专利名称：一种治疗和预防蜜蜂细菌病的中药组合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及中成药，具体地说是提供一种预防和治疗蜜蜂细菌病的中药组合物及其制备的工艺方法。
背景技术：
蜜蜂常见的细菌性疾病如欧洲幼虫腐臭病(European Foulbrood Disease)是由蜂房蜜蜂球菌(Melissococcus Pluton)感染引起的，它使蜂群的4日龄和5日龄幼虫大量死亡。我国蜜蜂病的防治在过去几十年主要采用抗生素和化学药物，如土霉素、氯霉素等，这些药物对蜜蜂病的治疗疗效显著，且具有使用方便、成本低廉等优点。但这些药物的使用，会导致蜂产品中病原体污染，农药残留特别是抗生素残留问题。如何解决因蜜蜂病防治过程中引起的抗生素等药物残留问题，提高蜂产品质量和市场竞争力，成为当前的首要任务，使用中草药等生物制剂防治蜜蜂传染病是解决好这个问题的关键。但国内用中草药为主要原料的蜂药的研制才刚刚开始，多数停留在开发试用阶段，无大规模产品推广。
发明内容
本发明提供了一种能够对蜜蜂细菌病进行预防和治疗的中药组合物及其制备的工艺方法，疗效好，并能解决蜂产品的抗生素药物残留问题。
根据中药药理，选择57味具有杀菌功效的中药进行抗蜂房蜜蜂球菌的实验室筛选，发现黄连提取液对蜂房蜜蜂球菌有良好的抑制作用。但试验同时表明，单味的黄连提取液浓度较高对蜜蜂具有一定的毒性，喂养会造成部分蜜蜂死亡。
黄连为毛莨科植物黄连Coptis chinensis Franch、三角叶黄连Coptisdeltoidea c.Y.Cheng et Hsiao或云连Coptis teeta所有黄连的干燥根茎。
干姜为姜科植物姜Zingiber officinale Rose的干燥根茎。
根据中药药理理论，黄连性苦、寒，具有清热燥湿、泻火解毒、杀虫作用，现代药理学研究证明黄连具有抗微生物及抗原虫作用，但黄连味苦性寒，过量伤脾胃，久服化燥伤阴，而干姜性辛、热，具有温中逐寒、回阳通脉、燥湿消痰作用，现代医学证明具有抗菌消炎作用。所以在黄连中加适量干姜具有辛开苦降，调和药性、降低毒副作用。
经选择试验，选用黄连的水和/或醇提取物作活性成分和药学上可接受的附加剂组成治疗和预防蜜蜂细菌病的中药组合物。
根据药学原理，还可选用黄连和干姜来配成治疗和预防蜜蜂细菌病的中药组合物，组合物是由下列原料的水和/或醇提取物作活性成分和药学上可接受的附加剂组成黄连55-85重量份，干姜15-45重量份。
本发明所提供的预防和治疗蜜蜂细菌病的中药组合物的制备的生产工艺包括下列步骤(a)取黄连或黄连55-85重量份，干姜15-45重量份作原料；(b)加8-12倍量水浸泡l小时，水煎煮1-2小时，过滤，得滤液I；药渣加入8-12倍量水煎煮1-2小时，过滤，得滤液II；药渣再加入8-12倍量水煎煮1-2小时，过滤，得滤液III；将滤液I、II、III合并后浓缩；(c)浓缩液中加入95％乙醇，边加边搅拌，含醇量达60％-75％后，冷置8-24小时，过滤，弃杂质沉淀物；(d)滤液经回收乙醇后，加水至1g生药/ml，再加入苯甲酸钠0.4-0.5重量份，搅拌，100℃30分钟蒸汽消毒，包装成成品。
所述的浓缩液在30℃下相对密度为1.02-1.20g/ml。
本发明中药组合物在预防和治疗蜜蜂细菌病中的应用，抑菌使用浓度为7.8mg-1g生药/ml；杀菌使用浓度为15.6mg-1g生药/ml。
在本发明制备的中药组合物，在多种中草药中选取黄连的提取液用于治疗和预防蜜蜂细菌病，以水煎醇沉的方法进行提取，除去蛋白质等杂质，既提高抗菌效果又降低毒性。同时可通过一定的配比将黄连和干姜进行复方处理，调和药性，降低毒副作用。本发明的中药组合物为天然药物制剂，低浓度使用时对蜂房蜜蜂球菌具有抑制效果，高浓度使用时具有良好的杀菌效果，使用后蜂产品中无残留，提高了蜂产品质量。
图1为本发明的制备工艺流程图；图2为本发明中药组合物的药效试验杀菌效果-时间曲线图。
具体实施例方式
一、配方筛选(一)受试药物大黄、大蒜、大青叶、蛇床子、乌梅、千里光、金银花、白头翁、山豆根、蒲公英、丹皮、莱服子、荆芥、地锦草、桑叶、连翘、秦皮、虎杖、茵陈、鹿衔草、黄连、柴胡、麻黄、黄柏、厚朴、莪术、菊花、黄精、半夏、鱼腥草、侧柏叶、龙胆、龙葵、金钱草、苦参、鸡矢藤、夏枯草、贯众、细辛、黄芪、干姜、桂枝、防风、幸夷、薄荷、葛根、升麻、蝉蜕、天花粉、苦参、板蓝根、地骨皮、水牛角、牛黄、满山香、知母、四季青共57味中药材，其中56味中药各取50g分别水煎二次(30分/次)，煎液合并浓缩成1g生药/ml浓度，15磅20分钟蒸汽消毒，备用，大蒜取新鲜榨汁。
(二)菌种蜂房蜜蜂球菌(Melissococcus Pluton)，由浙大农学院提供，实验室诊断为革兰氏阳性球菌。
(三)培养基采用马铃薯琼脂培养基(由马铃薯2g，氯化钠0.5g、肉膏1g、蛋白胨1g、琼脂6g、加蒸馏水250ml配成)，自制。
(四)仪器CO2培养箱和净化工作台。
(五)纸片扩散法1、琼脂平板制备马铃薯琼脂熔化后倾注平皿(直径15cm)制备平板，待其凝固，从培养于琼脂平板上24小时的细菌(Melissococcus Pluton)菌落中挑选4个相似菌落，用无菌生理盐水稀释，再用无菌棉木式浸菌液均匀接种于琼脂平板上，待其干燥数分钟后再用。
2、药液稀释将1g生药/ml的无菌中药煎液，在无菌试管中作原液、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64倍比稀释备用。
3、药敏试验用无菌镊子镊纸片(直径5.5mm)浸泡稀释的药液，放置在已接种细菌(Melissococcus Pluton)的琼脂平板上，轻压纸片使其与琼脂适当接触，每一平皿接种8片纸片，其中7片为一味中药的7种不同稀释度药片，1片为无菌生理盐水浸片。
将平皿在34℃10％CO2孵育24小时后，用塑料尺从平皿背面测量每个抑菌圈的直径。结果见表1。
表157种中药对蜂房蜜蜂球菌的抑制作用
注1、0表示直径5.5mm。
2、0.4％苯甲酸钠对照抑菌环直径为0。
由表1可见，57种中药提取液中，大蒜和黄连具有抑菌作用，并呈良好的量效关系，将大蒜试验皿和黄连试验皿继续在34℃10％CO2中培养48h，测量抑制圈，结果大蒜原有抑菌圈内均长满细菌(Mellissococcus Pluton)，而黄连原抑制圈无改变，测试结果见表2。
表2大蒜、黄连对蜂房蜜蜂球菌的抑制周期
注0表示直径5.5mm。
由上可见，对57种中药筛选结果，大蒜和黄连对蜜蜂蜂房球菌有较好的抑制作用。表2进一步抑菌周期实验结果表明，大蒜的抑菌效果持续时间较短，作用72小时后细菌填满抑菌圈，而黄连的抑菌效果持续稳定，至第7天抑菌效果仍未减弱。
二、黄连制剂的抑菌作用
(一)黄连水煎剂的制备黄连生药1000g，6000ml水浸泡1h，煮沸60min，过滤。药渣加5倍量水继续煎煮，煮沸60min，过滤。合并两次滤液，于80℃水上浓缩成1000ml，加苯甲酸钠4g，溶液冷却后4000rpm 20分钟离心，弃沉渣，上清液分装成100ml/瓶，蒸汽100℃，30分钟灭菌。最后样品为1g生药/ml溶液，临用时用冷开水30倍稀释。
(二)上述水煎液进行纸片扩散法抑菌试验，结果与前相同。
(三)将水煎液制剂进行毒性试验，以每蜂箱放一饲喂器30倍稀释的黄连水煎制剂300ml，观察24h，结果有蜜蜂死亡。表明单纯水提取液在浓度高时使用对蜜蜂有毒性。
(四)根据药学理论通过乙醇沉淀黄连水煎剂，除去蛋白质等杂质，以提高抗菌效果又降低毒性。同时黄连味苦性寒，过量伤脾胃，久服化燥伤阴，可以加适量干姜辛开苦降，调和药性，降低毒副作用。因此可以将黄连与干姜以一定配比进行配制，组成复合物，制备工艺改之为水煎醇沉。
三、配方实施例实施例1取黄连加10倍量水浸泡1小时，水煎煮1小时，滤过，得滤液I。药渣再加入10倍量水煎煮1小时，滤过，得滤液II。药渣再加10倍量水煎煮1小时，滤过，得滤液III。合并滤液I、II、III浓缩至相对密度为1.13(30℃测)液体，加95％乙醇，使药液终含醇量达75％，冷置24小时，过滤，弃杂质沉淀物，滤液回收乙醇，加苯甲酸钠(终量为0.4％)，搅拌，水加至1g生药/ml，灌装，100℃30分钟蒸汽消毒，包装、即得成品，临用时用水稀释30倍。
实施例2-5按下列比例取黄连、干姜加10倍量水浸泡1小时，水煎煮1小时，滤过，得滤液I。药渣再加入10倍量水煎煮1小时，滤过，得滤液II。药渣再加10倍量水煎煮1小时，滤过，得滤液III。合并滤液I、II、III浓缩至相对密度为1.13(30℃测)液体，加95％乙醇，使药液终含醇量达75％，冷置24小时，过滤，弃杂质沉淀物，滤液回收乙醇，加苯甲酸钠(终量为0.4％)，搅拌，水加至1g生药/ml，灌装，100℃30分钟蒸汽消毒，包装、即得成品，临用时用水稀释30倍。
分别选择不同的配比，按上述工艺分别配成1g生药/ml浓度消毒备用。将四种制剂分别用无菌水30倍稀释，进行抑菌试验，抑菌效果见表3表3黄连和干姜不同比例时的抑菌效果(mm)
四、制备工艺实施例取黄连100g、干姜60g进行不同工艺参数的实验1.水提正交试验以加水量(A)、煎煮时间(B)、煎煮次数(C)为主要影响因素，每个因素选3个水平，见表4。
表4 水提因素水平正交试验表
根据因素水平表4，选择L9(34)正交设计表进行试验，将每1水平样品配成1g生药/ml浓度，再用无菌水稀释成1∶30倍进行试验，以抑菌试验直径作为考察指标，并分别对有关数据作分析，结果见表5。
表5水提正交试验设计及结果
2、醇提正交试验以药液相对密度(A)、乙醇终浓度(B)、提取时间C(h)为主要影响因素，每个因素选3个水平，见表6。
表6 醇提因素水平表
根据因素水平表6，选择L9(34)正交设计表进行试验，以抑菌环直径作为考察指标，并分别对有关数据作分析，结果见表7。
表7醇提正交试验设计及结果
五、药效测试1、抑菌性能选取黄连按实施例1以及三批次的黄连和干姜药材按实施例3进行制备，取得4批制剂，抑菌作用采用纸片扩散法，抑菌环直径作为考察指标，观察制剂对蜜蜂蜂房球菌的抑制作用，见表8表8 不同批次制剂的抑菌作用(抑菌环直径mm)测试结果表
2、最小抑菌浓度将上述批号3的制剂用肉汤培养基按1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1024倍比稀释，再在每个稀释度药液中加入105～106个/ml菌液20μl，34℃，10％CO2培养72小时观察结果，见表9。
表9 最小抑菌浓度(MIC)测试结果表
注澄清表示无细菌生长，混浊表示细菌生长。
结果最小抑菌浓度为1∶128倍稀释液，即7.8mg生药/ml。实验还发现1∶4、1∶8试验管中产生沉淀，可能由于黄连有效成份在肉汤培养基中发生沉淀而造成抑菌效果下降。
3、最小杀菌浓度试验(MBC)将上述批号3的制剂按试管稀释法操作程序，将药物作1∶16 1∶32 1∶641∶128倍稀释，分装于4试管中，经接种菌液后，34℃，10％CO2培养18小时，分别取0.1ml，移种至不含药的马铃薯琼脂培养基平皿上，轻轻推开药液，置34℃，10％CO2培养72小时，观察有无细菌生长，计数少于5个菌落者作为最低杀菌浓度(MBC)。结果表10。
表10最小杀菌浓度(MBC)测试结果表
结果最小杀菌浓度为1∶64倍稀释液，即15.6mg生药/ml4、药物杀菌曲线实验将蜂房蜜蜂球菌接种肉汤培养基中，置34℃，10％CO2孵育18小时作为试验菌液，取菌液20μl分别接种于含批号3制剂的培养基中(10mg、33.3mg生药/ml)及不含药的肉汤培养基中，使试验管中细菌的最终浓度为105～106个/ml，然后将上述试验管在34℃，10％CO2中培养，分别在2、4、6、8、10、12小时分别吸取0.1ml培养液，接种马铃薯琼脂培养基平皿，进行菌落计数，每个时间段接种3块平皿，计算平均值，根据不同时间点的菌落计数绘制出杀菌曲线。结果见图1、表11。
表11 杀菌效果-时间曲线实验结果表
由表11、图1可见，本发明能使物以1∶30倍稀释，对细菌作用6小时后，蜂房蜜蜂球菌均被杀死，接种在琼脂平皿上无菌落生长。
5、制剂存放按《新药审批方法》规定和中国药典2000年版一部中的方法进行存放考察，本发明37□～40□温度和75％相对湿度条件下保温3个月，结果无明显变化，质量稳定。
6、蜂群防治试验报告由于2004年春季出现了近年来少有的蜂群春繁好气候，阴雨天气少，气温比常年偏高，无“倒春寒”情况，因而蜜蜂幼虫病在浙江及周遍地区的蜂场几乎没有爆发和流行。为了检测防治效果，不得不采用人工接种发病的方法，使蜂群发病，然后采用本发明提取液进行防治，同时以农业部《蜜蜂病虫害综合防治规范》中规定使用的蜂病防治药物(西药)为阳性对照，以检测其防治效果。
(一)、试验材料(1)、意大利蜂60群，蜂群健康无病害，群势中等。
(2)、人工发病用细菌菌种(蜂房蜜蜂球菌)由浙江省中医药研究院提供。
(3)、本发明上述批号3制剂1g生药/ml浓度。
(4)、红霉素(阳性药物)从药店购入。
(5)、试验用具量筒、烧杯、喷雾器等。
(二)、试验方法(1)、试验时间从2004年6月12日开始至7月6日结束。此时，蜂场周围没有蜜粉源；气候处于“梅雨”季节，湿度高，温度较高，多雨。
(2)、试验方法(a)将60群蜂均衡群势，随机分为3组，每组10群。这3组分别为本发明上述批号3制剂(A组)、红霉素组(B组)和空白对照1组(C组)。
(b)本发明上述批号3制剂组、红霉素组和空白对照1组这三组的30群蜂全部接种细菌菌种(蜂房蜜蜂球菌)，使蜂群发生幼虫腐臭病。
(c)在蜂群发病后的6月27日、6月30日和7月3日分别用本发明上述批号3制剂按1∶30稀释后，喷雾蜜蜂和巢脾，用红霉素喷雾致红霉素组的蜜蜂和巢脾；空白对照1组的蜂群则未作任何处理。
(4)在防治前后对每群蜂的发病率(指患病幼虫房占子脾总数的百分比)进行详细的检查，根据防治前后的发病率，计算出防治效果。
(三)、试验结果各组的发病率及防治效果如下
(1)A组
(2)B组
(3)C组
上述结果表明，本发明组合物对幼虫腐臭病具有很好的防治效果，平均达96.86％，与阳性对照(红霉素)组的防治效果(97.67％)相比，无显著差异(P＞0.05)。
权利要求
1.一种预防和治疗蜜蜂细菌病的中药组合物，其特征在于它是由黄连作为原料的水和/或醇提取物作活性成分和药学上可接受的附加剂组成的。
2.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于它是由下列原料的水和/或醇提取物作活性成分和药学上可接受的附加剂组成黄连55-85重量份，干姜15-45重量份。
3.根据权利要求1或2所述的中药组合物，其特征在于所述的组合物中还加有苯甲酸钠0.4-0.5重量份。
4.一种制备预防和治疗蜜蜂细菌病的中药组合物的方法，它包括下列步骤(a)取黄连中药材作原料；(b)加8-12倍量水浸泡1小时，水煎煮1-2小时，过滤，得滤液I；药渣加入8-12倍量水煎煮1-2小时，过滤，得滤液II；药渣再加入8-12倍量水煎煮1-2小时，过滤，得滤液III；将滤液I、II、III合并后浓缩；(c)浓缩液中加入95％乙醇，边加边搅拌，含醇量达60％-75％后，冷置8-24小时，过滤，弃杂质沉淀物；(d)滤液经回收乙醇后，加水至1g生药/ml，再加入苯甲酸钠0.4-0.5重量份，搅拌，100℃30分钟蒸汽消毒，包装成成品。
5.根据权利要求4所述的中药组合物的制备方法，它包括下列步骤(a)取下列中药材作原料黄连55-85重量份，干姜15-45重量份；(b)加8-12倍量水浸泡1小时，水煎煮1-2小时，过滤，得滤液I；药渣加入8-12倍量水煎煮1-2小时，过滤，得滤液II；药渣再加入8-12倍量水煎煮1-2小时，过滤，得滤液III；将滤液I、II、III合并后浓缩；(c)浓缩液中加入95％乙醇，边加边搅拌，含醇量达60％-75％后，冷置8-24小时，过滤，弃杂质沉淀物；(d)滤液经回收乙醇后，加水至1g生药/ml，加入苯甲酸钠0.4-0.5重量份，搅拌，100℃30分钟蒸汽消毒，包装成成品。
6.根据权利要求4或5所述的中药组合物的制备方法，其特征在于所述的浓缩液在30℃下相对密度为1.02-1.20g/ml。
7.根据权利要求1或2所述的中药组合物在预防和治疗蜜蜂细菌病中的应用。
8.根据权利要求1或2所述的中药组合物在预防蜜蜂细菌病中的应用，其特征在于所述的中药组合物在蜜蜂中的抑菌使用浓度为7.8mg-1g生药/ml。
9.根据权利要求1或2所述的中药组合物在治疗蜜蜂细菌病中的应用，其特征在于所述的中药组合物在蜜蜂中的杀菌使用浓度为15.6mg-1g生药/ml。
全文摘要
本发明公开了一种预防和治疗蜜蜂细菌病的中药组合物，由黄连的水和/或醇提取物作活性成分和药学上可接受的附加剂组成，也可由黄连55－85重量份，干姜15－45重量份作原料的水和/或醇提取物作活性成分和药学上可接受的附加剂组成。本发明还公开了制备上述组合物的生产工艺以及在预防和治疗蜜蜂细菌病的应用浓度。本发明制备的中药组合物，选取黄连的提取液应用于预防和治疗蜜蜂细菌病，并以水煎醇沉的方法进行提取，除去蛋白质等杂质，提高抗菌效果，降低毒性。还通过一定的配比将黄连和干姜进行复方处理，调和药性，降低毒副作用。本发明为天然药物制剂，低浓度使用时具有抑菌效果，高浓度使用时具有良好的杀菌效果，使用后蜂产品中无残留，提高了蜂产品质量。
文档编号A61P31/04GK1748782SQ20041006639
公开日2006年3月22日 申请日期2004年9月15日 优先权日2004年9月15日
发明者杨锋, 戴关海, 胡福良, 王超敏, 南建博 申请人:浙江省中医药研究院, 江山天宝蜂业科技开发有限公司