专利名称：一种积雪草多糖的制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及中草药提取多糖，更具体地说是从积雪草中提取多糖，及该多糖的化学结构特征和它的应用，具体包括积雪草多糖HBN的提取方法、化学结构及其对机体的免疫促进作用。
背景技术：
目前癌症已成为人类死亡的主要因素之一。但至今仍缺乏专一性强、疗效好、副作用小的抗癌药物。现在使用的抗肿瘤药物虽然种类很多，但大多是采用化学合成方法制备的化学药物，毒副作用较大。近年来，生物治疗已成为抗肿瘤治疗的重要途径，免疫促进剂是用于肿瘤生物治疗的一类药物。本发明从积雪草中获得的多糖即为一种免疫调节剂。
积雪草为中国药典收载的常用中药材，最早记载于《神农本草经》，列为中品，具有清热利湿、解毒消肿的功效，适用于湿热黄疸、中暑腹泻、砂淋血淋、痈肿疮毒等，临床上多用于跌打损伤、皮肤病等的治疗。本发明从积雪草中提取获得仍一的一种均一多糖，并确定其化学结构特征。药理试验表明该化学结构的多糖具有显著的免疫促进作用。
发明内容
本发明目的是提供一种从积雪草中分离提取出确定化学结构特征的多糖。
本发明的另一目的是提供该多糖的提取分离方法。
本发明的再一目的是提供该多糖的医学用途。
本发明是这样实施的取干积雪草全草粉碎品，加95％的药用乙醇，浸泡2周，浸泡完毕，过滤，残渣继续用索氏提取器用乙醇回流6小时，滤去母液，残渣阴干。脱脂后的干品用沸水提取3-5次，每次提取时间为5-6小时，将每次提取的提取液过滤，所得的水提液合并，浓缩至小体积，对流水透析3-4天，继续将溶液浓缩至小体积，用10％～20％三氯醋酸在4℃搅拌下脱蛋白，使溶液最终pH为2-3，静置放置6-8小时。溶液经离心去蛋白沉淀，清液以1mol/l氢氧化钠溶液中和至中性，再对流水透析3天。袋内溶液浓缩至1/3～1/5体积，加入3-5倍于糖溶液体积的95％乙醇于溶液中，并且于4℃沉淀过夜。离心收集沉淀，在40℃的低温真空干燥箱中脱水得到粗多糖JXC1。
取水提粗多糖JXC1，加入适量蒸馏水溶解，离心除去不溶物，上清液通过DEAE-纤维素柱层析进行分离。以蒸馏水作为洗脱液，然后用0.1，0.3，0.5和1.0mol/l的氯化钠溶液洗脱，分别收取合并各流分，其中水洗部分的组分经浓缩、透析和冷冻干燥得到次级多糖组分JXCH。JXCH再通过DEAE-纤维素柱层析，蒸馏水洗脱后，0.2mol/l氯化钠溶液洗脱，自动收集仪收集流分，硫酸-苯酚法检测多糖组分，收集糖反应阳性部分。减压浓缩、透析和冷冻干燥得多糖组分，再进一步使用DEAE-纤维素柱层析，先以0-0.05mol/l的氯化钠溶液梯度洗脱，再用0.2mol/l氯化钠溶液洗脱，收集该组分的多糖溶液，对纯水透析1天除去无机盐等小分子后，未透过液减压浓缩、冷冻干燥，获得的组分经Sephadex G-200柱层析，0.2mol/L氯化钠溶液洗脱，示差检测仪检测，收取峰位部分得到主要糖组分，该组分经减压浓缩冷冻干燥得到多糖，命名为HBN。
经高效凝胶柱层析(HPGPC)分析表明HBN的分子量为5.4×105Da。比旋度[α]D＝-10.4°(c＝0.70，水)。HBN的各个残基摩尔比为阿拉伯糖∶半乳糖∶鼠李糖∶半乳糖醛酸∶木糖＝1.00∶1.90∶0.26∶0.30∶0.15。13C NMR谱中，位于δ110.4和108.5ppm的信号为α-Araf和β-Xylp的异头碳信号。位于δ104.6～104.4ppm异头区域的信号是β-Galp信号。δ102.0和100.6ppm的弱信号为α-Rhap和α-GalpA的C1信号。约76％Araf残基处于末端，因此主要的Araf信号是由t-Araf产生。1H NMR谱图中，信号δ5.2和4.4-4.5ppm相应于Araf和β-Galp的异头氢信号。α-Rhap、α-GalpA和β-Xylp的异头氢信号位于δ5.1、4.9和4.7ppm处。上述结果结合甲基化反应以及高碘酸钠氧化、部分酸水解和酶降解等确证多糖结构常用的化学方法的结果，证明HBN是一个由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸和木糖组成的阿拉伯半乳聚糖。其中鼠李糖和半乳糖醛酸残基构成了HBN多糖的核心部分，属于果胶RG-I构型。在这条核心链的鼠李糖O-4位连接HBN的主要结构，即阿拉伯半乳聚糖区域以及短链的木糖链。在阿拉伯半乳聚糖链区域，1，6-连接的半乳糖占主导地位，即以1，6-连接的半乳糖形成长链，在其O-3位连接其它半乳糖支链和阿拉伯糖支链。同时在阿拉伯半乳聚糖链区域也存在部分1，3-连接的半乳糖构成的长链，并在O-6连接阿拉伯糖链和半乳糖链。
药理试验1.体外的小鼠脾淋巴细胞增殖活性分别取各多糖样品HBN 1-2mg/ml溶于生理盐水，临用时稀释成浓度为1,10,100μl/g的溶液。小鼠以颈椎脱位致死，无菌取脾脏，分离脾细胞，尼龙网过滤，蒸馏水破坏红细胞，调节至等渗，以RPMI-1640培养液洗三次，记数，调节细胞浓度为5×106Cell/ml。于96孔培养板，每孔加入100μ细胞，设一个对照组，再加入不同浓度的样品联合ConA或LPA，置37℃5％CO2培养箱48小时。培养终止前小时加MTT溶液20ul/孔，继续培养4小时后，加入三联液(二甲基甲酰胺和12烷基苯磺酸钠溶液)100ul/孔，于37℃放置过夜后，以DG-3022型酶柱仪测每孔的A570值。结果表明在浓度为1、10和100μg/ml时对T细胞的增殖率分别为36％、55％和76％，对B细胞的增值率分别达42％、120％和383％。为显著效果。各组浓度下的HBN均未表现出毒性。
2.小鼠体内免疫试验ICR(♀)小鼠体重20±2g，对照组生理盐水0.2ml/鼠，qd.×4d给药组分别腹腔注射剂量为0.1、1.0和10mg/kg的HBN，给药4天。小鼠给药后第三天致敏将鲜羊红细胞用生理盐水洗涤三次，按5％比例稀释SRBC压积，每只小鼠腹腔注射0.2ml。第五天解剖测定各项免疫参数。结果表明多糖HBN在0.1-10mg/kg的剂量下对小鼠的脾脏抗体形成细胞分泌抗体没有影响；在0.1-1mg/kg的剂量下，HBN对小鼠血清IgG无明显影响；在大剂量(10mg/kg)时出现对小鼠血清IgG抑制的作用；在1.0mg/kg剂量下，其对T、B淋巴细胞增殖反应有明显促进作用(P＜0.01)。
根据上述药理试验的体内外结果，表明HBN可以作为免疫调节药物使用。
图1是积雪草多糖分离纯化示意图。
具体实施例方式
实施例干积雪草全草粉碎品经95％的药用乙醇浸泡2周后，过滤，残渣继续用索氏提取器乙醇回流提取，滤去母液，残渣阴干。脱脂后的干品(6公斤)用沸水提取，每次加水30升，提取时间为5-6小时，以苯酚硫酸法检测提取液的糖含量，直至糖反应不明显，共计提取4次。将每次提取过滤所得的水提母液合并，浓缩至小体积，使用玻璃透析纸流水透析3天，继续将溶液浓缩至小体积，用15％三氯醋酸在4℃下搅拌脱蛋白。溶液经离心去沉淀，清液以1mol/l氢氧化钠溶液中和至中性，再对流水透析3天。袋内溶液浓缩至适当体积(约1/3-1/5)，加入95％的乙醇4倍于糖溶液的体积于4℃沉淀过夜。离心收集沉淀，经乙醇和无水丙酮依次洗涤三次后在40℃的低温真空干燥箱中脱水得到360g棕灰色的固体(JXC1，产率2.1％)。
取6g水提粗多糖JXC1，加入适量蒸馏水溶解，离心，上清液用DEAE-纤维素(氯型)柱层析进行初步分离。首先以蒸馏水作为洗脱液，然后用0.1，0.3，0.5和1.0mol/l的NaCl溶液洗脱，分别收取各流份，其中从水洗洗脱组分中获得多糖组分JXCH。
JXCH再用DEAE-纤维素(乙酸型)柱层析，蒸馏水洗脱后，0.2mol/l NaCl洗脱，自动收集仪收集流分，硫酸-苯酚法显色，收集糖组分。减压浓缩、透析和冷冻干燥该多糖组分，再进一步使用DEAE-纤维素(乙酸型)柱层析，先以0-0.05mol/l的乙酸钠溶液梯度洗脱，再用0.2mol/l氯化钠溶液洗脱，收集该组分的多糖溶液，透析除去无机盐等小分子后，减压浓缩、冷冻干燥，获得的组分经Sephadex G-200柱层析得到洗脱主要糖组分，该组分经减压浓缩冷冻干燥得到多糖HBN(400mg)。
物化性质测定按照多糖的常规方法，HPGPC法测定分子量为5.4×105Da，比旋度[α]D＝-10.4°(c 0.70，水)。
化学结构测定按照多糖的常规方法，包括光谱方法(13C NMR，IR)及化学方法(全水解、甲基化反应、高碘酸钠氧化-Smith降解、部分酸水解和酶解)证明HBN为一个由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸和木糖组成的阿拉伯半乳聚糖。HBN中鼠李糖和半乳糖醛酸构成了HBN多糖的核心部分，属于RG-I构型。在这条核心链的鼠李糖O-4位连接HBN的主要结构，即阿拉伯半乳聚糖区域以及短链的木糖链。在阿拉伯半乳聚糖链区域，1，6-连接的半乳糖占主导地位，即以1，6-连接的半乳糖形成长链，在其O-3位连接其它半乳糖支链和阿拉伯糖支链。同时在阿拉伯半乳聚糖链区域也存在部分1，3-连接的半乳糖构成的长链，并在O-6连接阿拉伯糖链和半乳糖链。
药理试验取上述HBN分别按照试验中提及的药理试验方法进行体内体外免疫试验。结果表明对T、B淋巴细胞的增殖试验中，浓度为1、10、100μg/ml的体外试验可达显著和非常显著。体内剂量达到1mg/kg的时候，HBN对丝裂原(ConA，LPS)诱导小鼠脾脏T、B淋巴细胞增殖反应有明显的促进作用。
权利要求
1.一种由积雪草提取的多糖HBN，其结构为分子量为5.4×105Da、比旋度[α]D＝-10.4°(c＝0.70，水)；HBN的各个残基摩尔比为阿拉伯糖∶半乳糖∶鼠李糖∶半乳糖醛酸∶木糖＝1.00∶1.90∶0.26∶0.30∶0.15；13C NMR谱中，位于δ110.4和108.5ppm的信号为α-Araf和β-Xylp的异头碳信号；位于δ104.6～104.4ppm异头区域的信号是β-Galp信号；δ102.0和100.6ppm的弱信号为α-Rhap和α-GalpA的C1信号；约76％Araf残基处于末端，因此主要的Araf信号是由t-Araf产生；1H NMR谱图中，信号δ5.2和4.4-4.5ppm相应于Araf和β-Galp的异头氢信号；α-Rhap、α-GalpA和β-Xylp的异头氢信号位于δ5.1、4.9和4.7ppm处；上述结果结合甲基化反应以及高碘酸钠氧化、部分酸水解和酶降解等测定多糖结构常用的化学反应的结果，证明HBN是一个由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸和木糖组成的阿拉伯半乳聚糖；其中鼠李糖和半乳糖醛酸残基构成了HBN多糖的核心部分，属于果胶RG-I构型；在这条核心链的鼠李糖O-4位连接HBN的主要结构，即阿拉伯半乳聚糖区域以及短链的木糖链；在阿拉伯半乳聚糖链区域，1，6-连接的半乳糖占主导地位，即以1，6-连接的半乳糖形成长链，在其O-3位连接其它半乳糖支链和阿拉伯糖支链；同时在阿拉伯半乳聚糖链区域也存在部分1，3-连接的半乳糖构成的长链，并在O-6连接阿拉伯糖链和半乳糖链。
2.如权利要求1所述的由积雪草提取的多糖HBN的制备方法由如下步骤组成a、干积雪草全草粉碎物95％的药用乙醇浸泡2周后，过滤、残渣用索氏提取器乙醇提取，滤去母液，残渣阴干；b、上述脱脂后的干品沸水提取3-5次，提取液过滤，合并提取液减压浓缩至小体积，用对流水透析3-4天，继续将溶液浓缩到小体积，用10％～20％三氯醋酸在4℃搅拌脱蛋白，溶液离心去沉淀，上清液用1mol/l NaOH溶液中和至中性，再用对流水透析3天，袋内溶液浓缩至1/3-1/5体积，加入3～5倍于糖溶液体积的95％乙醇，在冰箱中(4℃)放置过夜，离心收集沉淀，在40℃的低温真空干燥箱中脱水得粗多糖JXCl；c、加入蒸馏水溶解粗多糖，离心除去不溶物，上清液通过DEAE-纤维素柱层析分离，以蒸馏水作为冼脱液，然后用依次用每立升含0.1，0.3，0.5和1克分子的氯化钠溶液冼脱，分别收取合并各流分，其中水冼部分组分经浓缩、透析和冷冻干燥得次级多糖组份JXCH；d、上述JXCH通过DEAE-纤维素柱层析，蒸馏水冼脱后，用0.2克分子/立升氯化钠溶液冼脱，自动收集仪收集流分(硫酸-苯酚法检测多糖组份)，收集糖反应阳性部分减压浓缩、透析和冷冻干燥该多糖组份，再用DEAE-纤维柱层析先以0-0.05克分子/立升氯化钠溶液梯度冼脱，再用0.2克分子/立升NaCl溶液洗脱，收集该组份多糖溶液，透析除去无机盐小分子后，减压浓缩，冷冻干燥，得多糖组份；e、上述多糖组份经Sephadex G 200柱层析0.2克分子/立升氯化钠溶液冼脱，收集该组份的多糖溶液浓缩，冷冻干燥得多糖HBN。
3.如权利要求1所述的由积雪草提取的多糖HBN的用途在制备作为免疫调节药物使用。
全文摘要
本发明提供一种采用从积雪草中提取的多糖，提取多糖的方法以及该多糖的化学结构。经动物体内外药理试验证明该多糖具有明显的免疫促进作用，可作为免疫功能低下疾病的辅助治疗药物。
文档编号A61P37/00GK1754892SQ200410066859
公开日2006年4月5日 申请日期2004年9月29日 优先权日2004年9月29日
发明者方积年, 王雪松, 左建平 申请人:中国科学院上海药物研究所