专利名称：人体初乳提取物分泌型免疫球蛋白sigA提取工艺及其制品的制作方法
技术领域：
本发明属于用生物工程技术从人体母乳初乳中，分离提取出分泌型免疫球蛋白sigA的技术领域。特别涉及一种人体初乳提取物分泌型免疫球蛋白sigA提取工艺及其制品。
背景技术：
1、免疫球蛋白的基本结构和性质免疫球蛋白是具有抗体活性或化学结构与抗体相似的蛋白分子的总称。它既是抗体又是抗原。作为免疫球蛋白分子，是一种强抗原，用其免疫动物获得的抗体被称为“抗抗体”，广泛用于免疫测定系统中；作为抗体，是生物体抗御外来抗原侵袭的一种生理成分。
免疫球蛋白普遍存在于哺乳动物和人类的血液、组织液和外分泌液中。迄今为止人类已经发现的免疫球蛋白主要有五类IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。它们的相对分子质量很大，通常由1000个以上的氨基酸连接而成。其基本结构相同，都是由4条多肽链组成的对称性结构。1959年Edelman和Porter分别采用化学还原法和酶解法研究解剖了免疫球蛋白分子的结构，大胆提出了Ig结构的四肽链模式。Ig分子是由两条相同的重链(heavy chain，H链)和两条相同的轻链(light chain，L链)依靠链内和链间的二硫键连接而成的“Y”型分子。重链分子量约为50000～70000，轻链分子量约为22500。完整抗体Ig单体的分子量约160000～200000，分子量的差别主要是糖基化和功能区的不同造成的。重链由约450个氨基酸(IgG、IgA、IgD)或570个氨基酸(IgM、IgE)组成，轻链约有214个氨基酸组成。H链和L链靠近N-端部分的110个氨基酸序列的组成及排列变化多端，称为抗体可变区(variable region，V区)。靠近C-端部分的氨基酸序列的组成、数量、排列则相对恒定，称为抗体恒定区或叫稳定区(constant region，C区)。H链和L链的V区和C区分别简写VH、CH和VL、CL。VH和VL中的某些部位，氨基酸的变化更具有多样性，称为高变区或超变区(hypervariableregion，HV)。这些高变区都在Ig分子的抗原结合部位，因此又叫互补决定区(complementaritydetermining region，CDR)。重链和轻链上各有三对CDR如VL中的24～34、50～55和89～97和VH中的31～35、50～65、81～85，每个CDR长约5～16个氨基酸。L链和H链的V区是Ig分子同抗原的结合部位，并决定了抗体同抗原结合的特异性。高变区以外的V区序列称为框架区(framework region，FR)。每个V区有四个FR区。因此，V区可以用HV和FR亚区表示为FR1-HV1-FR2-HV2-FR3-HV3-FR4。FR区为β片层(β-sheet)结构。氨基酸组成相对保守，不与抗原分子直接结合，但对维持CDR的空间构型起着极为重要的作用。L链含有两个链内二硫键，一个位于V区，三个位于C区。二硫键将周围的约110个氨基酸连接成一个环型的区段，每个区段均一定的功能。L链具有两个功能区VL和CL，H链有四个功能区，VH、CH1、CH2、CH3。IgM和IgE多一个H链内二硫键，因此多一个功能区CH4。V区中氨基酸排列顺序有一定的同源性，CH区的氨基酸排列顺序也具有一定的同源性，但V区同C区无同源性。这种同源性不是偶然的，而是反应了Ig分子在进化上来自同一祖系。CH1和CH2之间的区域称为铰链区(hinge region)，重链间的二硫链多集中在该区，呈平行排列，并含有相当多的脯氨酸，而其他功能区中脯氨酸很少。铰链区短而柔曲，赋予Ig分子一定的柔顺性，使Ig分子可以更好地同抗原结合。由于该区含有二硫键及脯氨酸，妨碍了螺旋结构的形成，造成该区不能形成二级结构，因而易被酶水解。
众所周知，免疫球蛋白广泛存在于人和哺乳类动物的血清和乳汁以及分泌液中。而分泌型免疫球蛋白sIgA不仅作用独特，而且仅存在于人类及哺乳动物的外分泌液中，如唾液、泪液、气管咽部分泌液、肠液、胆汁及尿液和产妇的初乳中。而又以产妇的乳汁(初乳)含量最高。
初乳是产妇在产后3～10天所分泌的乳汁。其乳液黄色透明，与成熟乳比较，含有较多的蛋白质、短链脂肪酸以及丰富的抗体和酶。在初乳中维生素A、维生素E和胡萝卜素都较高，并且含有特殊的氨基酸，如牛磺酸和ω-3脂肪酸DHA、EPA及亚麻酸。此外还有生长因子和分泌型免疫球蛋白sIgA等。
初乳中还有很多结合蛋白，如维生素D结合蛋白，维生素B12结合蛋白，结合钙、锌的乳清蛋白，结合铁的乳铁蛋白和转铁蛋白。乳铁蛋白和转铁蛋白除有运输铁的功能外，也是生长因子，并具有抑菌和杀菌的功能。初乳中有很多免疫球蛋白，其中最重要的是分泌型免疫球蛋白sIgA且含量最高。
分泌型免疫球蛋白sIgA除了具有其他免疫球蛋白的功能和作用外，它的独特之处在于a)能使微生物黏附在一起而阻止微生物附着于肠粘膜细胞，防止微生物入侵肠屏障，同时它能吸引中性粒细胞和巨噬细胞来杀灭微生物。虽然其他的免疫球蛋白也有阻止细菌黏附肠粘膜细胞的能力，但分泌型免疫球蛋白sIgA的阻止能力是其他免疫球蛋白的7～10倍，同时它更能耐受肠中温度和pH的变化。
b)它具有免疫排除功能，即分泌型免疫球蛋白sIgA能结合饮食中大量的可溶性抗原以及肠道正常菌群或病原微生物所释放的热原物质，防止他们进入血液。
c)能有效抵抗蛋白酶解，更有效地阻止病原体的黏附和入侵，且胞内转运过程中的IgA还可中和胞内感染的病毒。并可以粘附到病毒表面预防感冒，而无需伴随常规抗体-抗原反应的补体生成等过程。这是唯一能够抵御各种不同结构致病原侵害的物质。
d)初乳中胰岛素样生长因子(IGF-I和II)不仅能使运动员极限运动后的恢复时间缩短，并可提高运动员机体的再次爆发能力，增加进行性力量和速度以及持久力。
另外，肠道屏障破坏直接导致肠内细菌和内毒素移位进入血液，可能是造成运动员血便、运动性腹泄及由此导致运动能力下降的重要诱因之一。而初乳提取物制品(sIgA)及双歧因子，在无兴奋剂作用的前提下，可有效保护肠黏膜、增殖有益菌群、提高免疫力。SIgA是一种机制确切、独特而又重要的肠粘膜表面免疫系统组成部分，通常独立于总体免疫系统之外发生作用。能有效预防由运动应激损伤引发的运动性肠道疾病的发生；具有确切抗腹泄、抗感冒、抗疲劳的功能目标。
2、免疫球蛋白的制备及其制品目前，免疫检测和医药治疗中所用的免疫球蛋白主要是从哺乳动物和人的血清中提取制备的。如人血白蛋白、丙种球蛋白等。但这样提取出来的免疫球蛋白能够激活标本中的补体系统，并且能够与类风湿因子产生非特异性结合，对试验产生干扰，而且这种干扰随着试验的敏感性而增加，并且还很难确定和消除，同时制取的成本太高。而且制取出的免疫球蛋白也仅限与IgA、IgG、IgE、IgD、IgM等血清型免疫球蛋白。
中国专利局曾公开了申请号为97106221.8的《人体母乳制品及其精粉生产工艺》专利申请资料，该专利申请仅是将人体母乳经脱脂、消毒后就制成冻干粉，加工成各种成分混杂的母乳精粉并在此基础上添加辅料制成母乳制品。该生产方法没有专门针对人体初乳提取分泌型免疫球蛋白sigA，且其制品中添加的辅料仅起到填充胶囊的作用，没有科学的针对性。
发明内容
本发明提供一种人体初乳提取物分泌型免疫球蛋白sigA提取工艺，其最终目的是为了获得人体母乳分泌型免疫球蛋白(sIgA)提取物。
本发明的再一目的在于提供一种分泌型免疫球蛋白(sIgA)制品。
为达上述目的，本发明采用如下技术方案，一种人体初乳提取物分泌型免疫球蛋白sigA提取工艺，包括以下工艺步骤1、收集健康产妇1～15天内多余初乳，在收集过程中可以采用PH值、比重、感官等检查方法对控制原料质量；2、离心，为更好地达到除去杂质和脂肪的目的，所述离心步骤分可以为两步，首先在8～12℃下，以600～800r/min的速度离心10分钟左右，以除去杂质；然后在30～40℃下，以2500～3000r/min的速度高速离心10分钟左右，以去除杂质、脂肪；3、巴氏灭菌，在63.5℃下，经过30min，以杀灭微生物和病毒；4、凝乳，可以采用在36℃下凝乳酶法，也可以采用微生物法或离子交换剂法去除酪蛋白；5、收集凝乳后的上清液；可以采用在4℃下，以7000r/min的速度离心20分钟左右的方法收集；6、盐析，可以采用加入浓度为30～50％的硫酸铵、硫酸钠或硫酸镁等进行盐析；7、收集盐析后的沉淀，可以采用在4℃下，以15000～18000r/min的速度离心20分钟，从而去除上清液，收集沉淀；8、浓缩，可以采用超滤浓缩技术，在10万膜0.1MPa下，除去乳糖、矿物质、水分；9、冷冻干燥，获得分泌型免疫球蛋白sigA冻干粉。
通过本明方法能够获得分泌型免疫球蛋白sigA提取物。
一种分泌型免疫球蛋白(sIgA)制品。包括通过上述方法获得的分泌型免疫球蛋白sigA提取物和添加剂，其质量百分比分别为分泌型免疫球蛋白sigA提取物15～85％，添加剂15～85％，其中所述添加剂可以是乳糖、黄芪III糖(F3)、牛磺酸或生物制剂表皮生长因子之一或其组合。所述添加剂中，各组份的质量百分可以是乳糖5～85％，黄芪III糖0～15％，牛磺酸0～15％，生物制剂表皮生长因子0～15％。其中乳糖能有效和明显保护分泌型免疫球蛋白(sIgA)组分的活性，在较长的时间内保持不变。而牛磺酸是人体所必需的氨基酸，该成分与分泌型免疫球蛋白(sIgA)结合运用，能促进大脑细胞DNA、RNA及蛋白质的合成，对提高免疫力、增强力量、改善神经传导和视觉功能有重要作用。中草药黄芪提取物-黄芪多糖(III糖F3)成分，该成分与分泌型免疫球蛋白(sIgA)结合运用，能有效和显著提高机体NK细胞(自然杀伤细胞)的活性。从而提高免疫功能。生物制剂-表皮生长因子(EGF)，该成分与本发明结合运用，能进一步显著提高修复机体破损的各类粘膜组织的作用，从而有效的防止各种病原微生物、病毒等有害物质入侵机体。本发明的最终产品的添加剂科学合理，针对性强。
具体实施例方式
以下结合三个人体初乳提取物分泌型免疫球蛋白sigA提取工艺实施例说明本发明。该三个提取工艺实施例中，除表一列出的参数外，其余均与下述工艺步骤相同。
人体初乳提取物分泌型免疫球蛋白sigA提取工艺，包括以下步骤
1、取健康产妇多余初乳，采用PH值、比重、感官等检查方法对控制原料质量；2、离心除去细胞和杂质；3、离心除去脂肪，并在-25℃下冷藏；4、巴氏消毒，在63.5℃下，经过30min，从而杀灭微生物和病毒；5、将冷冻的脱脂乳在室温下解冻后，凝乳，除去酪蛋白；6、收集凝乳后的上清液；将凝块破碎，在4℃下，以7000r/min离心20分钟，去掉沉淀；7、盐析，在乳清中加入硫酸盐，使其饱和度达35％，4℃下静置12小时，8、离心，弃掉上清液，收集沉淀；9、用原乳清体积1/4，PH值为7的0.01mol/L的PBS溶液溶解，用截留相对分子质量为10万的滤膜，在操作压力为0.1Mpa的条件下进行超滤浓缩纯化，浓缩到原体积的1/10，再加等体积的PBS重复超滤数次，直到滤液中无NH离子存在为止；10、经微膜过滤除菌后，冷冻干燥得免疫球蛋白sIgA冻干粉。
表一
通过上述三实施例均可获得人体初乳分泌型免疫球蛋白sigA提取物。
人体初乳分泌型免疫球蛋白sigA制品实施例。
由于上述三提取工艺实施例均可作为制品的主料，在此仅以实施例一获得的人体初乳分泌型免疫球蛋白sigA提取物，作为制品实施例的主料，通过加入添加剂制成制品。其中所述添加剂可以是乳糖、黄芪III糖(F3)、牛磺酸或生物制剂表皮生长因子。以下举九个制品的实施例列表说明人体初乳分泌型免疫球蛋白sigA制品。
表二
上述九个实施例的最终产品添加剂科学合理，针对性强。
权利要求
1.一种人体初乳提取物分泌型免疫球蛋白sigA提取工艺，包括以下工艺步骤收集健康产妇多余初乳；离心除去杂质、脂肪；巴氏灭菌；凝乳，去除酪蛋白；收集凝乳后的上清液；盐析；去除上清液，收集沉淀；浓缩，除去乳糖、矿物质、水分；冷冻干燥，获得sIgA提取物。
2.根据权利要求1所述的人体初乳提取物分泌型免疫球蛋白sigA提取工艺，其特征在于所述离心除去杂质、脂肪分为两步，首先在8～12℃下，以600～800r/min离心10分钟除去细胞和杂质；然后再在30～40℃下，以2500～3000r/min离心10分钟除去脂肪。
3.根据权利要求1或2所述的人体初乳提取物分泌型免疫球蛋白sigA提取工艺，其特征在于所述巴氏灭菌的温度为63.5℃，时间为30分钟。
4.根据权利要求1或2所述的人体初乳提取物分泌型免疫球蛋白sigA提取工艺，其特征在于所述凝乳步骤中，凝乳方法采用36℃下凝乳酶法、微生物法或离子交换剂法之一方法。
5.根据权利要求1或2所述的人体初乳提取物分泌型免疫球蛋白sigA提取工艺，其特征在于所述盐析方法为加入浓度为30～50％的硫酸铵、硫酸钠或硫酸镁之一或其组合。
6.根据权利要求1所述的人体初乳提取物分泌型免疫球蛋白sigA提取工艺，其特征在于所述步骤收集凝乳后的上清液的方法为在4℃下，以7000r/min转速离心20分钟后收集。
7.根据权利要求1或2所述的人体初乳提取物分泌型免疫球蛋白sigA提取工艺，其特征在于所述浓缩步骤中，采用超滤浓缩技术，在10万膜0.1MPa下进行浓缩。
8.一种分泌型免疫球蛋白sIgA制品，包括分泌型免疫球蛋白sIgA和添加剂，其特征在于所述sIgA提取物采用权利要求1至7中任一权利要求所述方法制成，所述添加剂为乳糖、黄芪III糖、牛磺酸或生物制剂表皮生长因子之一或其组合，其质量百分比分别为，sIgA提取物15～85％，添加剂15～85％。
9.根据权利要求8所述的分泌型免疫球蛋白sIgA制品，其特征在于所述添加剂中，各组份的质量百分比分别为乳糖5～85％，黄芪III糖0～15％，牛磺酸0～15％，生物制剂表皮生长因子0～15％。
全文摘要
本发明提供一种人体初乳提取物分泌型免疫球蛋白sigA提取工艺及其制品，所述提取工艺包括以下工艺步骤收集健康产妇多余初乳；离心除去杂质、脂肪；巴氏灭菌；凝乳，去除酪蛋白；收集凝乳后的上清液；盐析；去除上清液，收集沉淀；浓缩，除去乳糖、矿物质、水分；冷冻干燥，获得sIgA提取物。一种分泌型免疫球蛋白sIgA制品，包括分泌型免疫球蛋白sIgA和添加剂，所述sIgA提取物采用上述方法制成，所述添加剂为乳糖、黄芪III糖、牛磺酸或生物制剂表皮生长因子之一或其组合，其质量百分比分别为，sIgA提取物15～85％，添加剂15～85％。本发明的最终产品的添加剂科学合理，针对性强。
文档编号A61P37/04GK1660906SQ20041009327
公开日2005年8月31日 申请日期2004年12月20日 优先权日2004年12月20日
发明者蒋来高 申请人:蒋来高