专利名称：草鱼呼肠孤病毒抗原亚单位疫苗制备方法
技术领域：
本发明涉及病毒学领域，特别是一种草鱼呼肠孤病毒抗原亚单位疫苗制备方法。本发明所用病毒株为草鱼呼肠孤病毒湖南邵阳株GCRV873(Grass carp reovirus)，又称草鱼出血病病毒湖南邵阳株GCHV873(Grass carp hemorrhagic virus)，已由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日期是2004年7月23日，保藏编号是CCTCC NOV200414。
背景技术：
草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国淡水养殖四大家鱼之一。草鱼呼肠孤病毒是引起草鱼死亡的主要病原，发病严重时，可造成85％以上的草鱼鱼苗发病死亡，由此给淡水养殖业造成严重的经济损失。对于病毒性疾病的防治，疫苗是最为有效的措施。草鱼呼肠孤病毒粗制组织浆及细胞灭活疫苗已相继应用于生产，并取得了一定效果。但是，由于灭活疫苗的稳定性、纯度及安全性等方面存在诸多不利因素，其应用推广价值有限。草鱼出血病在我国有些地区仍时有发生，而且，在我国大面积再度暴发的隐患依然不可忽视。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是鉴于减毒活疫苗及粗制灭火疫苗所存在的残余感染性与效价不稳定等因素，有必要提供一种草鱼呼肠孤病毒抗原亚单位疫苗制备方法，从而为发展鱼用病毒疫苗开辟新的有效途径。
本发明所采用的技术方案是采用草鱼肾细胞系即CIK细胞增殖GCRV873，GCRV873是草鱼呼肠孤病毒湖南邵阳株；通过离心法，对感染了GCRV873的细胞病毒悬液进行纯化和浓缩；表面活性剂处理纯化的病毒，使完整病毒结构解体，形成病毒核酸与衣壳蛋白亚单位组分；采用核酸酶消化，降解游离的病毒基因组dsRNA；通过透析处理，得到不含核酸的草鱼呼肠孤病毒蛋白抗原亚单位制剂；用生理盐水稀释病毒蛋白抗原亚单位制剂，制备成草鱼呼肠孤病毒抗原亚单位疫苗。
本发明与现有技术相比，具有以下主要优点其一.制备方法简单、操作方便，适于规模化批量生产和应用。
其二.产物纯度较高基本不含有其它(如细胞及组织)蛋白抗原成分，可用于制备一种安全、高效防治草鱼出血病的疫苗。
其三.产物不含有病毒核酸，亚单位疫苗含有完整病毒抗原。不仅对鱼体及水环境具有安全性，同时排除了对水产养殖物的潜在的基因污染等问题。
其四.使用GCRV873亚单位制剂，浸泡3～5cm草鱼鱼苗30分钟，可达到80％～85％免疫保护效果。
其五.亚单位制剂为浓缩病毒抗原亚单位产物，具有包装体积小及高滴价等特点，便于运输与保存。
其六.具有商品化推广价值，与免疫佐剂同时使用，可进一步提高提高鱼体免疫保护率。
具体实施例方式
本发明提供的草鱼呼肠孤病毒抗原亚单位疫苗，其制备步骤包括(1)采用CIK细胞(草鱼肾细胞系)进行病毒增殖，获得感染CIK细胞的草鱼呼肠孤病毒湖南邵阳株GCRV873的病毒悬液。
(2)通过离心法，对感染了GCRV873的细胞病毒悬液进行纯化和浓缩。
(3)表面活性剂处理纯化的病毒，使完整病毒颗粒结构解体，形成病毒核酸与衣壳蛋白亚单位组分。表面活性剂可采用NP40(Fluka公司产品)；其浓度为0.5％～1％，这样可使得病毒衣壳蛋白变得松散而不至于完全降解。
(4)采用核酸酶进行消化，降解GCRV873亚单位制剂中游离的病毒基因组dsRNA。
(5)通过透析处理，得到不含核酸的草鱼呼肠孤病毒抗原亚单位蛋白制剂。
(6)用生理盐水对病毒抗原亚单位蛋白制剂进行稀释，得到草鱼呼肠孤病毒抗原亚单位疫苗。
下面结合实施例对上述制备方法作进一步说明。
一.GCRV873病毒增殖1.采用CIK细胞(草鱼肾细胞系)进行GCRV873增殖。
1)细胞培养液为含10％超级纯小牛血清的Eagle′s MEM培养基(MEM-10)，pH7.2。
2)CIK细胞培养取液氮中保存的CIK细胞，37℃温育2～3min。直接在台式离心机上离心1min后，加入适量的MEM-10培养液，转移至培养瓶中进行培养。CIK细胞最适培养温度为28℃，在细胞培养2～3天，待基本铺满培养瓶底后，采用0.1％～0.25％的胰蛋白酶消化贴壁细胞，进行传代培养。
3)GCRV873病毒制备传代细胞处于对数生长期或在瓶底汇集约80％时，将预接种的CIK细胞，首先用10mmol/L磷酸盐缓冲液(phosphate buffered salient，简称PBS)冲洗3次，除去牛血清蛋白组分；然后按1/10的培养体积加入感染的病毒悬液，病毒的感染复数MOI(Multiplicity of infection)为5～10PFU/cell，在病毒悬液吸附细胞30～60min后，倒掉未吸附的病毒悬液，然后再用10mmol/L PBS清洗3次，去除未吸附的病毒颗粒。采用含2％小牛血清的MEM(MEM-2)维持液进行病毒增殖。在病毒感染48～72h，待大部分细胞基本裂解后，收集病毒悬液，于4℃保存备用。
2.滴价测定将待测病毒悬液进行一系列10倍稀释(10-1～10-15)，按上述病毒增殖方法感染CIK细胞。在病毒感染48～72h，观察细胞病变情况。按Reed-Muech法计算50％中和滴价。测定病毒培养液的滴价为1011TCID50/ml。
二.GCRV873病毒纯化收集感染CIK细胞的GCRV病毒悬液，以8000r/min(6000g)低速离心30分钟，除去游离细胞碎片。将除去细胞碎片的病毒悬液以26,000r/min(80,000g)超速离心2.5hrs，沉淀GCRV颗粒。弃上清液，沉淀按1∶100倍体积溶于10mmol/L PBS中。随后再以8000r/min(6000g)低速离心20分钟，除去残余细胞碎片。上清液按1/10体积比加入0.5％～1％Nonidet p40(Flaka公司产品，简称NP40)或其它种表面活性剂如Triton-X-100(溶于10mmol/L PBS)，28℃处理2～4h，使病毒衣壳成分变得松散。在上述溶液中加入50-100mg/ml核酸酶(RNase)，28℃消化2～4h，降解游离病毒核酸。最后对双蒸水流水透析48h，除去降解的核酸。纯化的样品于-20℃保存备用。
GCRV873病毒颗粒为二十面体对称的球形颗粒，成熟病毒直径约为75nm，具有双层衣壳，无囊膜。该病毒在pH3-11范围内十分稳定，对氯仿与乙醚等有机溶剂不敏感，其基因组由11条dsRNA组成。
三.GCRV873亚单位中和效价的测定纯化后的病毒抗原亚单位经紫外分光光度计测定，采用10mmol/L PBS将其抗原亚单位制成终浓度0.5～1mg/ml制剂。取GCRV亚单位100-150μg(蛋白含量约0.5μg/μl)免疫家兔，取抗血清测定中和效价。采用固定病毒量与倍比稀释血清法进行病毒的中和效价测定。实验设置3组重复，于24孔Cast板中进行。同时设病毒感染与正常细胞对照各一组。按Reed-Muech法计算50％中和滴价测定。测得抗体中和效价为1∶1025。
四.GCRV873病毒亚单位制剂核酸检测采用常规氯仿酚抽提法对RNA酶处理的GCRV亚单位制剂进行核酸提取，取15μl核酸提取物，经聚丙稀酰胺电泳，未见GCRV核酸条带，未经RNA酶处理的对照，呈现明显的11条核酸条带。此外，为进一步提高检测灵敏度，采用地高辛标记的GCRV cDNA探针，未检测到残余的RNA。设置的阳性对照能检测到10pg的GCRVRNA。
五.GCRV873病毒亚单位疫苗对鱼苗的保护效果评估将GCRV亚单位疫苗用生理盐水(0.85％NaCl)稀释成10-2～10-6一系列梯度，采用浸泡法对3～4cm小鱼苗浸泡30分钟，得到较好的免疫保护效果。10-3稀释液的亚单位制剂保护率可达到85％，10-4稀释度的保护率在75％以上。表明采用稀释度为10-3或10-4GCRV亚单位制剂对草鱼鱼苗进行浸泡处理，可有效地防治草鱼出血病。
权利要求
1.一种草鱼呼肠孤病毒抗原亚单位疫苗制备方法，其特征是包括以下步骤(1)采用草鱼肾细胞系即CIK细胞增殖GCRV873，GCRV873是草鱼呼肠孤病毒湖南邵阳株，(2)通过离心法，对感染了GCRV873的细胞病毒悬液进行纯化和浓缩，(3)表面活性剂处理纯化的病毒，使完整病毒结构解体，形成病毒核酸与衣壳蛋白亚单位组分，(4)采用核酸酶消化，降解游离的病毒基因组dsRNA，(5)通过透析处理，得到不含核酸的草鱼呼肠孤病毒蛋白抗原亚单位制剂，(6)用生理盐水稀释病毒蛋白抗原亚单位制剂，制备成草鱼呼肠孤病毒抗原亚单位疫苗。
2.根据权利要求1所述的草鱼呼肠孤病毒抗原亚单位疫苗制备方法，其特征是GCRV873悬液的制备包括以下步骤(1)将预接种的CIK细胞用PBS即磷酸盐缓冲液冲洗3次，除去牛血清蛋白组分，PBS浓度为10mmol/L，(2)按细胞培养液1/10的培养体积加入GCRV873的病毒原液，病毒原液感染复数为5～10PFU/cell，(3)病毒吸附细胞30～60分钟后，倒掉未吸附的病毒原液，然后用PBS清洗3次，去除未吸附的病毒颗粒，(4)采用含2％小牛血清的MEM或MEM-2维持液进行病毒增殖，在病毒感染48～72h后，收集病毒悬液，于4℃保存备用。
3.根据权利要求1所述的草鱼呼肠孤病毒抗原亚单位疫苗制备方法，其特征是对GCRV873病毒悬液进行纯化和浓缩的方法是(1)收集感染了GCRV873的CIK细胞病毒悬液，以6000g低速离心25～35分钟，除去游离细胞碎片，(2)将除去细胞碎片的病毒悬液以80000g超速离心2～3h，得到GCRV873颗粒沉淀物，(3)将沉淀物按1∶100倍体积溶于PBS，(4)以6000g低速离心20～25分钟，除去残余细胞碎片，(5)将上清液按1/10比例加入0.5％～1％NP40表面活性剂，28℃处理2～4h，使病毒结构解体，(6)在上述溶液中加入50-100mg/ml核酸酶，28℃消化2～4h，降解游离病毒核酸，(7)经双蒸水流水透析40～50h，除去制剂中降解的核酸，得到较纯的GCRV873抗原蛋白亚单位成分，于-20℃保存备用。
4.根据权利要求3所述的草鱼呼肠孤病毒抗原亚单位疫苗制备方法，其特征是纯化后的GCRV873的病毒蛋白经紫外分光光度计测定其含量，用PBS稀释将其制成终浓度为0.5～1mg/ml的抗原亚单位制剂。
5.根据权利要求1所述的草鱼呼肠孤病毒抗原亚单位疫苗制备方法，其特征是采用表面活性剂NP-40处理，其处理浓度为0.05～0.1％。
全文摘要
本发明是一种草鱼呼肠孤病毒抗原亚单位疫苗制备方法，其步骤包括采用草鱼肾细胞系即CIK细胞增殖GCRV873，GCRV873是草鱼呼肠孤病毒湖南邵阳株；通过离心法，对感染了GCRV873的细胞病毒悬液进行纯化和浓缩；表面活性剂处理纯化的病毒，使完整病毒结构解体，形成病毒核酸与衣壳蛋白亚单位组分；采用核酸酶消化，降解游离的病毒基因组dsRNA；通过透析处理，得到不含核酸的草鱼呼肠孤病毒蛋白抗原亚单位制剂；然后用生理盐水稀释，即得所述疫苗。本发明疫苗的优点是不含有病毒遗传物质RNA、含有完整病毒蛋白抗原成分，具有制备方法简单、操作方便、产物纯度高、包装体积小、便于运输与保存。
文档编号A61P31/12GK1616094SQ20041006088
公开日2005年5月18日 申请日期2004年9月21日 优先权日2004年9月21日
发明者方勤, 丁清泉 申请人:中国科学院武汉病毒研究所