专利名称：胃癌特异性纳米疫苗的制备方法
技术领域：
本发明属于生物医学技术领域，涉及胃癌特异性纳米疫苗，特别涉及一种胃癌特异性纳米疫苗的制备方法。
背景技术：
虽然近些年来胃癌有逐渐减少的趋势，但是其仍居国人十大癌症死因排名的第三位，传统的治疗方式仍是手术，化疗和放疗，但均不能有效解决肿瘤转移，复发等问题。上个世纪50年代，Burnett发现了免疫系统在抗肿瘤中的重要作用，提出了免疫监视学说，才使人们逐渐认识到免疫系统与肿瘤的发生和消退有着密切的关系。目前肿瘤免疫治疗主要策略可分为①单克隆抗体治疗；②免疫反应调节因子治疗；③过继免疫治疗；④肿瘤特异性疫苗的主动免疫治疗。其中基于特定抗原的肿瘤疫苗是一种具有良好前景的肿瘤免疫治疗方式。
早期的肿瘤特异性疫苗主要为肿瘤全细胞疫苗和肿瘤裂解产物疫苗。随着对肿瘤抗原认识上的不断深入，目前研究较多的肿瘤疫苗有肿瘤细胞疫苗、肿瘤核酸疫苗、肿瘤多肽疫苗、肿瘤基因工程疫苗和抗独特型肿瘤疫苗等五种。其中，核酸疫苗、多肽疫苗和基因工程疫苗是1990年后才发展起来的新型疫苗。肿瘤多肽疫苗是由来自肿瘤特异性抗原、病毒相关抗原、癌基因或抑癌基因突变蛋白的多肽组成的疫苗。与传统疫苗相比优点是①几乎可以肯定是最安全的疫苗。②可诱导特异性免疫应答。③能迅速被合成和纯化，可以大量生产，纯度高。现正成为肿瘤疫苗的研制热点。
作为一种亚单位疫苗，多肽疫苗同样存在不足之处，主要问题是①抗原特异性差，目前发现的肿瘤抗原，除黑色素瘤的少数肿瘤外，多数肿瘤未发现有特异性的抗原存在。②体内讲解过快，因此只能诱导机体产生短暂的无记忆性的IgM，免疫原型弱。③多肽疫苗受到MHC的限制，只能对人群中某种特定的HLA表型产生作用，这给人群中广泛使用多肽疫苗带来困难。因此解决问题的关键在于寻找强有效的免疫佐剂增强多肽抗原的免疫效能，发掘高效无毒的体内药物载体，延迟多肽在体内的降解，增强抗原递呈细胞对其的递呈作用，并进一步突破MHC对抗原的限制。
针对上述问题，大量学者探索了各种不同的方法，包括寻找高特异性的肿瘤抗原，对已有抗原进行修饰，免疫佐剂的应用及药物载体的不断改进更新。本研究所在1980年代制备了一系列与胃癌组织有较高特异性(88％)的胃癌单克隆抗体-MG7抗体，抗原纯化分析表明MG7-Ag的抗原成分是中性糖脂和糖蛋白，抗原决定簇位于糖链。已初步证实MG7-Ag可以诱导抗瘤免疫，但是大量提取纯化碳水化合物抗原非常困难。申请人研究所的韩全利博士和徐立博士分别用噬菌体肽库随机技术进行亲和筛选，获得了一系列MG7抗原模拟表位，抗体竞争结合试验证实，该模拟表位多肽可以有效的模拟原始抗原，为胃癌疫苗的研究提供了侯选表位。
佐剂又称免疫增强剂，种类很多，目前常用的有福氏佐剂、明矾和氢氧化铝等，而这些都由于明显的毒副作用被禁用于人体。CpG是最近得到广泛研究的新型免疫佐剂，它是在细菌DNA中发现的含有非甲基化的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤基序(cytidine-phosphate-guanosine CpG DNA)，天然的CpG DNA或人工合成的CpG寡核甘酸序列CpG ODN具有诱导多种免疫细胞增殖活化，能上调细胞表面分子可刺激抗原提成细胞分泌细胞因子。它不仅是一种Th1型免疫佐剂，并且是一种安全性极高的可用于人体的新型免疫佐剂，目前已进入一期临床试验。当它与抗原通过一定方式结合后，其免疫佐剂功能大大加强。与肿瘤抗原共同免疫显示出有效的免疫佐剂效应。并且其本身就可诱导有效的肿瘤特异性免疫反应。
纳米乳剂是一种液-液分散系统，粒径一般在1-100nm，低粘度、各向同性的、热力学稳定的油水混合系统。它作为药物载体具有极大的应用潜力，主要有以下优点①热力学稳定且可以过滤，易于制备和保存。②具有增溶作用，可同时增溶不同脂溶性的药物，粘度低，注射时不会引起疼痛。③药物分散性好，利于吸收，可提高药物的生物利用度。④对易于水解的药物起到保护作用，可延长药物的释药时间。⑤具有靶向性，可根据纳米粒径的不同大小达到靶向给药的目的。⑥可携带外源性的多肽通过内化作用直接进入细胞浆，通过交叉递呈作用突破MHC限制。
发明内容
肿瘤的生物治疗是目前研究的热点，而疫苗是肿瘤预防和治疗的希望所在。本发明的目的在于提供一种可用于临床的胃癌特异性纳米疫苗的制备方法，并采用该方法制备的胃癌特异性纳米疫苗用于探索肿瘤生物治疗的新方法。
实现上述发明目的的技术方案是一种胃癌特异性纳米疫苗的制备方法，其特征在于，将人工合成的胃癌特异性抗原MG7模拟表位多肽和免疫佐剂CpGODN 1645，采用纳米乳剂包封，获得胃癌特异性纳米疫苗；具体包括以下步骤在双蒸水中分别加入质量分数为0.4％的司盘-80、土温-80；混合均匀得到水相A；在另一加入双蒸水的大试管中，先加入质量份数为20％的大豆油，然后各加入质量分数为0.2％的胃癌特异性抗原MG7模拟表位多肽和免疫佐剂CpGODN，再加入质量分数0.4％的司盘-80，混合均匀，得到油相B；在3000转/分搅拌下，将油相B逐滴加入到水相A中，滴加完毕后将混合物移至真空高速剪切乳化机上，在0.7Kpa真空下，23000转/分，高速剪切40分钟，2次；
剪切后室温冷却20分钟，得到乳白色带乳光液体，冰浴下超声3分钟后再用膜过滤、除菌后4℃保存，即得到20nm-30nm的胃癌特异性纳米疫苗。
本发明将人工合成胃癌MG7-Ag的模拟表位多肽，用磁力超声法将其与CpG共包封于纳米乳剂中，通过透析纯化，HPLC检测其包封效率分别达72％和99％，透射电镜观察粒径所研制的纳米疫苗为球形或椭圆型，粒径20-30nm，离心法检测具有较好的稳定性，6KD滤膜过滤除菌。用共包封纳米疫苗免疫健康BALB/c小鼠，以空白纳米疫苗和PBS作为对照，ELISA测定免疫小鼠血清中抗MG7抗体的效价显著提高；ELISPOT法测定小鼠脾T细胞活性明显增强；肿瘤攻击实验显示疫苗对小鼠有一定保护作用；同时，对成瘤小鼠进行免疫治疗，抑瘤率达到82.5％。并经体内外实验证实具有良好稳定性和免疫效能，有较高的临床应用价值。为胃癌的生物学治疗打下了基础。
图1是本发明所用的胃癌特异性抗原MG7模拟表位多肽的氨基酸序列。
图2是本发明所用的免疫佐剂CpG ODN 1645的核甘酸序列。
图3是本发明研制的纳米疫苗的透射电镜照片(1×100000)。
图4是本发明研制的纳米疫苗用HPLC检测包封率的高效液相结果，其中A为标准品，B为待测透析液。
具体实施例方式
以下结合附图对本发明作进一步的详细说明。
本发明选用胃癌高表达抗原MG7为靶点，结合新型免疫佐剂CpG，采用高科技纳米技术将二者共同包封，成功地研制出人胃癌特异性纳米疫苗，HPLC检测显示达到理想包封率，离心法证实具有较高稳定性。动物免疫后，运用ELISA法检测体液免疫，ELISPOT检测细胞免疫，肿瘤攻击试验检测疫苗的肿瘤预防和治疗作用。试验证实该纳米疫苗可有效激发系统的免疫效能，具有良好的预防和治疗效果。
1.技术方案及其路线1.1人胃癌特异性纳米疫苗的研制1.1.1材料准备胃癌特异性抗原MG7模拟表位多肽(图1)由美国美联(西安)生物科技有限公司合成并纯化。免疫佐剂CpG ODN 1645(图2)由美国赛百盛有限公司合成并作硫代修饰。司盘-80(span-80)、土温-80(twen-80)、大豆油均购自美国Sigma公司。6KD透析膜购自华美生物工程公司。BALB/c小鼠，雌性，4周龄，体重15g-20g，由本校实验动物中心提供。
1.1.2疫苗乳剂制备纳米乳剂包封癌特异性抗原MG7模拟表位多肽和免疫佐剂CpG ODN制备纳米疫苗2ml双蒸水中分别加入质量分数为0.4％的twen-80和span-80，混合均匀得到水相A，另取一大试管中加入8.0ml双蒸水，1.6ml大豆油，以及胃癌特异性抗原MG7模拟表位多肽、免疫佐剂CpG ODN各1.6mg，再加入质量分数为0.4％的span-80，混合均匀，得到油相B。
在3000转/分搅拌下，将油相B逐滴加入到水相A中，滴加完毕后将混合物移至真空高速剪切乳化机上，在0.7Kpa真空下，23000转/分，高速剪切40分钟，2次，室温冷却20分钟，得到乳白色带乳光液体，冰浴下超声3分钟后用0.22μm的膜过滤除菌后4℃保存，即得到20nm-30nm的胃癌特异性纳米疫苗。
本发明的方法制备的胃癌特异性纳米疫苗，可以同比放大生产。
1.2疫苗物理性能的检测1.2.1包封效率的检测取5ml制备好的MG7胃癌特异性纳米疫苗，置于6KD透析膜(购自华美生物工程有限公司)中，4℃下去离子水透析48h，取透析液，同时配制浓度为5ug/ml的MG7标准品，经高效液相色谱(HPLC)，在215nm处检测吸收峰。以内标一点法，通过峰面积之比计算包封率，具体计算公式如下
包封效率以及药物免疫用量如下表
1.2.2纳米疫苗乳剂粒径测定取适量MG7胃癌特异性纳米疫苗分散于生理盐水中，滴网染色，3％磷钨酸负染，风干后，透射电镜观察摄照。如下图，所制备的纳米疫苗为圆形或椭圆型微囊，粒径范围20nm-30nm，大小均匀(图3)。
1.2.3纳米疫苗稳定性研究取制备好的纳米疫苗2ml，4000rpm离心10min，或室温静置4个月，未见分层，重新透析，HPLC检测透析液中无游离药物漏出。
1.3疫苗体内免疫效能检测1.3.1 BLAB/c小鼠分组与免疫方案分组30只BALB/c小鼠随机分为6组MG7、CpG ODN共包封疫苗组[Nano(MG7+CpG)]，MG7、CpG ODN单独包封组[Nano(MG7)+Nano(CpG)]，单独包封MG7纳米疫苗与游离CpG组[Nano(MG7)+CpG]，单独包封MG7纳米疫苗组，空白纳米乳剂组[Nano(-)]，PBS组，每组5只，采用小鼠尾静脉注射免疫，MG7纳米乳剂1ml/只，每隔10天用同样方法加强免疫一次，共免疫3次。
1.6血清抗MG7抗体效价的测定在每次免疫后10天采小鼠眶上静脉血，将经过证实表达有MG7抗原的艾氏腹水瘤细胞(本研究所保存)铺于96孔板，以抗MG7-Ag抗体(本研究所保存)为阳性对照通过间接ELISA法测定血清抗MG7抗体效价。每个样品设3个复孔。以无关抗体做阴性对照。共包封疫苗组的抗体效价明显高于其余各组，有显著统计学差异。说明本发明可诱导有效的体液免疫反应。
1.3.2 ELISPOT法检测小鼠脾脏T淋巴细胞活性ELISPOT检测试剂盒(购自法国Diaclone公司)。用100ul 70％酒精孵育PVDF孔板，室温下孵育10分钟。倒去酒精，用100ul PBS洗涤3次。将100ul捕获抗体加入10ml PBS中，混合，每孔加100ul，盖上板盖，4℃过夜。倒去液体，100ul PBS洗涤一次。每孔加入100ul 2％脱脂乳PBS，盖上板盖，室温下孵育2小时。在水槽边和吸水纸上轻打，倒去液体。用100ul PBS洗涤一次。每孔加入50ul细胞悬浮液(1×106cells)(含10μg/ml MG7多肽)，37℃CO2孵育箱中孵育16小时)。在水槽边和吸水纸上轻打，倒去液体。每孔加100ul洗涤缓冲液，4℃孵育10分钟。用100ul洗涤缓冲液洗孔3次。于10ml PBS-1％BSA中稀释100ul检测抗体，每孔加100ul，37℃孵育2小时。倒去液体，100ul洗涤缓冲液洗3次。以10ml PBS-1％BSA稀释10ul亲和素碱性磷酸酶，每孔加入100ul，37℃孵育1小时。倒去液体，洗3次。在吸水纸上拍打，吸干残留的洗涤液。每孔加入100ul BCIP/NBT。室温下反应25分钟。完全显色后，倒掉孔内液体。用蒸馏水充分洗涤，吸水纸上轻拍，使膜干燥。将板倒置4℃下放置一夜，读取点数。共包封纳米疫苗组活性淋巴细胞数最多，为PBS对照组的8.4倍，空白纳米乳剂组的6.2倍。说明本发明可诱导机体产生特异性的细胞免疫反应。
1.3.3肿瘤攻击试验检测疫苗体内肿瘤预防效能免疫5周后，取艾氏腹水瘤细胞接种健康小鼠，待腹水形成，取小鼠腹腔腹水100μL/只(约含艾氏腹水瘤细胞1×108)皮下接种进行肿瘤攻击试验。两周后，颈椎脱臼法处死小鼠，取出瘤体，称重，比较各组小鼠成瘤情况。试验显示共包封疫苗组有2只小鼠未见肿瘤形成，平均瘤体重量约为PBS对照组的1/8，空白乳剂组的1/5，效果明显优于其余各组。说明本发明对肿瘤具有很好的预防作用。
1.3.4疫苗对荷瘤小鼠的免疫治疗效能检测将健康小鼠分为6组每组5只，小鼠腹腔腹水100μL/只(约含艾氏腹水瘤细胞1×108)皮下接种，2周后，肿瘤形成。按Nano(MG7+CpG)，Nano(MG7)+Nano(CpG)，Nano(MG7)+CpG，Nano(MG7)，Nano(-)以及PBS对荷瘤小鼠进行疫苗治疗，采用小鼠尾静脉注射治疗，药物用量见表，每隔10天用同样方法加强免疫一次，共治疗3次。最后一次治疗后两周，颈椎脱臼法处死小鼠，取出瘤体，称重，比较各组小鼠抑瘤率。结果显示共包封组的肿瘤抑制率达82.5％，高于其他各组，而空白组仅为1.8％。说明本发明对肿瘤具有良好治疗作用。
2.技术效果本发明采用胃癌特异性表面标志物MG7模拟表位设计合成抗原多肽，实验证明可以较好的模拟MG7抗原性，由较高的胃癌特异性。将其用理化方法包封于纳米颗粒之中，成功制备了胃癌特异性纳米疫苗，取得较高的包封率，粒径大小均匀，稳定性好。免疫小鼠，经ELISA法检测体液免疫，ELISPOT法检测细胞免疫。证实可诱导产生有效的细胞和体液免疫反应，肿瘤攻击试验显示本发明对小鼠具有显著肿瘤预防和治疗作用。本疫苗的研制对胃癌的生物学治疗具有巨大的应用价值。并且为多系统肿瘤治疗提供了一种崭新途径。
另外，本发明经申请人进行的专利检索后，未发现与本发明相同的技术方法和产品，因此本发明具有惟一性和自主的知识产权。
3.最佳实施方式3.1复合抗肿瘤疫苗的构建3.1.1多联的胃癌特异性疫苗的构建应用本发明中的纳米疫苗的构建方法，将多个不同的胃癌特异性抗原肽相连接，制备强效的胃癌特异性纳米疫苗，增强疫苗的免疫治疗效果。
3.1.2广谱的消化道肿瘤疫苗的构建用本发明中的纳米疫苗的构建方法，将多种消化系统肿瘤特异性抗原肽相连接，制备广泛应用于消化道肿瘤的疫苗。达到同时预防抑制胃癌和消化道其他肿瘤的目的。
3.1.3多肽、基因复合型纳米疫苗的构建将本发明中的多肽与可表达MG7抗原肽的基因载体，如质粒或腺病毒载体共包封于纳米乳剂中，纳米颗粒可将多肽类抗原和可表达抗原的基因类药物共同转入细胞浆中，不仅可发挥多肽药物快速高效的特点，还具有基因药物的持久性，从而达到更好的免疫效果。
3.2靶向性肿瘤疫苗的构建结合本发明中构建的纳米疫苗，在纳米粒表面交联特异性靶向分子，可起到靶向给药的目的。
氨基酸序列MG7Lys Pro His Val His Thr Lys基因序列CpG 1645GCATGACGTTGAGCT
权利要求
1.一种胃癌特异性纳米疫苗的制备方法，其特征在于，将人工合成的胃癌特异性抗原MG7模拟表位多肽和免疫佐剂CpG ODN 1645采用纳米乳剂包封，获得胃癌特异性纳米疫苗；具体包括以下步骤1)在双蒸水中分别加入质量分数0.4％的司盘-80、土温-80；混合均匀得到水相A；2)在另一加入双蒸水的大试管中，先加入质量分数为20％的大豆油，然后各加入质量分数0.2％的胃癌特异性抗原MG7模拟表位多肽和免疫佐剂CpGODN，最后加入质量分数0.4％的司盘-80，混合均匀，得到油相B；3)在3000转/分搅拌下，将油相B逐滴加入到水相A中，滴加完毕后将混合物移至真空高速剪切乳化机上，在0.7Kpa真空下，以23000转/分剪切40分钟，2次；4)剪切后室温冷却20分钟，得到乳白色带乳光液体，冰浴下超声3分钟后再用膜过滤、除菌后4℃保存，即得到20nm-30nm的胃癌特异性纳米疫苗。
全文摘要
本发明公开了胃癌特异性纳米疫苗的制备方法。本发明利用生物性纳米乳剂作为体内药物运输载体，以胃癌特异性多肽抗原MG7为免疫抗原，以含有CpG基序的寡核甘酸(CpG ODN)为免疫佐剂，采用磁力超声法构建共包封有MG7－Ag模拟表位多肽与CpG ODN的纳米疫苗。经高效液相色谱分析，电镜观察以及离心等方法鉴定表明所构建的纳米疫苗粒径控制在20－30nm并具有较高的包封率和稳定性。疫苗免疫接种后，可诱导小鼠产生抗MG7－Ag特异性抗体以及一定数量的特异性CTL分泌IFNγ，抗原－佐剂共包封组优于单表位抗原单独包封组和其他对照组。肿瘤攻击后，共包封疫苗免疫组小鼠成瘤体积明显小于对照组。这一基因疫苗在胃癌的免疫治疗研究，胃癌特异性疫苗的研制方面将具有巨大的潜在价值。
文档编号A61K39/00GK1647821SQ20041007312
公开日2005年8月3日 申请日期2004年9月29日 优先权日2004年9月29日
发明者吴开春, 师瑞, 吴道澄, 宁小萱, 丁杰, 樊代明 申请人:中国人民解放军第四军医大学