专利名称：白细胞介素－2前体脂质体及其制备方法
技术领域：
本发明属于药物制剂技术领域。具体涉及白细胞介素-2前体脂质体及其制备方法。
背景技术：
白细胞介素-2(IL-2)是一种由辅助性T淋巴细胞分泌的水溶性蛋白质(糖蛋白)，由活化的淋巴细胞所产生，含133个氨基酸残基的糖蛋白，其精确分子量为15420，在hIL-2氨基酸的第58位和105位的两个半胱氨酸之间形成的链内二硫链，对IL-2的构象和生物学活性有重要的作用。白细胞介素-2是淋巴细胞对抗原或丝裂原刺激后发生增殖反应再产生的淋巴因子。白细胞介素-2能够促进杀伤性T细胞(TC)、自然杀伤细胞(NK)及其它杀伤效应细胞的增殖活化，而且能直接或间接地影响B淋巴细胞及巨噬细胞的功能，诱导和促进干扰素产生，刺激产生淋巴因子激活的细胞(LAK)和肿瘤侵润淋巴细胞(TIL)，从而起到抗肿瘤、抗病毒的作用。但是白细胞介素2(IL-2)作为药物存在着用药剂量大、生物半衰期短并引起发热不适、间接性肺水肿、低血压和心动过速、贫血症等一系列循环、呼吸、泌尿、神经系统的较严重的毒性反应。
前体脂质体作为脂质体中的一类新型的脂质体，系将脂质体组成成分和赋形剂制成脱水形式，为干燥、具有良好流动性能的粉末，应用前与水混合，即可分散或溶解成等张的重建脂质体。其特点为①靶向性前体脂质体作为一种新型的脂质体，属于靶向给药系统，脂质体具有类细胞结构，进入人体主要被网状内皮系统吞噬而激活机体的自身免疫功能，并改变被包封药物的体内分布，使药物主要在肝、脾、肺和骨髓等组织器官中蓄积，进而实现靶向给药；②长效缓释作用前体脂质体制剂能够降低药物的清除速率，延长药物作用时间，增加药物在体内的稳定性；③药物包封于前体脂质体，能够降低药物毒性，提高药物的治疗指数，减少药物的治疗剂量并且使大剂量临床治疗成为可能；④前体脂质体能够保护包封的药物，提高药物的稳定性；⑤前体脂质体解决了脂质体分散系统的物理不稳定性如药物的渗漏、粒子的聚集以及磷脂在液态下的氧化、水解问题；⑥前体脂质体解决了工业化生产的一系列技术难点，使产业化成为可能。
现有前体脂质体的制备方法是将脂质吸附于极细的水溶性载体上，如氯化钠、山梨醇或其他聚合糖类，以增加脂质的分散的表面积，当这种“前体脂质体”与水接触时，脂质溶涨而载体迅速溶解，在水相中形成多层脂质体。
目前刊物杂志对前体脂质体也有相关的报道，但是真正形成产品的还没有，大多处于理论研究和实验室阶段。有关水溶性药物脂质体报道很少，特别是稳定性不是很好的水溶性大分子药物前体脂质体，目前在相关资料上还没有看到有关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于解决水溶性大分子蛋白药物白细胞介素-2前体脂质体的活性回收和包封率问题，提高白细胞介素-2药物的稳定性，提供一种更适合采用喷雾形式的肺部给药剂型，使白细胞介素-2大剂量临床应用成为可能。
本发明公开的白细胞介素-2前体脂质体是由重量百分比为0.01～0.5％白细胞介素-2、8.0～30.0％磷脂类和胆固醇类脂质体载体、0.1～5.0％抗氧剂、15.0～40.0％水溶性载体和24.5～76.89％填充剂制成的粒径小于900nm的粉末。
本发明所述磷脂类脂质体载体优选豆磷脂和卵磷脂。
本发明所述胆固醇类脂质体载体选自胆甾醇、胆固醇棕榈酸酯和胆固醇硬脂酸酯。
本发明所述抗氧剂选自制剂中常用的各种抗氧剂，包括无机硫化物、烯醇类、苯酚类和氨基类抗氧剂，优选无机硫化物如亚硫酸氢钠、硫脲等。
本发明所述水溶性载体选自粉末氯化钠和山梨醇。
本发明所述填充剂选自甘露醇、葡萄糖和海藻酸。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供了上述白细胞介素-2前体脂质体的制备方法，该方法包括下列步骤(1)配制PH6.8的磷酸二氢钠+磷酸氢二钠缓冲液，取白细胞介素-2原料溶于重量比为1∶1000～20000的磷酸缓冲液中，得到白细胞介素-2溶液W1；(2)取磷脂类和胆固醇类脂质体载体混合，于40～80℃熔融，得到混合物W2，趁热加入溶液W1，迅速搅拌混合均匀，冰浴降温，加入水溶性载体与抗氧剂，乳化均匀；(3)加入适量的磷酸缓冲液和填充剂，高速剪切机乳化混合均匀，得到乳白色的混合液W3；(4)将混合液W3真空冷冻干燥或者喷雾干燥，即得白色流动性良好的白细胞介素-2前体脂质体粉末，粒径小于900nm。
本发明所述乳化方法包括采用电动搅拌器，超声波乳化器，胶体磨，高压乳匀剂，高速剪切乳化机等设备乳化。
在本发明制备过程中特别要注意熔融的效果、喷雾干燥的温度以及乳化的程度。这些都会不同程度地影响药物的包封率和回收率。熔融的充分程度很大程度上影响包封率，必要时可以加入少量有机溶剂助熔如乙醇或乙醚等，这些有机溶剂在下一步操作之前要挥干。喷雾干燥的进口温度不能高于160℃，收集瓶温度采用冰浴处理保证收集的白细胞介素-2前体脂质体不长时间受热空气的影响，提高活性回收率。乳化条件的选择主要包括乳化强度和时间的选择，高强度长时间乳化会造成活性回收率的降低，而且在操作过程中要注意操作溶液温度控制在-10～20℃左右。在应用低熔点的脂质时则特别要注意温度不能太高，否则颗粒容易结块，制备时也可使用任何能溶解脂质的溶剂。根据本发明方法制得的白细胞介素-2前体脂质体包封率和活性回收率达到90％以上，并经稳定性试验证明，本发明白细胞介素-2前体脂质体质量稳定。
小分子药物是目前最为实际、效果最理想的制药目标，小分子药物的作用位置、作用机理确切，专一性强，人体生理利用度和适应性好，已成为较为理想的创新药物模式。本发明的白细胞介素-2前体脂质体由于粒径小可采用喷雾方式肺部局部给药，肺组织的表面积很大(≈140m2)，能迅速吸收药物直接进入大循环，有利于提高药物的生物利用度，有效地发挥药物的局部和全身治疗作用，实现药物的靶向性，同时提高人体对白细胞介素-2的耐受剂量，增加白细胞介素-2的临床应用范围。
本发明白介-2前体脂质体剂型，可用于肾癌、恶性黑色素瘤、淋巴瘤、肺癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、肠癌、膀胱癌、肝癌、多发性骨髓瘤、头颈部肿瘤、白血病、癌性胸腹水、严重联合免疫缺陷病(SCID)，以及乙型肝炎、丙型肝炎、中毒性休克和烧伤感染的恢复期治疗。白细胞介素-2前体脂质体还可以肺部给药，进行局部或全身治疗。
本发明白细胞介素-2前体脂质体具有下述特点(1)前体脂质体为固体，稳定性极好，适合大规模的工业化生产；(2)前体脂质体水化后的粒径达到纳米级，小于900nm，可改善药物对粘膜组织的渗透性，减少对组织的刺激性，增加药物的吸收；(3)包封率和活性回收率高，达到90％以上；(4)肺部给药的安全性高进入呼吸道及肺部的脂质体，大多通过粘膜纤毛运动或巨噬细胞内吞等方式清除，内吞的外源性磷脂能被再吸收利用，与肺部的内源性磷脂一起被循环更新。
具体实施例方式
实施例1白细白介素-2 2.5千万单位，卵磷脂0.60g，胆固醇0.15g，山梨醇0.80g，甘露醇2.60g，氯化钠0.20g，葡萄糖0.6g，亚硫酸氢钠0.05g。
制备工艺配制0.01M/PH6.8的磷酸缓冲液(磷酸二氢钠+磷酸氢二钠)，取2.5千万单位白细胞介素-2加5.0～10.0ml缓冲液溶解；取卵磷脂0.60g和胆固醇0.15g混匀，60.0℃熔融，将白细胞介素-2溶液加入熔融物中，搅拌混合均匀；加入山梨醇0.80g和亚硫酸氢钠0.05g，高速剪切乳化均匀；然后加入甘露醇2.6g，氯化钠0.2g，葡萄糖0.6g，超声波乳化分散均匀，在-20℃条件下预冻4小时，在-50℃条件下冷冻真空干燥24小时，即得具有流动性的白色粉末状态的前体脂质体，水化后粒经小于800nm，4.65×106单位/g制剂，活性回收93％，包封率94.8％。
实施例2白细胞介素-2 2.5千万单位，卵磷脂0.50g，二棕榈酰卵磷脂0.50g，胆固醇0.10g，山梨醇1.00g，甘露醇1.80g，葡萄糖1.05g，硫代乙酸0.02g，L-谷胱甘肽0.03g。
制备工艺配制0.1M/PH6.8的磷酸缓冲液，取2.5千万单位白细胞介素-2加5.0～10.0ml缓冲液溶解；取豆磷脂0.5g，二棕榈酰卵磷脂0.5g和胆固醇0.1g混匀水浴中加热熔融(70.0℃)，将白细胞介素-2溶液加入熔融物中，搅拌混合均匀；加入山梨醇1.0g，硫代乙酸0.02g和L-谷胱甘肽0.03g，高速剪切乳化均匀；然后加入甘露醇1.8g，葡萄糖1.05g，超声波乳化分散均匀，喷雾干燥，进口温度150℃，出口温度105℃，流速10m/min，风速600m3/hour，即得具有流动性的白色粉末状态的前体脂质体，水化后粒经小于600nm。4.50×106单位/g制剂，活性回收率90％，包封率93.5％。
实施例3白细胞介素-2 2.5千万单位，氢化卵磷脂0.75g，胆固醇0.05g，山梨醇0.75g，甘露醇2.82g，葡萄糖0.60g，羟基甲烷磺酸钠0.01g，维生素C棕榈酸酯0.02g。
制备工艺配制0.01M/PH6.8的磷酸缓冲液，取2.5千万单位白细胞介素-2加5.0～10.0ml缓冲液溶解；取氢化卵磷脂0.75g和胆固醇0.05g混匀熔融(50.0℃)，将白细胞介素-2溶液加入熔融物中，搅拌混合均匀；加入山梨醇0.75g，羟基甲烷磺酸钠0.01g和维生素C棕榈酸酯0.02g，高速剪切乳化均匀；然后加入甘露醇2.82g，葡萄糖0.6g，乳化分散均匀，在-20℃条件下预冻4小时，在-50℃条件下冷冻真空干燥24小时，即得具有流动性的白色粉末状态的前体脂质体，水化后粒经小于850nm，4.87×106单位/g制剂，活性回收97.4％，包封率90.8％。
实施例4白细胞介素-2前体脂质体稳定性考察数据比较。
表1.IL-2稳定性试验 贮存条件为4℃(湿度75％)20030606-3#和020030825-6#采用上述实施例1和3的冷冻干燥方法制备的白细胞介素-2前体脂质体。
20030626-2#采用上述实施例2的喷雾干燥方法制备的白细胞介素-2前体脂质体。
实施例5白细胞介素-2前体脂质体包封率比较试验。
表2.IL-2包封率比较试验 其中对照品1为采用空白前体脂质体法制备的白细胞介素-2前体脂质体。即首先制备未包封药物的空白脂质体，冷冻干燥前将待包封的药物加入混合，迅速冷冻制备前体脂质体。活性回收率为90％以上，包封率为52.0％。
检测分析方法白介-2的分子量为15,000，选用葡聚糖凝胶G-50分离前体脂质体。包封率EN(％)计算EN(％)＝W包封/W总×100％；其中W包封表示总投料量，W包封表示包封的药物量，白介-2以及白介-2前体脂质体测定方法MTT比色法。
实施例6白细胞介素-2前体脂质体回收率比较试验。
表3.IL-2回收率比较试验 其中对照品2为现有的前体脂质体法制备的白细胞介素-2前体脂质体。其中山梨醇与磷脂的重量比为4.3∶1，采用改进的旋转蒸发器，真空减压至93-101kPa，水浴温度35-45℃，先将载体山梨醇放在旋转蒸发仪中，分部加入类脂-药物混合液旋转蒸发除去其中的溶剂。
权利要求
1.白细胞介素-2前体脂质体，其特征在于该前体脂质体由重量百分比为0.01～0.5％白细胞介素-2、8.0～30.0％磷脂类和胆固醇类脂质体载体、0.1～5.0％抗氧剂、15.0～40.0％水溶性载体和24.5～76.89％填充剂制成的粒径小于900nm的粉末。
2.根据权利要求1所述的白细胞介素-2前体脂质体，其特征在于其中所述的磷脂类脂质体载体选自豆磷脂和卵磷脂，胆固醇类脂质体载体选自胆甾醇、胆固醇棕榈酸酯和胆固醇硬脂酸酯。
3.根据权利要求1所述的白细胞介素-2前体脂质体，其特征在于其中所述的抗氧剂选自无机硫化物、烯醇类、苯酚类和氨基类抗氧剂。
4.根据权利要求1所述的白细胞介素-2前体脂质体，其特征在于其中所述的水溶性载体选自氯化钠和山梨醇。
5.根据权利要求1所述的白细胞介素-2前体脂质体，其特征在于其中所述的填充剂选自甘露醇、葡萄糖和海藻酸。
6.根据权利要求1所述的白细胞介素-2前体脂质体的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)配制PH6.8的磷酸二氢钠+磷酸氢二钠缓冲液，取白细胞介素-2原料溶于重量比为1∶1000～20000的磷酸缓冲液中，得到白细胞介素-2溶液W1；(2)取磷脂类和胆固醇类脂质体载体混合，于40～80℃熔融，得到混合物W2，趁热加入溶液W1，迅速搅拌混合均匀，冰浴降温，加入水溶性载体与抗氧剂，乳化均匀；(3)加入适量的磷酸缓冲液和填充剂，高速剪切机乳化混合均匀，得到乳白色的混合液W3；(4)将混合液W3真空冷冻干燥或者喷雾干燥，即得。
7.根据权利要求6所述的白细胞介素-2前体脂质体的制备方法，其特征在于其中所述的高速剪切机乳化混合时溶液温度控制在-10～20℃。
8.根据权利要求6所述的白细胞介素-2前体脂质体的制备方法，其特征在于其中所述的混合液W3喷雾干燥是的进口温度低于160℃。
全文摘要
本发明涉及白细胞介素－2前体脂质体及其制备方法。本发明公开的白细胞介素－2前体脂质体是由重量百分比为0.01～0.5％白细胞介素－2、8.0～30.0％磷脂类和胆固醇类脂质体载体、0.1～5.0％抗氧剂、15.0～40.0％水溶性载体和24.5～76.89％填充剂制成的粒径小于900nm的粉末。本发明白细胞介素－2前体脂质体具有稳定性好，包封率和活性回收率高，药物吸收性好，适合大规模的工业化生产等特点。特别适用于肺部给药。
文档编号A61K35/00GK1762487SQ20041006726
公开日2006年4月26日 申请日期2004年10月19日 优先权日2004年10月19日
发明者韩庆惠, 李连会 申请人:上海新药研究开发中心, 韩庆惠