专利名称：一组人工合成的抗菌肽及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一组人工合成的抗菌肽、其制备方法及在制备治疗细菌、真菌、病毒感染的药物中的应用。
背景技术：
抗菌肽是生物体经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，一般由20-60个氨基酸组成，分子量在2000-7000D左右。随着医学免疫学和分子生物学的迅速发展，抗菌肽的研究越来越成为生物技术与生物医药领域中的热门课题。至今为止，在许多动物(尤其是昆虫)、植物、微生物和人体上已发现了超过200多种抗菌肽，这类短肽不仅对细菌、真菌有广谱的杀菌作用，而且对病毒、原虫及癌细胞也有攻击作用。临床试验也表明，在机体感染病菌或可能导致病菌感染的情况下，抗菌肽能快速杀灭已侵入的病菌，并且能阻止病菌的继续侵染。
随着对抗菌肽一级结构和高级结构研究的不断深入，已有许多研究者对这些抗菌肽的结构和功能进行研究，发现在模拟膜的疏水环境下，分子中的α-螺旋度与其杀菌活性密切相关。另外研究结果表明抗菌肽是通过破坏膜的完整性使得细菌细胞膜渗漏而杀死细菌(Nakajima Y.etal.，J.Biol.Chem，2621665-1669；Zasloff M.Nature，2002，415389-395)。因此有人试图通过增加分子中α-螺旋结构或提高多肽中含正电荷氨基酸的比例来寻找更强抗菌活性的多肽(Broth W.B.etal.，Antimicrobial AgentsChemotherapy，2001，451894-1895；HongS.Y.etal.，Peptides，2001，221669-1674)。
美国专利6,316,594公开了天然抗菌肽parasinI，它是一种新的从鲶鱼中分离出来的，是由鲶鱼在表皮损伤时为防止微生物的入侵其上皮粘膜层产生出一种具有很强抗菌作用的多肽，属于α-螺旋抗菌肽，分子量为2000.4Da，由19个氨基酸残基组成，序列为Lys Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Arg Ala Lys Ala Lys Thr Arg SerSer。尽管专利文献中的Parasin I对微生物表现出非常有效的广谱抗菌活性，包括革兰阳性和革兰阴性细菌以及真菌，而且没有任何溶血性。它合成的衍生物也具有有效的活性。但是在我们的实验中却发现其杀菌活性较低，天然序列很难应用于临床，但是Parasin I基本没有溶血性，它的一些相关的序列改造和功能应用方面的开发还进行的较少，所以本发明想通过对Parasin I序列的改造，得到杀菌活性更强的有药用开发价值的抗菌肽，即可以形成新的专利技术。
发明内容
本发明需要解决的技术问题之一是提供一组人工合成的抗菌肽。
本发明需要解决的技术问题之二是提供一组抗菌肽的制备方法。
本发明需要解决的技术问题之三是公开所述抗菌肽的应用。
本发明提供的抗菌肽是在对天然抗菌肽的序列、结构分析的基础上设计合成的，它们的序列如下Lys Ala Arg Gly Lys Gln Gly Asn Lys Val Arg Ala Lys Ala Lys Thr Arg Ser SerLys Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Arg Ala Lys Ala Lys Thr Arg Leu Ser Leu SerLys Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Arg Ala Lys Ala Lys Thr Arg Leu Ser LeuLys Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Arg Ala Leu Lys Ala Leu Lys Thr Arg Ser SerLys Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Arg Ala Leu Lys Ala Leu LysLys Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Phe Arg Ala Leu Lys Ala Leu LysLys Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Val Arg Ala Leu Lys Ala Leu LysLys Gly Gln Gly Lys Gln Gly Gly Asn Val Arg Ala Lys Ala Lys Thr Arg Ser SerLys Gly Gln Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Arg Ala Asn Ala Lys Thr Arg Ser SerLys Gly Gln Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Arg Ala Asn Ala LysAsn Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Arg Ala Asn Ala Lys Thr Arg Ser SerAsn Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Gln Ala Lys Ala Lys Thr Arg Ser SerAsn Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Arg Ala Asn Ala LysLys Ala Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Arg Ala Lys Ala Lys Thr Arg Ser SerLys Gly Arg Gly Lys Gln Gly Ala Lys Val Arg Ala Lys Ala Lys Thr Arg Ser SerLys Ala Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Arg Ala Lys Ala LysLys Gly Arg Gly Lys Gln Gly Ala Lys Val Arg Ala Leu Lys Ala Leu Lys Thr Arg Ser SerLys Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Arg Ala Leu Lys Ala Leu LysLys Gly Arg Gly Lys Gln Gly Ala Lys Val Arg Ala Leu Lys Ala Leu Lys本发明提供的一组抗菌肽，其制备方法可以是固相化学法，也可以将抗菌肽的编码基因克隆到载体上，然后在宿主细胞中表达后获得。其中表达载体可以是质粒或病毒中的一种，宿主细胞可以是原核细胞，包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等，宿主细胞也可以是真核细胞、包括酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。制备的抗菌肽可通过质谱鉴定。
为了深入研究本发明这类生物学活性抗菌肽的结构与功能关系，利用美国应用系统生物公司生产的Pioneer多肽合成仪制备一组多肽，以进行研究。下面以制备的具有下列氨基酸序列的GKIV-1和GKIV-2抗菌肽作为举例来进行叙述GKIV-1Lys Ala Arg Gly Lys Gln Gly Asn Lys Val Arg Ala Lys Ala Lys Thr Arg SerSer利用96孔板法检测多肽的杀菌活性(In Yup Park etc；FEBS Letters；437(1998)258-262)以预先合成的天然抗菌肽GramicidinS，nisin，magaininII为对照，进行杀菌活性检测。结果表明本发明抗菌肽的杀菌活性强于所述三种天然抗菌肽的杀菌活性。
抗菌肽在高效杀菌的同时也有可能作用于高等有机体包括人体细胞，因为抗菌肽的作用方式都是在细胞膜上穿孔使得细胞发生渗漏死亡。所以把抗菌肽能否使红细胞发生渗漏作为其是否有毒性的一个标准，如果抗菌肽能使红细胞中的血红蛋白发生渗漏，就可以通过检测OD490值确定毒性的大小。因此本发明还检测了抗菌肽对人体红细胞的溶血活性，实验表明，抗菌肽溶血率值很低，证实本发明抗菌肽的溶血毒性极小。
此外，又对本发明抗菌肽进行动物体内急性毒性试验，证明抗菌肽无毒性作用。又进行抗菌肽对小白鼠急性感染金黄色葡萄球菌的抑制作用的试验，表明抗菌肽对金黄色葡萄球菌感染有显著的抑制作用。
本发明提供一组新的人工设计合成的抗菌肽。可方便地采用固相化学法制备或将编码抗菌肽的基因克隆到载体上，然后进入宿主细胞中表达后获得。该抗菌肽对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌、病毒具有广谱杀伤活性，并较天然抗菌肽有更强的杀菌活性，但对动、植物细胞无任何毒害作用。并通过抗菌肽对金黄色葡萄球菌急性感染杀菌活性的小鼠试验显示抗菌肽给予0.25mg/kg剂量，就能达到100％杀菌抑制率，而作为杀灭金黄色葡萄球菌特效药的万古霉素要给予4.0mg/kg剂量才能达到100％的杀菌抑制率，表明本发明抗菌肽对金黄色葡萄球菌急性感染有很显著的杀菌效果，因此本发明抗菌肽可应用于制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或真菌感染引起的疾病的药物。
图1是抗菌肽GKIV-1的质谱图。
具体实施例方式
实施例1 抗菌肽的制备及分离纯化按上述序列制备GKIV-1和GKIV-2，同时制备GramicidinS，nisin和magaininII作为对照。
GramicidinS的序列Val Orn Leu Phe Pro Val Orn Leu Phe Pronisin的序列Ile Thr Ser Ile Ser Leu Cys Thr Pro Gly Cys Lys Thr Gly Ala Leu Met GlyCys Asn Met Lys Thr Ala Thr Cys His Cys Ser Ile His Val Ser LysmagaininII的序列Gly Ile Gly Lys Phe Leu His Ser Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala Phe Val Gly GluIle Met Asn Ser本实施例采用固相化学法合成，所用仪器为美国应用生物系统公司生产的Pioneer多肽合成仪。合成的多肽经过高浓度的TFA剪切后，用反向柱纯化，纯化后的多肽通过质谱鉴定。具体试验步骤如下1、抗菌肽的制备(以制备0.1mmol量的GKIV-1为例)以下所有制备抗菌肽的试剂均购于美国应用生物系统公司。
制备的GKIV-1多肽序列为N-Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Lys Leu Leu Lys Lys Leu LeuLys Lys Leu Leu Arg-C制备从C端到N端逐个进行，由合成仪自动控制。首先称量0.1mmol的结合了第一个氨基酸即Arg的树脂(购于美国应用生物系统公司)，装柱，再用20％哌啶二甲基甲酰胺溶液脱保护，二甲基甲酰胺清洗，9-笏甲氧羰基(Fmoc)保护的游离氨基酸溶解于碳二亚胺(DCC)，羟基苯并三唑(HOBt)/二异丙基乙基胺(DIPEA)，溶解后的溶液在柱上循环偶合反应30分钟，二甲基甲酰胺清洗重复以上脱保护到偶合反应步骤直到制备结束(具体操作步骤见pioneer多肽合成仪操作指南)。
制备后的多肽经如下步骤剪切取下反应后的树脂，加入B型剪切液(88％三氟乙酸，5％苯酚，5％水，2％三异丙基硅烷)，室温反应2小时，过滤，滤出液中加入10倍体积的预冷无水乙醚，4000转/分钟离心10分钟，收集沉淀并室温干燥。
2、抗菌肽纯化称量一定量干燥后的多肽，溶于0.1％三氟乙酸，样品处理后经反向柱分离(洗脱液为含80％乙氰的0.1％三氟乙酸)，收集洗脱峰。
3、抗菌肽的鉴定如图1所示，制备的抗菌肽GKIV-1经过质谱分析，GKIV-1在质谱图中显示的分子量计算如下 1036.3×2＝2072.6，2072.6-2＝2070.6计算出GKIV-1的分子量为2070.6。由多肽序列计算出的理论值为2071.4。证明制备的多肽即为设计的GKIV-1抗菌肽。鉴定合格的抗菌肽产物备用。
抗菌肽GKIV-2，天然抗菌肽GramicidinS，nisin和magaininII可以采用类似于GKIV-1抗菌肽的制备方法制备。
实施例2 抗菌肽的杀菌活性检测以下实施例中所使用的各种菌株购于中国生物制品检定所。
采用96孔板法对抗菌肽的杀菌活性进行检测，并用固相化学法合成的抗菌肽GramicidinS，nisin和magaininII作为对照，以评价本发明中作为举例的三条抗菌肽GKIV-1和GKIV-2的杀菌活性。
按以下步骤进行测定抗菌肽的杀菌活性菌种复苏，接种斜面37℃培养过夜，挑菌于普通LB培养基中，37℃培养过夜，稀释菌液使菌浓度为104-105CFU/ml，按每孔100ul菌液接种于96孔板中，将多肽以一定比例稀释后，每孔中加入10ul，将96孔板置于37℃培养过夜，酶标仪检测OD620值(In Yup Park etc；FEBS Letters；437(1998)258-262)。检测结果见表1。
含有抗菌肽的细菌的生长浓度(OD620)与不加抗菌肽的细菌的生长浓度的比值大于90％时的抗菌肽浓度即为最小抑菌浓度(最小抑菌浓度(MIC)定义为显著抑制细菌生长的最低的浓度)。
表1 五种抗菌肽对不同细菌的抗菌活性最小抑菌浓度(MIC)的比较
上表中的的最小抑菌浓度值越小，则代表抗菌能力越强，从上表可以看出，本发明的抗菌肽的MIC比GramicidinS，nisin和magaininII均要小，特别是对革兰氏阴性菌的效果，本发明的抗菌肽的抗菌能力大大强于对比的两条抗菌肽。
实施例3 体外溶血活性检测本实施例用于检测抗菌肽对人体红细胞是否具有溶血活性，并用固相化学法合成的抗菌肽GramicidinS，nisin和magaininII作为对照。使用的的血样取于正常人血。
抗菌肽溶血活性的检测步骤是4％的新鲜红细胞悬液在414nm下血红蛋白的释放来检测的。人红细胞经PBS(PBS35mM磷酸缓冲液/0.15M NaCl，PH7.0)洗涤，取100ul的8％人红细胞悬液于96孔板中，每孔中加入100ul抗菌肽溶液，37℃一小时后，1500rpm离心5分钟，转移100ul上清于新的96孔板中，通过酶标仪检测414nm下的吸收。阴性对照用PBS，阳性对照用0.1％TritonX-100。检测结果见表2表2 五种抗菌肽溶血活性检测结果抗菌肽浓度 溶血率(％)(ug/ml) GramicidinSnisinmagaininIIGKIV-1GKIV-212.5 0.60.3 0 0 0253.21.5 0 0 05025.5 10.5 0.8 0.5 0.9100 10054.3 3.5 2.3 2.3200 10080.5 11.2 9.8 9.5500 100100 40.0 31.2 20.0表2中抗菌肽的溶血率值越小，则代表抗菌肽的溶血毒性越小。
实施例4 动物体内急性毒性试验本实施例用以检测抗菌肽对动物的毒性，并用固相化学法合成的抗菌肽GramicidinS，nisin和magaininII作为对照，测定本发明提供的抗菌肽GKIV-1和GKIV-2的毒性。
采用昆明小白鼠60只，雌雄各半，体重33.5±0.25g，抗菌肽按1mg/kg剂量，每日一次连续7天经肌注小白鼠，观察动物在最大剂量下毒性反应。实验结果表明，动物经肌注抗菌肽7天后，无异常反应，活动正常。经7天观察，60只小白鼠全部存活。证明抗菌肽无毒性作用。
实施例5 抗菌肽和万古霉素对小鼠金黄色葡萄球菌感染模型抑制效果的比较使用昆明小白鼠的金黄色葡萄球菌急性感染模型，实验步骤如下将金黄色葡萄球菌CMCC26003置于含5％猪胃粘液素的小牛肉灌输肉汤里，振荡培养过夜。体重大约32.6±0.25g的小鼠腹腔内注射106-107存活细胞，每个处理组里有3个小鼠。静脉注射抗菌肽GKIV-1(溶于0.1毫升5％右旋糖里供注射)，在10分钟里注射。皮下注射万古霉素(万古霉素对小鼠皮下给药是完全可生物利用的，不论皮下给予或静脉给予有相似的活性)。
表3 抗菌肽GKIV-1和万古霉素对金黄色葡萄球菌急性感染小白鼠模型的抑制作用
如表3所示，静脉注射给予0.25mg/kg，抗菌肽能100％保护感染小鼠。万古霉素在4.0毫克/kg剂量下才100％有效。所有的未处理小鼠在不到24小时里都死亡。
该实验例显示，抗菌肽对用高致命的细菌剂量的小鼠急性感染模型杀灭金黄色葡萄球菌是十分有效的。
序列表<110>上海高科联合生物技术研发有限公司<120>一组人工合成的抗菌肽及其制备方法和应用<130>
<160>19<170>Patent In Version2.1<210>1<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>CHAIN<400>1Lys Ala Arg Gly Lys Gln Gly Asn Lys Val Arg Ala Lys Ala Lys5 10 15Thr Arg Ser Ser<210>2<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
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5 10 15Thr Arg Leu Ser Leu20<210>4<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
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5 10 15Leu Lys<210>19<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>CHAIN<400>19Lys Gly Arg Gly Lys Gln Gly Ala Lys Val Arg Ala Leu Lys Ala5 10 15Leu Lys
权利要求
1.一组抗菌肽，其特征在于所述抗菌肽具有序列表中所列的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗菌肽，其特征在于所述抗菌肽还包括所述抗菌肽中个别氨基酸的取代、环化、L-型氨基酸变为D-型氨基酸、缺失或加入而得到的功能等同物多肽。
3.一种如权利要求1或2所述抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述的制备方法为固相化学法合成。
4.一种如权利要求1或2所述抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述的制备方法为将编码所述抗菌肽的基因克隆到载体上，然后进入宿主细胞中表达后获得所述抗菌肽。
5.根据权利要求4所述抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述及的载体是质粒或病毒中的一种。
6.根据权利要求4所述抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述及的宿主细胞是原核细胞。
7.根据权利要求6所述抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述及的原核细胞包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。
8.根据权利要求4所述抗菌肽的制备方法，其特征在于所述及的宿主细胞是真核细胞。
9.根据权利要求8所述抗菌肽的制备方法，其特征在于所述及的真核细胞是酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
10.一种如权利要求1或2所述抗菌肽的应用，其特征在于所述的抗菌肽在制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌或病毒感染的药物中的应用。
11.抗菌肽在药物中的应用，其特征在于所述的药物包括权利要求1或2任一项的抗菌肽中的一种或一种以上，并混合有一种或一种以上医药上可接受的载体和添加剂。
全文摘要
本发明提供一组抗菌肽，这些抗菌肽具有比天然抗菌肽更强的杀菌活性，对革兰氏阴性菌的杀灭效果特别好。本发明还公开了该组抗菌肽的制备方法，可以用固相化学法合成，也可以通过基因工程表达获得。本发明合成抗菌肽可以用于制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌或病毒感染引起的疾病的药物。
文档编号A61K38/10GK1616483SQ20041007881
公开日2005年5月18日 申请日期2004年9月6日 优先权日2003年10月17日
发明者黄青山, 李国栋 申请人:上海高科联合生物技术研发有限公司