专利名称：骨碎补提取物用于治疗骨关节炎的制作方法
技术领域：
本发明涉及骨碎补提取物的新用途，具体说，涉及骨碎补提取物在治疗骨关节炎中的应用，治疗骨关节炎的药物以及骨关节炎的治疗方法。
背景技术：
骨关节炎是常见的关节病。骨关节炎的主要表现包括有软骨退行性病变和关节边缘骨赘的形成。一般表现有关节疼痛、压痛、强响、关节积液、活动受限、关节畸形以及可有不同程度的局部炎症。一般无全身的症状。
研究表明自后20岁后人的骨关节就开始退化。随年龄增大，患病率迅速上升。在对一定范围内的人群调查表明，其患病率为38.7％，其中60岁以上受到影响的患病率为78.5％。此疾病在我国已成为仅次于缺血性心脏病导致工作能力丧失的第二大因素。
骨关节炎的病因尚待进行深入研究。但一般认为与年龄、关节过度劳损、激素水平、畸形、损伤等有关。对其治疗来说，目前有运动疗法、理疗、手术治疗、药物治疗等。
治疗骨关节炎的药物，例如阿斯匹林、对乙酰氨基酚、消炎痛、布洛芬、双氯芬酸、萘普生、塞米昔布等非甾体解热镇痛消炎药，皮质激素类甾体抗炎药，透明质酸，氨基葡萄糖等。上述药物可以在一定程度上缓解疼痛、消除炎症，但是并不能扭转病变组织，因此通常病人仍然难以避免进行昂贵的手术治疗。
根据中医理论，骨关节炎相当于中医中的骨痹或者骨痿。中医认为，这虽是发生在关节上的疾病，但与肾、脾、肝的腑脏相关，因此要适当补益肾与脾肝。目前市场上销售的治疗骨关节炎的中成药均是从此点出发的。但是利用骨碎补或者其提取物治疗骨关节炎的报道还没有见到。
骨碎补是蕨类植物，为水龙骨科植物槲蕨Drynaria fortunei(Kunze)J.Sm.或中华槲蕨D.baronii(Chist)Diels等的根茎。我们曾经就骨碎补提取物治疗骨质疏松进行了研究，发现含有黄酮类化合物的骨碎补提取物可以治疗骨质疏松，并据此提交了国际专利申请(参见WO02/53164A1号公报)。
现在，我们惊讶地发现，除了治疗骨质疏松以外，上述骨碎补提取物还可以治疗骨关节炎，经过进一步研究，完成了本发明。
发明内容
研究表明，骨碎补提取物可以治疗骨关节炎，因此本发明的内容是1.治疗骨关节炎的骨碎补提取物，其中含有黄酮类物质，黄酮类物质中包含柚皮苷，在提取物中，黄酮类物质的含量在30重量％以上，并且柚皮苷的含量在黄酮类物质的30重量％以上，但少于100重量％。
2.根据1的提取物，其中黄酮类物质的含量在50重量％以上。
3.根据1或2的提取物，其中柚皮苷的含量在黄酮类物质的90重量％以下。
4.根据1～3中任一项的提取物在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。
5.治疗骨关节炎的药物，其中至少含有根据1～3任一项的提取物作为有效成分。
6.根据5的药物，为口服制剂。
图1是100倍放大的实验例1的兔膝骨关节炎模型正常对照组的关节滑膜、滑膜下组织病理照片。
图2是100倍放大的实验例1的兔膝骨关节炎模型模型组的关节滑膜、滑膜下组织病理照片。
图3是100倍放大的实验例1的兔膝骨关节炎模型本发明提取物高剂量组的关节滑膜、滑膜下组织病理照片。
图4是100倍放大的实验例1的兔膝骨关节炎模型本发明提取物中剂量组的关节滑膜、滑膜下组织病理照片。
图5是100倍放大的实验例1的兔膝骨关节炎模型本发明提取物低剂量组的关节滑膜、滑膜下组织病理照片。
图6是100倍放大的实验例1的兔膝骨关节炎模型正常对照组的软骨组织病理照片。
图7是100倍放大的实验例1的兔膝骨关节炎模型模型组的软骨组织病理照片。
图8是100倍放大的实验例1的兔膝骨关节炎模型本发明提取物高剂量组的软骨组织病理照片。
图9是100倍放大的实验例1的兔膝骨关节炎模型本发明提取物中剂量组的软骨组织病理照片。
图10是100倍放大的实验例1的兔膝骨关节炎模型本发明提取物低剂量组的软骨组织病理照片。
图11是100倍放大的实验例2的大鼠骨关节炎模型正常对照组(假手术组)的关节软骨、滑膜组织病理照片。
图12是100倍放大的实验例2的大鼠骨关节炎模型模型组的关节软骨、滑膜组织病理照片。
图13是100倍放大的实验例2的大鼠骨关节炎模型本发明提取物高剂量组的关节软骨、滑膜组织病理照片。
图14是100倍放大的实验例2的大鼠骨关节炎模型本发明提取物中剂量组的关节软骨、滑膜组织病理照片。
图15是100倍放大的实验例2的大鼠骨关节炎模型本发明提取物低剂量组的关节软骨、滑膜组织病理照片。
图16是实验例2的大鼠骨关节炎模型正常对照组(假手术组)大鼠的股骨外髁的扫描电镜照片，图中比例尺为2微米。
图17是实验例2的大鼠骨关节炎模型模型组大鼠的股骨外髁的扫描电镜照片，图中比例尺为2微米。
图18是实验例2的大鼠骨关节炎模型本发明提取物高剂量组大鼠的股骨外髁的扫描电镜照片，图中比例尺为2微米。
图19是实验例2的大鼠骨关节炎模型本发明提取物中剂量组大鼠的股骨外髁的扫描电镜照片，图中比例尺为2微米。
图20是实验例2的大鼠骨关节炎模型本发明提取物低剂量组大鼠的股骨外髁的扫描电镜照片，图中比例尺为2微米。
具体实施例方式
以下具体叙述本发明。
本发明引用上述WO02/53164A1号公报的内容，在此全文引入作为参考。
本发明中所述的骨碎补(Rhizoma Drynariae)是指水龙骨科(Polypodiaceae S.F.Gary)槲蕨属(Drynaria(Bory)J.Sm.)植物如槲蕨Drynaria fortunei(Kunze)J.Sm.、秦岭槲蕨D.baronii(Chist)Diels、中华槲蕨D.sinica Diels、川滇槲蕨D.delavayi Chirst，以及骨碎补科骨碎补属(Davallia Sm.)植物骨碎补Davallia mariesii Moore exBak等一种或多种植物的根茎或全草。在本发明中，作为上述用作骨碎补使用的植物，只要是鉴定为骨碎补的，可以单独或者混合使用，在本发明中对此不加限制。
本发明的骨碎补提取物中，黄酮类物质的总含量应该在30重量％以上，优选40重量％以上，更优选45重量％以上，最优选50重量％以上。骨碎补提取物中黄酮类的含量上限没有特别限制，在30重量％～100重量％的范围内均具有治疗骨关节炎的活性。从工艺路线的选择和成本方面考虑，黄酮类物质的含量在50％以上即可较好的实现本发明的目的，如果把黄酮类物质的量提高到90％以上，不仅原料的成本要上升，而且还要增加额外的处理工序，因此黄酮类物质的含量最优选在50重量％～90重量％的范围内。
根据本发明人等的研究，根据本发明方法所得的骨碎补提取物中还可以含有多酚化合物。虽未发现多酚化合物对骨质疏松的明确作用，但本发明提取物这优选包含多酚化合物，因为已知多酚化合物具有抗炎、抗氧化作用，含有多酚化合物有利于本提取物在制备药物中的应用。多酚的含量因提取工艺等而变化，大体在10～50重量％之间。
在本发明提取物的黄酮类物质中，柚皮苷应不少于30％，优选不少于40％，更优选不少于50％，但黄酮类物质中不应该全部是柚皮苷，优选不多于90％，更优选至多80％。
本发明骨碎补提取物的典型制备方法例如包括药材粉碎、水煎煮提取、大孔树脂吸附、含水乙醇洗脱、后处理等步骤进行提取。具体可参见上述WO02/53164A1号公报中关于提取的记载，在此不再赘述。
获得提取物后，可以采用常规方法将提取物进行处理如调整含量、干燥等，然后制成制剂。
如上所述本发明的提取物，可以按照常规的制剂工艺，制备成任何适用于临床使用的药物剂型，例如，胶囊剂、丸剂、片剂、滴丸、颗粒剂、溶液剂或注射剂等。其中各剂型所含提取物的量依据剂型组成、所治疗患者的状况、临床使用条件等而有所不同。大体来说，当提取物中黄酮类物质含量以50％计时，患者每天给药0.1～5克，分1～4次服用。
另外，本发明的提取物也可以与其它现有的治疗骨关节炎的药物合用，例如与解热镇痛药、非甾体抗炎药、甾体抗炎药等联用，或者与其它治疗骨关节炎的中成药联用，治疗各种原因引起的骨关节炎。
本发明所述的骨关节炎，例如原发性或继发性骨关节炎。原发性全身性骨关节炎如累及远端和近端指间关节、第1腕掌关节、颈腰椎的椎间盘及椎突间关节、第1跖关节、髋和膝关节等骨关节炎等。其亚型包括侵蚀性、炎性骨关节炎、迅速破坏的肩、膝髋关节炎、弥漫性特发性骨骺肥厚、髌软骨骨关节炎等。继发性骨关节炎包括先天性关节畸形、遗传学缺陷、感染性、代谢性、内分泌性和神经病性疾病、改变透明软骨正常结构与功能的各种疾病如痛风、软骨钙质沉着等所导致的骨关节炎、对透明软骨及周围组织的创伤如骨折、一个或一组关节长期过劳等导致的骨关节炎等。
具体来说，本发明中所指的骨关节炎是指任何由于软骨细胞发生病理变化导致骨质变硬、顺应性降低，形成骨软骨赘、骨刺等，和/或同时软骨下的骨髓内形成骨囊肿所引发的关节疾病，如大体病理所见为透明软骨表面粗糙或缺失；有凹痕、不规则、局部出现大块溃烂、软骨表面弥漫缺失、滑膜增生和轻度滑膜炎的关节疾病。
同时，由于本发明的骨关节炎如果发生在颈椎、腰椎等位置时，还可引起脊髓病和神经根病，因此本发明的提取物也可以用于上述骨关节炎引发的其它疾病的辅助治疗。
以下实验例用来说明本发明提取物的效果，但不对本发明构成任何限制。
方法通过在关节腔内注入木瓜蛋白酶引发兔膝骨关节炎，通过股静脉结扎引发大鼠骨关节炎。观察本发明提取物对上述病理模型的效果。
药物和试剂1.本发明提取物原料褐色结晶粉末，由北京岐黄制药有限责任公司，批号0301012.木瓜蛋白酶北京奥博星生物技术责任有限公司产品，批号20030401其它试剂等均为市售常规试剂。
动物雄性白色家兔，48只，体重2.0～2.4kg，由南京安立默科技有限公司提供。许可证号为SCXK(苏)2002-0002。
SD雄性大鼠，60只，重200-230g，由东南大学实验动物中心提供。许可证号为SCXK(苏)2002-0014。
实验例1.本发明提取物对木瓜蛋白酶引发兔膝骨关节炎的效果按照文献方法[(1)高文香等，补肾法与活血法治疗兔膝骨关节炎的病理形态学对比研究，中医正骨，2000，12(6)325；(2)凌沛学等，玻璃酸钠对关节腔内注入木瓜蛋白酶所致兔膝关节退行性改变的改善作用，中国生化药物杂志，1996，17(6)242]，考察本发明提取物对兔膝骨关节炎模型的影响分组及剂量设计取40只白色家兔，按体重随机分为5组，每组8只，即正常对照组，模型对照组，本发明提取物高，中，低剂量组，本发明提取物组称取适量本发明提取物，用蒸馏水配成18mg/ml、9mg/ml、4.5mg/ml溶液，高、中、低剂量组给药剂量分别为108mg/kg、54mg/kg、27mg/kg，给药容积为6ml/kg；正常对照及模型对照组给予蒸馏水6ml/kg。
造模方法按照文献(1)公开的兔膝关节腔内注入木瓜蛋白酶造成骨关节炎病变模型方法，在家兔右膝关节腔内注入1.6％木瓜蛋白酶生理盐水溶液0.5ml，隔3天再注射第2次，共注射2次。
实验步骤 40只健康家兔正常饲养1周后，模型对照组、本发明提取物高、中、低剂量组按上述造模方法造模。在造模的同时，灌胃给药。连续给药8周后，将各组家兔放血处死，取下右膝关节，10％福尔马林溶液固定，常规石蜡包埋，然后切取膝关节的滑膜组织，作HE染色，光镜下观察。再切取股骨内髁软骨后，作HE染色，光镜下观察。
观察指标软骨及滑膜HE染色，观察有关的形态学变化。各组关节滑膜、滑膜下组织的病理照片如图1～图5所示，各组软骨组织病理照片如图6～10所示。
评分标准 按Mankin骨关节病组织学分类方法(表1、表2)对软骨及滑膜进行评分。
统计学处理 病理观察结果采用平均值±标准差表示，显著性比较采用t检验。结果见表3、表4。
表1骨关节软骨退行性改变评分表
表2滑膜组织改变的评分表
表3本发明提取物对兔膝骨关节炎模型关节滑膜病变积分的影响
**P＜0.01，与模型对照组比较表4本发明提取物对兔膝骨关节炎模型关节软骨病变积分的影响
*P＜0.05，**P＜0.01，与模型对照组比较由表3和图1～5可见，木瓜蛋白酶关节腔内注射造模8周后，模型对照组关节囊滑膜组织不完整，滑膜上皮细胞增生肥大，滑膜出现明显炎细胞浸润。正常组和模型对照组滑膜病变积分存在显著差异(P＜0.01)。高、中剂量组用药后病变减轻，积分显著降低(P＜0.01，与模型对照组比较)。
由表4和图6～10可见，木瓜蛋白酶关节腔内注射造模8周后，模型对照组关节软骨出现退行性病变，表层软骨细胞肥大，增生。正常组和模型对照组软骨病变积分存在显著差异(P＜0.01)。高、中、低剂量组用药后病变减轻，积分显著降低(分别P＜0.01，P＜0.05，与模型对照组比较)。
从图1～5和图6～10的结果可见，本发明提取物家兔给药后，与模型对照组相比，各剂量组形态优于模型对照组，高、中剂量组有明显改善。
实验例2.本发明提取物对大鼠骨关节炎模型的影响按照文献(唐旭升等，手法治疗大鼠实验性膝骨关节炎扫描电镜研究；中医正骨，2001，13(1)3)，考察本发明提取物对大鼠实验性骨关节炎的效果。
分组及剂量设计取50只大鼠，按体重随机分为5组，每组10只，即假手术组、模型对照组、本发明提取物高、中、低剂量组。本发明提取物组称取适量本发明提取物，用蒸馏水配成21.6mg/ml，10.8mg/ml，5.4mg/ml溶液，高、中、低剂量组给药剂量分别为216mg/kg，108mg/kg，54mg/kg，给药容积为1ml/100g体重；假手术及模型对照组给予蒸馏水1ml/100g体重。
大鼠乙醚麻醉，于无菌条件下垂直腹股沟切口，分离出股静脉，做双重结扎，缝合皮肤。术后分笼饲养。假手术组找到股静脉后不予结扎，缝合切口。4周起开始给药。每天灌胃给药1次，共给药8周。
于术后12周处死取材，取左膝关节，固定于10％福尔马林溶液，石蜡包埋，切片，进行组织病理学检查。并按照上述Mankin骨关节病组织学分类方法对软骨和滑膜进行评分。结果见表5、表6。
各组关节软骨、滑膜组织病理照片如图11～15所示。
另取右股骨外髁，先用生理盐水冲净表面血液、关节液及碎屑等，于2％的戊二醛固定，4℃下保存24小时，0.1M PBS清洗，以1％四氧化锇固定2小时。再以0.1M PBS漂洗，乙醇逐级脱水，丙酮-醋酸异戊脂置换，液态二氧化碳临界点干燥，粘台，镀金，于SX-40扫描电镜下观察，加速电压20KV。
各组扫描电镜照片如图16～20所示。
表5本发明提取物对大鼠膝骨关节炎模型关节软骨病变积分的影响
*P＜0.05，**P＜0.01，与模型对照组比较表6本发明提取物对大鼠膝骨关节炎模型关节滑膜病变积分的影响
**P＜0.01，与模型对照组比较由表5和图11～15可见，模型对照组软骨表层细胞增生，软骨细胞排列紊乱，关节软骨出现退行性病变。假手术组和模型对照组软骨病变积分存在显著差异(P＜0.01)。高、中剂量组病变减轻，软骨病变积分显著降低(分别P＜0.01，P＜0.05，与模型对照组比较)。
由表6和图11～15可见，模型对照组关节囊滑膜组织不完整，滑膜上皮细胞增生肥大，滑膜出现明显炎细胞浸润。假手术组和模型对照组滑膜病变积分存在显著差异(P＜0.01)。高、中剂量组病变减轻，积分显著降低(P＜0.01，与模型对照组比较)。
扫描电镜检测结果假手术组，软骨表面光滑，似覆盖一层无定形物质，典型的垄形结构基本趋于平行，无胶原暴露；模型组，无定形物质有所缺损，表面有胶原暴露，排列较不整齐，软骨面胶原集合成粗枝状，并翻起出现裂缝；高剂量组，软骨表面光滑，似覆盖一层无定形物质，垄形结构较平行，无定形物质有少量缺损，有少量胶原暴露；中剂量组，软骨表面较不光滑，无定形物质部分缺损，部分胶原暴露，垄形结构排列不平行；低剂量组，软骨表面无定形物质部分缺损，有部分胶原暴露，垄形结构排列紊乱，但较模型组有所改善。
上述检测结果表明本发明提取物大鼠给药后，与模型对照组相比，各剂量组形态优于模型对照组，高、中剂量组有明显改善。
权利要求
1.治疗骨关节炎的骨碎补提取物，其中含有黄酮类物质，黄酮类物质中包含柚皮苷，在提取物中，黄酮类物质的含量在30重量％以上，并且柚皮苷的含量在黄酮类物质的30重量％以上，但少于100重量％。
2.根据权利要求1的提取物，其中黄酮类物质的含量在50重量％以上。
3.根据权利要求2的提取物，其中柚皮苷的含量在黄酮类物质中的90重量％以下。
4.根据权利要求1～3中任一项的提取物在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。
5.治疗骨关节炎的药物，其中至少含有根据权利要求1～3任一项的提取物作为有效成分。
6.根据权利要求5的药物，为口服制剂。
全文摘要
治疗骨关节炎的骨碎补提取物，其中含有黄酮类物质和多酚类物质，黄酮类物质中包含柚皮苷，在提取物中，黄酮类物质的含量在30重量％以上，并且柚皮苷的含量在黄酮类物质的30重量％以上，但少于100重量％。
文档编号A61P19/00GK1733022SQ200410057489
公开日2006年2月15日 申请日期2004年8月13日 优先权日2004年8月13日
发明者王国芳 申请人:岐黄药业科技投资有限责任公司