专利名称：抗原特异性lgE抗体产生抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及IgE产生抑制剂，其有效预防或改善变应性疾病如特应性皮炎。本发明还涉及刺激活体免疫系统以增强免疫的组合物。
背景技术：
乳铁蛋白(LF)是一种铁结合糖蛋白，其不仅存在于乳中，还存在于外分泌液中，如唾液、泪液、胆汁和胰液。它还可以由在炎症部位被激活的中性白细胞释放。
LF具有广谱的生物活性。例如包括抗微生物活性、抗病毒活性、抗肿瘤活性、抑制癌转移活性之类等等。
此外，LF影响细胞因子分泌。例如LF促进人类中性白细胞分泌白细胞介素8(IL-8)，控制IL-1，IL-6和TNFα的分泌，并抑制GM-CSF基因水平的表达。
选择性产生细胞因子在各种疾病中起保护性作用或病原学作用。例如，大多数变态反应是I型变态反应，其与IgE抗体相关联。该IgE产生是由涉及IL-4的过程诱导的，另一方面，该IgE产生受到涉及干扰素-γ(IFN-γ)的过程控制。IFN-γ的产生是由其上位的IL-12和IL-18诱导的。
IFN-γ还显示出抗病毒活性、抗微生物活性和抗肿瘤活性，这些活性依赖于各种免疫调节功能(免疫学杂志(J.Immunol.)，130，2011-2013，1983；美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，85，4874-4878，1988)。
Nakajima等报道，当口服牛LF(bLF)后将小鼠脾细胞在促分裂原(Con A)的存在下培养时，IFN-γ的产生增加，但IL-4的产生未增加(生物医学研究(Biomedical Research)，29(1)，27-33，1999)。
如上所述，LF参与多种生物活性与细胞因子的产生及调控。因此本发明的目标是揭示LF的新生物活性，并基于此活性，提供含有LF作为活性成分的药物和功能性食品。本发明的另一个目标是发现一种可经口摄入的物质，当其与LF联合时，具有增加LF生物活性的效应。
本发明的公开本发明人发现，当用一种主要的食物变应原卵清蛋白(OVA)免疫经口摄入LF、经热处理的LF或LF水解产物的小鼠时，OVA-特异性IgE抗体的产生受到抑制，脾细胞培养系统中的抗原特异性IL-4的产生也受到抑制。他们还发现，当在LF的存在下培养巨噬细胞时，巨噬细胞产生IL-12增加。另外，他们还发现，联合使用LF和神经酰胺，显著增加脾细胞培养系统中IFN-γ的产生。认为经口摄入LF抑制抗原特异性IgE抗体的产生是通过抑制IL-4产生而抑制产生IgE抗体的B淋巴细胞的活化，以及通过增加IL-12的产生而在Th1/Th2平衡中向Th1优势移动引起的。即，经口摄入LF能防止通过向Th2应答移动而发生的细胞免疫的降低，并能预防或改善由变应性疾病或抗体反应引起的肾炎。LF和神经酰胺的组合显著增加IFN-γ的产生表明LF和神经酰胺的组合可有效对抗病毒性疾病、细菌感染或肿瘤。
具体地说，本发明提供一种哺乳动物(包括人)IgE抗体产生抑制剂，其包含活性成分LF或其水解产物。
本发明还提供一种通过抑制哺乳动物(包括人)IgE抗体产生而控制免疫的组合物，其包含活性成分LF或其水解产物。
本发明还提供用于包括人在内的哺乳动物的IFN-γ产生增效剂组合物、抗病毒剂组合物、抗菌剂组合物或抗肿瘤剂组合物，其包含LF或其水解产物以及神经酰胺。
本发明还提供用于包括人在内的哺乳动物的免疫增强剂组合物，其包含LF或其水解产物以及神经酰胺。
本发明还提供LF或其水解产物用于制备哺乳动物(包括人)IgE抗体产生抑制剂的用途。
本发明还提供LF或其水解产物用于制备通过抑制哺乳动物(包括人)IgE抗体产生而控制免疫的组合物的用途。
本发明还提供LF或其水解产物以及神经酰胺用于制备用于包括人在内的哺乳动物的IFN-γ产生增效剂组合物、抗病毒剂组合物、抗菌剂组合物或抗肿瘤剂组合物的用途。
此外本发明还提供LF或其水解产物以及神经酰胺用于制备用于包括人在内的哺乳动物的免疫增强剂组合物的用途。
本发明还提供在包括人在内的哺乳动物中抑制IgE抗体产生的方法，其包括施用有效量的LF或其水解产物。
本发明还提供在包括人在内的哺乳动物中调节IgE抗体产生的方法，其包括施用有效量的LF或其水解产物。
本发明还提供在包括人在内的哺乳动物中增加IFN-γ产生的方法，其包括施用有效量的LF或其水解产物以及神经酰胺。
本发明还提供增强包括人在内的哺乳动物免疫的方法，其包括施用有效量的LF或其水解产物以及神经酰胺。
附图简要说明
图1是在1％牛LF经口摄入组(■n＝7)和对照组(□n＝8)中将小鼠用OVA抗原敏化后血清中总IgE浓度的示意图(平均值±SD；*p＜0.05)。
图2是血清中OVA-特异性IgE抗体水平的示意图(平均值±SD；*p＜0.05)。
图3是小鼠脾细胞(在各组中将细胞合并)产生IL-4能力的示意图。●1％牛LF经口摄入组，■对照组。
图4是对2.2％经热处理的牛LF经口摄入组(n＝19)和对照组(n＝17)，用OVA抗原敏化(3次)之后，小鼠血清中总IgE抗体浓度的示意图(*p＜0.05)。
图5是血清中OVA-特异性IgE抗体水平的示意图(*p＜0.05)。
图6是小鼠脾细胞(牛LF经口摄入组n＝11，对照组n＝10)产生OVA-特异性IFN-γ的示意图。
图7是小鼠脾细胞产生OVA-特异性IL-4的示意图(*p＜0.05)。
图8是对2.2％经热处理的牛LF经口摄入组(n＝8)和对照组(n＝7)，用OVA抗原敏化(4次)之后，小鼠脾细胞产生OVA-特异性IFN-γ的示意图。
图9是小鼠脾细胞(对照组7只小鼠，2.2％bLF8只小鼠)产生OVA-特异性IL-4的示意图。
图10是对1％牛LF水解产物经口摄入组(n＝7)和对照组(n＝8)，用OVA抗原敏化之后，小鼠血清中总IgE抗体浓度的示意图(*p＜0.05)。
图11是对血清中OVA-特异性IgE抗体水平的效应的示意图。
图12是小鼠脾细胞产生OVA-特异性IFN-γ的示意图。
图13是小鼠脾细胞产生OVA-特异性IL-4的示意图。
图14是在100μg/ml牛LF的存在下培养小鼠腹膜巨噬细胞之后，在培养上清液中IL-12产量的示意图(**p＜0.01)。
图15是在100μg/ml牛LF存在或不存在的条件下，培养腹膜施用乳糖苷神经酰胺后的小鼠脾细胞和未施用乳糖苷神经酰胺的脾细胞时，培养上清液中IFN-γ产量的示意图。
实施本发明的最佳模式在许多变应性疾病中，已知变应原特异性IgE参与其发病。事实上，在变应性疾病患者的血清中经常发现变应原-特异性IgE(变态反应临床免疫学(Allergy Clin.Immunol.)，16，161，1996)。因此认为抑制IgE产生是预防和治疗变态反应的有效方法。
在IgE产生中，一种由CD4+辅助T细胞(Th细胞)产生的细胞因子起着重要的作用。取决于所产生的细胞因子及其功能，将Th细胞大致分为两个亚群，与细胞免疫相关的Th1细胞和与体液免疫相关的Th2细胞，参与IgE产生的是Th2细胞(免疫学杂志(J.Immunol.)，136，2348，1986)。
Th1细胞和Th2细胞相互关联，在分化和功能表达中，通过其产生的细胞因子彼此抑制。具体地说，Th2细胞产生IL-4、IL-5和IL-6以控制IgE产生；相反，Th1细胞产生的IFN-γ通过抑制IgE类别转换和Th细胞应答而抑制IgE产生。相应地，Th2细胞应答增加IgE产生并促进变应性疾病(自然(Nature)，383，787，1996)。因此通过诱导Th1细胞应答将Th1/Th2平衡恢复至正常可以预防和改善变应性疾病。于是曾尝试在食物成分中筛选诱导Th1应答的因子。在此之前已发现某些类型的乳酸细菌(国际变态反应免疫学文献(Int.Arch.Allergy Immunol.)，115，278，1998)、核苷酸(国际变态反应免疫学文献(Int.Arch.Allergy Immunol.)，122，33，2000)之类等等显示出该效应。
近年来，报道了口服LF在各种动物模型中的生物防御效应。因此本发明人用小鼠首先进行了一项研究，内容关于当让小鼠随意经口摄入LF时，血清中总IgE和抗原特异性IgE的产生。结果发现随意经口摄入LF抑制总IgE抗体的产生和抗原特异性IgE的产生。
已知LF的生理学活性经热处理而下降(儿科学杂志(J.Pediatr.)，90，29，1977)。因此假设将LF进行热处理会降低LF抑制总IgE产生和抗原特异性IgE产生的能力。于是进行了关于经热处理的LF对总IgE抗体产生和抗原特异性IgE产生的可能效应的研究。此外，在OVA的存在下培养脾细胞，并测定培养上清液中细胞因子(IFN-γ、IL-4)的水平。结果发现即使LF经加热，其对抗原特异性IgE抗体产生和IL-4产生的抑制活性也没有丧失。
已经发现，当LF或经热处理的LF经口摄入时，与对照组相比，总IgE抗体的产生和抗原特异性IgE的产生受到显著抑制。还发现当将用抗原敏化的脾细胞在该抗原的存在下培养时，与对照组相比，IL-4的产生显著降低。
然后研究了当经水解的LF随意经口摄入时其对总IgE抗体产生和抗原特异性IgE产生的可能效应。另外，将用抗原敏化的脾细胞在该抗原的存在下培养，并测定上清液中的细胞因子(IFN-γ、IL-4)水平。结果发现在LF水解产物摄入组中，总IgE抗体产生和抗原特异性IgE产生具有降低的倾向。另一方面，在LF水解产物摄入组中，证实在不考虑浓度的OVA的存在下IFN-γ的产生有增加的趋势，但对于IL-4，在LF水解产物摄入组和对照组之间未观察到差异。
IL-12是由抗原呈递细胞如单核细胞、巨噬细胞和树突细胞产生的一种细胞因子，其在IFN-γ的产生和诱导辅助T细胞分化为Th1中有重要作用(血液(Blood)，84，4008，1994；白细胞生物学(Leukoc.Biol.)，55，280，1994)。Gazzinelli等报道用鼠弓形体(Toxoplasmagondii)感染小鼠，引起脾脏或腹腔内细胞产生IL-12增加，而随后给小鼠施用抗IL-12抗体使脾细胞产生IL-12减少，并使IL-4和IL-10产生增加(免疫学杂志(J.Immunol.)，153，2533，1994)。此外，Nastala等发现向癌移植小鼠施用IL-12抑制癌的生长，并增加血中IFN-γ浓度(免疫学杂志(J.Immunol.)，153，1697，1994)。
于是，通过将已在巯基乙酸培养基中诱导的小鼠腹膜巨噬细胞与LF一起培养，研究IL-12的产生。结果发现LF诱导巨噬细胞产生IL-12。
先前认为特应性皮炎是一种温和形式的皮炎，但现在认为其是一种所有年龄(婴儿到成人)均可发生的难于控制的疾病，并已成为严重的社会问题。在表皮中鞘脂的代谢紊乱被认为是可能的病因。实际上，在许多特应性皮炎患者中观察到表皮中神经酰胺量的减少。神经酰胺还用作营养品和功能性食品。因此本发明人得出假设，联合经口摄入LF和神经酰胺，增强了LF在预防和改善变应性疾病中的效应，超过单独应用LF。
因此，本发明人进行了关于LF和神经酰胺组合对IFN-γ产生的可能效应的研究。结果发现LF和神经酰胺组合显著增加了脾细胞中IFN-γ的产生。在鞘脂之中，已知在酸乳(发酵的奶)中的鞘脂(鞘氨醇、鞘磷脂、溶血磷脂酰胆碱)促进IFN-β的产生(生物疗法(Biotherapy)，115-123，1994)。还报道了通过施用鞘氨醇增加感染小鼠血IFN-β和IFN-γ(Osada，K.等，动物细胞技术向21st世纪的发展(Animal Cell TechnologyDevelopment towards the 21stCentury)，1067-1071，1995)。
根据这些结果，认为经口摄入LF对抗原特异性IgE抗体产生的抑制作用可归因于通过抑制IL-4产生而抑制了产生IgE的B淋巴细胞的活化，还可归因于通过增加IL-12产生而在Th1/Th2平衡中向Th1应答的移动。因此，经口摄入IF对预防和改善变应性炎性疾病是有效的。相应地，加入有效量的LF作为食物的补充可通过饮食预防和改善变应性疾病，而且LF还可用作针对这些疾病的药物。变应性炎性疾病的例子是慢性支气管哮喘、特应性皮炎、花粉病(过敏性鼻炎)、变应性血管炎、过敏性结膜炎、过敏性胃肠炎、过敏性肝病、过敏性膀胱炎和过敏性紫癜。预计LF还可预防和改善抗体引起的肾炎或类似疾病。
由于联合应用LF和神经酰胺显著增加IFN-γ的产生，可以理解联合应用LF和神经酰胺通过在Th1/Th2平衡中向Th1优势迁移而抑制IgE抗体的产生。已知IFN-γ展示出抗病毒活性、抗肿瘤活性、诱导细胞毒T淋巴细胞效应、诱导自然杀伤细胞(NK细胞)活性效应、活化中性白细胞效应、活化巨噬细胞效应、促进MHC II表达效应、促进IL-2受体表达效应、促进Fc受体表达效应之类等等。另一方面，IFN实质上是一种生物物质，其参与活体抵抗外来物质的防御机制，具有极高的选择毒性，并对活体高度安全。当含有LF和神经酰胺组合物的食物等经口摄入时，该组合物刺激活体细胞以促进IFN-γ的分泌并发挥上述IFN-γ的生理学活性。因此，联合含有LF和神经酰胺的组合物可以用作抗病毒剂、抗肿瘤剂和/或抗菌剂。关于LF的安全性，在用小鼠进行的牛LF的急性毒性试验和亚急性毒性试验中，即使以最大剂量(2,000毫克/公斤体重/天)施用牛LF，也绝对没有观察到异常(乳科学(Milk Science)，48(3)，227-232，1999)。至于神经酰胺的安全性，稻神经酰胺(一种从Oryza Sativa Linne的种子得到的神经酰胺)的LD50对小鼠是5,000毫克/公斤或以上(食物种类(FOODStyle，4(10)，99-105，2000)。
可用于本发明的LF的例子可包括市售的LF、用本领域本身已知的方法(例如，离子交换层析之类等等)从哺乳动物(例如人、奶牛、绵羊、山羊、马或之类动物)的初乳、过渡乳、正常乳、哺乳晚期乳之类等等或脱脂乳或从这些乳得到的乳清中分离的LF、其用酸或酶产生的水解产物、通过用盐酸、柠檬酸或之类的酸去除铁而得到的apoLF，和通过用金属(如铁、铜、锌和锰)螯合apoLF所得的金属饱和的或部分饱和的LF。
为制备本发明中的LF水解产物，可用已知的水解方法。当酶用于水解时，可用除胰蛋白酶之外的酶，例如hepsin和木瓜蛋白酶，尽管在本发明中用的是胰蛋白酶。对酶没有施加限制，只要所述水解产物具有根据本发明的活性。通过在加热下使酶失活，然后用本领域本身已知的方法(如超滤)进行分级分离，可将水解产物浓缩。所得液体水解产物可直接使用，或在冻干之后使用。
重组LF包括具有与Orla M.Conneely等公开的序列(美国专利5,766,939)基本相同的氨基酸序列的多肽。还包括天然存在的等位基因以及与天然LF相比，通过一个或多个氨基酸的插入、置换或缺失形成的经修饰的LF。重组LF还包括在转基因动物(例如牛)中表达的重组LF。其糖基化方式可与从人乳中获得的天然LF不同。
可用于本发明的神经酰胺包括神经酰胺相关物质。例如，鞘脂，特别优选鞘糖脂。鞘糖脂的例子可包括脑苷脂(它是在乳、脑和肾脏中发现的最简单的鞘糖脂)、硫苷脂带有一个硫酸基团加至脑苷脂、神经酰胺寡己糖苷带有数个中性糖分子加至脑苷脂和神经节苷脂带有氰尿酸加至脑苷脂。取决于鞘糖脂糖链的差异已确定了超过100种鞘糖脂的结构。
鞘糖脂都包括在内，只要它们在本发明中有效。优选的例子可包括乳糖苷神经酰胺、半乳糖苷神经酰胺和糖基神经酰胺。此外，还优选鞘磷脂(乳中含有)，它是一种磷脂。另外，不对称合成技术或之类技术使化学合成天然神经酰胺成为可能，并正在发展具有光学活性的神经酰胺。它们包括神经酰胺2和神经酰胺3(Cosmo Farm Co.，Ltd.)。这些神经酰胺可用于本发明中，只要它们在本发明中有效。而且，植物衍生的神经酰胺正受到关注，并开发应用。在大米衍生的鞘脂中，例如一种带有通过酸-酰胺结构键合至长链碱性鞘氨醇的脂肪酸的疏水神经酰胺是类似动物鞘脂的基本骨架。大米衍生的鞘脂在分子种类上具有多样性，其取决于长链碱性鞘氨醇和脂肪酸的碳原子数的差异以及羟基基团或双键的存在或不存在。根据Obihiro农业和兽医大学的Fujino教授的一项报道，有至少超过20种鞘脂的分子种类。
本发明包括这些神经酰胺。
关于本发明中LF(包括所有LF、具有与LF相当的生理学活性的LF衍生物以及LF和LF衍生物的水解产物)和神经酰胺的含量，估计神经酰胺含量的范围优选从0.0001到0.1wt％，更优选从0.0005到0.01wt％，特别优选从0.0001到0.05wt％，所有wt％都基于组合物的总重量，而估计LF的含量范围优选从0.005到10wt％，特别优选从0.01到5wt％，最优选从0.01到3wt％，所有wt％都基于组合物的总重量。然而，相信本领域技术人员能容易地确定其在各目标组合物中的最佳含量，例如，通过下述试验。顺便提及乳中的神经酰胺的含量是已知的，据信其至少在某种程度上可作为要加入的神经酰胺量的标准。
本发明已阐明，经口摄入LF抑制抗原特异性IgE抗体的产生。因此，本领域普通技术人员可基于本发明从上述各种LF及其有效量中选择适用本发明的优选形式的LF，例如通过用IgE抗体产生作为一个指标；视临床数据、临床症状等与患者血清IgE之间的关系来确定LF的剂型和有效剂量，以用于食品、补充剂、病残者食品、婴儿配方奶粉、健康食品、健康要求食品、功能性食品、特定的健康食品、药物或之类中。相应地，如上所述确定的LF类型及其有效剂量包括在本发明中。将LF加入或加工成为食品之类的技术是熟知的并常用的。在使用有效量的LF作为药物时，可通过将其配置成本领域技术人员已知的各种制剂形式来应用。
实施例本发明此后将基于测试和实施例进行描述。但是应该记住本发明并不限于这些测试和实施例。
在下列试验中，将3周龄的雄性未成熟的BALB/c小鼠(Japan SLC，Inc.，Shizuoka，Japan)用于测试1-4和6中，将8周龄的雌性BALB/c小鼠(Japan SLC，Inc.，Shizuoka，Japan)用于测试5中。用学生t检验(Student’s t test)进行各对照组及其相对应的试验组之间的显著性检验。
测试1 牛LF(bLF)抑制IgE抗体产生的活性在试验期间，让LF施用组中的小鼠(n＝7)随意摄入一种含酪蛋白作为蛋白质来源的饲料(基于AIN76)，和含1％牛LF(bLF，DMV JapanK.K.的产品)的水。让对照组中的小鼠(n＝8)随意摄入上述饲料和无bLF的水。
在试验开始后的第5天和第19天，用10μg卵清蛋白(OVA，SEIKAGAKU CORPORATION的产品)以及4mg氢氧化铝对每只小鼠进行腹膜内免疫。在第26天，从眼眶取血，用ELISA测定血清中总IgE抗体水平和OVA-特异性IgE抗体水平。bLF组小鼠血清中总IgE抗体水平(图1)和OVA-特异性IgE抗体水平(图2)都低于对照组(*p＜0.05)。
测试2 bLF抑制IL-4产生的活性在测试1中，切除脾以制备脾细胞悬液。溶血后，在OVA的存在下将脾细胞在各种浓度(5，10，50和100μg/mL)培养72小时。培养之后，用ELISA测定各培养上清液中的IL-4水平。在bLF施用组(n＝7)中，各OVA浓度下的IL-4水平都低于对照组(n＝8)中相应的IL-4水平。
测试3经热处理的bLF抑制IgE抗体和细胞因子产生的活性将一种通过向测试1的饲料中加入2.2％bLF获得的饲料[bLF(+)]在70℃加热1小时。作为对照，将未加入bLF的饲料[bLF(-)]同样在70℃加热1小时。
在试验期间，让小鼠随意摄入bLF(+)(试验组)或bLF(-)(对照组)。在试验开始后的第5天、第14天、第23天和第33天，对每只小鼠用卵清蛋白(OVA，SEIKAGAKU CORPORATION的产品)(10μg)以及氢氧化铝(4mg)进行腹膜内免疫。在第3次腹膜免疫之后第8天(第30天)(7周龄)，从尾部取血，用ELISA测定血清中的抗体。此外，在第3次腹膜免疫之后第11天(第33天)以及在第4次腹膜免疫之后第8天(第40天)，取决于各小鼠分别收集脾细胞。将脾细胞与不同浓度(0，50，100，200和400μg/mL)的OVA一起在含10％FCS、100U/mL青霉素G、100μg/mL链霉素和5×10-5M 2-巯基乙醇的RPMI1640培养基中培养72小时。培养后，用ELISA测定各培养上清液中的IFN-γ水平和IL-4水平。
当进行3次免疫时，试验组血清中的总IgE抗体水平和OVA-特异性IgE抗体水平与对照组相应结果相比显著降低(图4和图5)。对于脾细胞在各OVA浓度(0，50，100和200μg/mL)下IFN-γ的产生，在试验组和对照组之间没有观察到实质性差异(图6)。另一方面，试验组中脾细胞在各OVA浓度下IL-4的产生总体低于对照组，在200μg/mL OVA的刺激下，试验组中IL-4的产生比对照组降低得更为显著(图7)。
当进行4次免疫时，脾细胞在各OVA浓度(0，50，100，200和400μg/mL)下IFN-γ的产生，如3次免疫的实施例一样在组之间没有产生实质性差异(图8)。另一方面，试验组中在各OVA浓度下IL-4的产生总体比对照组降低得更为显著(图9)。
由以上结果可见，bLF抑制抗原特异性IgE抗体产生的活性和抑制IL-4产生的活性不随加热而丢失。
测试4经水解的bLF抑制IgE抗体和细胞因子产生的活性(1)制备经水解的bLF将胰蛋白酶(“207-09891”，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.的产品，用于生物化学用途，从猪脾脏制备，4,500USP胰蛋白酶单位/mg)溶解在灭菌的PBS中作为胰蛋白酶原液(×500，50mg/mL)。将bLF(“127-04122”，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.的产品，lot.KSG7724)(10g)溶解在25mM CaCl2-0.1M Tris-HCl(pH8.2)中形成1％溶液。将1L bLF溶液加热至37℃后，加入胰蛋白酶原液(2mL)，接着在37℃反应4小时。反应之后，在80℃加热30分钟以使酶失活。在1,700×g离心20分钟之后，收集上清液并用0.45μm滤器过滤除菌，用“Micro Acilyezer S1”(一种电透析机器，由AsahiChemical Industry Co.，Ltd.生产)处理样本，从样本中除去盐。将样本用0.45μm滤器再次过滤除菌之后，将其贮存在-20℃，直到用于试验。bLF水解产物的收率基本上是100％。bLF水解产物的浓度是1％。
让小鼠随意摄入测试1的饲料和含1％bLF水解产物的溶液。让对照组随意摄入同样的固体饲料和无bLF的水。在试验开始后的第5天和第19天，用卵清蛋白(OVA，SEIKAGAKU CORPORATION的产品)(10μg)以及氢氧化铝(4mg)对每只小鼠进行腹膜内免疫。在第2次免疫之后第8天(第26天)，取血，用ELISA测定血清中的抗体。同时，还取决于各小鼠分别收集脾细胞。将脾细胞与OVA(0-400μg/mL)共同培养72小时，用ELISA测定各培养上清液中的IFN-γ和IL-4水平。
观察到试验组血清中的总IgE抗体水平和OVA-特异性IgE水平与对照组中的相应水平相比变得更低(图10和11)。
注意到脾细胞在不同OVA浓度下产生IFN-γ的总体倾向在试验组中高于对照组(图12)。另一方面，IL-4的产生在试验组和对照组之间没有显示出实质性差异(图13)。
测试5 LF对产生IL-12的效应尽管IL-12是相对近来才发现的一种细胞因子，已知其作用于T细胞和NK细胞以诱导IFN-γ的产生(实验医学杂志(J.Exp.Med.)，173，869-879，1991；实验医学杂志(J.Exp.Med.)，177，1199-1204，1993)。对于诱导IL-12的产生，细胞组分如LPS的刺激是有效的，产生IL-12的细胞包括多种细胞，如巨噬细胞、B细胞和嗜中性白细胞。
本发明人在加入bLF(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.的产品)的培养基中培养腹膜巨噬细胞，并用ELISA测定培养上清液中的IL-12水平。
对于随意摄入饲料“MF”(Oriental Yeast Co.，Ltd的产品)的小鼠，用巯基乙酸培养基(DIFCO Laboratories的产品)(2.5mL)各进行腹膜内注射，以激活腹膜巨噬细胞。4天后，将含1％FCS的Dulbeccos磷酸缓冲液(“Dulbeccos’PBS”，NISSUI PHARMACEUTICALCO.，Ltd的产品)注射至腹腔中以收集腹膜细胞。将细胞洗涤两次之后，将其重悬于“Dulbeccos’PBS”中，加入96孔板(2×105细胞/0.2mL孔)之后，将板在CO2培养箱中温育2小时。去除非粘附细胞之后，用含10％FCS、100U/mL青霉素G、100μg/mL链霉素、5×10-5M 2-巯基乙醇和100μg/mL bLF(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.的产品)的RPMI 1640培养基(200μL)注满各孔。作为对照，使用无bLF的上述培养基。将各板在CO2培养箱中温育18小时。培养之后，用ELISA测定各上清液中的IL-12水平。结果如图14所示。培养基中加入bLF显著增加了巨噬细胞IL-12的产生。
从以上结果可见，乳铁蛋白诱导巨噬细胞产生IL-12。
测试6 神经酰胺对IFN-γ的产生的效应试验使用BALB/c小鼠(3周龄，雄性)(Japan SLC，Inc.)。将小鼠分成乳糖苷神经酰胺施用组(试验组)和乳糖苷神经酰胺未施用组(对照组)(每组3只小鼠)，以使两组小鼠体重的均值和偏差基本上相等。
用作神经酰胺的是乳糖苷神经酰胺(“生物化学试剂126-04491”，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.的产品，来源于牛奶，lotELK6191)。将乳糖苷神经酰胺以200μg/mL的浓度分散在含0.5％Tween20的0.9％NaCl溶液中，并将所得分散体贮存于-20℃直到使用。在使用时，将分散体化冻，向其中加入等量的已灭无菌的PBS。充分混合后，每天给小鼠腹膜内施用乳糖苷神经酰胺溶液(每只小鼠200μL)共14天，除外周日和周六(每只小鼠20μg)。对于对照组，只施用溶剂(含0.5％Tween20的0.9％NaCl溶液并加入等量的已灭菌的PBS)。
将在给药后第14天从每只小鼠获得的脾细胞接种至96孔微量培养板中(“No.3072”，由Becton Dickinson and Company生产)，接种量为每孔4×105细胞。培养采用的培养基是RPMI 1640培养基(“No.11875-093”，Gibco BRL的产品)，其中含有10％胎牛血清(JapanBiotest Laboratory的产品，lot 10086-1)、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和5×10-5M 2-巯基乙醇。培养进行4轮，将脾细胞在bLF(MeggleGmbH的产品，0或100μg/mL)的存在下培养20小时。培养之后，用ELISA试剂盒(ENDOGEN Inc.的产品)测定各培养上清液中的IFN-γ。用双向分类方差分析(2×2，显著性水平5％)分析数据，取施用乳糖苷神经酰胺和bLF刺激作为因素。
结果如图15所示。当未施用神经酰胺时，无论bLF是否存在都未观察到IFN-γ的产生。当预先施用神经酰胺时，在bLF不存在及存在下都观察到IFN-γ的产生显著增加。由于在神经酰胺和bLF这两个因素之间观察到相互作用(p＝0.0016)，发现施用乳糖苷神经酰胺增加牛LF刺激的IFN-γ生。
实施例1将牛LF以0.01％的浓度加入“EPITOLESS”(MEIJI MILK PRODUCTSCO.，LTD的产品)，这是一种针对乳过敏患者的乳，其不使用乳清蛋白作为原材料，并具有下述配方。
实施例2将牛LF以0.01％的浓度加入经水解的乳“MEIJI NOBIYAKA”(MEIJIMILK PRODUCTS CO.，LTD的产品)，其含有乳清蛋白作为原材料。
工业应用性通过本发明发现，经口摄入LF抑制体内IgE抗体的产生。
权利要求
1.乳铁蛋白或其水解产物用于制备包括人在内的哺乳动物抗原-特异性IgE抗体产生抑制剂的用途。
2.乳铁蛋白或其水解产物用于制备通过抑制包括人在内的哺乳动物抗原-特异性IgE抗体的产生而控制免疫的组合物的用途。
全文摘要
本发明涉及哺乳动物(包括人)IgE抗体产生抑制剂和免疫调节组合物，其各包含乳铁蛋白(LF)或其水解产物作为活性成分。本发明还涉及IFN－γ产生增效剂，其各包含LF或其水解产物以及神经酰胺。
文档编号A61K38/01GK1626240SQ20041005770
公开日2005年6月15日 申请日期2001年1月12日 优先权日2000年1月14日
发明者高桥毅, 永渕真也, 中村吉孝, 矢岛高二, 桑田有 申请人:明治乳业株式会社