胞、淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞等免疫细胞数量也明显增加，只是攻毒后小鼠中性粒细胞数量较对照组稍低。两免疫组各指标变化无显著差异(P＞0.05)。
3.9壳聚糖纳米颗粒包装VPIL-46、VPIL-4、VPIL-6质粒对小鼠特异性免疫应答的影响从图21、22、23、24可见在特异性免疫组中，壳聚糖包装VPIL-46质粒纳米颗粒与链球菌疫苗、巴氏杆菌疫苗、沙门氏菌疫苗联合使用，可以明显提高实验小鼠血清中的IgG、IgA、IgM含量(P＜0.05)，对疫苗的特异性链球菌疫苗、巴氏杆菌疫苗、沙门氏菌抗体免疫应答也显著加强(P＜0.05)；与对照组相比，IL-2、IL-4、IL-6等细胞因子水平，免疫细胞数量等细胞免疫指标也明显提高(P＜0.05)，只是攻毒后中性粒细胞数量较对照组稍高。壳聚糖包装VPIL-4质粒及壳聚糖包装VPIL-6质粒联合疫苗免疫，同样能明显提高免疫小鼠的细胞免疫和体液免疫水平，增强疫苗免疫应答。
3.10强毒菌攻击后的免疫保护结果攻毒2周后剖解实验小鼠发现，实验接种小鼠多数健康存活(详见表4)，肝、脾、十二指肠、等消化道和呼吸道组织器官未出现明显病变，而对照小鼠均发病，精神萎靡，被毛耸立；发现各处组织皮下、粘膜等处有以出血、肝脾肿大等为主的病变，死亡鼠的病变较发病鼠严重和明显。
表4实验小鼠巴氏杆菌强毒菌攻击结果
这些结果显示壳聚糖纳米颗粒包裹VRIL46接种能显著增强小鼠对链球菌和巴氏杆菌感染的免疫抵抗力，提高其免疫保护率。
猪白细胞介素4和6融合基因序列<110>四川大学<120>猪白细胞介素-4、6融合基因抗病制剂<160>1<210>1<211>831<212>DNA<213>猪(Sus scrofa)<220>
<400>1ATGAGAAGTG TGAAAACCAG CAAGGAGGTA CTGGCAGAAA ACAACCTGAA CCTTCCAAAA 60ATGGCAGAAA AAGACGGATG CTTCCAATCT GGGTTCAATC AGGAGACCTG CTTGATGAGA 120ATCACCACCG GTCTTGTGGA GTTTCAGATA TACCTGGACT ACCTCCAGAA AGAGTATGAG 180AGCAATAAGG GAAATGTCGA GGCTGTGCAG ATTAGTACCA AAGCACTGAT CCAGACCCTG 240AGGCAAAAGG GAAAGAATCC AGACAAAGCC ACCACCCCTA ACCCCACCAC AAATGCCGGC 300CTGCTGGATA AGCTGCAGTC ACAGAACGAG TGGATGAAGA ACACAAAGAT CATTCTCATC 360CTGCGCAGCC TTGAGGATTT CCTGCAGTTC AGCCTGAGGG CCATTCGGAT AATGGTCGAC 420GGCTCCTCTA CTGGTCTCAC CTCCCAACTG ATCCCAACCC TGGTCTGCTT ACTGGCATGT 480ACCAGCAACT TCGTCCACGG ACACAAGTGC GACATCACCT TACAAGAGAT CATCAAAACC 540TTGAACATTC TCACAGCGAG AGAGAACTCG TGCATGGAGC TGCCCGTGAC GGACGTCTTT 600GCTGCCCCAG AGAACACGAC GGAGAAGGAA ACCTTCTGCC GGGCCTCGAC TGTGCTTCGG 660CACATCTACA GACACCACAC GTGCATGAAG AGCCTCCTGA GCGGACTTGA CAGGAACCTG 720AGCAGCATGG CAAACATGAC CTGTTCTGTG CATGAAGCCA AGAAGAGCAC TTTGAAAGAC 780TTCTTGGAAA GGCTAAAGAC GATTATGAAG GAGAAATACT CAAAGTGTTG A 83权利要求
1.猪白细胞介素-4、6融合基因抗病制剂，其特点为包括猪白细胞介素-4、6融合基因真核表达质粒的构建和口服制剂应用于猪增强机体免疫应答及抗感染免疫力的应用技术。
2.根据权利要求1所述的猪白细胞介素-4、6融合基因抗病制剂的制备，其特征在于融合猪白细胞介素-4和6基因，构建融合基因的VR1020真核表达质粒。
3.根据权利要求1所述的融合猪白细胞介素-4、6基因抗病制剂的制备，其特征在于所述制剂的包裹材料是分子量为300000，脱乙酰度95％以上的壳聚糖，以离子交联法制备质粒壳聚糖纳米颗粒分子。
4.使用权利要求1的猪白细胞介素-4、6融合基因表达质粒作为新型动物抗病免疫调节剂的应用技术，其特征如下a)将制备的猪白细胞介素-4、6融合基因质粒壳聚糖纳米颗粒分子用口服方式免疫动物，结果表明该制剂能有效提高实验动物非特异性细胞和体液免疫水平，增强其非特异性免疫抗病力，可有效抵抗强毒病原的感染攻击；b)用制备的猪白细胞介素-4、6融合基因抗病制剂联合疫苗(猪沙门氏菌疫苗、链球菌疫苗及巴氏杆菌疫苗)共免疫实验动物，结果表明猪白细胞介素-4、6融合基因抗病制剂可显著促进动物对疫苗的细胞免疫和体液免疫应答反应，增强动物的特异性免疫保护力，提高其免疫保护水平。
全文摘要
本发明公开猪白细胞介素－4、6融合基因抗病制剂的制备和应用技术。先克隆猪白细胞介素基因4和6，再融合猪白细胞介素－4、6基因，构建融合基因的真核表达质粒(VPIL46)，用离子交联法制备壳聚糖纳米颗粒分子包装质粒将质粒溶于三聚磷酸盐溶液，与分子量300000、脱乙酰度9 5％以上的壳聚糖醋酸液，55℃水浴恒温15min，按比例均匀混合质粒和壳聚糖溶液，得到壳聚糖纳米颗粒包装质粒液，粒径48nmnm，Zeta电位为+25.8mv。将VPIL46质粒纳米颗粒制剂以口服接种方式单独或配合疫苗免疫实验动物，可明显提高动物特异和非特异的细胞和体液免疫水平，显著增强试验动物的抗感染免疫保护力，提供了壳聚糖纳米颗粒包装VPIL46质粒作为动物抗病制剂的应用技术。
文档编号A61K48/00GK1692945SQ20041004076
公开日2005年11月9日 申请日期2004年9月30日 优先权日2004年9月30日
发明者高荣, 武梅, 孟民杰, 李江凌, 王泽洲, 吕学斌, 李惠, 付满良, 吴凯源, 杨毅, 沈翼 申请人:四川大学