低分子化的tpo激动剂抗体的制作方法

专利名称：低分子化的tpo激动剂抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及改变的抗体，其包含抗体的二个或多个H链V区以及二个或多个L链V区，该抗体通过交联TPO受体而显示激动剂活性。该改变的抗体具有通过交联TPO受体而转导信号进入细胞的TPO激动剂活性，并用作多种用途的药物。
背景技术：
血小板生成素(TPO)是1994年发现的一种血小板生成调节因子，已知由主要在肝中生成的分子量为70-80k的糖蛋白组成。血小板生成素是一种细胞因子，在骨髓中促进血小板前体细胞存活、增殖、分化和成熟，即促进巨核细胞分化和增殖。血小板生成素(TPO)受体早于TPO确认为一种调节血小板生成的特异性因子的受体，c-Mpl(M.Souyri等人，Cell 631137(1990))。据报告，c-Mpl主要分布于血小板前体细胞，巨核细胞和血小板细胞，抑制c-Mpl表达选择性抑制巨核细胞生成(M.Methia等人，Blood 821395(1993))。据报告，根据特异性针对c-Mpl配基的细胞的增殖分析以及利用c-Mpl纯化该配基的结果，c-Mpl的配基为TPO(F.de Sauvage等人，Nature369533(1994)；TD.Bartley等人，Cell 771117(1994))。目前Mpl被称为TPO受体。因此，期望TPO和TPO受体激动剂作为血小板减少症的治疗药物，例如，作为减轻癌症病人骨髓抑制或骨髓切除治疗所致血小板减少症的药物。
另一方面，通过降低分子大小改善对组织和肿瘤的通透性、并利用重组方法制备而开发改变的抗体，特别是分子大小下降的抗体，例如单链Fv。最近，单链Fv的二聚体，特别是双特异性二聚体已用于交联细胞。这种二聚体的典型例子是识别癌细胞抗原以及宿主细胞(如NK细胞和嗜中性白细胞)抗原的单链Fv的异源二聚体(Kipriyanov等人，Int.J.Cancer，77，9763-9772，1998)。它们利用将单链Fv构建为改变的抗体的技术而制备，通过诱导细胞间交联而更有效地治疗癌症。已经认为由抗体及其片段(例如Fab片段)，双特异性改变的抗体乃至单特异性的单链Fv二聚体诱导细胞间交联。
对于能够通过交联细胞表面分子而转导信号的抗体，已知有细胞分化和增殖涉及的EPO受体的抗体(JP-A 2000-95800)、MuSK受体的抗体(Xie等人，Nature Biotech.15，768-771，1997)及其它。已知还存在TPO受体的激动剂抗体、其片段以及单链Fv(WO99/17364)。然而，尚无具有激动剂活性的单链Fv二聚体和改变的抗体，例如单链双价抗体的报告。
注意到来源于单克隆抗体(本发明人制备的MABL-1抗体和MABL-2抗体)的单链Fv单体诱导含有IAP的细胞凋亡，不诱导细胞凋亡，而二聚体诱导凋亡，本发明人发现二聚体交联(二聚体化)细胞表面的IAP受体，从而转导信号进入细胞，导致诱导凋亡。这提示，单特异性单链Fv二聚体交联细胞表面分子(例如受体)，并像配基一样转导信号，从而用作激动剂。
研究细胞间交联发现，上述单链Fv二聚体不引起血细胞凝集反应，而上述单克隆抗体则能。单链双价抗体(包含两个H链V区和两个L链V区的单链多肽)也观察到相同结果。这提示，单克隆抗体可能形成细胞间交联，而改变的抗体，如单链Fv二聚体和单链双价抗体，交联细胞表面分子但不形成细胞间交联。
基于这些观察结果，本发明人新近发现，改变的抗体，例如单链Fv二聚体和单链双价抗体，除了用于已知的细胞间交联以外，还交联相同细胞的细胞表面分子或细胞内分子，适合作为该分子的配基(特别是作为模拟天然配基作用的配基)。
本发明人进一步发现，抗体分子(完全IgG)可以改变成为交联细胞表面分子的单链Fv二聚体、单链双价抗体等，从而降低细胞间交联引起的副作用，并提供了只诱导细胞目的效应的新药，完成了本发明。相比与该改变的抗体具有相同V区的完全抗体(IgG)，本发明改变的抗体具有显著高的活性。由于其分子大小比抗体分子下降，并缺少恒定区，其具有提高的组织通透性。

发明内容
本发明的一个目的在于提供低分子大小的激动剂改变的抗体，其包含单克隆抗体的二个或多个H链V区以及二个或多个L链V区，并通过交联TPO受体而具有TPO激动剂作用。
因此，本发明涉及改变的抗体，其包含二个或多个H链V区以及二个或多个L链V区，优选每种2-6个，特别优选每种2-4个，最优选每种二个，并通过交联TPO受体而显示TPO激动剂活性。
本说明书中“改变的抗体”是指包含二个或多个H链V区以及二个或多个L链V区的任何物质，其中所述V区直接连接或通过接头以共价键或非共价键连接。例如，通过肽接头或化学交联剂等连接抗体的各个V区而制备的多肽和化合物。本发明利用的二个或多个H链V区以及二个或多个L链V区可来源于相同抗体或不同抗体。
本发明的改变的抗体可以是特异性识别并交联TPO受体、因而能够转导信号进入细胞的任何物质。它们包括进一步修饰该改变的抗体V区的部分氨基酸序列而制备的改变的抗体。
本发明改变的抗体的优选实例为包含H链V区和L链V区的单链Fv的多聚体，例如二聚体、三聚体或四聚体，或者包含二个或多个H链V区以及二个或多个L链V区的单链多肽。如果本发明的改变的抗体是包含H链V区以及L链V区的单链Fv的多聚体，例如二聚体、三聚体或四聚体等，优选位于相同链上的H链V区和L链V区不结合形成抗原结合位点。
更优选的实例为包含H链V区以及L链V区的单链Fv的二聚体、或者包含二个H链V区以及二个L链V区的单链多肽。改变的抗体的H链V区和L链V区优选通过接头相联。
上述单链Fv多聚体包括非共价键多聚体、通过交联基的共价键多聚体以及通过交联剂的多聚体(抗体、抗体片段或双价改变的抗体)。用于交联肽的常规交联基可以用作形成多聚体的交联基。例如通过半胱氨酸残基交联的二硫化物，其它交联基，如C4-C10亚烃基(例如四亚甲基、五亚甲基、六亚甲基、七亚甲基以及八亚甲基等)或C4-C10亚烯基(顺/反-3-亚丁烯基、顺/反-2-亚戊烯基、顺/反-3-亚戊烯基、顺/反-3-亚己烯基等)。
此外，能够结合单链Fv的交联剂有，例如可随意引入Fv的氨基酸序列，例如抗FLAG序列的抗体等或其片段、或来源于抗体的改变的抗体，例如单链Fv。
本说明书″TPO激动剂作用″是指通过交联TPO受体而转导入信号的细胞内发生的生物学作用，例如增殖、分化或巨核细胞的生长刺激、或血小板生成。
利用测定激动剂作用的已知方法，确定本发明TPO激动剂作用的ED50。测定的例子有，利用TPO敏感的细胞系(例如BaF/mpl或UT7/TPO)进行细胞增殖分析，测定MPL蛋白质的磷酸化，通过骨髓细胞分化进行巨核细胞集落分析，小鼠体内血小板恢复合成分析，利用人白血病成巨核细胞系(CMK)测定血小板抗原GPIIbIIIa(抗GPIIbIIIa)的表达诱导，或者测定成巨核细胞系(DAMI)的多倍性诱导。ED50为达到50％最大反应(剂量-反应曲线中设为100％)所需剂量。
本发明优选的改变的抗体，其TPO激动剂作用(ED50)等于或好于具有与该改变的抗体相同的抗原结合区的抗体，即具有与形成该改变的抗体的抗原结合区的H链V区和L链V区对相同的H链V区和L链V区对的完全抗体(以下“亲本抗体”)，如IgG。更优选其TPO激动剂作用(ED50)高于亲本抗体二倍以上、进一步优选5倍以上、最优选10倍以上的改变的抗体。本发明包含具有TPO激动剂作用的改变的抗体，其包含形成与亲本抗体(可结合TPO受体，但对该分子没有激动剂作用)相同的抗原结合区的H链V区和L链V区。
本发明的包含二个或多个H链V区以及二个或多个L链V区的化合物可以是包含抗体的二个或多个H链V区以及二个或多个L链V区、显示的激动剂作用(ED50)等于或好于血小板生成素(TPO)的任何化合物。优选为其TPO激动剂作用(ED50)高于TPO 2倍以上、更优选5倍以上、最优选10倍以上的化合物。
此处所述“化合物”不仅包括本发明的改变的抗体，也包括包含二个或多个、优选2-6个、更优选2-4个、最优选2个抗原结合区(例如完全抗体或F(ab’)2)的任何化合物。
本发明包含抗体的二个或多个H链V区以及二个或多个L链V区的优选的改变的抗体或化合物所具有的细胞间粘附作用(ED50)不超过亲本抗体的1/10，最优选基本上没有细胞间粘附作用。
利用测定细胞间粘附作用的已知方法，例如测定表达TPO受体的细胞的凝聚作用，确定上述细胞间粘附作用的ED50。
本发明涉及编码该改变的抗体的DNA。
本发明涉及产生该改变的抗体的动物细胞或微生物。
本发明涉及该改变的抗体作为TPO激动剂的用途。
本发明涉及利用该改变的抗体，通过交联TPO受体而转导信号进入细胞，从而诱导TPO激动剂作用(例如巨核细胞增殖、分化诱导或生长刺激、血小板生成、TPO受体蛋白质的磷酸化等)的方法。
本发明涉及包含该改变的抗体为活性成分的治疗血小板减少症等的药物。
本发明涉及该改变的抗体作为药物的用途。
本发明涉及包含抗体的二个或多个H链V区以及二个或多个L链V区、并通过交联TPO受体而显示TPO激动剂作用的改变的抗体的筛选或测定方法，其包含1)制备包含抗体的二个或多个H链V区以及二个或多个L链V区、并特异性结合TPO受体的改变的抗体，2)将该改变的抗体接触表达TPO受体的细胞，以及3)测定由交联TPO受体而在细胞中发生的TPO激动剂作用。该测定方法用于制备本发明作为药物和其它目的的改变的抗体中的质量控制。
该改变的抗体可以是单特异性的改变的抗体或者多特异性的改变的抗体，例如双特异性的改变的抗体。优选单特异性的改变的抗体。
本发明还涉及H链V区和/或L链V区是来源于人抗体的H链V区和/或来源于人抗体的L链V区的改变的抗体。如WO99/10494所述，可以通过筛选人单克隆抗体文库获得来源于人抗体的H链V区和/或L链V区。也包括来源于通过转基因小鼠等制备的人单克隆抗体的H链V区和L链V区。
本发明进一步涉及H链V区和/或L链V区是人源化的H链V区和/或人源化的L链V区的改变的抗体。具体地，该人源化改变的抗体由人源化的L链V区(其包含来源于人单克隆抗体L链V区的构架区(FR)以及来源于非人哺乳动物(例如小鼠、大鼠、牛、绵羊、猿)单克隆抗体L链V区的互补决定区(以下“CDR”))和/或人源化的H链V区(其包含来源于人单克隆抗体H链V区的FR以及来源于非人哺乳动物(例如小鼠、大鼠、牛、绵羊、猿)单克隆抗体H链V区的CDR)组成。在这种情况下，可以部分改变CDR和FR的氨基酸序列，例如缺失、替换或添加。
本发明改变的抗体的H链V区和/或L链V区可以是来源于非人动物(例如小鼠、大鼠、牛、绵羊、猿、鸡等)的单克隆抗体的H链V区和/或L链V区。在这种情况下，可以部分改变CDR和FR的氨基酸序列，例如缺失、替换或添加。
本发明也涉及编码上述各种改变的抗体的DNA，以及用于制备包含该DNA的重组载体的基因工程技术。
本发明还涉及用该重组载体转化的宿主细胞。宿主细胞的例子为动物细胞，例如人细胞、小鼠细胞等，以及微生物，例如大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、酵母等。
本发明涉及产生改变的抗体的方法，包括培养上述宿主，并从其培养物中提取该改变的抗体。
本发明另外涉及产生单链Fv二聚体的方法，其包括在无血清培养基中培养可产生该单链Fv的宿主动物细胞，以分泌单链Fv到培养基中，并分离培养基中形成的单链Fv二聚体。
本发明还涉及该改变的抗体作为TPO激动剂的用途。即涉及信号转导激动剂，其包含上述获得的改变的抗体作为活性成分。
因此，包含本发明TPO激动剂改变的抗体为活性成分的药物制剂，可用作血小板减少相关的血液疾病、癌症或白血病化疗所致血小板减少症等的预防和/或治疗药。
本发明的改变的抗体包含源于抗体的2个或多个H链V区以及2个或多个L链V区。该改变的抗体的结构可能是包含1个H链V区和1个L链V区的单链Fv的二聚体，或者是包含2个H链V区和2个L链V区的多肽。在本发明的改变的抗体中，H链和L链的V区优选通过由一个或多个氨基酸组成的肽接头相连。产生的改变的抗体包含抗体的可变区，以与原始单克隆抗体相同的特异性结合抗原。
H链V区在本发明中，来源于抗体的H链V区识别TPO受体并寡聚体化，例如通过交联所述分子而二聚体化，从而转导信号进入细胞。本发明的H链V区包括来源于哺乳动物(例如人、小鼠、大鼠、牛、绵羊、猿等)的H链V区，以及H链V区的氨基酸序列部分改变的H链V区。更优选人源化的H链V区，其包含人单克隆抗体H链V区的FR，以及小鼠单克隆抗体H链V区的CDR。还优选具有来源于人的氨基酸序列的H链V区，其可以利用重组技术制备。本发明的H链V区可能是保留抗原结合能力的上述H链V区的片段。
L链V区在本发明中，该L链V区识别TPO受体并寡聚体化，例如通过交联所述分子而二聚体化，从而转导信号进入细胞。本发明的L链V区包括来源于哺乳动物(例如人、小鼠、大鼠、牛、绵羊、猿等)的L链V区，以及L链V区的氨基酸序列部分改变的L链V区。更优选人源化的L链V区，其包含人单克隆抗体L链V区的FR，以及小鼠单克隆抗体L链V区的CDR。还优选具有来源于人的氨基酸序列的L链V区，其可以利用重组技术制备。本发明的L链V区可能是保留抗原结合能力的L链V区的片段。
互补决定区(CDR)L链和H链的每个V区形成抗原结合位点。L和H链的可变区由连接3个高度可变区或互补决定区(CDR)的相当保守的4个共同构架区组成(Kabat，E.A.等人，“Sequences of Protein of ImmunologicalInterest”，US Dept.Health and Human Services，1983)。
4个构架区(FR)中的主要部分形成β-片层结构，从而3个CDR形成环。某些情况下，CDR可形成β-片层结构的一部分。3个CDR在空间位置上通过FR互相接近，连同3个CDR形成抗原结合结点。
根据Kabat，E.A.等人“Sequences of Protein ofImmunological Interest”中的经验规则，将获得的抗体V区氨基酸序列与已知抗体V区的已知氨基酸序列比较，来鉴定这些CDR。
单链Fv单链Fv是多肽单体，包含互相连接的来源于单克隆抗体的H链V区和L链V区。产生的单链Fv包含原始抗体的可变区，并保留其互补决定区，因而该单链Fv以与原始抗体相同的特异性结合抗原(JP-Appl.11-63557)。本发明单链Fv的部分可变区和/或CDR，或其部分氨基酸序列可能是部分改变的，例如缺失、替换或添加。前已述及构成本发明单链Fv的H链V区和L链V区，它们可以直接连接或通过接头相连，优选肽接头。单链Fv的结构可能是[H链V区]-[L链V区]，或者[L链V区]-[H链V区]。本发明中，有可能使单链Fv形成二聚体、三聚体或四聚体，从中形成本发明的改变抗体。
单链改变的抗体本发明包含两个或多个H链V区以及两个或多个L链V区、优选每种2-4个、特别优选每种2个的单链改变的抗体，包含上述的两个或多个H链V区和L链V区。应当排列肽的每个区，使改变的单链抗体形成特定的空间结构，精确模拟由单链Fv二聚体形成的空间结构。例如，按下列顺序排列V区[H链V区]-[L链V区]-[H链V区]-[L链V区]；或者[L链V区]-[H链V区]-[L链V区]-[H链V区]，其中这些区分别通过肽接头相连。
接头本发明中，连接H链V区和L链V区之间的接头可能是能通过基因工程方法引入的任何肽接头，或者是化学合成的任何接头。例如，本发明可能使用文献中公开的接头，如Protein Egineering，9(3)，299-305，1996。在同一分子中这些接头可以相同或不同。如果需要肽接头，以下为引用的接头实例SerGly-SerGly-Gly-SerSer-Gly-GlyGly-Gly-Gly-SerSer-Gly-Gly-GlyGly-Gly-Gly-Gly-SerSer-Gly-Gly-Gly-GlyGly-Gly-Gly-Gly-Gly-SerSer-Gly-Gly-Gly-Gly-GlyGly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-SerSer-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n以及(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)n其中n是不小于1的整数。优选的肽接头长度根据作为抗原的受体而变化，对于单链Fv，通常优选1-20个氨基酸范围内。对于包含两个或多个H链V区以及两个或多个L链V区的单链改变的抗体，与其连接形成包含[H链V区]-[L链V区](或[L链V区]-[H链V区])的相同抗原结合位点的肽接头长度为1-30个氨基酸，优选1-20个氨基酸，更优选3-18个氨基酸。与其连接而不形成包含[H链V区]-[L链V区](或[L链V区]-[H链V区])的相同抗原结合位点的肽接头，其长度为1-40个氨基酸，优选3-30个氨基酸，更优选5-20个氨基酸。在编码本发明改变的抗体的DNA构建体的说明中，将描述引入这些接头的方法。
根据本发明，化学合成的接头，即化学交联剂，可以是常规用于连接肽的任何接头。接头的例子可能包括N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)、辛二酸双(磺基琥珀酰亚胺酯)(BS3)、二硫代双(丙酸琥珀亚胺酯)(DSP)、二硫代双(丙酸磺基琥珀酰亚胺酯)(DTSSP)、乙二醇双(琥珀酸琥珀酰亚胺酯)(EGS)、乙二醇双(琥珀酸磺基琥珀酰亚胺酯)(sulfo-EGS)、酒石酸二琥珀酰亚胺酯(DST)、酒石酸二磺基琥珀酰亚胺酯(sulfo-DST)、双[2-(琥珀酰亚胺基氧羰基氧基)乙基]砜(BSOCOES)、双[2-(磺基琥珀酰亚胺基氧羰基氧基)乙基]砜(sulfo-BSOCOES)等。这些都是商品化的。优选与肽接头长度相同的化学合成接头。
为形成单链Fv的二聚体，优选接头适于使宿主细胞产生的单链Fv在溶液中(例如培养基中)二聚体化超过20％，优选超过50％，更优选超过80％，最优选超过90％。特别地，优选接头由2-12个氨基酸、优选3-10个氨基酸组成，或其对应的其它接头。
改变的抗体的制备通过用上述接头连接来源于特异性结合TPO受体的已知或新型单克隆抗体的H链V区和L链V区，可以制备改变的抗体。引用的单链Fv的实例具有WO99/10494中描述的抗体12B5和抗体12E10的H链V区和L链V区。本发明具有二个或多个H链V区以及二个或多个L链V区的改变的抗体的实例为包含来源于上述单克隆抗体的H链V区和L链V区的sc12B5二聚体(接头15个氨基酸)、sc12E10二聚体(接头15个氨基酸)、db12B5二聚体(接头5个氨基酸)、db12E10二聚体(接头5个氨基酸)、sc12B5sc(FV)2和sc12E10sc(FV)2。
为制备该改变的抗体，如果希望该多肽为分泌肽，则可在其N端连接信号肽。为有效纯化该多肽，可以连接众所周知的用于多肽纯化的氨基酸序列，例如FLAG序列。在此情况下，利用抗FLAG抗体可以形成二聚体。
为制备本发明的改变的抗体，必须获得DNA，即编码单链Fv的DNA或者编码重建的单链多肽的DNA。这些DNA，特别是sc12B5、db12B5、sc12E10和/或db12E10的DNA，可从编码所述Fv的H链V区和L链V区的DNA获得。利用这些DNA为模板，以及对应其两末端的引物对，通过聚合酶链式反应(PCR)方法扩增其中包含编码目的氨基酸序列的DNA部分，也可以获得它们。
当希望每个V区的氨基酸序列部分改变时，可利用PCR通过本领域已知的方法，获得其中一个或一些氨基酸改变(即缺失、替换或添加)的V区。为制备对特定抗原具有充分活性的改变的抗体，优选利用本领域已知的PCR方法改变V区的部分氨基酸序列。
为确定PCR扩增引物，如果单克隆抗体用作原料，则利用本技术领域已知的分型方法，确定H链和L链的类型。
为了PCR扩增抗体12B5和抗体12E10的L链V区，按上述方法确定5’端和3’端的寡核苷酸引物。以同样方法确定扩增抗体12B5和抗体12E10的H链V区所用的5’端和3’端寡核苷酸引物。
本发明的实施方案中，使用的5’端引物包含“GANTC”序列，在其5’端附近提供限制性酶Hinf I识别位点，3’端引物包含核苷酸序列“CCCGGG”，在其5’端附近提供XmaI识别位点。只要可用于将目的DNA片段亚克隆到克隆载体中，可以使用这些位点以外的其它限制性酶识别位点。
使用特别设计的PCR引物，在抗体12B5和12E10的V区编码cDNA的5’端和3’端提供合适的核苷酸序列，从而使该cDNA容易插入表达载体并在表达载体中具有适当的功能(例如，本发明设计为通过插入Kozak序列提高翻译效率)。利用这些引物进行PCR扩增，获得抗体12B5和12E10的V区，将其插入包含目的人C区的HEF表达载体(见WO92/19759)。可利用任何常规方法测序克隆的DNA，例如利用自动DNA测序仪(Applied Biosystems)。
可按下列方法，将一接头，例如肽接头引入本发明的改变的抗体。设计具有上述H链V区和L链V区引物的部分互补序列、以及编码接头的N端或C端的引物。然后，利用这些引物进行PCR程序，制备编码具有目的氨基酸序列及长度的肽接头的DNA。利用得到的DNA连接编码H链V区和L链V区的DNA，制备编码本发明具有目的肽接头的改变的抗体的DNA。一旦制备了编码一个改变的抗体的DNA，通过设计接头的各种引物，利用该引物以及上述DNA为模板进行PCR，可以很容易制备编码有或没有目的肽接头的改变的抗体的DNA。
利用常规技术(例如，Sato K.等人，Cancer Res.，53，1-6(1993))，能够对本发明改变的抗体的每个V区进行人源化。一旦制备了编码每个人源化Fv的DNA，能够很容易按照常规方法，制备人源化单链Fv、人源化单链Fv的片段、人源化单克隆抗体以及人源化单克隆抗体的片段。优选地，如果需要，可以对其V区氨基酸序列进行部分改变。
此外，利用上述常规方法，按照制备编码来源于小鼠的H链V区和L链V区DNA所用的同样方式，可以制备来源于其它哺乳动物的DNA，例如编码人抗体的每个V区的DNA。得到的DNA可用于制备其它哺乳动物特别是来源于人抗体的H链V区和L链V区、来源于人的单链Fv及其片段、以及人源的单克隆抗体及其片段。
如果本发明的改变的抗体为双特异性的改变的抗体，则可以通过已知方法制备(例如WO9413804所述方法)。
如上所述，一旦制备了编码改变的抗体的V区以及人源化改变的抗体的V区的目的DNA，就可以按照常规方法获得包含它们的表达载体以及利用该载体转化的宿主。此外，可以按照常规方法培养宿主，制备重建的单链Fv、重建的人源化单链Fv、人源化单克隆抗体及其片段。其可从细胞或培养基中分离，并纯化为均一物质。为此目的，如果必要，可以联合使用常规用于蛋白质分离和纯化的任何方法，例如层析、超滤、盐析和透析，对其没有限制。
当在无血清培养基中培养动物细胞(例如COS7细胞或CHO细胞，优选CHO细胞)，制备本发明的重建单链Fv时，可以稳定回收并高产量纯化培养基中形成的所述单链Fv的二聚体。这样纯化的二聚体能够长期稳定保存。本发明使用的无血清培养基可以是常规用于制备重组蛋白质的任何培养基，对其没有限制。
为制备本发明的改变的抗体，可以利用任何表达系统，例如真核细胞如动物细胞(例如建立的哺乳动物细胞系)、丝状真菌和酵母，以及原核细胞如细菌细胞(例如E.coli)。本发明的改变的抗体优选在哺乳动物细胞中表达，例如COS7细胞或CHO细胞。
在这些情况下，可以使用用于哺乳动物细胞表达的常规启动子。优选使用人巨细胞病毒(HCMV)的立即早期启动子。包含HCMV启动子的表达载体，包括源于pSV2neo的HCMV-VH-HCγ1、HCMV-VL-HCK等(WO92/19759)。
此外，本发明可能使用的哺乳动物细胞基因表达的其它启动子包括来源于逆转录病毒、多形瘤病毒、腺病毒和猿猴病毒40(SV40)的病毒启动子，以及来源于哺乳动物的启动子，例如人多肽链延长因子1α(HEF-1α)。根据Mulligan R.C.等人的方法可容易使用SV40启动子(Nature 277，108-114(1979))，也可根据Mizushima S.等人方法使用HEF-1α启动子(Nucleic Acids Research，18，5322(1990))。
可用于本发明的复制起点(ori)包括来源于SV40、多形瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒(BPV)等的起点。表达载体可能包含磷酸转移酶APH(3’)II或I(neo)基因、胸苷激酶(TK)基因、E.coli黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因或二氢叶酸还原酶(DHFR)基因作为选择标志。
利用常规方法，例如放射免疫分析(RIA)、酶联免疫吸附分析(ELISA)或表面胞质基因共振技术(surface plasmonresonance)，可以评价上述制备的改变的抗体的抗原结合活性。也可以利用原始抗体的结合-抑制能力为指标(例如依据所述单克隆抗体与抗原的结合是否存在浓度依赖性抑制作用)进行评价。
更详细地，培养用包含编码本发明改变的抗体DNA的表达载体转化的动物细胞，例如COS7细胞或CHO细胞。培养的细胞和/或培养上清、或从中纯化的改变的抗体，用于测定与抗原的结合。培养只转化表达载体的细胞的培养基上清用作对照。至于抗原，例如抗体12B5和抗体12E10，将本发明改变的抗体的测试样品或对照上清加入表达人MPL的Ba/F3细胞中，然后进行例如流式细胞术测定，以评价抗原结合活性。
按照以下方法进行信号转导效应(例如巨核细胞增殖、分化诱导或生长刺激、血小板生成、或TPO受体蛋白质的磷酸化)的体外评价。将上述改变的抗体的测试样品加入表达抗体的细胞或者已经引入抗体基因的细胞中，并利用常规方法通过信号转导引起的变化(例如人MPL抗原特异性增殖、测定蛋白质磷酸化、或表达血小板特异性抗原)进行评价。
给予小鼠识别MPL的单克隆抗体、本发明的改变的抗体或PBS对照，通过小鼠血清中血小板数量的变化评价活性强度进行体内评价。如上所述，通过制备包含二个或多个H链V区以及二个或多个L链V区、并特异性结合TPO受体的改变的抗体，并通过上述体内或体外评价方法筛选改变的抗体，可以获得本发明的改变的抗体。
本发明包含二个或多个H链V区以及二个或多个L链V区、优选每种2-4个、更优选每种2个的改变的抗体，可能是包含一个H链V区和一个L链V区的单链Fv的二聚体，或者是其中有二个或多个H链V区和二个或多个L链V区相连的单链多肽。可以认为，由于这样的结构，使肽模拟TPO的三维结构，从而具有优良的抗原结合特性及TPO激动剂活性。
本发明的改变的抗体相比亲本抗体分子(例如IgG)，具有显著低的分子大小，因而具有对组织或肿瘤的强通透性，具有比亲本单克隆抗体高的活性。因此，本发明的改变的抗体能够有效转导TPO信号进入细胞。包含它们的药物制剂用于治疗血小板减少相关的血液病以及癌症或白血病化疗所致血小板减少症。还期望本发明的抗体经过RI标记后可用作造影剂。通过连接RI化合物或毒素可增强该效果。
本发明的最佳工作方式本发明将根据以下实施例具体阐明，但其并不限制本发明的范围。
为阐明本发明改变的抗体的制备方法，制备单链Fv的实施例如下所示。制备改变的抗体的实施例中使用小鼠抗人IAP抗体，MABL-1和MABL-2。1997年9月11日，将分别产生它们的杂交瘤MABL-1和MABL-2进行了国际保藏，分别以FERM BP-6100和FERM BP-6101存放于微生物授权保藏机构-国立生命科学和人体技术研究所，工业科学技术局，国际贸易和工业部(National Institute of BiosCience andhuman Technology，Agency of Industrial Science andTechnology，Minister of International Trade and Industry)(1-3Higasi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-Ken，Japan)。
实施例实施例1(克隆小鼠抗人IAP单克隆抗体的V区编码DNA)如下克隆小鼠抗人IAP单克隆抗体MABL-1和MABL-2的可变区的编码DNA。
1.1制备信使RNA(mRNA)利用mRNA Purification试剂盒(Pharmacia Biotech)获得杂交瘤MABL-1和MABL-2的mRNA。
1.2合成双链cDNA利用Marathon cDNA Amplification试剂盒(CLONTECH)从大约1μg mRNA合成双链cDNA，并连上一个接头。
1.3PCR扩增抗体可变区的编码基因利用Thermal Cycler(PERKIN ELMER)进行PCR。
(1)扩增MABL-1 L链V区编码基因用于PCR方法的引物是SEQ ID No.1所示Adapter Primer-1(CLONTECH)，它与接头的部分序列杂交，以及SEQ ID No.2所示MKC(小鼠Kappa恒定)引物(Bio/Technology，9，88-89，1991)，它与小鼠Kappa型L链V区杂交。
50μl PCR溶液包含5μl 10×PCR缓冲液II、2mM MgCl2、0.16mMdNTPs(dATP，dGTP，dCTP和dTTP)、2.5单位DNA聚合酶AmpliTaqGold(PERKIN ELMER)、0.2μM SEQ ID No.1接头引物、0.2μM SEQID No.2MKC引物以及0.1μg来源于MABL-1的双链cDNA。溶液于起始温度94℃预热9分钟，然后依次94℃加热1分钟、60℃1分钟、72℃1分20秒。此温度循环重复35次，然后72℃再加热反应混合物10分钟。
(2)扩增MABL-1H链V区的编码cDNASEQ ID No.1所示AdapterPrimer-1以及SEQ ID No.3所示MHC-γ1(小鼠重链恒定)引物(Bio/Technology，9，88-89，1991)用作PGR引物。
按照实施例1.3-(1)所述L链V区基因的扩增方法进行cDNA扩增，只是使用0.2μM MHC-γ1引物，而非0.2μM MKC引物。
(3)扩增MABL-2L链V区的编码cDNASEQ ID No.1的AdapterPrimer-1以及SEQ ID No.2的MKC引物用作PCR引物。
按照实施例1.3-(1)所述MABL-1 L链V区基因的扩增方法进行cDNA扩增，只是使用0.1μg来源于MABL-2的双链cDNA，而非0.1μgMABL-1的双链cDNA。
(4)扩增MABL-2 H链V区的编码cDNASEQ ID No.1的AdapterPrimer-1以及SEQ ID No.4所示MHC-γ2a引物(Bio/Technology，9，88-89，1991)用作PCR引物。
按照实施例1.3-(3)所述L链V区基因的扩增方法进行cDNA扩增，只是使用0.2μM MHC-γ2a引物，而非0.2μM MKC引物。
1.4纯化PCR产物利用QIAquick PCR Purification试剂盒(QIAGEN)纯化上述PCR扩增的DNA片段，并溶于含1mM EDTA的10mM Tris-HCl(pH8.0)。
1.5连接和转化上述制备的包含源于MABL-1小鼠Kappa型L链V区编码基因的DNA片段约140ng，与50ng pGEM-T Easy载体(Promega)于15℃连接3小时，反应缓冲液包含30mM Tris-HCl(pH7.8)、10mM MgCl2、10mM二硫苏糖醇、1mM ATP以及3单位T4DNA连接酶(Promega)。
然后将1μl反应混合物加入50μlE.ColiDH5α感受态细胞中(Toyobo Inc.)，细胞于冰上保存30分钟，42℃温育1分钟，冰上再保存2分钟。加入100μl SOC培养基(GIBCO BRL)。将E.coli细胞接种在含100μg/ml氨苄青霉素(SIGMA)的LB琼脂培养基中(MolecularCloningA laboratory Manual，Sambrook等人，Cold SpringHarbor laboratory Press，1989)，37℃培养过夜，获得E.coli转化子。
转化子于3ml含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，使用QIAprep Spin Minprep试剂盒(QIAGEN)从培养物中制备质粒DNA。
所得包含源于杂交瘤MABL-1的小鼠Kappa型L链V区的编码基因的质粒，命名为pGEM-M1L。
根据上述相同方法，从纯化的DNA片段制备质粒，其包含源于杂交瘤MABL-1的小鼠H链V区编码基因，命名为pGEM-M1H。
从纯化的DNA片段制备质粒，其包含源于杂交瘤MABL-2的小鼠kappa型L链V区编码基因，命名为pGEM-M2L。
从纯化的DNA片段制备质粒，其包含源于杂交瘤MABL-2的小鼠H链V区编码基因，命名为pGEM-M2H。
实施例2(DNA测序)利用Auto DNA Sequencer(Applied Biosystem)和ABI PRISMDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction试剂盒(Applied Biosystem)，按照制造商规程，测定上述质粒中cDNA编码区的核苷酸序列。
质粒pGEM-M1L中包含的小鼠抗体MABL-1的L链V区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
质粒pGEM-M1H中包含的小鼠抗体MABL-1的H链V区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
质粒pGEM-M2L中包含的小鼠抗体MABL-2的L链V区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
质粒pGEM-M2H中包含的小鼠抗体MABL-2的H链V区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。
实施例3(确定CDR)L链与H链的V区通常结构相似，其每四个构架区通过三个高度可变区，即互补决定区(CDR)相连。构架的氨基酸序列相对很保守，而CDR的氨基酸序列极其高度可变(Kabat E.A.等人，“Sequencesof Proteins of Immunological Interest”，US Dept.Health andHuman Services，1983)。
基于这些事实，将小鼠抗人IAP单克隆抗体可变区的氨基酸序列，应用于Kabat等人建立的抗体氨基酸序列数据库中，研究其同源性。表1所示为根据同源性确定的CDR区。
表1质粒SEQ ID No.CDR(1)CDR(2)CDR(3)pGEM-M1L 5 43-58 74-80 113-121pGEM-M1H 6 50-54 69-85 118-125pGEM-M2L 7 43-58 74-80 113-121pGEM-M2H 8 50-54 69-85 118-125实施例4(鉴定克隆cDNA的表达、制备嵌合MABL-1抗体和嵌合MABL-2抗体)4.1制备表达嵌合MABL-1抗体的载体分别编码小鼠抗体MABL-1的L链与H链V区的cDNA克隆pGEM-M1L和pGEM-M1H，经过PCR方法改变后，引入HEF表达载体(WO92/19759)，制备表达嵌合MABL-1抗体的载体。
设计L链V区的正向引物MLS(SEQ ID No.9)和H链V区的正向引物MHS(SEQ ID No.10)，使之可与每个V区前导序列开始处的编码DNA杂交，并包含Kozak共有序列(J.Mol.Biol.，196，947-950，1987)以及HindIII限制性酶位点。设计L链V区反向引物MLAS(SEQID No.11)和H链V区反向引物MHAS(SEQ ID No.12)，使之可与J区末端编码DNA杂交，并包含剪接供体序列以及BamHI限制性酶位点。
将包含10μl 10×PCR缓冲液II、2mM MgCl2、0.16mM dNTPs(dATP，dGTP，dCTP和dTTP)、5单位DNA聚合酶AmpliTaq Gold、0.4uM每种引物和8ng模板DNA(pGEM-M1L或pGEM-M1H)的100μl PCR溶液，在起始温度94℃预热9分钟，然后依次94℃加热1分钟、60℃1分钟、72℃1分20秒。此温度循环重复35次，然后72℃再加热反应混合物10分钟。
用QIAquick PCR Purification试剂盒(QIAGEN)纯化PCR产物，然后用HindIII和BamHI消化。L链V区的产物克隆到HEF表达载体HEF-κ，H链V区的产物克隆到HEF表达载体HEF-γ。DNA测序后，含有正确DNA序列的DNA片段的质粒，分别命名为HEF-M1L和HEF-M1H。
4.2制备表达嵌合MABL-2抗体的载体按照如实施例4.1所述相同的方法，对cDNA进行改变和克隆，只是使用pGEM-M2L和pGEM-M2H为模板DNA，而非pGEM-M1L和pGEM-M1H。DNA测序后，含有正确DNA序列的DNA片段的质粒，分别命名为HEF-M2L和HEF-M2H。
4.3转染COS7细胞在COS7细胞中测试上述表达载体，观察嵌合MABL-1和MABL-2抗体的瞬时表达。
(1)转染嵌合MABL-1抗体的基因使用Gene Pulser装置(BioRad)，通过电穿孔将HEF-M1L和HEF-M1H载体共转化COS7细胞。小杯中加入每种DNA(10μg)和0.8ml含1×107细胞/ml的PBS。混合物用1.5KV、25μF电容脉冲处理。
室温恢复10分钟后，将电穿孔细胞转到包含10％无γ-球蛋白的胎牛血清的DMEM培养基中(GIBCO BRL)。培养72小时后，收集上清，离心去除细胞碎片并回收。
(2)转染编码嵌合MABL-2抗体的基因利用如实施例4.3-(1)所述相同方法，将嵌合MABL-2抗体的编码基因共转染COS7细胞，只是使用HEF-M2L和HEF-M2H载体，而非HEF-M1L和HEF-M1H载体。以同样方法回收上清。
4.4流式细胞术利用上述COS7细胞培养上清进行流式细胞术分析，测量其抗原结合。将表达嵌合MABL-1抗体的COS7细胞、或表达嵌合MABL-2抗体的COS7的细胞的培养上清，或者作为对照的人IgG抗体(SIGMA)，加入4×105表达人IAP的小鼠白血病细胞系L1210中，冰浴。洗涤后，向其中加入FITC标记的抗人IgG抗体(Cappel)。温育并洗涤后，用FACScan装置(BECTON DICKINSON)测量其荧光强度。
由于嵌合MABL-1和MABL-2抗体特异性结合表达人IAP的L1210细胞，可以确定，这些嵌合抗体分别具有小鼠单克隆抗体MABL-1和MABL-2的正确V区结构(图1-3)。
实施例5(制备抗体MABL-1和抗体MABL-2的重建单链Fv(scFv))5.1制备抗体MABL-1的重建单链Fv如下制备抗体MABL-1的重建单链Fv。利用PCR方法分别扩增抗体MABL-1的H链V区和L链V区，以及接头，并连接在一起，以制备抗体MABL-1的重建单链Fv。制备方法如图4所示。利用六种引物(A-F)制备抗体MABL-1的单链Fv。引物A、C和E具有正义序列，引物B、D和F具有反义序列。
H链V区的正向引物VHS(引物A，SEQ ID No.13)设计为可与H链V区N端编码DNA杂交，并包含NcoI限制性酶识别位点。H链V区的反向引物VHAS(引物B，SEQ ID No.14)设计为可与H链V区C端编码DNA杂交，并与接头重叠。
接头的正向引物LS(引物C，SEQ ID No.15)设计为可与接头N端编码DNA杂交，并与H链V区C端编码DNA重叠。接头的反向引物LAS(引物D，SEQ ID No.16)设计为可与接头C端编码DNA杂交，并与L链V区N端编码DNA重叠。
L链V区的正向引物VLS(引物E，SEQ ID No.17)设计为可与接头C端编码DNA杂交，并与L链V区N端编码DNA重叠。L链V区的反向引物VLAS-FLAG(引物F，SEQ ID No.18)设计为可与L链V区C端编码DNA杂交，并具有FLAG肽编码序列(Hopp.T.P.等人，Bio/Technology，6，1204-1210，1988)、两个终止密码子以及EcoRI限制性酶识别位点。
在第一个PCR步骤中，进行A-B、C-D、E-F三个反应，纯化其PCR产物。将第一步PCR获得的三种PCR产物按照其互补性进行组装。然后加入引物A和F，扩增抗体MABL-1的重建单链Fv的全长编码DNA(第二步PCR)。第一步PCR中分别以编码抗体MABL-1H链V区的质粒pGEM-M1H(参见实施例2)、包含接头区编码DNA序列的质粒pSC-DP1(该接头区包含Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly GlyGly Ser(SEQ ID No.19))(Huston J.S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，5879-5883，1988)、以及编码抗体MABL-1L链V区的质粒pGEM-M1L(参见实施例2)作模板。
第一步PCR反应的50μl溶液包含5μl 10×PCR缓冲液II、2mMMgCl2、0.16mM dNTPs、2.5单位DNA聚合酶AmpliTaq Gold(PERKINELMER)、0.4μM每种引物和5ng每种模板DNA。PCR溶液在起始温度94℃预热9分钟，然后依次94℃加热1分钟、65℃1分钟、72℃1分20秒。此温度循环重复35次，然后72℃再加热反应混合物7分钟。
利用QIApuick PCR Purification试剂盒(QIAGEN)纯化PCR产物A-B(371bp)、C-D(63bp)和E-F(384bp)，并在第二步PCR中组装。第二步PCR中，将包含120ng第一步PCR产物A-B、20ng PCR产物C-D和120ng PCR产物E-F、10μl 10×PCR缓冲液II、2mMMgCl2、0.16mM dNTPs、5单位DNA聚合酶AmpliTaq Gold(PERKINELMER)的9μl PCR溶液，在起始温度94℃预热8分钟，然后依次94℃加热2分钟、65℃2分钟、72℃2分钟。此温度循环重复2次，然后反应中分别加入每种引物A和F 0.4μM。混合物在起始温度94℃预热1分钟，然后依次94℃加热1分钟、65℃1分钟、72℃1分20秒。此温度循环重复35次，然后72℃再加热反应混合物7分钟。
纯化第二步PCR制备的843bp DNA片段，用NcoI和EcoRI消化。将得到的DNA片段克隆到pSCFVT7载体。表达载体pSCFVT7包含适于E.coli周质表达系统的pelB信号序列(Lei S.P.等人，J.Bacteriology，169，4379-4383，1987)。DNA测序后，将包含抗体MABL-1的重建单链Fv正确氨基酸序列的编码DNA片段的质粒，命名为“pscM1”(参见图5)。质粒pscM1包含的抗体MABL-1重建单链Fv的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID No.20所示。
利用PCR方法改变pscM1载体，以制备在哺乳动物细胞中表达抗体MABL-1重建单链Fv的载体。将得到的DNA片段引入pCHO1表达载体。表达载体pCHO1是经过EcoRI和SmaI消化DHFR-ΔE-rvH-PM1-f(WO92/19759)，去除抗体基因，并连上EcoRI-NotI-BamHI衔接头(Takara Shuzo)而构建的。
设计SEQ ID No.21所示Sal-VHS引物，作为PCR正向引物，其可与H链V区N端的编码DNA杂交，并包含Sal I限制性酶识别位点。设计如SEQ ID No.22所示FRHlanti引物，作为PCR反向引物，其可与第一构架序列末端的编码DNA杂交。
将包含10μl 10×PCR缓冲液II、2mM MgCl2、0.16mM dNTPs、5单位DNA聚合酶AmpliTaq Gold、0.4μl M每种引物以及8ng模板DNA(pscM1)的100μl PCR溶液，在起始温度95℃预热9分钟，然后依次95℃加热1分钟、60℃1分钟，72℃1分20秒。此温度循环重复35次，然后72℃再加热反应混合物7分钟。
利用QIAquick PCR Purification试剂盒(QIAGEN)纯化PCR产物，用SalI和MboII消化，获得抗体MABL-1的重建单链Fv的N端编码DNA片段。用MboII和EcoRI消化pscM1载体，获得抗体MABL-1的重建单链Fv的C端编码DNA片段。将该SalI-MboII DNA片段和MboII-EcoRI DNA片段克隆到pCHO1-IgS载体。DNA测序后，将包含目的DNA序列的质粒命名为“pCHOM1”(参见图6)。表达载体pCHO1-Igs包含适于哺乳动物细胞分泌表达系统的小鼠IgG1信号序列(Nature，322，323-327，1988)。质粒pCHOM1包含的抗体MABL-1重建单链Fv的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID No.23所示。
5.2制备抗体MABL-2的重建单链Fv按照上述实施例5.1方法，制备抗体MABL-2的重建单链Fv。第一步PCR中利用编码MABL-2的H链V区的质粒pGEM-M2H(参见实施例2)，而非pGEM-M1H，以及编码MABL-2的L链V区的质粒pGEM-M2L(参见实施例2)，而非pGEM-M1L，从而获得质粒pscM2，其中包含抗体MABL-2的单链Fv目的氨基酸序列的编码DNA片段。质粒pscM2中包含的抗体MABL-2的重建单链Fv的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID No.24所示。
利用PCR方法改变pscM2载体，制备载体pCHOM2，用于在哺乳动物细胞中表达，其中包含抗体MABL-2的重建单链Fv正确氨基酸序列的编码DNA片段。质粒pCHOM2中包含的抗体MABL-2的重建单链Fv的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID No.25所示。
5.3转染COS7细胞在COS7细胞中测试pCHOM2载体，观察抗体MABL-2的重建单链Fv的瞬时表达。
利用Gene Pulser装置(BioRad)，通过电穿孔将pCHOM2转化COS7细胞。小杯中加入每种DNA(10μg)和0.8ml含1×107细胞/ml的PBS。混合物用1.5KV、25μF电容脉冲处理。
室温恢复10分钟后，将电穿孔细胞转到含有10％胎牛血清的IMDM培养基(GIBCO BRL)。培养72小时后，收集上清，离心去除细胞碎片并回收。
5.4在COS7细胞培养上清中检测抗体MABL-2的重建单链Fv通过Western印迹方法，确定pCHOM2载体转染的COS7细胞的培养上清中存在抗体MABL-2的单链Fv。
将pCHOM2载体转染的COS7细胞的培养上清，以及作对照的pCHO1转染的COS7细胞培养上清，进行SDS电泳，并转到REINFORCED NC膜上(Schleicher & Schuell)。用5％脱脂牛奶(Morinaga Nyu-gyo)封闭膜，用0.05％ Tween20-PBS洗涤，与抗FLAG抗体(SIGMA)混合。膜在室温下温育、洗涤并混合碱性磷酸酶偶联的小鼠IgG抗体(Zymed)。室温下温育并洗涤后，加入底物液(Kirkegaard Perry Laboratories)显色(图7)。
仅在引入pCHOM2载体的COS7细胞的培养上清中检测到FLAG肽特异性蛋白质，从而证明抗体MABL-2的重建单链Fv分泌到该培养上清中。
5.5流式细胞术利用上述COS7细胞培养上清，通过流式细胞术测定抗原结合。将表达抗体MABL-2的重建单链Fv的COS7细胞培养上清，或者作对照的经pCHO1载体转化的COS7细胞培养上清，加入2×105表达人整合素相关蛋白质(IAP)的小鼠白血病细胞系L1210中，或者加入作对照的pCOS1转化的L1210细胞系中。冰浴并洗涤后，加入小鼠抗FLAG抗体(SIGMA)。然后温育细胞并洗涤。然后加入FITC标记的抗小鼠IgG抗体(BECTON DICKINSON)，再次温育并洗涤细胞。随后用FACScan装置(BECTON DICKINSON)测量荧光强度。
由于抗体MABL-2的单链Fv与表达人IAP的L1210细胞特异性结合，可以确定抗体MABL-2的重建单链Fv对人整合素相关蛋白质(IAP)具有亲和力(参见图8-11)。
5.6竞争性ELISA根据对小鼠单克隆抗体结合抗原的抑制活性，测定抗体MABL-2的重建单链Fv的结合活性。
将抗FLAG抗体调整为1μg/ml，加入96孔板的每孔中，37℃温育2小时。洗涤后，用1％BSA-PBS封闭。室温下温育并洗涤后，将引入了分泌型人IAP抗原基因(SEQ ID No.26)的COS7细胞培养上清，用PBS稀释到两倍体积，加入每孔中。室温下温育并洗涤后，将50μl调整为100ng/ml的生物素化MABL-2抗体与50μl顺序稀释的表达抗体MABL-2的重建单链Fv的COS7细胞培养上清的混合物，加入每孔中。室温下温育并洗涤后，每孔中加入碱性磷酸酶偶联的链亲合素(Zymed)。室温下温育并洗涤后，加入底物液(SIGMA)，测量每孔中反应混合物在405nm处的吸光度。
结果表明，以引入pCHO1的COS7细胞培养上清作对照，相比之下，抗体MABL-2的重建单链Fv(MABL2-scFv)浓度依赖性地显著抑制小鼠抗体MABL-2与人IAP抗原的结合(图12)。因此提示，抗体MABL-2的重建单链Fv中，具有正确结构的来源于小鼠单克隆抗体MABL-2的每个V区。
5.7体外凋亡诱导效应使用人IAP基因转染的L1210细胞、作对照的经pCOS1载体转染的L1210细胞以及CCRF-CEM细胞，通过Annexin-V染色(Boehninger Mannheim)，检测抗体MABL-2的重建单链Fv的凋亡诱导作用。
在1×105上述每种细胞中，按50％终浓度加入表达抗体MABL-2的重建单链Fv的COS7细胞培养上清、或作对照的经pCHO1载体转染的COS7细胞培养上清，混合物培养24小时。然后进行Annexin-V染色，用FACScan装置(BECTON DICKINSON)测定荧光强度。
Annexin-V的染色结果分别如图13-18所示。左下区的点代表活细胞，右下区的点代表凋亡早期细胞，右上区的点代表凋亡晚期细胞。结果表明，抗体MABL-2的重建单链Fv(MABL2-scFv)显著诱导特异性针对人IAP抗原的L1210细胞死亡(图13-16)，与对照相比，重建的单链Fv也显著诱导CCRF-CEM细胞死亡(图17-18)。
5.8纯化CHO细胞产生的源于MABL-2的单链Fv用pCHOM2载体转染CHO细胞，建立恒定表达源于抗体MABL-2的单链Fv(多肽)的CHO细胞系。
使用Gene Dulser装置(BioRad)，通过电穿孔方法将pCHOM2载体转化CHO细胞。小杯中加入DNA(10μg)和0.7ml含CHO细胞(1×107细胞/ml)的PBS的混合物。混合物用1.5KV、25μF电容脉冲处理。室温恢复10分钟后，将电穿孔细胞转到含10％胎牛血清的无核酸α-MEM培养基(GIBCO BRL)中培养。得到的克隆用SDS-PAGE确认目的蛋白质的表达，选择表达水平高的克隆，作为源于抗体MABL-2的单链Fv的生产细胞系。在含有10nM氨甲蝶呤(SIGMA)的无血清培养基CHO-S-SFM II(GIBCO BRL)中培养该细胞系。然后，收集培养上清，离心去除细胞碎片并回收。
5.9纯化CHO细胞产生的源于MABL-2的单链Fv将实施例5.8获得的表达单链Fv的CHO细胞系的培养上清，利用人工透析柱(PAN130SF，ASAHI MEDICALS)浓缩多达20倍。浓缩液-20℃保存，并于纯化时融化。
利用三种层析方法，即Blue-sepharose、羟基磷灰石和凝胶过滤，从CHO细胞培养上清中纯化单链Fv。
(1)Blue-sepharose柱层析用20mM乙酸盐缓冲液(pH6.0)将浓缩的上清稀释10倍，离心去除不溶物(10,000×转/分，30分钟)。用相同缓冲液平衡Blue-sepharose柱(20ml)，将上清上样。用相同缓冲液洗柱后，利用相同缓冲液中的NaCl逐步梯度0.1、0.2、0.3、0.5到高达1.0M，洗脱柱中吸附的蛋白质。用SDS-PAGE分析流过组分和每个洗脱组分。将确认含有单链Fv的组分(0.1-0.3M NaCl洗脱组分)混合在一起，利用Centri Prep-10(AMICON)浓缩高达大约20倍。
(2)羟基磷灰石(1)中获得的浓缩液用10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)稀释10倍，上样羟基磷灰石柱(20ml，BIORAD)。用60ml 10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗柱。然后，用高达200mM的磷酸钠缓冲液的线性梯度，洗脱柱中吸附的蛋白质(参见图19)。用SDS-PAGE分析每个组分，确认在组分A和组分B中存在单链Fv。
(3)凝胶过滤用CentriPrep-10分别浓缩(2)中组分A和B，并上样到用含0.15M NaCl的20mM乙酸盐缓冲液(pH6.0)平衡的TSKgelG3000SWG柱(21.5×600mm)。层析图如图20所示。经SDS-PAGE分析各组分，确认了两个主峰(AI和BI)是目的单链Fv。凝胶过滤分析中，组分A在36KDa表观分子量处洗脱，组分B在76kDa处洗脱。用15％SDS聚丙烯酰胺凝胶分析纯化的单链Fv(AI、BI)。在有或无还原剂存在下处理样品，按照Laemmli’s方法进行电泳。然后用考马斯亮蓝染色蛋白质。如图21所示，无论还原剂存在与否，AI和BI都呈现35kDa表观分子量处的单链。从上所述可以推断，AI是单链Fv的单体，BI是单链Fv非共价结合的二聚体。使用TSKgel G3000SW柱(7.5×60mm)通过凝胶过滤分析组分AI和BI，表明只在组分AI中检测到单体峰，只在组分BI中检测到二聚体峰(图22)。二聚体组分(组分BI)占总单链Fv的百分之四。二聚体组分中超过90％的二聚体可4℃稳定保存超过1个月。
5.10构建在E.coli细胞中表达源于抗体MABL-2的单链Fv的载体利用PCR方法改变pscM2载体，以制备在E.coli细胞中有效表达抗体MABL-2的单链Fv的载体。将得到的DNA片段引入pSCFVT7表达载体。
设计如SEQ ID No.27所示Nde-VHSm02引物，作为PCR正向引物，其可与H链V区N端编码DNA杂交，并包含起始密码子和NdeI限制性酶识别位点。设计如SEQ ID No.28所示VLAS引物，作为PCR反向引物，其可与L链V区C端编码DNA杂交，并包含二个终止密码子和EcoRI限制性酶识别位点。为在E.coli中有效表达，在正向引物Nde-VHSm02中与H链V区N端编码DNA可杂交的部分中包含5个点突变。
将包含10μl 10×PCR缓冲液#1、1mM MgCl2、0.2mM dNTPs、5单位KOD DNA聚合酶(都来自TOYOBO)、1μM每种引物和100ng模板DNA(pscM2)的100μl PCR溶液，依次98℃加热15秒、65℃2秒以及74℃30秒。此温度循环重复25次。
利用QIAquick PCR Purification试剂盒(QIAGEN)纯化PCR产物，用NdeI和EcoRI消化，得到的DNA片段然后克隆到pSCFVT7载体，该载体中已用NdeI和EcoRI消化去除了pel B信号序列。经DNA测序后，将产生的包含带有目的DNA序列的DNA片段的质粒命名为“pscM2DEm02”(参见图23)。质粒pscM2DEm02中包含的源于抗体MABL-2的单链Fv的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID No.29所示。
5.11在E.coli细胞中表达源于抗体MABL-2的单链Fv用pscM2DEm02载体转化E.coliBL21(DE3)pLysS(STRATAGENE)，得到表达源于抗体MABL-2的单链Fv的E.coli菌株。用SDS-PAGE检查得到的克隆中目的蛋白质的表达，选择表达水平高的克隆，作为源于抗体MABL-2的单链Fv的生产菌株。
5.12纯化E.coli中产生的源于抗体MABL-2的单链Fv将转化获得的E.coli单克隆在3ml LB培养基中，28℃培养7小时，然后在70ml LB培养基中28℃培养过夜。
将预培养物转移到7L LB培养基中，300rpm(转/分)搅拌，用Jar发酵罐28℃培养。培养基吸光度达到O.D.＝1.5时，用1mM IPTG诱导细菌，然后培养3小时。
培养基离心(10,000×g，10分钟)回收细菌沉淀物。向细菌中加入含5mM EDTA、0.1M NaCl和1％ Triton X-100的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，超声波破碎细菌(输出量4，工作循环70％，1分钟×10次)。离心破碎细菌的悬浮液(12,000xg，10分钟)，以沉淀包涵体。将分离的包涵体与含5mM EDTA、0.1M NaCl和4％Triton X-100的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)混合，再次超声处理(输出量4，工作循环50％，30秒×2次)，离心(12,000xg，10分钟)分离目的蛋白质沉淀，去除上清中包含的蛋白质。
在含6M脲、5mM EDTA和0.1M NaCl的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中裂解含目的蛋白质的包涵体，上样到Sephacryl S-300凝胶过滤柱(5×90cm，Amersharm Pharmacia)，该柱用含4M脲、5mM EDTA、0.1M NaCl和10mM巯基乙醇的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)平衡，流速为5ml/分钟，以去除结合的高分子量单链Fv。经SDS-PAGE分析得到的组分，用凝胶过滤所用缓冲液将高纯度的蛋白质组分稀释到O.D280＝0.25。然后用含5mM EDTA、0.1M NaCl、0.5MArg、2mM还原型谷胱苷肽以及0.2mM氧化型谷胱苷肽的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，透析该组分3次，以使蛋白质重折叠。进一步用含0.15M NaCl的20mM乙酸盐缓冲液(pH6.0)透析该组分三次，以更换缓冲液。
将透析产物上样到Superdex 200pg凝胶过滤柱(2.6×60cm，Amersharm Pharmacia)，该柱已用含0.15M NaCl的20mM乙酸盐缓冲液(pH6.0)平衡，以去除少量通过分子间S-S键交联的高分子量蛋白质。如图24所示，在宽峰(预期为高分子量聚集物)后洗脱出两个峰，即主峰和副峰。SDS-PAGE分析(参见图21)以及凝胶过滤分析这两个峰的洗脱位置，提示主峰是单链Fv单体，副峰是非共价结合的单链Fv二聚体。非共价结合的二聚体占总单链Fv的4％。
5.13源于抗体MABL-2的单链Fv的体外凋亡诱导活性利用已引入人IAP基因的L1210细胞(hIAP/L1210)，按照两种Annexin-V染色(Boehringer Mannheim)方法，检测CHO细胞和E.coli产生的源于抗体MABL-2的单链Fv(MABL2-scFv)的凋亡诱导作用。
第一种方法中，向5×104个hIAP/L1210细胞中加入样品抗体，终浓度为3μg/ml，培养24小时。分析样品抗体，即实施例5.9中从CHO细胞获得的MABL-2单链Fv的单体和二聚体，实施例5.12中从E.coli获得的MABL-2单链Fv的单体和二聚体，以及作对照的小鼠IgG抗体。培养后进行Annexin-V染色，用FACScan装置(BECTONDICKINSON)测量其荧光强度。
第二种方法中，向5×104个hIAP/L1210细胞中加入样本抗体，终浓度为3μg/ml，培养2小时，并与抗FLAG抗体(SIGMA)混合，终浓度为15μg/ml，再培养22小时。分析样本抗体，它们是实施例5.9中从CHO细胞获得的MABL-2单链Fv的单体，以及作对照的小鼠IgG抗体。培养后进行Annexin-V染色，使用FACScan装置测量其荧光强度。
Annexin-V染色分析的结果如图25-31所示。结果表明，CHO细胞和E.coli中产生的MABL-2单链Fv多肽的二聚体，与对照相比(图25)，可显著诱导细胞死亡(图26，27)，而CHO细胞和E.coli中产生的MABL-2单链Fv多肽的单体，则没有观察到凋亡诱导作用(图28，29)。当一起使用抗FLAG抗体时，与对照相比(图30)，CHO细胞中产生的源于MABL-2抗体的单链Fv多肽的单体显著诱导细胞死亡(图31)。
5.14scFv/CHO多肽的单体和二聚体对人骨髓瘤模型小鼠的抗肿瘤效应(1)定量测量小鼠血清中的人IgG利用以下ELISA方法测量小鼠血清中含有的、由人骨髓瘤细胞产生的人IgG(M蛋白质)。用0.1％碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)将山羊抗人IgG抗体(BIOSOURCE，Lot#7902)稀释到1μg/ml，向96孔板(Nunc)中每孔加入100μl，4℃温育过夜，使抗体固定化。封闭后，向每孔加入100μl逐步稀释的小鼠血清或作为标准的人IgG(CAPPEL，Lot#00915)，室温下温育2小时。洗涤后，加入100μl5000倍稀释的碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体(BIOSOURCE，Lot#6202)，室温下温育1小时。洗涤后加入底物液。温育后，使用MICROPLATE READER Model 3550(BioRad)测量405nm处的吸光度。基于由人IgG标准品的吸光度得到的校准曲线，计算小鼠血清中人IgG的浓度。
(2)制备给药用抗体在给药当天，用无菌过滤的PBS(-)将scFv/CHO多肽的单体和二聚体分别稀释到0.4mg/ml或0.25mg/ml，制备给药用样品。
(3)制备人骨髓瘤的小鼠模型如下制备人骨髓瘤的小鼠模型。将在SCID小鼠(Japan Clare)体内传代的KPMM2细胞(JP-Appl.7-236475)悬浮于含10％胎牛血清(GIBCO-BRL)的RPMI1640培养基中(GIBCO-BRL)，调整为3×107细胞/ml。通过尾静脉将200μl KPMM2细胞悬液(6×106细胞/小鼠)移植给SCID小鼠(雄性，6周龄)，该SCID小鼠已于移植前一天皮下注射脱唾液酸GM1抗体(WAKO JUNYAKU，1瓶溶于5ml)。
(4)抗体给药将(2)中制备的抗体样本，单体(250μl)和二聚体(400μl)通过尾静脉给药于(3)中制备的人骨髓瘤细胞模型小鼠。移植KPMM2细胞3天后开始给药，每天2次，进行3天。作为对照，同样通过尾静脉给药200μl无菌过滤的PBS(-)，一天2次，进行3天。每组包含7只小鼠。
(5)用人骨髓瘤模型小鼠评价scFv/CHO多肽的单体和二聚体的抗肿瘤效应根据小鼠血清中人IgG(M蛋白质)浓度的变化以及小鼠的存活时间，用人骨髓瘤模型小鼠评价scFv/CHO多肽单体和二聚体的抗肿瘤效应。移植KPMM2细胞后24天收集小鼠血清，利用以上(1)中所述ELISA方法测定人IgG浓度的变化。PBS(-)给药组(对照)的血清中人IgG(M蛋白质)的量提高到约8500μg/ml，而scFv/CHO二聚体给药组的人IgG的量明显较低，等于或少于对照组的十分之一。所以，此结果表明scFv/CHO二聚体强烈抑制KPMM2细胞生长(图32)。如图33所示，与PBS(-)给药组相比，在scFv/CHO二聚体给药组观察到的存活时间明显延长。
如上所述可以确认，scFv/CHO二聚体对于人骨髓瘤模型小鼠具有抗肿瘤效应。可以认为scFv/CHO二聚体，即本发明的改变的抗体，其抗肿瘤效应是由于该改变的抗体具有凋亡诱导作用。
5.15血细胞凝集反应实验根据Tokyo Kagaku Dojin出版，日本生物化学会编辑的Zoku-Seikagaku Jikken Koza“Immuno-Biochemical Investigation”，进行血细胞凝集反应测试并确定血细胞凝集反应。
用经肝素处理的注射器取健康供者血液，用PBS(-)洗涤三次，然后用PBS(-)制备终浓度2％的红细胞悬液。测试样本包括，MABL-2抗体，CHO细胞产生的单链Fv多肽的单体和二聚体，E.coli产生的单链Fv多肽的单体和二聚体，以小鼠IgG为对照(ZYMED)。利用购自Falcon的圆底96孔板研究血细胞凝集效应。每孔中加入50μl上述抗体样本，以及50μl 2％红细胞悬液，于孔中混合。37℃温育2小时后，将反应混合物4℃保存过夜，测定其血细胞凝集反应。对照使用每孔50μl PBS(-)，按同样方法进行血细胞凝集反应测试。使用的小鼠IgG和抗体MABL-2的抗体终浓度为0.01、0.1、1.0、10.0或100.0μg/ml。使用的单链Fv终浓度为0.004、0.04、0.4、4.0、40.0或80.0μ/ml，只在E.coli产生的多肽二聚体情况下，另外使用160.0μg/ml。结果如表2所示。对于抗体MABL-2而言，在大于0.1μ/ml浓度下观察到血细胞凝集反应，而单链Fv的单体和二聚体都没有观察到血细胞凝集反应。
表2血细胞凝集反应测试

实施例6包含2个H链V区和2个L链V区的改变的抗体sc(Fv)2，以及具有不同长度接头的抗体MABL-2scFv6.1构建表表达抗体MABL-2sc(Fv)2的质粒利用下述PCR方法改变上述pcHOM2(其中包含源于上述MABL-2的scFv的编码DNA)，将产生的DNA片段插入pcHOM2，以制备改变的抗体[sc(Fv)2](其中包含源于抗体MABL-2的二个H链V区和二个L链V区)的表达质粒。
PCR所用引物包括，EF1引物(SEQ ID NO30)为正向引物，设计为可与EF1α编码DNA杂交，和反向引物(SEQ ID NO19)，设计为可与L链V区C端编码DNA杂交，并包含接头区的编码DNA序列，以及包含SalI限制性酶识别位点的VLLAS引物(SEQ ID NO31)。
100μl PCR溶液包含10μl 10×PCR缓冲液#1、1mM MgCl2、0.2mM dNTPs(dATP，dGTP，dCTP和dTTP)、5单位KOD DNA聚合酶(Toyobo，Inc.)、1μM每种引物以及100ng模板DNA(pCHOM2)。将该PCR溶液依次94℃加热30秒、50℃30秒以及74℃1分钟。此温度循环重复30次。
利用QIAquick PCR Purification试剂盒(QIAGEN)纯化PCR产物，并用SalI消化。将产生的DNA片段克隆到pBluescript KS+载体(Toyobo，Inc.)。DNA测序后，用SalI消化包含目的DNA序列的质粒，用快速DNA Ligation试剂盒(BOEHRINGER MANNHEIM)将得到的DNA片段与经SalI消化的pCHOM2连接。DNA测序后，将包含目的DNA序列的质粒命名为“pCHOM2(Fv)2”(参见图34)。质粒pCHOM2(Fv)2中包含的抗体MABL-2sc(Fv)2区的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID No.32所示。
6.2制备具有不同长度接头的抗体MABL-2scFv的表达质粒利用源于MABL-2的H链和L链编码cDNA作模板，如下所述制备scFv，其中包含不同长度接头以及V区，按[H链]-[L链](下文称“HL”)或[L链]-[H链](下文称“LH”)顺序设计。
利用pCHOM2(Fv)2为模板进行PCR程序，构建HL型scFv。PCR步骤中，使用引物对CFHL-F1(SEQ ID NO33)和CFHL-R2(SEQ IDNO34)，或引物对CFHL-F2(SEQ ID NO35)和CFHL-R1(SEQ IDNO36)，以及KOD聚合酶。进行PCR程序，温度循环为94℃30秒、60℃30秒和72℃1分钟，重复30次，以产生其5’端含有前导序列的H链cDNA，或其3’端含有FLAG序列的L链cDNA。混合所产生的H链和L链cDNA，利用混合物为模板以及KOD聚合酶进行PCR，温度循环为依次94℃30秒、60℃30秒和721分钟，重复5次。向反应混合物中加入CFHL-F1和CFHL-R1引物，然后重复上述温度循环30次，进行PCR反应，以产生没有接头的HL-0型cDNA。
为构建LH型scFv，利用pGEM-M2L和pGEM-M2H为模板，其中分别包含抗体MABL-2的L链V区和H链V区的编码cDNA，进行PCR反应(参见JP-Appl.11-63557)。使用引物对T7(SEQ ID NO37)和CFLH-R2(SEQ ID NO38)，或引物对CFLH-F2(SEQ ID NO39)和CFLH-R1(SEQ ID NO40)，以及KOD聚合酶(Toyobo Inc.)。进行PCR反应，温度循环为顺次94℃30秒、60℃30秒和72℃1分钟，重复30次，以产生5’端包含前导序列的L链cDNA，或其3’端包含FLAG序列的H链cDNA。混合所产生的L链和H链cDNA，以该混合物为模板，使用KOD聚合酶进行PCR，温度循环包含依次94℃30秒、60℃30秒和72℃1分钟，重复5次。反应混合物中加T7和CFLH-R1引物，上述温度循环重复30次进行反应。以反应产物为模板，利用引物对CFLH-F4(SEQ ID NO41)和CFLH-R1进行PCR，温度循环包含依次94℃30秒、60℃30秒和72℃1分钟，重复30次，以产生没有接头的LH-0型cDNA。
产生的LH-0和HL-0型cDNA用EcoRI和BamHI限制性酶(Takara Shuzo)消化，将消化的cDNA用Ligation High(ToyoboInc.)分别引入哺乳动物表达质粒INPEP4中。用每个质粒转化感受态E.coliJM109(Nippon Gene)，利用QIAGEN Plasmid Maxi试剂盒(QUIAGEN)从转化的E.coli中分离目的质粒。从而制备质粒pCF2LH-0和pCF2HL-0。
为构建包含不同大小接头的HL型表达质粒，以pCF2HL-0为模板，使用的正义引物为CFHL-X3(SEQ ID NO42)、CFHL-X4(SEQID NO43)、CFHL-X5(SEQ ID NO44)、CFHL-X6(SEQ ID NO45)或CFHL-X7(SEQ ID NO46)，反义引物为BGH-1(SEQ ID NO47)，其与载体序列互补。使用KOD聚合酶进行PCR反应，温度循环包括依次94℃30秒、60℃30秒以及72℃1分钟，重复30次，用限制性酶XhoI和BamHI(Takara Shuzo)消化反应产物。消化的片段分别用Ligation High(Toyobo Inc.)引入pCF2HL-0的XhoI和BamHI位点之间。用每个质粒转化感受态E.coliJM109，利用Qiagen Plasmid Maxi试剂盒从转化的E.coli中分离目的质粒。从而制备表达质粒pCF2LH-3、pCF2LH-4、pCF2LH-5、pCF2LH-6和pCF2LH-7。
为构建在COS7细胞中瞬时表达的表达质粒，用限制性酶EcoRI和BamHI(Takara Shuzo)消化质粒pCF2HL-0、pCF2HL-3、pCF2HL-4、pCF2HL-5、pCF2HL-6和pCF2HL-7，用琼脂糖凝胶电泳纯化产生的约800bp片段。利用Ligation High(Toyobo Inc.)分别将获得的片段引入表达质粒pCOS1的EcoRI和BamHI位点之间，用于在哺乳动物细胞中表达。每个质粒转化感受态E.coliDH5α(Toyobo Inc.)，使用Qiagen Plasmid Maxi试剂盒从转化的E.coli中分离目的质粒。从而制备表达质粒CF2HL-0/pCOS1、CF2HL-3/pCOS1、CF2HL-4/pCOS1、CF2HL-5/pCOS1、CF2HL-6/pCOS1和CF2HL-7/pCOS1。
作为这些质粒的典型实例，质粒CF2HL-0/pCOS1的构建如图35所示，该质粒中包含的MABL2-scFv<HL-0>的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID No.48所示。这些质粒中接头区的核苷酸序列和氨基酸序列也如图36所示。
为构建包含不同大小接头的LH型表达质粒，使用pCF2LH-0为模板，CFLH-X3(SEQ ID NO49)、CFLH-X4(SEQ ID NO50)、CFLH-X5(SEQ ID NO51)、CFHL-X6(SEQ ID NO52)或CFLH-X7(SEQID NO53)为正义引物，BGH-1为反义引物，其与载体序列互补。使用KOD聚合酶进行PCR反应，温度循环包括依次94℃30秒、60℃30秒以及72℃1分钟，重复30次，用限制性酶XhoI和BamHI消化反应产物。利用Ligation High分别将消化的片段引入pCF2LH-0的XhoI和BamHI位点之间。每个质粒转化感受态E.coliDH5α(Toyobo Inc.)，使用Qiagen Plasmid Maxi试剂盒从转化的E.coli中分离目的质粒。从而制备表达质粒pCF2LH-3、pCF2LH-4、pCF2LH-5、pCF2LH-6和pCF2LH-7。
为构建在COS7细胞中瞬时表达的表达质粒，用限制性酶EcoRI和BamHI(Takara Shuzo)消化质粒pCF2LH-0、pCF2LH-3、pCF2LH-4、pCF2LH-5、pCF2LH-6和pCF2LH-7，用琼脂糖凝胶电泳纯化产生的约800bp片段。利用Ligation High分别将获得的片段引入哺乳动物细胞表达质粒pCOS1的XhoI和BamHI位点之间。用每个质粒转化感受态E.coliDH-5α(Toyobo Inc.)，利用Qiagen Plasmid Maxi试剂盒从转化的E.coli中分离目的质粒。随后制备表达质粒CF2LH-0/pCOS1、CF2LH-3/pCOS1、CF2LH-4/pCOS1、CF2LH-5/pCOS1、CF2LH-6/pCOS1和CF2LH-7/pCOS1。
作为这些质粒的典型实例，质粒CF2LH-0/pCOS1的构建如图37所示，该质粒中包含的MABL2-scFv<LH-0>的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID No.54所示。这些质粒中接头区的核苷酸序列和氨基酸序列也如图38所示。
6.3在COS7细胞中表达scFv和sc(Fv)2(1)用含血清培养基制备培养上清在COS7细胞中(JCRB9127，Japan Health SciencesFoundation)瞬时表达HL型和LH型的scFv和sc(Fv)2。在CO2气体培养箱中，用含10％胎牛血清(HyClone)的DMEM培养基(GIBCOBRL)，37℃传代培养COS7细胞。使用Gene Pulser装置(BioRad)，通过电穿孔将实施例6.2制备的CF2HL-0、3～7/pCOS1或CF2LH-0、3～7/pCOS1，或pCHOM2(Fv)2载体转染COS7细胞。小杯中加入DNA(10μg)以及0.25ml含2×107细胞/ml、10％FBS和5mMBES(SIGMA)的DMEM培养基。维持10分钟后，用0.17kv、950μF电容脉冲处理混合物。室温恢复10分钟后，将电穿孔细胞转入75cm3培养瓶中的DMEM培养基(10％FBS)。培养72小时后，收集培养上清，离心去除细胞碎片。培养上清用0.22μm过滤器(FALCON)过滤，以获得培养上清(下文称“CM”)。
(2)用无血清培养基制备培养上清将按与(1)相同方法转染的细胞转入75cm3培养瓶中的DMEM培养基(10％FBS)，培养过夜。培养后弃去上清，用PBS洗涤细胞，然后加入CHO-S-SFM II培养基(GIBCO BRL)。培养72小时后，收集培养上清，离心去除细胞碎片，用0.22μm过滤器(FALCON)过滤以获得CM。
6.4检测COS7 CM中的scFv和sc(Fv)2用Western印迹方法检测上述实施例6.3(2)中制备的COS7 CM中的各种MABL2-scFv和sc(Fv)2。
SDS-PAGE电泳分析每个COS7的CM，转移到REINFORCED NC膜(Schleicher & Schuell)。用5％脱脂牛奶(Morinaga Nyu-gyo)封闭膜，TBS洗涤。然后向其中加入抗FLAG抗体(SIGMA)。膜在室温下温育并洗涤。加入过氧化物酶标记的小鼠IgG抗体(JachsonImmuno Research)。室温下温育并洗涤后，加入底物液(Kirkegaard Perry Laboratories)显色(图39)。
6.5流式细胞术使用实施例6.3(1)制备的COS7细胞培养上清，进行流式细胞术分析，以测定MABL2-scFv和sc(Fv)2与人整合素相关蛋白质(IAP)抗原的结合。将待测培养上清或作对照的COS7细胞培养上清，加入2×105个表达人IAP的小鼠白血病细胞系L1210。冰浴并洗涤后，加入10μg/ml小鼠抗FALG抗体(SIGMA)，然后温育并洗涤细胞。然后其中加入FITC标记的抗小鼠IgG抗体(BECTON DICKINSON)，再次温育并洗涤细胞。利用FACScan装置(BECTON DICKINSON)测定荧光强度。流式细胞术结果显示，在COS7培养上清中，具有不同长度接头的MABL2-scFv和sc(Fv)2对人IAP具有高亲合力(参见图40a和40b)。
6.6体外凋亡诱导效应通过Annexin-V染色(Boehringer Mannheim)，利用转染人IAP基因的L1210细胞(hIAP/L1210)，检测实施例6.3(1)制备的COS7培养上清的凋亡诱导作用。
向5×104个hIAP/L1210细胞中加入用每个载体转染的COS7细胞培养上清，或作对照的COS7细胞培养上清，终浓度为10％，混合物培养24小时。然后进行Annexin-V/PI染色，利用FACScan装置(BEKTON DICHINSON)测定荧光强度。结果表明，COS7CM中的scFv<HL3、4、6、7，LH3、4、6、7>以及sc(Fv)2显著诱导hIAP/L1210细胞的死亡。这些结果如图41所示。
6.7构建用于CHO细胞中表达scFv和sc(Fv)2的载体为从培养上清中分离、纯化MABL2-scFv和sc(Fv)2，如下构建用于CHO细胞中表达的载体。
使用Ligation High，将实施例6.2制备的pCF2HL-0、3～7以及pCF2LH-0、3～7的EcoRI-BamHI片段，引入CHO细胞表达载体pCHO1的EcoRI和BamHI位点之间。用其转化感受态E.coliDH5α。使用QIAGEN Plasmind Midi试剂盒(QIAGEN)从转化的E.coli中分离质粒，制备表达质粒pCHOM2HL-0、3～7以及pCHOM2LH-0、3～7。
6.8制备表达MABL2-scFv<HL-0、3～7>、MABL2-scFv<LH-0、3～7>以及sc(Fv)2的CHO细胞，并制备其培养上清用实施例6.7构建的每个表达质粒pCHOM2HL-0、3～7和pCHOM2LH-0、3～7，以及pCHOM2(Fv)2载体，转化CHO细胞，以制备恒定表达每种改变的抗体的CHO细胞。作为其典型实例，恒定表达MABL2-scFv<HL-5>或sc(Fv)2的CHO细胞的制备如下所示。
通过限制性酶PvuI消化，线性化表达质粒pCHOM2HL-5和pCHOM2(Fv)2，使用Gene Pulser装置(BioRad)通过电穿孔转染CHO细胞。向小杯中加DNA(10μg)和0.75ml 1×107细胞/ml的PBS，用1.5KV、25μF电容脉冲处理。室温恢复10分钟后，将电穿孔细胞转到含10％胎牛血清的包含核酸的α-MEM培养基中(GIBCOBRL)培养。培养过夜后，弃去上清。用PBS洗涤细胞，加入含10％胎牛血清的无核酸α-MEM培养基(GIBCO BRL)。培养两周后，将细胞在含10nM(终浓度)氨甲蝶呤(SIGMA)的培养基中培养，然后是50nM和100nM的氨甲蝶呤。得到的细胞在CHO-S-SFM II无血清培养基(GIBCO BRL)中转瓶培养。收集培养上清，离心去除细胞碎片，用0.22μm孔径滤膜过滤，分别获得CM。
如上所述，获得了恒定表达MABL2-scFv<HL-0、-3、-4、-6、-7>和<LH-0、-3、-4、-5、-6、-7>的CHO细胞及其CM。
6.9纯化MABL2-scFv<HL-5>二聚体和sc(Fv)2利用下述两种纯化方法，从实施例6.8制备的CM中纯化MABL2-scFv<HL-5>以及sc(Fv)2。
<纯化方法1>
利用位于多肽C端的FLAG序列，通过抗FLAG抗体亲和柱层析以及凝胶过滤纯化HL-5和sc(Fv)2。用抗FLAG M2亲和凝胶(SIGMA)制备柱子(7.9ml)，用含150mM NaCl的50mM Tris-HCl缓冲液(TBS，pH7.5)平衡，将在6.8中得到的1升CM上样。用TBS洗柱后，通过0.1M甘氨酸-HCl缓冲液(pH3.5)洗脱scFv。利用SDS-PAGE分析所得到的组分，确认洗脱了scFv。将scFv组分与终浓度可高达0.01％的Tween 20混合，并用Centricon-10(MILIPORE)浓缩。TSKgel G3000SWG柱(7.5×600mm)用含150mM NaCl和0.01％Tween 20的20mM乙酸盐缓冲液(pH6.0)平衡后，将浓缩液上样。流速为0.4ml/分，通过280nm的吸光度检测scFv。在二聚体处洗脱的主要组分为HL-5，单体处洗脱sc(Fv)2。
<纯化方法2>
使用离子交换层析、羟基磷灰石和凝胶过滤，三步纯化HL-5和sc(Fv)2。在离子交换层析中，纯化HL-5使用Q Sepharose FastFlow柱(Pharmacia)，纯化sc(Fv)2使用SP-sepharose Fast Flow柱。在第二步之中及之后，用相同程序处理HL-5和sc(Fv)2。
HL-5的第一步HL-5的CM用含0.02％ Tween 20的20mM Tris-HCl缓冲液(pH9.0)稀释2倍，然后用1M Tris调pH到9.0。用含0.02％Tween 20的20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)平衡Q-sepharosefast flow柱后，将溶液上样。通过含0.1～0.55M NaCl线性梯度的相同缓冲液，洗脱柱上结合的多肽。经SDS-PAGE监测洗脱组分，收集含HL-5的组分，上样到第二步的羟基磷灰石上。
sc(Fv)2的第一步sc(Fv)2的CM用含0.02％ Tween 20的20mM乙酸盐缓冲液(pH5.5)稀释2倍，用1M乙酸调pH到5.5。用含0.02％ Tween 20的20mM乙酸盐缓冲液(pH5.5)平衡SP-sepharose fast flow柱后，将溶液上样。通过含0～0.5M NaCl线性梯度的缓冲液洗脱柱上结合的多肽。经SDS-PAGE监测洗脱组分，收集包含sc(Fv)2的组分，上样到第二步的羟基磷灰石上。
第二步HL-5和sc(Fv)2的羟基磷灰石层析羟基磷灰石柱(I型，BIORAD)用含0.02％ Tween 20的10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)平衡后，分别上样第一步获得的HL-5和sc(Fv)2组分。用相同缓冲液洗柱后，利用高达0.5M线性梯度的磷酸盐缓冲液，洗脱柱上结合的多肽。经SDS-PAGE监测洗脱的组分，收集包含目的多肽的组分。
第三步HL-5和sc(Fv)2的凝胶过滤用CentriPrep-10(MILIPORE)分别浓缩第二步获得的每一组分，并上样到用含0.02％ Tween 20和0.15M NaCl的20mM乙酸盐缓冲液(pH6.0)平衡的Superdex 200柱(2.6×60cm，Pharmacia)。在二聚体处洗脱到HL-5，sc(Fv)HL-5和sc(Fv)2分别在单体处作为主要峰被洗脱。
两种纯化方法均难以检测HL-5单体，证实当单链Fv的接头包含大约5个氨基酸时，高产量地形成单链Fv二聚体。此外，HL-5的二聚体和sc(Fv)2能够在纯化后4℃稳定保存一个月。
6.10评价纯化的scFv<HL-5>二聚体和sc(Fv)2与抗原的结合活性利用纯化的MABL2-scFv<HL-5>二聚体和纯化的sc(Fv)2进行流式细胞术分析，以评价其与人整合素相关蛋白质(IAP)抗原的结合。将10μg/ml纯化的MABL2-scFv<HL-5>二聚体、纯化的sc(Fv)2、阳性对照抗体MABL-2或阴性对照小鼠IgG(Zymed)，加入2×105个表达人IAP的小鼠白血病L1210细胞系(hIAP/L1210)，或经pCOS1转化的L1210细胞系(pCOS1/L1210)作对照。冰浴并洗涤后，加入10μg/ml小鼠抗FLAG抗体(SIGMA)，然后温育并洗涤细胞。向其中加入FITC标记的抗小鼠IgG抗体(BECTION DICKINSON)，再次温育并洗涤细胞。然后利用FACScan装置(BECTON DICKINSON)测定荧光强度。
由于纯化的MABL2-scFv<HL-5>二聚体和纯化的sc(Fv)2特异性结合hIAP/L1210细胞，可以证实scFv<HL-5>二聚体和sc(Fv)2对人IAP高亲和力(参见图42)。
6.11纯化的scFv<HL-5>二聚体和sc(Fv)2在体外的凋亡诱导活性使用引入人IAP基因的L1210细胞(hIAP/L1210)以及人白血病细胞系CCRF-CEM细胞，通过Annexin-V染色(BoehringerMannheim)，检测纯化的MABL2-scFv<HL-5>二聚体和纯化的sc(Fv)2的凋亡诱导作用。
将不同浓度的纯化的MABL2-scF<HL-5>二聚体、纯化的MABL2-sc(Fv)2、阳性对照抗体MABL-2或阴性对照小鼠IgG，加入5×104个hIAP/L1210细胞或1×105个CCRF-CEM细胞中。培养24小时后进行Annexin-V染色，使用FACScan装置(BECTON DICKLNSON)测定其荧光强度。结果，MABL2-scFv<HL-5>二聚体和MABL2-sc(Fv)2以浓度依赖方式显著诱导hIAP/L1210和CCRF-CEM细胞死亡(参见图43)。结果表明，MABL2-scFv<HL-5>二聚体和MABL2-sc(Fv)2的凋亡诱导效力高于原始抗体MABL-2。
6.12纯化的scFv<HL-5>二聚体和sc(Fv)2的血细胞凝集反应测试按照实施例5.15方法，使用不同浓度的纯化的scFv<HL-5>二聚体和纯化的sc(Fv)2，进行血细胞凝集反应测试。
用抗体MABL-2作为阳性对照，观察到血细胞凝集反应，而对单链抗体MABL2-sc(Fv)2和MABL2-scFv<HL-5>均未观察到血细胞凝集反应。此外，抗体MABL-2使用两种缓冲液进行血细胞凝集反应，没有实质差别。这些结果如表3所示。
6.13纯化的scFv<HL-5>二聚体和sc(Fv)2对人骨髓瘤模型小鼠的抗肿瘤效应测试实施例6.8和6.9制备和纯化的scFv<HL-5>二聚体和sc(Fv)2的抗肿瘤效应。利用实施例5.1产生的人骨髓瘤小鼠模型，ELISA测定小鼠血清中人骨髓瘤细胞产生的M蛋白质的量，并检测小鼠的存活时间，进行测试。然后根据小鼠血清中M蛋白质的数量变化以及小鼠的存活时间，评价scFv<HL-5>二聚体和sc(Fv)2的抗肿瘤效应。
测试中使用0.01、0.1或1mg/ml的HL-5和sc(Fv)2，它们溶于包含150mM NaCl、0.02％ Tween和20mM乙酸盐缓冲液(pH6.0)的载体中，按0.1、1或10mg/kg剂量对小鼠给药。对照组小鼠只给予载体。
移植人骨髓瘤细胞26天后，收集小鼠血清，按实施例5.14方法，利用ELISA测定血清中M蛋白质的数量。结果，给予HL-5二聚体和sc(Fv)2的两组小鼠的血清M蛋白质数量，均以剂量依赖性方式下降(参见图44)。此外，与给予载体的对照组相比，观察到给予HL-5(图45)和sc(Fv)2(图46)的两组，其存活时间均显著延长。这些结果表明，本发明的HL-5和sc(Fv)2具有极好的体内抗肿瘤效应。
实施例7包含抗人MPL的人抗体12B5的H链V区和L链V区的单链Fv如下构建抗人MPL的人单克隆抗体12B5的V区编码DNA7.1构建编码12B5H链V区的基因通过其基因的核苷酸序列(SEQ ID NO55)在5’端连接来源于人抗体基因的前导序列(SEQ ID NO56)(Eur.J.Immunol.1996；2663-69)，设计结合人MPL的人抗体12B5的H链V区的编码基因。设计的核苷酸序列分为各具有15bp重叠序列的四个寡核苷酸(12B5VH-1、12B5VH-2、12B5VH-3、12B5VH-4)。分别地，12B5VH-1(SEQ ID NO57)和12B5VH-3(SEQ ID NO59)为正义方向合成，12B5VH-2(SEQ ID NO58)和12B5VH-4(SEQ ID NO60)为反义方向合成。根据各自的互补性组装每个合成的寡核苷酸以后，加入外部引物(12B5VH-S和12B5VH-A)，扩增全长基因。分别地，12B5VH-S(SEQ ID NO61)设计为通过正向引物与前导序列的5’端杂交，并具有Hind III限制性酶识别位点和Kozak序列，而12B5VH-A(SEQ ID NO62)设计为通过反向引物与编码H链V区C端的核苷酸序列杂交，并具有剪接供体序列和BamHI限制性酶识别位点。
100μl PCR溶液包含10μl 10×PCR Gold Buffer II、1.5mMMgCl2、0.08mM dNTPs(dATP，dGTP，dCTP和dTTP)、5单位DNA聚合酶AmpliTaq Gold(均来自PERKIN ELMER)、2.5pmol每种合成的寡核苷酸(12B5VH-1至-4)，起始温度94℃加热9分钟，在94℃2分钟、55℃2分钟以及72℃2分钟。此循环重复2次后，加入各100pmol外部引物12B5VH-S和12B5VH-A。该混合物进行包含94℃30秒、55℃30秒以及72℃1分钟的循环35次，并72℃再加热5分钟。
利用1.5％低熔点温度琼脂糖凝胶(Sigma)纯化PCR产物，利用限制性酶BamHI和Hind III消化，并克隆到人H链表达载体HEF-gγ1。DNA测序后，将包含正确DNA序列的质粒命名为HEF-12B5H-gγ1。
HEF-12B5H-gγ1用限制性酶EcoRI和BamHI消化，产生编码12B5VH的基因，然后克隆到人Fab H链表达载体pCOS-Fd，产生pFd-12B5H。利用PCR扩增包含内含子区与人H链部分恒定区的编码基因的DNA(SEQ ID NO63)，该内含子区位于人抗体H链V区和恒定区的编码基因之间，将该PCR产物插入动物细胞表达载体pCOS1，构建人Fab H链表达载体。以HEF-gγ1为模板，正向引物G1CH1-S(SEQ ID NO64)(设计为与内含子1的5’端序列杂交，并具有限制性酶识别位点EcoRI和BamHI)，反向引物G1CH1-A(SEQ ID NO65)(设计为与人H链恒定区CH1结构域的3’端DNA杂交，并具有编码一部分铰链区的序列、2个终止密码子以及限制性酶识别位点BglII)，于上述相同条件下扩增人H链恒定区基因。
质粒HEF-12B5H-gγ1和pFd-12B5H中包含的重建的12B5H链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO66所示。
7.2构建编码12B5L链V区的基因通过基因的核苷酸序列(SEQ ID NO67)在5’端与来源于人抗体基因3D6(Nuc.Acid Res.199018；4927)的前导序列(SEQID NO68)连接，设计结合人MPL的人抗体12B5的L链V区的编码基因。按上述相同方法，设计的核苷酸序列分为各具有15bp重叠序列的四个寡核苷酸(12B5VL-1、12B5VL-2、12B5VL-3、12B5VL-4)，分别进行合成。分别地，12B5VL-1(SEQ ID NO69)和12B5VL-3(SEQ ID NO71)具有正义序列，12B5VL-2(SEQ ID NO70)和12B5VL-4(SEQ ID NO72)具有反义序列。按照各自的互补性组装每个合成的寡核苷酸以后，与外部引物(12B5VL-S和12B5VL-A)混合，扩增全长基因。12B5VL-S(SEQ ID NO73)设计为通过正向引物与前导序列的5’端杂交，并具有Hind III限制性酶识别位点和Kozak序列。12B5VL-A(SEQ ID NO74)设计为通过反向引物与编码L链V区C端的核苷酸序列杂交，并具有剪接供体序列和BamHI限制性酶识别位点。
如上所述进行PCR，利用1.5％低熔点温度琼脂糖凝胶(Sigma)纯化PCR产物，利用限制性酶BamHI和Hind III消化，并克隆到人L链表达载体HEF-gκ。DNA测序后，将包含正确DNA序列的质粒命名为HEF-12B5L-gκ。质粒HEF-12B5L-gκ中包含的重建的12B5 L链V区的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO75所示。
7.3制备重建的12B5单链Fv(scFv)重建的12B5抗体单链Fv设计为12B5VH-接头-12B5VL顺序，并且C端具有FLAG序列(SEQ ID NO76)，以便于检测和纯化。利用由(Gly4Ser)3所代表的15个氨基酸组成的接头序列，构建该重建的12B5单链Fv(sc12B5)。
(1)利用由15个氨基酸组成的接头序列制备重建的12B5单链Fv利用PCR分别扩增12B5的H链V区、接头区和12B5L链V区并连接，制备包含由15个氨基酸组成的接头序列的重建的12B5抗体单链Fv的编码基因。该方法图解示于图47。利用六种引物(A-F)制备重建的12B5单链Fv。引物A、C和E具有正义序列，引物B、D和F具有反义序列。
H链V区的正向引物12B5-S(引物A，SEQ ID No.77)设计为可与H链前导序列的5’端杂交，并具有EcoRI限制性酶识别位点。H链V区的反向引物HuVHJ3(引物B，SEQ ID No.78)设计为可与H链V区的C端的编码DNA杂交。
接头的正向引物RHuJH3(引物C，SEQ ID No.79)设计为与接头N端的编码DNA杂交，并与H链V区C端的编码DNA重叠。接头的反向引物RHuVK1(引物D，SEQ ID No.80)设计为可与接头C端的编码DNA杂交，并与L链V区N端的编码DNA重叠。
L链V区的正向引物HuVK1.2(引物E，SEQ ID No.81)设计为与L链V区N端的编码DNA杂交。L链V区的反向引物12B5F-A(引物F，SEQID No.82)设计为可与L链V区C端的编码DNA杂交，并具有FLAG肽编码序列(Hopp T.P.等人，Bio/Technology，6，1204-1210，1988)、两个转录终止密码子以及NotI限制性酶识别位点。
在第一个PCR步骤中，进行A-B、C-D、E-F三个反应，将第一步PCR获得的三种PCR产物按照各自互补性进行组装。加入引物A和F以后，扩增具有由15个氨基酸组成的接头的、重建的12B5单链Fv的全长编码DNA(第二步PCR)。第一步PCR中分别以编码重建的12B5H链V区的质粒HEF-12B5H-gγ1(参见实施例7.1)、包含接头区编码DNA(SEQ ID NO83)的质粒pSCFVT7-hM21(人源化的ONS-M21抗体)(Ohtomo等人，Anticancer Res.18(1998)，4311-4316)(该接头区由Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly SerGly Gly Gly Gly Ser组成)(Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，5879-5883，1988)、以及编码重建的12B5L链V区的质粒HEF-12B5L-gκ(参见实施例7.2)作模板。
第一步PCR反应的50μl溶液包含5μl 10×PCR Gold BufferII、1.5mM MgCl2、0.08mM dNTPs、5单位DNA聚合酶AmpliTaq Gold(均来自PERKIN ELMER)、100pmol每种引物和100ng每种模板DNA。PCR溶液在起始温度94℃加热9分钟，在94℃30秒、55℃30秒以及72℃1分钟。此温度循环重复35次以后，72℃再加热反应混合物5分钟。
利用第二步PCR组装PCR产物A-B、C-D和E-F。第二步PCR混合物溶液98μl，包含1μl第一步PCR产物A-B、0.5μl PCR产物C-D和1μl PCR产物E-F为模板、10μl 10×PCR Gold Buffer II、1.5mMMgCl2、0.08mM dNTPs、5单位DNA聚合酶AmpliTaq Gold(均来自PERKIN ELMER)，在起始温度94℃加热9分钟，在94℃2分钟、65℃2分钟以及72℃2分钟。此循环重复2次以后，加入每种引物A和F各100pmol。重复由94℃30秒、55℃30秒、72℃1分钟组成的循环35次以后，反应混合物在72℃加热5分钟。
利用1.5％低熔点温度琼脂糖凝胶纯化第二步PCR制备的DNA片段，用EcoRI和NotI消化，克隆到pCHO1载体和pCOS1载体(日本专利申请号8-255196)。表达载体pCHO1是利用EcoRI和SmaI消化DHFR-ΔE-rvH-PM1-f(参见WO92/19759)，去除抗体基因，并连上EcoRI-NotI-BamHI接头(TAKARA SHUZO)而构建的。DNA测序后，将包含重建的12B5单链Fv正确氨基酸序列的编码DNA片段的质粒命名为pCHO-sc12B5和pCOS-sc12B5。质粒pCHO-sc12B5和pCOS-sc12B5中包含的重建的12B5单链Fv的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ TD NO84所示。
7.4利用动物细胞表达抗体12B5(IgG、Fab)和单链Fv多肽利用COS-7细胞或CHO细胞表达抗体12B5(IgG、Fab)和来源于抗体12B5的单链Fv。
如下利用COS7细胞进行瞬时表达。使用Gene Pulser装置(BioRad)，通过电穿孔方法进行转染。在悬浮于0.8ml PBS的COS-7细胞中(1×107细胞/ml)，为表达抗体12B5(IgG)而加入上述表达载体HEF-12B5H-gγ1和HEF-12B5L-gκ各10μg，为表达12B5 Fab片段而加入pFd-12B5H和HEF-12B5L-gκ各10μg，为表达单链Fv而加入10μg pCOS-sc12B5。利用1.5KV、25μFD电容脉冲处理小杯中的混合物。室温恢复10分钟后，将电穿孔细胞加到含有10％胎牛血清的DMEM培养基中(GIBCO BRL)培养。培养过夜后，用PBS洗涤细胞一次，加到无血清培养基CHO-S-SFM II中培养2天。培养基离心去除细胞碎片，用0.22μm滤膜过滤，制备培养上清。
为建立稳定表达来源于抗体12B5的单链Fv(多肽)的CHO细胞系，如下将表达载体pCHO-sc12B5引入CHO细胞。
使用Gene Pulser装置(BioRad)，通过电穿孔方法将该表达载体引入CHO细胞。利用限制性酶PvuI消化，获得线性化DNA(100μg)，与悬浮于0.8ml PBS的CHO细胞(1×107细胞/ml)在小杯中混合，冰上静置10分钟，利用1.5KV、25μFD电容脉冲处理。室温恢复10分钟后，将电穿孔细胞加到含有10％胎牛血清的CHO-S-SFMII(GIBCO BRL)中培养。培养2天后，在含有5nM氨甲蝶呤(SIGMA)和10％胎牛血清的CHO-S-SFM II(GIBCO BRL)中继续培养。从这样获得的克隆中选择高表达率克隆，作为12B5单链Fv的生产细胞系。在含有5nM氨甲蝶呤(SIGMA)的无血清培养基CHO-S-SFM II(GIBCO BRL)中培养以后，离心分离细胞碎片，获得培养上清。
7.5纯化CHO细胞产生的来源于12B5的单链Fv将7.4中获得的表达12B5单链Fv的CHO细胞系的培养上清，利用抗FLAG抗体柱和凝胶过滤柱纯化。
(1)抗FLAG抗体柱将培养上清加入PBS平衡的抗FLAG M2亲和凝胶(Sigma)。利用相同缓冲液洗柱以后，通过0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH3.5)洗脱柱上吸附的蛋白质。洗脱组分立即加入1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)进行中和。用SDS-PAGE分析洗脱组分，利用Centricon-10(MILLIPORE)浓缩经确认含有单链Fv的组分。
(2)凝胶过滤(1)中获得的浓缩溶液加入由含0.01％ Tween20的PBS平衡的Superdex200柱(10×300mm，AMERSHAM PHARMACIA)。
产物sc12B5在2个峰中洗脱(A、B)(参见图48)。利用14％-SDS-聚丙烯酰胺凝胶分析组分A和B。按照Laemmli方法，在有或无还原剂存在下将样品进行电泳，电泳后用考马斯亮蓝染色。如图49所示，无论还原剂存在与否，组分A和B都产生表现分子量大约31kD的单一条带。利用Superdex200 PC 3.2/3.0(3.2×300mm，AMERSHAM PHARMACIA)通过凝胶过滤分析组分A和B，组分A产生表观分子量大约44kD的洗脱产物，而组分B产生22kD的产物(参见图50a和b)。此结果表明，组分A是sc12B5单链Fv的非共价键二聚体，组分B是单体。
7.6测量各种单链Fv的TPO样激动剂活性通过测定对表达人TPO受体(MPL)的Ba/F3细胞(BaF/mpl)的增殖活性，评价抗MPL单链抗体的TPO样活性。利用含有10％胎牛血清(GIBCO)的RPMI1640培养基(GIBCO)洗涤BaF/Mpl细胞两次后，将细胞按5×105细胞/ml的细胞密度悬浮于培养基中。分别用培养基稀释抗MPL单链抗体和人TPO(R&D Systems)。将50μl细胞悬液和50μl稀释的抗体或人TPO加入96孔微孔板中(平底)(Falcon)，CO2保温箱中(CO2浓度5％)培养24小时。温育以后，加入10μl WST-8试剂(用于测定原始细胞SF的数目Nacalai Tesque)，立即利用荧光吸收光度计SPECTRA Fluor(TECAN)测量吸光度，测量波长450nm，参比波长620nm。在CO2保温箱中(CO2浓度5％)温育2小时以后，利用SPECTRA Fluor再次测量吸光度，测量波长450nm，参比波长620nm。由于WST-8试剂根据活细胞数目在波长450nm处产生显色反应，通过如下计算的ED50，基于2小时后吸光度的变化，评价BaF/Mpl的增殖活性。在增殖反应曲线中，以吸光度为纵坐标、抗体浓度为横坐标画图，平台期的吸光度设为100％反应率。基于接近50％反应率所画数值，利用直线拟合方法(straight line approximation)获得拟合公式，计算50％反应率的抗体浓度，采用为ED50。
利用表达各种12B5抗体分子的COS-7细胞培养上清，测定对MPL的激动剂活性，如图51所示结果表明，具有双价抗原结合位点的12B5IgG，其吸光度以浓度依赖性方式提高，并具有TPO样激动剂活性(ED50；29nM)，而具有单价抗原结合位点的12B5Fab的激动剂活性非常弱(ED50；34,724nM)。相反，如Fab具有单价抗原结合位点的单链Fv(sc12B5)，显示强激动剂活性，ED50水平为75nM。然而，已知单链Fv H链和L链的可变区通过非共价键结合，因此在溶液中各个可变区分离，可与其它分子的可变区结合，形成多聚体，如二聚体。测定凝胶过滤纯化的sc12B5的分子量时，证实存在识别为单体和二聚体的分子(参见图48)。然后分离sc12B5单体和sc12B5二聚体(参见图50)，测定其对MPL的激动剂活性。如图51和52所示，sc12B5单体的ED50为4438.7nM，证实与利用COS-7细胞培养上清的结果相比，其激动剂活性下降。相反，具有双价抗原结合位点的单链Fv(sc12B5二聚体)，显示的激动剂活性比单价sc12B5高出大约400倍(ED50；10.1nM)。此外，双价单链Fv显示的激动剂活性等于或高于人TPO和12B5IgG的激动剂活性。
实施例8构建抗人MPL的人抗体12E10的可变区编码基因如下构建抗人MPL的人单克隆抗体12E10的可变区编码DNA8.1构建12E10 H链V区的编码基因SEQ ID NO86的核苷酸序列是以WO99/10494所述的氨基酸序列(SEQ ID NO85)为基础设计的结合人MPL的人抗体12E10的H链V区的编码基因。通过其5’端连接来源于人抗体基因(GeneBank登录号AF062252)的前导序列(SEQ ID NO87)，设计全长核苷酸序列。设计的核苷酸序列分为各具有15bp重叠序列的四个寡核苷酸(12E10VH1、12E10VH2、12E10VH3、12E10VH4)。分别地，12E10VH1(SEQ ID NO88)和12E10VH3(SEQ ID NO90)为正义方向合成，12E10VH2(SEQ ID NO89)和12E10VH4(SEQ ID NO91)为反义方向合成。根据各自的互补性组装每个合成的寡核苷酸以后，加入外部引物(12E10VHS和12E10VHA)，扩增全长基因。分别地，12E10VHS(SEQ ID NO92)设计为通过正向引物与前导序列的5’端杂交，并具有Hind III限制性酶识别位点和Kozak序列，而12E10VHA(SEQ ID NO93)设计为通过反向引物与编码H链V区C端的核苷酸序列杂交，并具有剪接供体序列和BamHI限制性酶识别位点。
100μl PCR溶液包含10μl 10×PCR Gold Buffer II、1.5mMMgCl2、0.08mM dNTPs(dATP，dGTP，dCTP和dTTP)、5单位DNA聚合酶AmpliTaq Gold(均来自PERKIN ELMER)、2.5pmol每种合成的寡核苷酸(12E10VH-1至-4)，起始温度94℃加热9分钟，在94℃2分钟、55℃2分钟以及72℃2分钟。此循环重复2次后，加入各100pmol外部引物12E10VHS和12E10VHA。该混合物进行由94℃30秒、55℃30秒以及72℃1分钟组成的循环35次，并在72℃再加热5分钟。
利用1.5％低熔点温度琼脂糖凝胶(Sigma)纯化PCR产物，利用限制性酶BamHI和Hind III消化，并克隆到人H链表达载体HEF-gγ1。DNA测序后，将包含正确DNA序列的质粒命名为HEF-12E10H-gγ1。
HEF-12E10H-gγ1用限制性酶EcoRI和BamHI消化，产生12E10VH的编码基因，然后克隆到人Fab H链表达载体pCOS-Fd，产生pFd-12E10H。利用PCR扩增包含内含子区与人H链一部分恒定区的编码基因的DNA(SEQ ID NO63)，该内含子区位于人抗体H链V区和恒定区的编码基因之间，该PCR产物插入动物细胞表达载体pCOS1，构建人Fab H链表达载体。以HEF-gγ1为模板，正向引物G1CH1-S(SEQ IDNO64)(设计为与内含子1的5’端序列杂交，并具有限制性酶识别位点EcoRI和BamHI)，反向引物G1CH1-A(SEQ ID NO65)(设计为与人H链恒定区CH1结构域的3’端DNA杂交，并具有编码一部分铰链区的序列、2个终止密码子以及限制性酶识别位点Bgl II)，于上述相同条件下扩增人H链恒定区基因。
质粒HEF-12E10H-gγ1和pFd-12E10H中包含的重建的12E10H链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO94所示。
8.2构建编码12E10 L链V区的基因SEQ ID NO96的核苷酸序列是以WO99/10494所述的氨基酸序列(SEQ ID NO95)为基础设计的结合人MPL的人抗体12E10的L链V区的编码基因。通过其5’端连接来源于人抗体基因(Mol.Immunol.1992；291515-1518)的前导序列(SEQ ID NO97)，进一步进行设计。按上述相同方法，设计的核苷酸序列分为各具有15bp重叠序列的四个寡核苷酸(12E10VL1、12E10VL2、12E10VL3、12E10VL4)，分别进行合成。分别地，12E10VL1(SEQ ID NO90)和12E10VL3(SEQ ID NO100)具有正义序列，12E10VL2(SEQ ID NO99)和12E10VL4(SEQ ID NO101)具有反义序列。按照各自的互补性组装每个合成的寡核苷酸以后，与外部引物(12E10VLS和12E10VLA)混合，扩增全长基因。12E10VLS(SEQ ID NO102)设计为通过正向引物与前导序列的5’端杂交，并具有EcoR I限制性酶识别位点和Kozak序列。12E10VLA(SEQ ID NO103)设计为通过反向引物与编码L链V区C端的核苷酸序列杂交，并具有BlnI限制性酶识别位点。
如上所述进行PCR，利用1.5％低熔点温度琼脂糖凝胶(Sigma)纯化PCR产物，利用限制性酶EcoR I和BlnI消化，并克隆到包含人λ链恒定区基因的pUC19中。DNA测序后，将包含正确DNA序列的质粒用EcoR I消化，产生编码12E10 L链V区和人λ链恒定区的基因，然后插入表达载体pCOS1。具有12E10 L链基因(SEQ ID NO104)的质粒命名为DCOS-12E10L。
8.3制备重建的12E10单链Fv重建的12E10抗体单链Fv设计为12E10VH-接头-12E10VL顺序，并且C端具有FLAG序列(SEQ ID NO105)以便于检测和纯化。利用由(Gly4Ser)3所代表的15个氨基酸、或(Gly4Ser)1所代表的5个氨基酸组成的接头序列，构建该重建的12E10链Fv(sc12E10和db12E10)。
(1)利用由5个氨基酸组成的接头序列制备重建的12E10单链Fv将(Gly4Ser)1接头的核苷酸序列引入12E10H链V区编码基因的3’端以及12E10 L链V区编码基因的5’端，利用PCR扩增这样获得的各个基因，并连接所扩增的基因，构建包含由5个氨基酸组成的接头序列的重建的12E10单链Fv的编码基因。利用四种PCR引物(A-D)制备重建的12E10单链Fv。引物A和C具有正义序列，引物B和D具有反义序列。
H链V区的正向引物为12E10S(引物A，SEQ ID NO106)。H链V区的反向引物DB2(引物B，SEQ ID NO107)设计为与H链V区C端的编码DNA杂交，并具有(Gly4Ser)1接头的编码核苷酸序列以及L链V区N端的编码核苷酸序列。
L链V区的正向引物DB1(引物C，SEQ ID NO108)设计为与L链V区N端的编码DNA杂交，并具有(Gly4Ser)3接头的编码核苷酸序列以及H链V区C端的编码核苷酸序列。L链V区的反向引物12E10FA(引物D，SEQ ID NO109)设计为可与L链V区C端的编码DNA杂交，并具有FLAG编码序列以及NotI限制性酶识别位点。
在第一个PCR步骤中，进行A-B、C-D二个反应，将第一步PCR获得的二种PCR产物按照各自互补性进行组装。加入引物A和D以后，扩增具有由5个氨基酸组成的接头的、重建的12E10单链Fv的全长编码DNA(第二步PCR)。第一步PCR中分别用编码重建的12E10H链V区的质粒HEF-12E10H-gγ1(参见实施例8.1)，以及编码重建的12E10 L链V区的质粒pCOS-12E10L(参见实施例8.2)作模板。
第一步PCR反应的50μl溶液包含5μl 10×PCR Gold BufferII、1.5mM MgCl2、0.08mM dNTPs、5单位DNA聚合酶AmpliTaq Gold(来自PERKIN ELMER)、100pmol每种引物和100ng每种模板DNA。PCR溶液在起始温度94℃加热9分钟，在94℃30秒、55℃30秒以及72℃1分钟。此温度循环重复35次以后，72℃再加热反应混合物5分钟。
利用第二步PCR组装PCR产物A-B(429bp)和C-D(395bp)。第二步PCR混合物溶液(98μl)包含第一步PCR产物A-B和C-D每种1μl为模板、每种引物各100pmol、10μl 10×PCR Gold BufferII、1.5mM MgCl2、0.08mM dNTPs、5单位DNA聚合酶AmpliTaq Gold(来自PERKIN ELMER)，在上述相同条件下反应。
利用1.5％低熔点温度琼脂糖凝胶纯化第二步PCR产生的795bpDNA片段，用EcoRI和NotI消化，克隆到pCHO1载体或pCOS1载体。表达载体pCHO1是利用EcoRI和SmaI消化DHFR-ΔE-RVH-PM1-f(参见WO92/19759)，去除抗体基因，并连上EcoRI-NotI-BamHI接头(TAKARA SHUZO)而构建的。DNA测序后，将包含重建的12E10单链Fv正确氨基酸序列的编码DNA片段的质粒，命名为pCHO-db12E10和pCOS-db12E10。质粒pCHO-db12E10和pCOS-db12E10中包含的重建的12E10单链Fv的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO110所示。
(2)利用由15个氨基酸组成的接头序列制备重建的12E10单链Fv将(Gly4Ser)3接头的核苷酸序列引入12E10 H链V区编码基因的3’端以及12E10 L链V区编码基因的5’端，利用PCR分别扩增这样获得的各个基因，并连接所扩增的基因，构建包含由15个氨基酸组成的接头序列的重建12E10抗体单链Fv的编码基因。利用四种PCR引物(A-D)制备重建的12E10单链Fv。引物A和C具有正义序列，引物B和D具有反义序列。
H链V区的正向引物为12E10S(引物A，SEQ ID NO106)。H链V区的反向引物sc4.3(引物B，SEQ ID NO111)设计为与H链V区C端的编码DNA杂交，并具有(Gly4Ser)3接头的编码核苷酸序列以及L链V区N端的编码核苷酸序列。
L链V区的正向引物sc1.3(引物C，SEQ ID NO112)设计为与L链V区N端的编码DNA杂交，并具有(Gly4Ser)3接头的编码核苷酸序列以及H链V区C端的编码核苷酸序列。L链V区的反向引物12E10FA(引物D，SEQ ID NO109)设计为可与L链V区C端的编码DNA杂交，并具有FLAG编码核苷酸序列以及NotI限制性酶识别位点。
在第一个PCR步骤中，进行A-B、C-D二个反应，将第一步PCR获得的二种PCR产物按照各自互补性进行组装。加入引物A和D以后，扩增具有由15个氨基酸组成的接头的、重建的12E10单链Fv的全长编码DNA(第二步PCR)。第一步PCR中，重建的12E10单链Fv的编码质粒pCOS-db12E10(参见实施例8.3(1))用作模板。
第一步PCR反应的50μl溶液包含5μl 10×ExTaq Buffer、0.4mM dNTPs、2.5单位DNA聚合酶TaKaRa ExTaq(来自TAKARA)、每种引物各100pmol和10ng每种模板DNA。PCR溶液在起始温度94℃加热30秒，在94℃15秒、72℃2分钟，此循环重复5次。在94℃15秒、72℃2分钟的循环重复28次以后，72℃再加热反应混合物5分钟。
利用第二步PCR组装PCR产物A-B(477bp)和C-D(447bp)。第二步PCR混合物溶液(98μl)包含各1μl第一步PCR产物A-B和C-D为模板、每种引物A和D各100pmol、5μl 10×ExTaq Buffer、0.4mM dNTPs、2.5单位DNA聚合酶TaKaRa ExTaq(来自TAKARA)，在上述相同条件下反应。
利用1.0％低熔点温度琼脂糖凝胶纯化第二步PCR产生的825bpDNA片段，用EcoRI和NotI消化。这样获得的DNA片段克隆到pCHO1载体或pCOS1载体。DNA测序后，将包含重建的12E10单链Fv正确氨基酸序列的编码DNA片段的质粒，命名为pCHO-sc12E10和pCOS-sc12E10。质粒pCHO-sc12E10和pCOS-sc12E10中包含的重建的12E10单链Fv的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO113所示。
8.4利用动物细胞表达抗体12E10(IgG、Fab)和单链Fv多肽利用COS-7细胞或CHO细胞表达抗体12E10(IgG、Fab)和来源于抗体12E10的单链Fv(接头序列5个氨基酸、15个氨基酸)。
利用COS7细胞如下进行瞬时表达。使用Gene Pulser II装置(BioRad)，通过电穿孔方法进行转染。在悬浮于0.8ml PBS的COS-7细胞中(1×107细胞/ml)，为表达抗体12E10(IgG)而加入上述表达载体HEF-12E10H-gγ1和pCOS-12E10L各10μg，为表达12E10Fab片段而加入pFd-12E10H和pCOS-12E10L各10μg，为表达单链Fv而加入pCOS-sc12E10(10μg)或pCOS-db12E10(10μg)。利用1.5KV、25μFD电容脉冲处理小杯中的混合物。室温恢复10分钟后，将电穿孔细胞加到含有10％胎牛血清的DMEM培养基(GIBCO BRL)中培养。培养过夜后，用PBS洗涤细胞一次，加到无血清培养基CHO-S-SFMII(GIBCO BRL)中培养3天。培养上清离心去除细胞碎片，用0.22μm滤膜过滤。
为建立稳定表达来源于抗体12E10的单链Fv(多肽)的CHO细胞系，将表达载体pCHO-sc12E10或pCOS-ds12E10分别引入CHO细胞。
使用Gene Pulser II装置(BioRad)，通过电穿孔方法将每种表达载体引入CHO细胞。利用限制性酶PvuI消化，获得线性化DNA(100μg)，与悬浮于0.8ml PBS的CHO细胞(1×107细胞/ml)在小杯中混合，冰上静置10分钟，利用1.5KV、25μFD电容脉冲处理。室温恢复10分钟后，将电穿孔细胞加到含有10％透析过的胎牛血清和核酸的CHO-S-SFM II培养基(GIBCO BRL)中培养。培养2天后，在含有10％透析过的胎牛血清的无核酸CHO-S-SFM II培养基(GIBCOBRL)中继续培养。从这样获得的克隆中选择高表达率克隆，作为12E10单链Fv的生产细胞系。在无血清CHO-S-SFM II培养基(GIBCO BRL)中培养以后，离心培养上清去除细胞碎片，用0.22μm滤膜过滤。
8.5纯化CHO细胞产生的来源于12E10的单链Fv将实施例8.4中获得的表达12E10单链Fv(sc12E10、db12E10)的CHO细胞系产生的培养上清，分别利用抗FLAG抗体柱和凝胶过滤柱纯化，制备纯化的单链Fv。
(1)利用抗FLAG抗体柱纯化将每种培养上清(sc12E10、db12E10)加入用含150mM NaCl的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)平衡的抗FLAG M2亲和凝胶柱(Sigma)。利用相同缓冲液洗柱以后，通过100mM甘氨酸缓冲液(pH3.5)洗脱柱上吸附的蛋白质。洗脱组分立即加入1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)进行中和，并用SDS-PAGE分析。将确认含有单链Fv的组分混合，利用Centricon-10(AMICON)浓缩大约20倍。
(2)凝胶过滤(1)中获得的浓缩溶液加入用含0.01％ Tween20的PBS平衡的Superdex200柱HR(10×300mm，AMERSHAM PHARMACIA)。层析图如图53和54所示。产物sc12E10洗脱为2个峰(A、B)(参见图53)。产物db12E10洗脱为2个峰(C、D)(参见图54)。收集每个峰组分，在有或无还原剂存在下处理，按照Laemmli方法电泳，电泳后用考马斯亮蓝染色。如图55所示，无论还原剂存在与否，所有组分A、B、C和D都产生表观分子量大约31kD的单一条带。利用Superdex200HR通过凝胶过滤分析这些组分时，组分A产生表观分子量大约42kD处洗脱的产物，组分B产生20kD的产物(参见图56)，组分C产生69kD的产物，组分D产生41kD的产物(参见图57)。此结果提示，sc12E10来源的组分A是单链Fv的非共价键二聚体，组分B是单链Fv的单体，db12E10来源的组分C是单链Fv的非共价键三聚体，组分D是单链Fv的非共价键二聚体。
8.6测量各种单链Fv的TPO样激动剂活性通过测定对表达人TPO受体(MPL)的Ba/F3细胞(BaF/mpl)的增殖活性，评价抗mpl单链抗体的TPO样活性。
利用含有1％胎牛血清(GIBCO)的RPMI1640培养基(GIBCO)洗涤BaF/mpl细胞两次后，细胞按5×105细胞/ml的细胞密度悬浮于培养基中。用培养基分别稀释抗MPL单链抗体或人TPO(R&D Systems)。将50μl细胞悬液和50μl稀释的抗体或人TPO加入96孔微孔板中(平底)(Falcon)，CO2保温箱中(CO2浓度5％)培养24小时。温育后加入10μl WST-8试剂(测定原始细胞SF数目的试剂Nacalai Tesque)，立即利用吸收光度计Benchmark Plus(BioRad)测量吸光度，测量波长450nm，参比波长655nm。在CO2保温箱中(CO2浓度5％)温育2小时以后，利用Benchmark Plus再次测量吸光度，测量波长450nm，参比波长655nm。由于WST-8试剂根据活细胞数目在波长450nm处产生显色反应，基于2小时后吸光度的变化，评价BaF/mpl的增殖活性。
利用表达各种12E10抗体分子的COS-7细胞培养上清，测定对MPL的激动剂活性，如图58所示。具有5个氨基酸接头(ds12E10)和15个氨基酸接头(sc12E10)的单链Fv，其吸光度以浓度依赖性方式提高，显示TPO样激动剂活性(ED50；分别9pM和51pM)，而12E10IgG和12E10Fab没有活性。
已知单链Fv H链和L链不仅分子内结合，而且分子间结合形成多聚体，例如二聚体。表达12E10单链Fv的CHO细胞的培养上清经凝胶过滤，测定对MPL的激动剂活性。结果如图59所示。sc12E10中包含的小量二聚体，显示的TPO样激动剂活性(sc12E10二聚体，ED50；1.9pM)比单体(sc12E10单体，ED50；＞10nM)高大约5000倍。活性高于TPO(ED50；27pM)。db12E10的二聚体(db12E10二聚体，ED50；2.0pM)显示与sc12E10二聚体相当的活性。db12E10的二聚体(db12E10二聚体，ED50；2.0pM)显示与sc12E10二聚体相当的高活性。db12E10的三聚体(从凝胶过滤获得的分子量推测为三聚体)(ED50；7.4pM)显示低于db12E10二聚体的高活性。这些结果提示，双价抗原结合位点(二聚体)对于激动剂抗体12E10的活性是重要的。鉴于12E10IgG没有活性，推测双价之外的其它因素是重要的，例如抗原结合位点的定位、距离或角度。


图1表示流式细胞术结果，表明人IgG抗体不结合表达人IAP的L1210细胞(hIAP/L1210)。
图2表示流式细胞术结果，表明嵌合MABL-1抗体特异性结合表达人IAP的L1210细胞(hIAP/L1210)。
图3表示流式细胞术结果，表明嵌合MABL-2抗体特异性结合表达人IAP的L1210细胞(hIAP/L1210)。
图4图解根据本发明制备单链Fv的过程。
图5阐明表达质粒的结构，其可用于在E.coli中表达本发明单链Fv的编码DNA。
图6阐明表达质粒的结构，其可用于在哺乳动物细胞中表达本发明单链Fv的编码DNA。
图7显示实施例5.4中Western印迹的结果图。从左侧开始为，分子量标志(从上面显示97.4、66、45、31、21.5和14.5kDa)、引入pCHO1的COS7细胞培养上清、以及引入pCHOM2的COS7细胞培养上清。表明在引入pCHOM2的细胞培养上清中包含抗体MABL-2的重建单链Fv(箭头)。
图8表示流式细胞术结果，表明作对照的pCHO1/COS7细胞培养上清中的抗体，不结合pCOS1/L1210对照细胞。
图9表示流式细胞术结果，表明MABL2-scFv/COS7细胞培养上清中的抗体，不结合pCOS1/L1210对照细胞。
图10表示流式细胞术结果，表明作对照的pCOS1/COS7细胞培养上清中的抗体不结合hIAP/L1210细胞。
图11表示流式细胞术结果，表明MABL2-scFv/COS7细胞培养上清中的抗体特异性结合hIAP/L1210细胞。
图12表示实施例5.6中竞争性ELISA结果，其中以对小鼠单克隆抗体MABL-2结合抗原的抑制作用为指征，与对照的pCHO1/COS7细胞培养上清比较，阐明本发明单链Fv(MABL2-scFv)的抗原结合活性。
图13表示实施例5.7中凋亡诱导效应的结果，表明作对照的pCHO1/COS7细胞培养上清中的抗体，不能诱导pCOS1/L1210对照细胞凋亡。
图14表示实施例5.7中凋亡诱导效应的结果，表明MABL2-scFv/COS7细胞培养上清中的抗体，不诱导pCOS1/L1210对照细胞凋亡。
图15表示实施例5.7中凋亡诱导效应的结果，表明作对照的pCHO1/COS7细胞培养上清中的抗体，不诱导hIAP/L1210细胞凋亡。
图16表示实施例5.7中凋亡诱导效应的结果，表明MABL2-scFv/COS7细胞培养上清中的抗体，特异性诱导hIAP/L1210细胞凋亡。
图17表示实施例5.7中凋亡诱导效应的结果，表明作对照的pCHO1/COS7细胞培养上清中的抗体，不诱导CCRF-CEM细胞凋亡(终浓度50％)。
图18表示实施例5.7中凋亡诱导效应的结果，表明MABL2-scFv/COS7细胞培养上清中的抗体，特异性诱导CCRF-CEM细胞凋亡(终浓度50％)。
图19表示实施例5.9纯化CHO细胞产生的源于抗体MABL-2的单链Fv所得到的层析结果，表明用羟基磷灰石柱纯化来自Blue-sepharose柱的组分时，获得的主要峰，组分A和组分B。
图20表示实施例5.9-(2)获得的组分A和组分B的凝胶过滤纯化结果，表明组分A在表观分子量约36kD处、以及组分B在约76kD处洗脱的主要峰(分别为AI和BI)。
图21为实施例5.9纯化CHO细胞产生的源于抗体MABL-2的单链Fv所获得组分的SDS-PAGE分析，表明两个组分中都观察到分子量约35kD的单一条带。
图22表示凝胶过滤纯化CHO细胞产生的源于抗体MABL-2的单链Fv所获得组分AI和BI的分析结果，其中组分AI包含单体，组分BI包含二聚体。
图23阐明表达质粒的结构，其可用于在E.coli中表达本发明单链Fv的编码DNA。
图24表示实施例5.12凝胶过滤柱纯化E.coli产生的源于抗体MABL-2的单链Fv多肽粗产物的结果，其中每个峰分别表示E.coli产生的单链Fv的单体或二聚体。
图25表示实施例5.13中凋亡诱导效应的结果，表明作对照的小鼠IgG抗体，不诱导hIAP/L1210细胞凋亡(终浓度3μg/ml)。
图26表示实施例5.13中凋亡诱导效应的结果，表明CHO产生的MABL2-scFv二聚体，显著诱导hIAP/L1210细胞凋亡(终浓度3μg/ml)。
图27表示实施例5.13中凋亡诱导效应的结果，表明E.coli产生的MABL2-scFv二聚体，显著诱导hIAP/L1210细胞凋亡(终浓度3μg/ml)。
图28表示实施例5.13中凋亡诱导效应的结果，表明CHO细胞产生的MABL2-scFv单体对hIAP/L1210细胞的凋亡诱导作用与对照处于相同水平(终浓度3μg/ml)。
图29表示实施例5.13中凋亡诱导效应的结果，表明E.coli产生的MABL2-scFv单体对hIAP/L1210细胞的凋亡诱导作用与对照处于相同水平(终浓度3μg/ml)。
图30表示实施例5.13中凋亡诱导效应的结果，表明作对照的小鼠IgG抗体，即使加入抗FLAG抗体，也不诱导hIAP/L1210细胞凋亡(终浓度3μg/ml)。
图31表示实施例5.13中凋亡诱导效应的结果，表明CHO细胞产生的MABL2-scFv单体，在加入抗FLAG抗体时，显著诱导hIAP/L1210细胞凋亡(终浓度3μg/ml)。
图32表示在人骨髓瘤细胞系KPMM2移植小鼠的血清中人IgG的定量测量结果，显示小鼠中由人骨髓瘤细胞产生的人IgG数量。表明scFv/CHO二聚体显著抑制KPMM2细胞生长。
图33表示小鼠在移植肿瘤后的存活时间，表明scFv/CHO二聚体给药组存活时间显著延长。
图34阐明表达质粒的结构，其可表达包含源于抗体MABL-2的两个H链V区和两个L链V区的改变的抗体[sc(Fv)2]。
图35阐明表达scFv(HL型)质粒的结构，其中V区通过没有肽接头的[H链]-[L链]方式连接。
图36阐明HL型多肽的结构以及肽接头的氨基酸序列。
图37阐明表达scFv(LH型)质粒的结构，其中V区通过没有肽接头的[L链]-[H链]方式连接。
图38阐明LH型多肽的结构以及肽接头的氨基酸序列。
图39表示实施例6.4 Western印迹的结果，表明表达了包含两个H链V区和两个L链V区的改变的抗体sc(Fv)2、以及具有不同长度肽接头的MABL2-scFv。
图40a和40b表示实施例6.3(1)制备的COS7细胞培养上清的流式细胞术结果，表明MABL2-scFv和具有不同长度肽接头的sc(Fv)2对人IAP具有高亲和力。
图41a和41b表示实施例6.6凋亡诱导效应的结果，表明scFv<HL3、4、6、7、LH3、4、6和7>以及sc(Fv)2显著诱导hIAP/L1210细胞死亡。
图42表示实施例6.10抗原结合能力的评价结果，表明scFv<HL5>二聚体和sc(Fv)2对人IAP具有高亲和力。
图43表示实施例6.11体外凋亡诱导效应的结果，表明scFv<HL5>二聚体和sc(Fv)2以浓度依赖方式诱导hIAP/L1210细胞和CCRF-CEM细胞凋亡。
图44表示在移植人骨髓瘤细胞的小鼠血清中，由人骨髓瘤细胞系KPMM2产生的M蛋白质的定量测量结果。表明scFv<HL5>二聚体和sc(Fv)2显著抑制KPMM2细胞生长。
图45表示肿瘤移植后小鼠的存活时间(天)，表明scFv<HL5>给药组的存活时间显著延长。
图46表示肿瘤移植后小鼠的存活时间(天)，表明sc(Fv)2给药组的存活时间显著延长。
图47图示重建12B5单链Fv(包含由15个氨基酸组成的接头序列)的编码DNA片段的构建方法及其结构。
图48表示实施例7.5(1)中获得的每种12B5单链Fv的凝胶过滤纯化结果，表明sc12B5分为两个峰(组分A和B)。
图49表示实施例7.5(2)中进行的每个组分A和B的SDS-PAGE分析结果。
图50表示实施例7.5(2)中进行的每个组分A和B的Superdex200柱分析结果，表明组分A的主峰在(a)中所示大约44kD表观分子量处洗脱，组分B的主峰在(b)中所示大约22kD表观分子量处洗脱。
图51表示sc12B5和抗体12B5(IgG、Fab)的TPO样激动剂活性的测量结果，表明12B5IgG和单价单链Fv(sc12B5)以浓度依赖性方式显示TPO样激动剂活性。
图52表示sc12B5单体和二聚体的TPO样激动剂活性的测量结果，表明具有双价抗原结合位点的单链Fv(sc12B5二聚体)的激动剂活性高于单价sc12B5大约400倍，并且效力等于或高于人TPO。
图53表示利用Superdex200HR柱通过凝胶过滤层析获得的sc12E10单链抗体的纯化结果，表明sc12E10分为两个峰(组分A和B)。
图54表示利用Superdex200HR柱通过凝胶过滤层析获得的db12E10单链抗体的纯化结果，表明db12E10分为两个峰(组分C和D)。
图55表示组分A和B(sc12E10)以及组分C和D(db12E10)在还原或非还原条件下的SDS-PAGE分析。
图56表示利用Superdex200HR柱通过凝胶过滤层析的组分A和B的分析结果，表明(1)组分A的主峰在大约42kD表观分子量处洗脱，以及(2)组分B的主峰在大约20kD表观分子量处洗脱。
图57表示利用Superdex200HR柱通过凝胶过滤层析的组分C和D的分析结果，表明(1)组分C的主峰在大约69kD表观分子量处洗脱，以及(2)组分D的主峰在大约41kD表观分子量处洗脱。
图58图示各种12E10抗体分子对MPL的激动剂活性，表明单链Fv(sc12E10、db12E10)显示TPO样激动剂活性，而12E10 IgG和12E10 Fab不显示。
图59图示sc12E10单体和二聚体以及db12E10二聚体和三聚体对MPL的激动剂活性，表明sc12E10二聚体以及db12E10二聚体和三聚体显示的TPO样激动剂活性高于TPO。
工业应用本发明的改变抗体具有能够通过交联细胞表面分子而转导信号进入细胞的激动剂作用，优势在于因其相比抗体分子(完全IgG)的分子大小下降而对组织和肿瘤的通透性高。本发明提供了其激动剂活性显著高于TPO或亲本抗体(完全IgG)的改变的抗体。特别是即使没有激动剂活性的亲本抗体，也能够改变为激动剂活性比TPO更高的改变的抗体。因此，该改变的抗体可用作信号转导激动剂。抗体分子的改变，导致细胞间交联引起的副作用降低，并提供通过交联细胞表面分子只诱导所需作用的新型药物。包含本发明的改变的抗体为活性成分的药物制剂，可用作血小板减少相关的血液疾病、癌症或白血病化疗所致血小板减少症等的预防和/或治疗药。
序列表<110>CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA<120>低分子化的TPO激动剂抗体<130>FP1033<141>2001-10-22<150>JP2000-321821<151>2000-10-20<150>PCT/JP01/03288<151>2001-04-17<150>JP2001-277314<151>2001-09-12<160>113<210>1<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>1ccatcctaat acgactcact atagggc 27<210>2<211>27<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物<400>2ggatcccggg tggatggtgg gaagatg 27<210>3<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>PCR引物<400>4ggatcccggg agtggataga ccgatg 26<210>5<211>394<212>DNA<213>Mus<220>
<221>CDS<222>(1)...(393)<223>pGEM-M1L.1-57；信号肽，58-394；成熟肽<400>5atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct gcg 48Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala1 5 10 15tcc agc agt gat gtt gtg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc 96Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val20 25 30agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag agc ctt 144Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu35 40 45cta cac agt aaa gga aac acc tat tta caa tgg tac cta cag aag cca 192Leu His Ser Lys Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro50 55 60ggc cag tct cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct 240Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser65 70 75 80ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca 288Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr85 90 95ctc aag atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc 336Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys100 105 110tct caa agt aca cat gtt ccg tac acg tcc gga ggg ggg acc aag ctg 384Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu115 120 125
gaa ata aaa c 394Glu Ile Lys130<210>6<211>409<212>DNA<213>Mus<220>
<221>CDS<222>(1)...(408)<223>pGEM-M1H.1-57；信号肽，58-409；成熟肽<400>6atg gaa tgg agc tgg ata ttt ctc ttc ctc ctg tca gga act gca ggt 48Met Glu Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly1 5 10 15gtc cac tcc cag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gac ctg gta aag 96Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys20 25 30cct ggg gct tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct gga tac acc ttc 144Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe35 40 45gtt aac cat gtt atg cac tgg gtg aag cag aag cca ggg cag ggc ctt 192Val Asn His Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu50 55 60gag tgg att gga tat att tat cct tac aat gat ggt act aag tac aat 240Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn65 70 75 80
gag aag ttc aag ggc aag gcc aca ctg act tca gag aaa tcc tcc agc 288Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Glu Lys Ser Ser Ser85 90 95gca gcc tac atg gag ctc agc agc ctg gcc tct gag gac tct gcg gtc 336Ala Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val100 105 110tac tac tgt gca aga ggg ggt tac tat agt tac gac gac tgg ggc caa 384Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Ser Tyr Asp Asp Trp Gly Gln115 120 125ggc acc act ctc aca gtc tcc tca g409Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser130 135<210>7<211>394<212>DNA<213>Mus<220>
<221>CDS<222>(1)...(393)<223>pGEM-M2L.1-57；信号肽，58-394；成熟肽<400>7atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct ggt 48Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Gly1 5 10 15tcc agc agt gat gtt gtg atg acc caa agt cca ctc tcc ctg cct gtc 96Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val20 25 30
agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgo aga tca agt cag agc ctt 144Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu35 40 45gtg cac agt aat gga aag acc tat tta cat tgg tac ctg cag aag cca 192Val His Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro50 55 60ggc cag tct cca aaa ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct 240Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser65 70 75 80ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca gtg aca gat ttc aca 288Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Val Thr Asp Phe Thr85 90 95ctc atg atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc 336Leu Met Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys100 105 110tct caa agt aca cat gtt ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg 384Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu115 120 125gaa ata aaa c394Glu Ile Lys130<210>8<211>409<212>DNA<213>Mus<220>
<221>CDS
<222>(1)...(408)<223>pGEM-M2H.1-57；信号肽，58-409；成熟肽<400>8atg gaa tgg agc tgg ata ttt ctc ttc ctc ctg tca gga act gca ggt 48Met Glu Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly1 5 10 15gtc cac tcc cag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gaa ctg gta aag 96Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys20 25 30cct ggg gct tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct gga tac acc ttc 144Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe35 40 45gct aac cat gtt att cac tgg gtg aag cag aag cca ggg cag ggc ctt 192Ala Asn His Val Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu50 55 60gag tgg att gga tat att tat cct tac aat gat ggt act aag tat aat 240Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn65 70 75 80gag aag ttc aag gac aag gcc act ctg act tca gac aaa tcc tcc acc 288Glu Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Thr85 90 95aca gcc tac atg gac ctc agc agc ctg gcc tct gag gac tct gcg gtc 336Thr Ala Tyr Met Asp Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val100 105 110tat tac tgt gca aga ggg ggt tac tat act tac gac gac tgg ggc caa 384Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Thr Tyr Asp Asp Trp Gly Gln115 120 125ggc acc act ctc aca gtc tcc tca g409
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser130 135<210>9<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>9cccaagcttc caccatgaag ttgcctgtta gg32<210>10<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>10cccaagcttc caccatggaa tggagctgga ta32<210>11<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>11
cgcggatcca ctcacgtttt atttccagct tggt 34<210>12<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>12cgcggatcca ctcacctgag gagactgtga gagt 34<210>13<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>13catgccatgg cgcaggtcca gctgcagcag 30<210>14<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>14accaccacct gaggagactg tgagagt 27
<210>15<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>15gtctcctcag gtggtggtgg ttcgggt 27<210>16<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>16cacaacatcc gatccgccac cacccga 27<21O>17<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>17ggcggatcgg atgttgtgat gacccaa 27
<210>18<211>57<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>18ccggaattct cattatttat cgtcatcgtc tttgtagtct tttatttcca gcttggt 57<210>19<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>接头氨基酸序列和核苷酸序列<400>19ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggc gga tcg 45Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser5 10 15<210>20<211>828<212>DNA<213>Mus<220>
<221>CDS<222>(1)...(822)<223>pscM1.MABL1-scFv
<400>20atg aaa tac cta ttg cct acg gca gcc gct gga ttg tta tta ctc gct 48Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala1 5 10 15gcc caa cca gcc atg gcg cag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gac 96Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp20 25 30ctg gta aag cct ggg gct tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct gga 144Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly35 40 45tac acc ttc gtt aac cat gtt atg cac tgg gtg aag cag aag cca ggg 192Tyr Thr Phe Val Asn His Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly50 55 60cag ggc ctt gag tgg att gga tat att tat cct tac aat gat ggt act 240Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr65 70 75 80aag tac aat gag aag ttc aag ggc aag gcc aca ctg act tca gag aaa 288Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Glu Lys85 90 95tcc tcc agc gca gcc tac atg gag ctc agc agc ctg gcc tct gag gac 336Ser Ser Ser Ala Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp100 105 110tct gcg gtc tac tac tgt gca aga ggg ggt tac tat agt tac gac gac 384Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Ser Tyr Asp Asp115 120 125tgg ggc caa ggc acc act ctc aca gtc tcc tca ggt ggt ggt ggt tcg 432Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser130 135 140
ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggc gga tcg gat gtt gtg atg acc caa 480Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln145 150 155 160act cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct 528Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser165 170 175tgc aga tct agt cag agc ctt cta cac agt aaa gga aac acc tat tta 576Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Lys Gly Asn Thr Tyr Leu180 185 190caa tgg tac cta cag aag cca ggc cag tct cca aag ctc ctg atc tac 624Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr195 200 205aaa gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt 672Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser210 215 220gga tca ggg aca gat ttc aca ctc aag atc agc aga gtg gag gct gag 720Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu225 230 235 240gat ctg gga gtt tat ttc tgc tct caa agt aca cat gtt ccg tac acg 768Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr245 250 255tcc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa gac tac aaa gac gat gac 816Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp260 265 270gat aaa taatga 828Asp Lys<210>21
<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>21acgcgtcgac tcccaggtcc agctgcagca g 31<210>22<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>22gaaggtgtat ccagaagc18<210>23<211>819<212>DNA<213>Mus<220>
<221>CDS<222>(1)...(813)<223>pCHOM1.MABL1-scFv<400>23atg gga tgg agc tgt atc atc ctc ttc ttg gta gca aca gct aca ggt 48Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15gtc gac tcc cag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gac ctg gta aag 96Val Asp Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys20 25 30cct ggg gct tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct gga tac acc ttc 144Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe35 40 45gtt aac cat gtt atg cac tgg gtg aag cag aag cca ggg cag ggc ctt 192Val Asn His Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu50 55 60gag tgg att gga tat att tat cct tac aat gat ggt act aag tac aat 240Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn65 70 75 80gag aag ttc aag ggc aag gcc aca ctg act tca gag aaa tcc tcc agc 288Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Glu Lys Ser Ser Ser85 90 95gca gcc tac atg gag ctc agc agc ctg gcc tct gag gac tct gcg gtc 336Ala Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val100 105 110tac tac tgt gca aga ggg ggt tac tat agt tac gac gac tgg ggc caa 384Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Ser Tyr Asp Asp Trp Gly Gln115 120 125ggc acc act ctc aca gtc tcc tca ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggt 432Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly130 135 140ggt tcg ggt ggt ggc gga tcg gat gtt gtg atg acc caa act cca ctc 480Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu145 150 155 160
tcc ctg cct gtc agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct 528Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser165 170 175agt cag agc ctt cta cac agt aaa gga aac acc tat tta caa tgg tac 576Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Lys Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr180 185 190cta cag aag cca ggc cag tct cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt tcc 624Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser195 200 205aac cga ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg 672Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly210 215 220aca gat ttc aca ctc aag atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga 720Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly225 230 235 240gtt tat ttc tgc tct caa agt aca cat gtt ccg tac acg tcc gga ggg 768Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Ser Gly Gly245 250 255ggg acc aag ctg gaa ata aaa gac tac aaa gac gat gac gat aaa taa 816Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys260 265 270tga 819<210>24<211>828<212>DNA<213>Mus<220>
<221>CDS<222>(1)...(822)<223>pscM2.MABL2-scFv<400>24atg aaa tac cta ttg cct acg gca gcc gct gga ttg tta tta ctc gct48Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala1 5 10 15gcc caa cca gcc atg gcg cag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gaa96Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu20 25 30ctg gta aag cct ggg gct tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct gga 144Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly35 40 45tac acc ttc gct aac cat gtt att cac tgg gtg aag cag aag cca ggg 192Tyr Thr Phe Ala Asn His Val Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly50 55 60cag ggc ctt gag tgg att gga tat att tat cct tac aat gat ggt act 240Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr65 70 75 80aag tat aat gag aag ttc aag gac aag gcc act ctg act tca gac aaa 288Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys85 90 95tcc tcc acc aca gcc tac atg gac ctc agc agc ctg gcc tct gag gac 336Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met Asp Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp100 105 110tct gcg gtc tat tac tgt gca aga ggg ggt tac tat act tac gac gac 384Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Thr Tyr Asp Asp115 120 125
tgg ggc caa ggc acc act ctc aca gtc tcc tca ggt ggt ggt ggt tcg 432Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser130 135 140ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggc gga tcg gat gtt gtg atg acc caa 480Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln145 150 155 160agt cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct 528Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser165 170 175tgc aga tca agt cag agc ctt gtg cac agt aat gga aag acc tat tta 576Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Lys Thr Tyr180 185 190cat tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tct cca aaa ctc ctg atc tac 624His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr195 200 205aaa gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt 672Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser210 215 220gga tca gtg aca gat ttc aca ctc atg atc agc aga gtg gag gct gag 720Gly Ser Val Thr Asp Phe Thr Leu Met Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu225 230 235 240gat ctg gga gtt tat ttc tgc tct caa agt aca cat gtt ccg tac acg 768Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr245 250 255ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa gac tac aaa gac gat gac 816Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp260 265 270gat aaa taa tga 828
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85 90 95aca gcc tac atg gac ctc agc agc ctg gcc tct gag gac tct gcg gtc 336Thr Ala Tyr Met Asp Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val100 105 110tat tac tgt gca aga ggg ggt tac tat act tac gac gac tgg ggc caa 384Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Thr Tyr Asp Asp Trp Gly Gln115 120 125ggc acc act ctc aca gtc tcc tca ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggt 432Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly130 135 140ggt tcg ggt ggt ggc gga tcg gat gtt gtg atg acc caa agt cca ctc 480Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu145 150 155 160tcc ctg cct gtc agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tca 528Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser165 170 175agt cag agc ctt gtg cac agt aat gga aag acc tat tta cat tgg tac 576Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu His Trp Tyr180 185 190ctg cag aag cca ggc cag tct cca aaa ctc ctg atc tac aaa gtt tcc 624Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser195 200 205aac cga ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca gtg 672Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Val210 215 220aca gat ttc aca ctc atg atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga 720Thr Asp Phe Thr Leu Met Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly225 230 235 240
gtt tat ttc tgc tct caa agt aca cat gtt ccg tac acg ttc gga ggg 768Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly245 250 255ggg acc aag ctg gaa ata aaa gac tac aaa gac gat gac gat aaa taa 816Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys260 265 270tga 819<210>26<211>456<212>DNA<213>Mus<220>
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50 55 60att tac acc ttt gat gga gct cta aac aag tcc act gtc ccc act gac 240Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp65 70 75 80ttt agt agt gca aaa att gaa gtc tca caa tta cta aaa gga gat gcc 288Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala85 90 95tct ttg aag atg gat aag agt gat gct gtc tca cac aca gga aac tac 336Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr100 105 110act tgt gaa gta aca gaa tta acc aga gaa ggt gaa acg atc atc gag 384Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu115 120 125cta aaa tat cgt gtt gtt tca tgg ttt tct cca aat gaa aat gac tac 432Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Asp Tyr130 135 140aag gac gac gat gac aag tgatag456Lys Asp Asp Asp Asp Lys145 150<210>27<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
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att gga tat att tat cct tac aat gat ggt act aag tat aat gag aag 192Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys50 55 60ttc aag gac aag gcc act ctg act tca gac aaa tcc tcc acc aca gcc 240Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala65 70 75 80tac atg gac ctc agc agc ctg gcc tct gag gac tct gcg gtc tat tac 288Tyr Met Asp Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr85 90 95tgt gca aga ggg ggt tac tat act tac gac gac tgg ggc caa ggc acc 336Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Thr Tyr Asp Asp Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110act ctc aca gtc tcc tca ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggt ggt tcg 384Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser115 120 125ggt ggt ggc gga tcg gat gtt gtg atg acc caa agt cca ctc tcc ctg 432Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu130 135 140cct gtc agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tca agt cag 480Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln145 150 155 160agc ctt gtg cac agt aat gga aag acc tat tta cat tgg tac ctg cag 528Ser Leu Val His Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln165 170 175aag cca ggc cag tct cca aaa ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga 576Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg180 185 190ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca gtg aca gat 624
Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Val Thr Asp195 200 205ttc aca ctc atg atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat 672Phe Thr Leu Met Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr210 215 220ttc tgc tct caa agt aca cat gtt ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc 720Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr225 230 235 240aag ctg gaa ata aaa taatga 741Lys Leu Glu Ile Lys245<210>30<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
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Glu Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Thr85 90 95aca gcc tac atg gac ctc agc agc ctg gcc tct gag gac tct gcg gtc 336Thr Ala Tyr Met Asp Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val100 105 110tat tac tgt gca aga ggg ggt tac tat act tac gac gac tgg ggc caa 384Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Thr Tyr Asp Asp Trp Gly Gln115 120 125ggc acc act ctc aca gtc tcc tca ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggt 432Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly130 135 140ggt tcg ggt ggt ggc gga tcg gat gtt gtg atg acc caa agt cca ctc 480Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu145 150 155 160tcc ctg cct gtc agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tca 528Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser165 170 175agt cag agc ctt gtg cac agt aat gga aag acc tat tta cat tgg tac 576Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu His Trp Tyr180 185 190ctg cag aag cca ggc cag tct cca aaa ctc ctg atc tac aaa gtt tcc 624Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser195 200 205aac cga ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca gtg 672Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Val210 215 220aca gat ttc aca ctc atg atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga 720Thr Asp Phe Thr Leu Met Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
225 230 235 240gtt tat ttc tgc tct caa agt aca cat gtt ccg tac acg ttc gga ggg768Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly245 250 255ggg acc aag ctg gaa ata aaa ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggt ggt816Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly260 265 270tcg ggt ggt ggc gga tcg gtc gac tcc cag gtc cag ctg cag cag tct864Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Asp Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser275 280 285gga cct gaa ctg gta aag cct ggg gct tca gtg aag atg tcc tgc aag912Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys290 295 300gct tct gga tac acc ttc gct aac cat gtt att cac tgg gtg aag cag960Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Asn His Val Ile His Trp Val Lys Gln305 310 315 320aag cca ggg cag ggc ctt gag tgg att gga tat att tat cct tac aat 1008Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn325 330 335gat ggt act aag tat aat gag aag ttc aag gac aag gcc act ctg act 1056Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr340 345 350tca gac aaa tcc tcc acc aca gcc tac atg gac ctc agc agc ctg gcc 1104Ser Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met Asp Leu Ser Ser Leu Ala355 360 365tct gag gac tct gcg gtc tat tac tgt gca aga ggg ggt tac tat act 1152Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Thr370 375 380
tac gac gac tgg ggc caa ggc acc act ctc aca gtc tcc tca ggt ggt 1200Tyr Asp Asp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly385 390 395 400ggt ggt tcg ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggc gga tcg gat gtt gtg 1248Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val405 410 415atg acc caa agt cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga gat caa gcc 1296Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala420 425 430tcc atc tct tgc aga rca agt cag agc crt gtg cac agt aat gga aag 1344Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Lys435 440 445acc tat tta cat tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tct cca aaa ctc 1392Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu450 455 460ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc 1440Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe465 470 475 480agt ggc agt gga tca gtg aca gat ttc aca ctc atg atc agc aga gtg 1488Ser Gly Ser Gly Ser Val Thr Asp Phe Thr Leu Met Ile Ser Arg Val485 490 495gag gct gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc tct caa agt aca cat gtt 1536Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val500 505 510ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa gac tac aaa 1584Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Asp Tyr Lys515 520 525gac gat gac gat aaa taatga 1605
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agtctcgagt gacgtcgtga tgacccaaag tccactctcc 40<210>36<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>CDS<222>(1)...(768)<223>CF2HL-0/pCOS1.MABL2-scFv<HL-0>
<400>48atg gga tgg agc tgt atc atc ctc ttc ttg gta gca aca gct aca ggt gtc 51MET Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val5 10 15gac tcc cag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gaa ctg gta aag cct ggg 102Asp Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly20 25 30gct tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct gga tac acc ttc gct aac cat 153Ala Ser Val Lys MET Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Asn His35 40 45 50gtt att cac tgg gtg aag cag aag cca ggg cag ggc ctt gag tgg att gga 204Val Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly55 60 65tat att tat cct tac aat gat ggt act aag tat aat gag aag ttc aag gac 255Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Asp70 75 80 85aag gcc act ctg act tca gac aaa tcc tcc acc aca gcc tac atg gac ctc 306Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr MET Asp Leu90 95 100agc agc ctg gcc tct gag gac tct gcg gtc tat tac tgt gca aga ggg ggt 357Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly105 110 115
tac tat act tac gac gac tgg ggc caa ggc acc act ctc aca gtc tcg agt 408Tyr Tyr Thr Tyr Asp Asp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr yal Ser Ser120 125 130 135gac gtc gtg atg acc caa agt cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga gat 459Asp Val Val MET Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp140 145 150caa gcc tcc atc tct tgc aga tca agt cag agc ctt gtg cac agt aat gga 510Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly155 160 165 170aag acc tat tta cat tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tct cca aaa ctc 561Lys Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu175 180 185ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc agt 612Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser190 195 200ggc agt gga tca gtg aca gat ttc aca ctc atg atc agc aga gtg gag gct 663Gly Ser Gly Ser Val Thr Asp Phe Thr Leu MET Ile Ser Arg Val Glu Ala205 210 215 220gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc tct caa agt aca cat gtt ccg tac acg 714Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr225 230 235ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa gac tac aaa gac gat gac gat 765Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp240 245 250 255aaa taa tga gga tcc 780Lys<210>49
<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>49caagctcgag ataaaatccg gaggccaggt ccaattgcag cagtc 45<210>50<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>50caagctcgag ataaaatccg gaggtggcca ggtccaattg cagcagtc48<210>51<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>51caagctcgag ataaaatccg gaggtggtgg ccaggtccaa ttgcagcagt c51<210>52<211>54
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>52caagctcgag ataaaatccg gaggtggtgg tggccaggtc caattgcagc agtc 54<210>53<211>57<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>53caagctcgag ataaaatccg gaggtggtgg tggtggccag gtccaattgc agcagtc 57<210>54<211>780<212>DNA<213>Mus<220>
<221>CDS<222>(1)...(768)<223>CF2LH-0/pCOS1.MABL2-scFv<LH-0>
<400>54atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct ggt tcc 51MET Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu MET Phe Trp Ile Pro Gly Ser5 10 15
agc agt gat gtt gtg atg acc caa agt cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt 102Ser Ser Asp Val Val MET Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu20 25 30gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tca agt cag agc ctt gtg cac agt 153Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser35 40 45 50aat gga aag acc tat tta cat tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tct cca 204Asn Gly Lys Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro55 60 65aaa ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca gac agg 255Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg70 75 80 85ttc agt ggc agt gga tca gtg aca gat ttc aca ctc atg atc agc aga gtg 306Phe Ser Gly Ser Gly Ser Val Thr Asp Phe Thr Leu MET Ile Ser Arg Val90 95 100gag gct gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc tct caa agt aca cat gtt ccg 357Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro105 110 115tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctc gag ata aaa cag gtc caa ttg cag 408Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gln Val Gln Leu Gln120 125 130 135cag tct gga cct gaa ctg gta aag cct ggg gct tca gtg aag atg tcc tgc 459Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys MET Ser Cys140 145 150aag gct tct gga tac acc ttc gct aac cat gtt att cac tgg gtg aag cag 510Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Asn His Val Ile His Trp Val Lys Gln155 160 165 170aag cca ggg cag ggc ctt gag tgg att gga tat att tat cct tac aat gat 561
Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp175 180 185ggt act aag tat aat gag aag ttc aag gac aag gcc act ctg act tca gac 612Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp190 195 200aaa tcc tcc acc aca gcc tac atg gac ctc agc agc ctg gcc tct gag gac 663Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr MET Asp Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp205 210 215 220tct gcg gtc tat tac tgt gca aga ggg ggt tac tat act tac gac gac tgg 714Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Thr Tyr Asp Asp Trp225 230 235ggc caa ggc acc act ctc aca gtc tcc tca gac tac aaa gac gat gac gat 765Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp240 245 250 255aaa taa tga gga tcc 780Lys<210>55<211>351<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(1)...(351)<223>12B5HV.1-351肽<400>55cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gga ggc ttg gtc cgg ccc ggg ggg 48Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15tcc ctg agt ctc tcc tgt gca gtc tct gga atc acc ctc agg acc tac 96Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Thr Leu Arg Thr Tyr20 25 30ggc atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg 144Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45gca ggt ata tcc ttt gac gga aga agt gaa tac tat gca gac tcc gtg 192Ala Gly Ile Ser Phe Asp Gly Arg Ser Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60cag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac agt tcc aag aac acc ctg tat 240Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80ctg caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac acg gct gtg tat tac tgt 288Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95gcg aga gga gca cat tat ggt ttc gat atc tgg ggc caa ggg aca atg 336Ala Arg Gly Ala His Tyr Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met100 105 110gtc acc gtc tcg agt 351Val Thr Val Ser Ser115<210>56<211>57<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(1)...(57)<223>前导序列<400>56atg gag ttt ggg ctg agc tgg gtt ttc ctc gtt gct ctt tta aga ggt 48Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly5 10 15gtc cag tgt 57Val Gln Cys<210>57<211>115<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12B5VH-1<400>57atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60gtgcagctgg tgcagtctgg gggaggcttg gtccggcccg gggggtccct gagtc 115<210>58<211>115<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12B5VH-2<400>58
aaggatatac ctgccaccca ctccagcccc ttgcctggag cctggcggac ccagtgcatg 60ccgtaggtcc tgagggtgat tccagagact gcacaggaga gactcaggga ccccc 115<210>59<211>115<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12B5VH-3<400>59ggcaggtata tcctttgacg gaagaagtga atactatgca gactccgtgc agggccgatt 60caccatctcc agagacagtt ccaagaacac cctgtatctg caaatgaaca gcctg 115<210>60<211>108<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12B5VH-4<400>60actcgagacg gtgaccattg tcccttggcc ccagatatcg aaaccataat gtgctcctct 60cgcacagtaa tacacagccg tgtcctcggc tctcaggctg ttcatttg 108<210>61<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>1285VH-S，PCR引物<400>61ttcaagcttc caccatggag tttgggctga gc32<210>62<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>1285VH-A，PCR引物<400>62ttgggatcca ctcaccactc gagacggtga ccat 34<210>63<211>588<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(236)...(558)<223>1-235内含子，236-558人IgG恒定区(部分)<400>63gaattcgtga gtggatccca agctagcttt ctggggcagg ccaggcctga ccttggcttt 60ggggcaggga gggggctaag gtgaggcagg tggcgccagc caggtgcaca cccaatgccc 120atgagcccag acactggacg ctgaacctcg cggacagtta agaacccagg ggcctctgcg 180ccctgggccc agctctgtcc cacaccgcgg tcacatggca caacctctct tgca gcc 237Ala1
tcc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc 285Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu A1a Pro Ser Ser Lys Ser5 10 15acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc 333Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe20 25 30ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc 381Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly35 40 45gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc 429Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu50 55 60 65agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac 477Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr70 75 80atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aaa 525Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys85 90 95gtt gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca 558Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr100 105<210>64<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>G1CH1-S，PCR引物
<400>64tgagaattcg tgagtggatc ccaagct 27<210>65<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>G1CH1-A，PCR引物<400>65aaaagatctt tatcatgtgt gagttttgtc acaagatttg ggctcaactt tcttgtccac 60<210>66<211>432<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(12)...(419)<223>HEF-12B5H-g gamma.12-419肽<400>66aagcttccac c atg gag ttt ggg ctg agc tgg gtt ttc ctc gtt gct ctt 50Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu1 5 10tta aga ggt gtc cag tgt cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gga ggc98Leu Arg Gly Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly15 20 25ttg gtc cgg ccc ggg ggg tcc ctg agt ctc tcc tgt gca gtc tct gga 146
Leu Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly30 35 40 45atc acc ctc agg acc tac ggc atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc 194Ile Thr Leu Arg Thr Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly50 55 60aag ggg ctg gag tgg gtg gca ggt ata tcc ttt gac gga aga agt gaa 242Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Gly Ile Ser Phe Asp Gly Arg Ser Glu65 70 75tac tat gca gac tcc gtg cag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac agt 290Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser80 85 90tcc aag aac acc ctg tat ctg caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac 338Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp95 100 105acg gct gtg tat tac tgt gcg aga gga gca cat tat ggt ttc gat atc 386Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala His Tyr Gly Phe Asp Ile110 115 120 125tgg ggc caa ggg aca atg gtc acc gtc tcg agt ggtgagtgga tcc 432Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser130 135<210>67<211>321<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(1)...(321)
<223>12B5LV.1-321肽<400>67gac atc cag atg acc cag tct cct tcc acc ctg tct gea tct att gga 48Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Ile Gly1 5 10 15gac aga gtc acc atc acc tgc cgg gcc agc gag ggt att tat cac tgg 96Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Gly Ile Tyr His Trp20 25 30ttg gcc tgg tat cag cag aag cca ggg aaa gcc cct aaa ctc ctg atc 144Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45tat aag gcc tct agt tta gcc agt ggg gcc cca tca agg ttc agc ggc 192Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Ala Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc age ctg cag cct 240Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80gat gat ttt gca act tat tac tgc caa caa tat agt aat tat ccg ctc 288Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu85 90 95act ttc ggc gga ggg acc aag ctg gag atc aaa 321Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105<210>68<211>66<212>DNA<213>人
<220>
<221>CDS<222>(1)...(66)<223>前导序列<400>68atg gac atg agg gtc ccc gct cag ctc ctg ggg ctc ctg ctg ctc tgg 48MET Asp MET Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp5 10 15ctc cca ggt gcc aaa tgt 66Leu Pro Gly Ala Lys Cys20<210>69<211>110<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12B5VL-1<400>69atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60aaatgtgaca tccagatgac ccagtctcct tccaccctgt ctgcatctat 110<210>70<211>110<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12B5VL-2
<400>70ggagtttagg ggctttccct ggcttctgct gataccaggc caaccagtga taaataccct 60cgctggcccg gcaggtgatg gtgactctgt ctccaataga tgcagacagg 110<210>71<211>110<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12B5VL-3<400>71aagcccctaa actcctgatc tataaggcct ctagtttagc cagtggggcc ccatcaaggt 60tcagcggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagcctg 110<210>72<211>103<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12B5VL-4<400>72tttgatctcc agcttggtcc ctccgccgaa agtgagcgga taattactat attgttggca 60gtaataagtt gcaaaatcat caggctgcag gctgctgatg gtg 103<210>73<211>32<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>12B5VL-S，PCR引物<400>73ttcaagcttc caccatggac atgagggtcc cc 32<210>74<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12B5VL-A，PCR引物<400>74tctaggatcc actcacgttt gatctccagc ttggt35<210>75<211>415<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(12)...(398)<223>HEF-12B5H-g kappa.12-398肽<400>75aagcttccac c atg gac atg agg gtc ccc gct cag ctc ctg ggg ctc ctg 50Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu1 5 10ctg ctc tgg ctc cca ggt gcc aaa tgt gac atc cag atg acc cag tct 98Leu Leu Trp Leu Pro Gly Ala Lys Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser
15 20 25cct tcc acc ctg tct gca tct att gga gac aga gtc acc atc acc tgc 146Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Ile Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys30 35 40 45cgg gcc agc gag ggt att tat cac tgg ttg gcc tgg tat cag cag aag 194Arg Ala Ser Glu Gly Ile Tyr His Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys50 55 60cea ggg aaa gcc cct aaa ctc ctg atc tat aag gcc tct agt tta gcc 242Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Ala65 70 75agt ggg gcc cca tca agg ttc agc ggc agt gga tct ggg aca gat ttc 290Ser Gly Ala Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe80 85 90act ctc acc atc agc agc ctg cag cct gat gat ttt gca act tat tac 338Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr95 100 105tgc caa caa tat agt aat tat ccg ctc act ttc ggc gga ggg acc aag 386Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys110 115 120 125ctg gag atc aaa cgtgagtgga tcctaga 415Leu Glu Ile Lys<210>76<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>FLAG标签序列
<400>76gac tac aag gat gac gac gat aag 24Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys5<210>77<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12B5-S，PCR引物<400>77atagaattcc accatggagt ttgggctgag c 31<210>78<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HuVHJ3，PCR引物<400>78tgaagagacg gtgaccattg tccc 24<210>79<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>RhuJH3，PCR引物<400>79ggacaatggt caccgtctct tcaggtgg 28<210>80<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>RhuVK1，PCR引物<400>80ggagactggg tcatctggat gtccgatccg cc32<210>81<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HuVK1.2，PCR引物<400>81gacatccaga tgacccagtc tcc 23<210>82<211>59<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12B5F-A，PCR引物
<400>82attgcggccg cttatcactt atcgtcgtca tccttgtagt ctttgatctc cagcttggt 59<210>83<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>接头氨基酸序列和核苷酸序列<400>83ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggc gga tcg 45Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser5 10 15<210>84<211>823<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(12)...(809)<223>sc12B5，单链Fv<400>84aagcttccac c atg gag ttt ggg ctg agc tgg gtt ttc ctc gtt gct ctt 50Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu1 5 10tta aga ggt gtc cag tgt cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gga ggc 98Leu Arg Gly Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly
15 20 25ttg gtc cgg ccc ggg ggg tcc ctg agt ctc tcc tgt gca gtc tct gga 146Leu Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly30 35 40 45atc acc ctc agg acc tac ggc atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc 194Ile Thr Leu Arg Thr Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly50 55 60aag ggg ctg gag tgg gtg gca ggt ata tcc ttt gac gga aga agt gaa 242Lys Gly Leu Glu Trp yal Ala Gly Ile Ser Phe Asp Gly Arg Ser Glu65 70 75tac tat gca gac tcc gtg cag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac agt 290Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser80 85 90tcc aag aac acc ctg tat ctg caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac 338Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp95 100 105acg gct gtg tat tac tgt gcg aga gga gca cat tat ggt ttc gat atc 386Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala His Tyr Gly Phe Asp Ile110 115 120 125tgg ggc caa ggg aca atg gtc acc gtc tcg agt ggt ggt ggt ggt tcg 434Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser130 135 140ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggc gga tcg gac atc cag atg acc cag 482Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln145 150 155tct cct tcc acc ctg tct gca tct att gga gac aga gtc acc atc acc 530Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Ile Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr160 165 170
tgc cgg gcc agc gag ggt att tat cac tgg ttg gcc tgg tat cag cag 578Cys Arg Ala Ser Glu Gly Ile Tyr His Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln175 180 185aag cca ggg aaa gcc cct aaa ctc ctg atc tat aag gcc tct agt tta 626Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Ser Leu190 195 200 205gcc agt ggg gcc cca tca agg ttc agc ggc agt gga tct ggg aca gat 674Ala Ser Gly Ala Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp210 215 220ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag cct gat gat ttt gca act tat 722Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr225 230 235TAC TGC CAA CAA TAT AGT AAT TAT CCG CTC ACT TTC GGC GGA GGG ACC 770Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr240 245 250aag ctg gag atc aaa gac tac aag gat gac gac gat aag tgataagcgg c 820Lys Leu Glu Ile Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys255 260 265cgc 823<210>85<211>114<212>PRT<213>人<400>85Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Ile Ser Ser Tyr20 25 30Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys50 55 60Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Ser Gln Phe Ser Leu65 70 75 80Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Arg Gly Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Arg Gly Thr Met Val Thr Val100 105 110Ser Ser<210>86<211>342<212>DNA<213>人<400>86caggtgcagc tgcagcagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60acctgcactg tctctggtga ctccatcagt agttactact ggagctggat tcggcagccc 120ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atctattaca gtgggagcac caactacaac 180ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagagcca gttctccctg 240aagctgagct ctgtgaccgc cgcagacacg gccgtgtatt actgtgcgag agggcggtac 300ttcgatgtct ggggccgtgg caccatggtc actgtctcct ca 342<210>87
<211>57<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(1)...(57)<223>前导序列<308>GenBank No.AF062252<400>87atg aaa cat ctg tgg ttc ttc ctt ctc ctg gtg gca gct ccc aga tgg 48Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp1 5 10 15gtc ctg tcc 57Val Leu Ser<210>88<211>110<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12E10VH1<400>88atgaaacatc tgtggttctt ccttctcctg gtggcagctc ccagatgggt cctgtcccag 60gtgcagctgc agcagtcggg cccaggactg gtgaagcctt cggagaccct 110<210>89<211>110<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>12E10VH2<400>89acccaatcca ctccagtccc ttccctgggg gctgccgaat ccagctccag tagtaactac 60tgatggagtc accagagaca gtgcaggtga gggacagggt ctccgaaggc 110<210>90<211>110<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12E10VH3<400>90tggagtggat tgggtatatc tattacagtg ggagcaccaa ctacaacccc tccctcaaga 60gtcgagtcac catatcagta gacacgtcca agagccagtt ctccctgaag 110<210>91<211>114<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12E10VH4<400>91tgaggagaca gtgaccatgg tgccacggcc ccagacatcg aagtaccgcc ctctcgcaca 60gtaatacacg gccgtgtctg cggcggtcac agagctcagc ttcagggaga actg114<210>92
<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12E10VHS，PCR引物<400>92ttcaagcttc caccatgaaa catctgtggt tc 32<210>93<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12E10VHA，PCR引物<400>93ttgggatcca ctcacctgag gagacagtga ccat34<210>94<211>426<212>DNA<213>Mus<220>
<221>CDS<222>(12)...(417)<223>12E10H，H链V区<400>94aagcttccac c atg aaa cat ctg tgg ttc ttc ctt ctc ctg gtg gca gct 50Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala
1 5 10ccc aga tgg gtc ctg tcc cag gtg cag ctg cag cag tcg ggc cca gga 98Pro Arg Trp Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly15 20 25ctg gtg aag cct tcg gag acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tct ggt 146Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly30 35 40 45gac tcc atc agt agt tac tac tgg agc tgg att cgg cag ccc cca ggg 194Asp Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly50 55 60aag gga ctg gag tgg att ggg tat atc tat tac agt ggg agc acc aac 242Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn65 70 75tac aac ccc tcc ctc aag agt cga gtc acc ata tca gta gac acg tcc 290Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser80 85 90aag agc cag ttc tcc ctg aag ctg agc tct gtg acc gcc gca gac acg 338Lys Ser Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr95 100 105gcc gtg tat tac tgt gcg aga ggg cgg tac ttc gat gtc tgg ggc cgt 386Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Arg110 115 120 125ggc acc atg gtc act gtc tcc tca ggtgagtgga tcccaa426Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser130<210>95<211>110
<212>PRT<213>Mus<400>95Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln1 5 10 15Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr20 25 30Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu35 40 45Met Ile Tyr Glu Gly Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe50 55 60Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu65 70 75 80Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Thr Arg85 90 95Ser Thr Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu100 105 110<210>96<211>330<212>DNA<213>Mus<400>96tcctatgtgc tgactcagcc accctcggtg tcagggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt ggttataact atgtctcctg gtaccaacag 120cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tatgagggca gtaaacggcc ctcaggggtt 180
tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatata caaccagaag cactcgggtg 300ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330<210>97<211>57<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(1)...(57)<223>前导序列<310>
<400>97atg gcc tgg acc gtt ctc ctc ctc ggc ctc ctc tct cac tgc aca ggc 48Met Ala Trp Thr Val Leu Leu Leu Gly Leu Leu Ser His Cys Thr Gly1 5 10 15tct gtg acc 57Ser Val Thr<210>98<211>110<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12E10VL1，PCR 引物<400>98atggcctgga ccgttctcct cctcggcctc ctctctcact gcacaggctc tgtgacctcc 60
tatgtgctga ctcagccacc ctcggtgtca gggtctcctg gacagtcgat 110<210>99<211>62<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12E10VL2，PCR引物<400>99tcatgagttt gggggctttg cctgggtgct gttggtacca ggagacatag ttataaccac 60caacgtcact gctggttcca gtgcaggaga tggtgatcga ctgtccagga110<210>100<211>110<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12E10VL3，PCR引物<400>100cccccaaact catgatttat gagggcagta aacggccctc aggggtttct aatcgcttct 60ctggctccaa gtctggcaac acggcctccc tgaccatctc tgggctccag110<210>101<211>102<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12E10VL4，PCR引物
<400>101taggacggtc agcttggtcc ctccgccgaa cacccgagtg cttctggttg tatatgagct 60gcagtaataa tcagcctcgt cctcagcctg gagcccagag at102<210>102<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12E10VLS，PCR引物<400>102atcaagcttc caccatggcc tggaccgttc t 31<210>103<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12E10VLA，PCR引物<400>103ctaggatccg ggctgaccta ggacggtcag cttggt36<210>104<211>387<212>DNA<213>Mus<220>
<221>CDS
<222>(1)...(387)<223>12E10L，L链V区<310>
<400>104atg gcc tgg acc gtt ctc ctc ctc ggc ctc ctc tct cac tgc aca ggc 48Met Ala Trp Thr Val Leu Leu Leu Gly Leu Leu Ser His Cys Thr Gly1 5 10 15tct gtg acc tcc tat gtg ctg act cag cca ccc tcg gtg tca ggg tct 96Ser Val Thr Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ser20 25 30cct gga cag tcg atc acc atc tcc tgc act gga acc agc agt gac gtt 144Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val35 40 45ggt ggt tat aac tat gtc tcc tgg tac caa cag cac cca ggc aaa gcc 192Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala50 55 60ccc aaa ctc atg att tat gag ggc agt aaa cgg ccc tca ggg gtt tct 240Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu Gly Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser65 70 75 80aat cgc ttc tct ggc tcc aag tct ggc aac acg gcc tcc ctg acc atc 288Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile85 90 95tct ggg ctc cag gct gag gac gag gct gat tat tac tgc agc tca tat 336Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr100 105 110Aca acc aga agc act cgg gtg ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc 384Thr Thr Arg Ser Thr Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val115 120 125
cta 387Leu<210>105<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)...(24)<223>FLAG，前导序列<400>105gac tac aag gat gac gac gat aag 24Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys<210>106<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12E10S，PCR引物<400>106tatgaattcc accatgaaac atctgtggtt 30<210>107<211>38<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>DB2，PCR引物<400>107taggagctac cgcctccacc tgaggagaca gtgaccat 38<210>108<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DB1，PCR引物<400>108gtctcctcag gtggaggcgg tagctcctat gtgctgactc agcc 44<210>109<211>59<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>12E10FA，PCR引物<400>109attgcggccg cttatcactt atcgtcgtca tccttgtagt ctaggacggt cagcttggt 59<210>110<211>792<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(11)...(778)<223>12E10，单链Fv<400>110gaattccacc atg aaa cat ctg tgg ttc ttc ctt ctc ctg gtg gca gct49Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala1 5 10ccc aga tgg gtc ctg tcc cag gtg cag ctg cag cag tcg ggc cca gga 97Pro Arg Trp Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly15 20 25ctg gtg aag cct tcg gag acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tct ggt 145Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly30 35 40 45gac tcc atc agt agt tac tac tgg agc tgg att cgg cag ccc cca ggg 193Asp Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly50 55 60aag gga ctg gag tgg att ggg tat atc tat tac agt ggg agc acc aac 241Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn65 70 75tac aac ccc tcc ctc aag agt cga gtc acc ata tca gta gac acg tcc 289Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser80 85 90aag agc cag ttc tcc ctg aag ctg agc tct gtg acc gcc gca gac acg 337Lys Ser Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr95 100 105gcc gtg tat tac tgt gcg aga ggg cgg tac ttc gat gtc tgg ggc cgt 385Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Arg110 115 120 125
ggc acc atg gtc act gtc tcc tca ggt gga ggc ggt agc tcc tat gtg 433Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Val130 135 140ctg act cag cca ccc tcg gtg tca ggg tct cct gga cag tcg atc acc 481Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr145 150 155atc tcc tgc act gga acc agc agt gac gtt ggt ggt tat aac tat gtc 529Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val160 165 170tcc tgg tac caa cag cac cca ggc aaa gcc ccc aaa ctc atg att tat 577Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr175 180 185gag ggc agt aaa cgg ccc tca ggg gtt tct aat cgc ttc tct ggc tcc 625Glu Gly Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser190 195 200 205aag tct ggc aac acg gcc tcc ctg acc atc tct ggg ctc cag gct gag 673Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu210 215 220gac gag gct gat tat tac tgc agc tca tat aca acc aga agc act cgg 721Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Thr Arg Ser Thr Arg225 230 235gtg ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta gac tac aag gat gac 769Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Asp Tyr Lys Asp Asp240 245 250gac gat aag tgataagcgg ccgc 792Asp Asp Lys255
<210>111<211>62<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>sc4.3，PCR引物<400>111ggtggctgag tcagcacata ggacgatccg ccaccacccg aaccaccacc acccgaacca 60cc 62<210>112<211>61<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>sc1.3，PCR引物<400>112gcaccatggt cactgtctcc tcaggtggtg gtggttcggg tggtggtggt tcgggtggtg 60g 61<210>113<211>822<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(11)...(807)<223>sc12E10，单链Fv
<400>113gaattccacc atg aaa cat ctg tgg ttc ttc ctt ctc ctg gtg gca gct 49Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala1 5 10ccc aga tgg gtc ctg tcc cag gtg cag ctg cag cag tcg ggc cca gga 97Pro Arg Trp Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly15 20 25ctg gtg aag cct tcg gag acc ctg tcc ctc acc tgc aet gtc tct ggt 145Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly30 35 40 45gac tcc atc agt agt tac tac tgg agc tgg att cgg cag ccc cca ggg 193Asp Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly50 55 60aag gga ctg gag tgg att ggg tat atc tat tac agt ggg agc acc aac 241Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn65 70 75tac aac ccc tcc ctc aag agt cga gtc acc ata tca gta gac acg tcc 289Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser80 85 90aag agc cag ttc tcc ctg aag ctg agc tct gtg acc gcc gca gac acg 337Lys Ser Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr95 100 105gcc gtg tat tac tgt gcg aga ggg cgg tac ttc gat gtc tgg ggc cgt 385Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Arg110 115 120 125ggc acc atg gtc act gtc tcc tca ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggt 433Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly130 135 140
ggt tcg ggt ggt ggc gga tcg tcc tat gtg ctg act cag cca ccc tcg 481Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser145 150 155gtg tca ggg tct cct gga cag tcg atc acc atc tcc tgc act gga acc 529Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr160 165 170agc agt gac gtt ggt ggt tat aac tat gtc tcc tgg tac caa cag cac 577Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His175 180 185cca ggc aaa gcc ccc aaa ctc atg att tat gag ggc agt aaa cgg ccc 625Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu Gly Ser Lys Arg Pro190 195 200 205tca ggg gtt tct aat cgc ttc tct ggc tcc aag tct ggc aac acg gcc 673Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala210 215 220tcc ctg acc atc tct ggg ctc cag gct gag gac gag gct gat tat tac 721Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr225 230 235tgc agc tca tat aca acc aga agc act cgg gtg ttc ggc gga ggg acc 769Cys Ser Ser Tyr Thr Thr Arg Ser Thr Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr240 245 250aag ctg acc gtc cta gac tac aag gat gac gacgat aag tgataagcgg818Lys Leu Thr Val Leu Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys255 260 265ccgc 82权利要求
1.增加TPO激动剂活性的方法，其通过将抗体改变为改变的抗体而进行，该改变的抗体包含二个或多个H链V区以及二个或多个L链V区。
2.将信号转导入细胞的方法，其通过使用改变的抗体交联TPO受体而进行，其中该改变的抗体包含两个或多个H链V区以及两个或多个L链V区。
3.权利要求1或2的方法，其中H链V区和L链V区通过接头相连。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中该接头是包含至少一个氨基酸的肽接头。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中该改变的抗体是包含一个H链V区和一个L链V区的单链Fv的多聚体。
6.权利要求5的方法，其中该改变的抗体由单链Fv的四聚体、三聚体或二聚体组成。
7.权利要求6的方法，其中该改变的抗体由单链Fv的二聚体组成。
8.权利要求5-7中任一项的方法，其中处于相同链上的H链V区和L链V区不结合形成抗原结合位点。
9.权利要求1-4中任一项的方法，其中该改变的抗体为包含二个或多个H链V区和二个或多个L链V区的单链多肽。
10.权利要求9的方法，其中该改变的抗体是包含二个H链V区以及二个L链V区的单链多肽。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中该改变的抗体另外包含用于肽纯化的氨基酸序列。
12.权利要求1-12中任一项的方法，其中该改变的抗体已经纯化。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中H链V区和/或L链V区是来源于人抗体的H链V区和/或L链V区。
14.权利要求1-12中任一项的方法，其中H链V区和/或L链V区是人源化的H链V区和/或L链V区。
15.权利要求1-14中任一项的方法，其中该改变的抗体为单特异性的改变的抗体。
16.权利要求1-14中任一项的方法，其中该改变的抗体为多特异性的改变的抗体。
17.权利要求16的方法，其中该改变的抗体为双特异性的改变的抗体。
18.权利要求15的方法，其中该L链V区和H链V区来自同一单克隆抗体。
19.权利要求1-18中任一项的方法，其显示与亲本单克隆抗体相同或更好的激动剂作用(ED50)。
20.权利要求19的方法，其相比亲本单克隆抗体显示至少2倍的激动剂作用(ED50)。
21.权利要求20的方法，其相比亲本单克隆抗体显示至少10倍的激动剂作用(ED50)。
22.权利要求1-18中任一项的方法，其来源于基本没有激动剂作用的亲本抗体。
全文摘要
本发明涉及改变的抗体，其包含单克隆抗体的至少二个H链V区以及至少二个L链V区，能够通过交联TPO受体转导信号进入细胞，从而展示TPO激动剂作用。该改变抗体能够用作TPO信号转导激动剂，并因此用作血小板减少相关的血液病、癌症或白血病化疗后的血小板减少症等的预防和/或治疗药物。
文档编号A61K39/395GK1721445SQ20041008566
公开日2006年1月18日 申请日期2001年10月22日 优先权日2000年10月20日
发明者土屋政幸, 大友俊彦, 薮田尚弘, 角田浩行, 织田哲郎 申请人:中外制药株式会社