专利名称：从小牛血中提取刺激细胞呼吸活性物质的方法
技术领域：
本发明涉及一种从血液中提取具有促进细胞对氧和葡萄糖的摄取和利用作用的血液提取物的方法，尤其涉及采用超滤等生物技术从小牛血中提取刺激细胞呼吸活性物质的方法。
背景技术：
小牛血去蛋白提取物是以小牛血液为原料，制备的小分子(分子量＜6000)肽、核苷酸和寡糖类物质。其主要药理作用是促进细胞对氧和葡萄糖的摄取和利用，使葡萄糖的无氧代谢转向有氧代谢，促使能量物质生成增多，延长细胞生存时间，促进组织细胞代谢及功能恢复和组织修复。
我国卫生部1992年批准进口奥地利HAFSLUND NYCOMED药厂的Actovegin注射剂及片剂在临床上使用，临床疗效肯定，国产该品种的注射剂型已获得生产批文。
中国专利(专利号为96120777.9)公开了一种提取小牛血去蛋白提取物的方法，此方法采用乙醇为溶媒去蛋白，然后去除溶媒，这种方法使提取的物质的活性损失，并且还存在处理量低、生产周期长、产量和收率低等问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种从小牛血中提取刺激细胞呼吸活性物质的方法，该方法解决了目前技术存在的处理量低、生产周期长、产量和收率低，并且活性损失较高的问题。
为了解决上述技术问题本发明是这样实现的
一种从小牛血中提取刺激细胞呼吸活性物质的方法，它包括下述步骤1).取非传染区的、经检验合格的健康小牛，采用无菌动脉方法采血，在采集过程中，不断用表面消毒过的棒状器具进行搅拌，使纤维蛋白吸附在无菌的棒状器具上，除去纤维蛋白，以避免出现凝血，得到去纤维蛋白小牛血；2).将去纤维蛋白小牛血在-30℃～40℃下反复冻融，于低温(0～8℃)条件下胶体磨中反复匀浆，显微镜下检查细胞基本破碎，得匀浆液；3).将匀浆液经过滤、不同截留分子量超滤膜分级超滤，超滤后最终截留分子量＜6000D，得小牛血去纤维蛋白提取物超滤液，此超滤液经低温减压浓缩并病毒灭活后得小牛血去蛋白提取物。
所述的一种从小牛血中提取刺激细胞呼吸活性物质的方法，其特征在于它包括下述步骤1).取非传染区的、经检验合格的、出生6个月以内的健康小牛，采用无菌动脉方法采血，在采集过程中，不断用表面消毒过的器具，器具为木棒进行搅拌，使纤维蛋白吸附在木棒上，除去纤维蛋白以避免出现凝血，得到去纤维蛋白小牛血；2).将去纤维蛋白小牛血在-30℃～40℃下反复冻融二-四次，于0--8℃下胶体磨中匀浆2分钟，重复三次，在显微镜下检查细胞基本破碎，得匀浆液；3).取匀浆液离心后，弃沉淀；取上清液，用截留分子量100000D的超滤膜超滤，得滤液A；取滤液A，用截留分子量10000D的超滤膜超滤，得滤液B；将滤液B用截留分子量8000D的超滤膜超滤得超滤液C；取超滤液C，经低温减压浓缩5-8倍得浓缩液；将浓缩液病毒在55-65℃下灭活10小时；灭活后的浓缩液用截留分子量6000D的超滤膜超滤，得超滤后的浓缩液；将检验合格的超滤后的浓缩液分装于一次性使用塑料输液袋中，低温(-18℃±2℃)贮存，即得小牛血去蛋白提取物。
本发明的优点和效果如下采用生物技术及分级超滤手段，在本产品的制造工艺中，首次采用分级超滤手段。超滤膜分离技术作为二十一世纪六大高新技术之一，以其常温低压下操作、无相变、能耗低等显著特点已成为一种分离过程的标准，在欧美等发达国家和地区得到了广泛的使用，超滤膜的分离过程具有以下几个显著特点1)在常温和低压下进行分离，因而能耗低，从而使设备的运行费用低；2)设备体积小、结构简单，故投资费用低；3)超滤分离过程只是简单的加压输送液体，工艺流程简单，易于操作管理；4)超滤膜是由高分子材料制成的均匀连续体，纯物理方法过滤，物质在分离过程中不发生质的变化，并且在使用过程中不会有任何杂质脱落，保证超滤液的纯净。
采用分级超滤技术手段，使本品活性物质活性状态保持好，不经过除溶媒过程，提高质量，提高收率；可进行工业规模化生产，生产周期短、成本降低。
传统技术提取工艺 本发明提取工艺处 理 量 25万ml 50万ml生产周期 7天 4天产量 2.5万ml 10万ml活性 QO2＝4.0～4.4μlO2/mg·h QO2＝4.2～4.8μlO2/mg·hSI＝2.5～2.8 SI＝2.7～3.0收率 10％ 20％
具体实施例方式
实施例一1).取非传染区的、经检验合格的出生5个月的健康小牛，采用无菌动脉方法采血，在采集过程中，不断用表面消毒过的木棒进行搅拌，使纤维蛋白吸附在无菌的木棒上，除去纤维蛋白，以避免出现凝血，得到去纤维蛋白小牛血；2).将去纤维蛋白小牛血在-20℃冷冻，30℃下融化，反复三次，于低温0--5℃条件下胶体磨中反复匀浆，显微镜下检查细胞基本破碎，得匀浆液；3).将匀浆液经过滤、不同截留分子量的超滤膜分级超滤，超滤后最终截留分子量＜6000D，得小牛血去纤维蛋白提取物超滤液，此超滤液经低温减压浓缩并病毒灭活后得小牛血去蛋白提取物。
实施例二1).取非传染区的、经检验合格的出生6个月的健康小牛，采用无菌动脉方法采血，在采集过程中，不断用表面消毒过的木棒进行搅拌，使纤维蛋白吸附在无菌的木棒上，除去纤维蛋白，以避免出现凝血，得到去纤维蛋白小牛血；2).将去纤维蛋白小牛血在-20℃冷冻，20℃下融化，反复三次，于低温5--8℃条件下胶体磨中反复匀浆，显微镜下检查细胞基本破碎，得匀浆液；3).将匀浆液经过滤、不同截留分子量的超滤膜分级超滤，超滤后最终截留分子量＜6000D，得小牛血去纤维蛋白提取物超滤液，此超滤液经低温减压浓缩并病毒灭活后得小牛血去蛋白提取物。
实施例三1).取非传染区的、经检验合格的出生3个月的健康小牛，采用无菌动脉方法采血，在采集过程中，不断用表面消毒过的木棒进行搅拌，使纤维蛋白吸附在无菌的玻璃棒，除去纤维蛋白，以避免出现凝血，得到去纤维蛋白小牛血；2).将去纤维蛋白小牛血在-20℃冷冻，40℃下融化，反复三次，于低温0--5℃条件下胶体磨中反复匀浆，显微镜下检查细胞基本破碎，得匀浆液；3).将匀浆液经过滤、不同截留分子量的超滤膜分级超滤，超滤后最终截留分子量＜6000D，得小牛血去纤维蛋白提取物超滤液，此超滤液经低温减压浓缩并病毒灭活后得小牛血去蛋白提取物。
实施例四1).取非传染区的、经检验合格的、出生4个月的健康小牛，采用无菌动脉方法采血，在采集过程中，不断用表面消毒过的器具，器具为木棒或玻璃棒进行搅拌，使纤维蛋白吸附在木棒上，除去纤维蛋白以避免出现凝血，得到去纤维蛋白小牛血；2).将去纤维蛋白小牛血在-30℃冻，40℃下融化，反复四次，于0--5℃下胶体磨中匀浆2分钟，重复三次，在显微镜下检查细胞基本破碎，得匀浆液；3).取匀浆液于4000转/分钟离心20分钟，弃沉淀；取上清液，用截留分子量100000D的超滤膜超滤，得滤液A；用截留分子量10000D的超滤膜超滤，得滤液B；将滤液B用截留分子量8000D的超滤膜超滤得超滤液C；取超滤液C，经低温减压浓缩8倍得浓缩液；将浓缩液病毒在60℃下灭活，灭活10小时左右；灭活后的浓缩液用截留分子量6000D的超滤膜超滤，得超滤后的浓缩液；将检验合格的超滤后的浓缩液分装于一次性使用塑料输液袋中，低温-20℃贮存，即得小牛血去蛋白提取物。
实施例五1).取非传染区的、经检验合格的、出生2个月的健康小牛，采用无菌动脉方法采血，在采集过程中，不断用表面消毒过的器具，器具为木棒进行搅拌，使纤维蛋白吸附在木棒上，除去纤维蛋白以避免出现凝血，得到去纤维蛋白小牛血；
2).将去纤维蛋白小牛血在-30℃冻，20℃下融化，反复冻融二次，于0--5℃下胶体磨中匀浆2分钟，重复三次，在显微镜下检查细胞基本破碎，得匀浆液；3).取匀浆液离心后，弃沉淀；取上清液，用截留分子量100000D的超滤膜超滤，得滤液A；用截留分子量10000D的超滤膜超滤，得滤液B；将滤液B用截留分子量8000D的超滤膜超滤得超滤液C；取超滤液C，经低温减压浓缩6倍得浓缩液；将浓缩液病毒在65℃下灭活，灭活15小时左右；灭活后的浓缩液用截留分子量6000D的超滤膜超滤，得超滤后的浓缩液；将检验合格的超滤后的浓缩液分装于一次性使用塑料输液袋中，低温(-18℃±2℃)贮存，即得小牛血去蛋白提取物。
实施例六1).取非传染区的、经检验合格的、出生6个月以内的健康小牛，采用无菌动脉方法采血，在采集过程中，不断用表面消毒过的器具，器具为木棒进行搅拌，使纤维蛋白吸附在木棒上，除去纤维蛋白以避免出现凝血，得到去纤维蛋白小牛血；2).将去纤维蛋白小牛血在-20℃冻，10℃下融化，反复冻融四次，于0～8℃下胶体磨中匀浆2分钟，重复三次，在显微镜下检查细胞基本破碎，得匀浆液；3).取匀浆液离心后，弃沉淀；取上清液，用截留分子量100000D的超滤膜超滤，得滤液A；用截留分子量10000D的超滤膜超滤，得滤液B；将滤液B用截留分子量6000D的超滤膜超滤得超滤液C；取超滤液C，经低温减压浓缩5倍得浓缩液；将浓缩液病毒在60℃下灭活；灭活后的浓缩液用截留分子量6000D的超滤膜超滤，得超滤后的浓缩液；将检验合格的超滤后的浓缩液分装于一次性使用塑料输液袋中，低温(-18℃±2℃)贮存，即得小牛血去蛋白提取物。使用上述本发明提供的方法取得的小牛血去蛋白提取物性状为淡黄色澄明液体，其检测情况如下[检查]pH值为6.5-7.5(中国药典2000年版二部附录VIH)吸收度420nm波长处的吸收度小于0.25(中国药典2000年版二部附录IVA)蛋白质阴性细菌内毒素每1ml中含细菌内毒素量小于1EU(中国药典2000年版二部附录XIE)照高效液相色谱法(中国药典2000年版二部附录VD)测定大分子量物质。用凝胶色谱柱(如Pharmarcia Superdex Peptide或TSKG2000SW柱)，乙腈-三氟醋酸-水(40∶0.1∶60)为流动相，检测波长为214nm，按面积归一化法计算，含高分子量物质(分子量＞5800D)的量不得过2.0％。
采用瓦氏呼吸检压仪测定豚鼠肝匀浆的呼吸活力，从测得的耗氧量计算出计算出呼吸活力QO2为4.0～6.0μlO2/mg·h；刺激指数(SI)为2.5～4.0。
(1)总固体量，精密量取2ml，置称量瓶中，在55℃下真空干燥至恒重，计算出，每1ml中含固型物为38～60mg。
(2)采用中国生物制品规程附录蛋白质含量测定法测定本发明多肽含量，每1ml为0.90～1.5mg。
(3)游离氨基酸含量，用高效液相进行氨基酸分析，游离氨基酸含量每1ml不少于0.80～1.2mg。
权利要求
1.一种从小牛血中提取刺激细胞呼吸活性物质的方法，它包括下述步骤1).取非传染区的、经检验合格的健康小牛，采用无菌动脉方法采血，在采集过程中，不断用表面消毒过的器具进行搅拌，使纤维蛋白吸附在无菌的器具上，除去纤维蛋白，以避免出现凝血，得到去纤维蛋白小牛血；2).将去纤维蛋白小牛血在-30℃～40℃下反复冻融，于低温(0～8℃)条件下胶体磨中反复匀浆，显微镜下检查细胞基本破碎，得匀浆液；3).将匀浆液经过滤、不同截留分子量的超滤膜分级超滤，超滤后最终截留分子量＜6000D，得小牛血去纤维蛋白提取物超滤液，此超滤液经低温减压浓缩并病毒灭活后得小牛血去蛋白提取物。
2.根据权利要求1所述的一种从小牛血中提取刺激细胞呼吸活性物质的方法，其特征在于它包括下述步骤1).取非传染区的、经检验合格的、出生6个月以内的健康小牛，采用无菌动脉方法采血，在采集过程中，不断用表面消毒过的器具，器具为木棒或玻璃棒进行搅拌，使纤维蛋白吸附在木棒上，除去纤维蛋白以避免出现凝血，得到去纤维蛋白小牛血；2).将去纤维蛋白小牛血在-30℃～40℃下反复冻融二～四次，于0～8℃下胶体磨中匀浆2分钟，重复三次，在显微镜下检查细胞基本破碎，得匀浆液；3).取匀浆液离心后，弃沉淀；取上清液，用截留分子量100000D的超滤膜超滤，得滤液A；取滤液A，用截留分子量10000D的超滤膜超滤，得滤液B；将滤液B用截留分子量8000D的超滤膜超滤得超滤液C；取超滤液C，经低温减压浓缩5-8倍得浓缩液；将浓缩液病毒在55～65℃下灭活10小时；灭活后的浓缩液用截留分子量6000D的超滤膜超滤，得超滤后的浓缩液；将检验合格的超滤后的浓缩液分装于一次性使用塑料输液袋中，低温(-18℃±2℃)贮存，即得小牛血去蛋白提取物。
全文摘要
本发明公开了一种从小牛血中提取刺激细胞呼吸活性物质的方法，它包括下述步骤取健康小牛，采用无菌动脉方法采血，不断用表面消毒过的器具进行搅拌，使纤维蛋白吸附在无菌的器具上，除去纤维蛋白得到去纤维蛋白小牛血；将其在－30℃～40℃下反复冻融，于低温(0～8℃)条件下胶体磨中反复匀浆，得匀浆液；将匀浆液经过滤、不同截留分子量的超滤膜分级超滤，超滤后最终截留分子量＜6000D，得小牛血去纤维蛋白提取物超滤液，此超滤液经低温减压浓缩并病毒灭活后得小牛血去蛋白提取物。所用设备体积小、结构简单，投资费用低；制备的活性物质活性状态保持好，不经过除溶媒过程，提高质量，提高收率；可进行工业规模化生产，生产周期短、成本降低。
文档编号A61K35/14GK1634137SQ200410087620
公开日2005年7月6日 申请日期2004年11月19日 优先权日2004年11月19日
发明者王光, 李莉, 史晓丹, 马骉 申请人:沈阳斯佳科技发展有限公司