作为t－型钙通道阻滞剂的3,4－二氢喹唑啉衍生物及其制备方法

专利名称：作为t－型钙通道阻滞剂的3,4－二氢喹唑啉衍生物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及作为T-型钙通道阻滞剂的3，4-二氢喹唑啉衍生物或其盐及其制备方法。本发明进一步涉及含有上述化合物的用于阻滞T-型钙通道的组合物。
背景技术：
神经细胞中的钙在神经细胞之间的信号传递中起着重要的作用。钙具有多种通道。然而，当向其传递末端刺激时，电压依赖性Ca2+通道起主要作用。也就是说，作为膜蛋白的电压依赖性Ca2+通道，通过控制细胞外钙离子的内流，调节各种细胞内功能(如肌肉收缩、神经组织的形成、突触的适应性、神经递质和激素的分泌、基因表达等)。
根据其生物物理性质电压依赖性Ca2+通道在功能上可以分为两种类型低电压激活Ca2+通道(以下称为“LVA”)，其在低电压下被激活；以及高电压激活Ca2+通道(以下称为“HVA”)，其在高电压下被激活。根据其诱导的电流的药理学性质，HVA钙通道又可以被细分为L-、P/Q、N-和R-型。LVA钙通道的特征在于其传导性小，可以被快速地激活或灭活。因此，其属于T(瞬时)-型钙通道(Tsien，R.W.等，Trends Neurosci.1988，11，431-438)。
据报道，T-型钙通道与神经细胞的激发(Huguenard，J.R.等，Annu.Rev.Physiol.1996，58，329-348)、心脏起搏器活性(Zhou，Z.等，J.Mol.Cell.Cardiol.1994，26，1211-1219)、醛固酮的分泌(Rossier，M.F.等，Endocrinology 1996，137，4817-4826)、受精作用(Arnoult，C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.1996，93，13004-13009)以及疼痛的缓解(Ikeda，H.等，Science 2003，299，1237-1240)有关。
T-型钙通道可由于遗传或环境原因，例如癫痫(Tsakiridou，E.等，J.Neurosci.1995，15，3110-3117)、高血压(Self，D.A.等，J.VACS.Res.1994，31，359-366)、心室肥厚(Nuss，H.B.等，Circ.Res.1995，73，777-7825)、疼痛(Shin，H.S.等，Science 2003，302，117-119)以及心绞痛(Van der Vring，J.A.et al，Am.J.Ther.1999，6，229-233)而变得过度表达。通过基因克隆技术，已发现T-型钙通道中具有三种类型的基因α1G、α1H和α1I(Talley，E.M.等，J.Neurosci.1999，19，1895-1911)。现已作了很多努力试图开发选择性地抑制T-型钙通道的阻滞剂。然而，除了咪拉地尔和ZD7288(Felix，R.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.2003，311，187-192)以外，还没有发现有效的T-型钙通道阻滞剂。因此，通过开发一种选择性T-型钙通道阻滞剂，可能开发出用于癫痫、高血压和疼痛相关的疾病的全新治疗剂。
阻滞T-型钙通道的代表性药物为Hoffman La Roche Ltd.的咪拉地尔(注册商标Posicor)。已发现该药物能够有效地治疗高血压、心绞痛和脑中风。自1997年5月以来，该药物已作为治疗高血压的药物上市。然而人们发现由于抑制CYP3A4肝酶而产生的药物-药物的相互作用可导致副作用。于是，1999年6月该药物退出了市场，自其第一次进入市场至此仅13个月。
因此，在本领域需要开发一种具有可以替代咪拉地尔的新结构的选择性T-型钙通道阻滞剂。
发明概述本发明的目的是提供一种具有新结构骨架的T-型钙通道阻滞剂，其比咪拉地尔的治疗效果更好，而且不产生任何副作用。
具体地说，本发明提供以式1表示的新3，4-二氢喹唑衍生物及其盐，其可以有效用作选择性T-型钙通道阻滞剂，以及其制备方法。并且，本发明还提供用于阻滞T-型钙通道的组合物，包括上述3，4-二氢喹唑衍生物或其盐和药学上的可接受载体。此外，本发明还提供一种通过给予治疗有效量的3，4-二氢喹唑啉衍生物或其药学上的可接受盐来治疗选自心绞痛、高血压、心肌疾病、疼痛和癫痫的疾病的方法。
式1
其中，n为1至4的整数；R1选自氢、羟基、卤素、硝基、C1-C8烷基、C3-C6环烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、取代或未取代的芳基和杂芳基、C1-C6烷氧基、C3-C6环烷氧基、(芳基或杂芳基)氧基、C1-C6硫代烷氧基、C3-C6环硫代烷氧基、(芳基或杂芳基)硫代氧基以及氨基；R2为C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C1-C6烷氧基烷基、C3-C6环烷氧基烷基、C1-C6链烯基、取代或未取代的芳基和杂芳基；4-吗啉基；4位上随机取代的哌嗪基；1-吡咯烷基；1-哌啶基；或-NR1R2，其中R1和R2各自独立地选自C1-C6烷基、C3-C6环烷基、取代或未取代的芳基和杂芳基；R3选自C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C1-C6烷氧基烷基、C3-C6环烷氧基烷基、取代或未取代的芳基和杂芳基；R4为R4为X-(CH2)n-Y(NH)o-S(O)m-Z，其中X为氧或氮；n为1至4的整数；Y为取代或未取代的C3-C6环烷基、芳基或杂芳基；o为0或1的整数；m为0至2的整数；Z选自取代或未取代的C3-C6环烷基、芳基或杂芳基；在o为0的条件下，-S(O)m-Z不存在。
附图的简单说明

图1为表示T-型钙通道性质的曲线图，其主要在-30mV的低电压下被激活。
图2为表示T-型钙通道性质的曲线图，其中的激活电流可以快速激活和灭活。
图3为表示Ni2+对T-型钙通道产生的抑制效果的曲线图。
图4为表示咪拉地尔对T-型钙通道的抑制效果的曲线图。
图5为表示本发明化合物对T-型钙通道的抑制效果图。
图6为表示本发明化合物细胞毒性图。
优选实施方式的详细描述本发明内容是基于对3，4-二氢喹唑啉衍生物的研究结果，该衍生物能够有效地选择性阻滞T-型钙通道。
优选的本发明的式1化合物的代表性例子有4-(N-苄基乙酰氨基)-3-苯基-2-(哌啶-1-基)-3，4-二氢喹唑啉(KYS05001)，4-(N-苄基乙酰氨基)-3-苯基-2-(吗啉-1-基)-3，4-二氢喹唑啉(KYS05026)，
4-(N-苄基乙酰氨基)-3-苯基-2-(4-甲基哌嗪基)-3，4-二氢喹唑啉(KYS05028)，4-[N-(4-硝基苄基)乙酰氨基)-3-苯基-2-(哌啶-1-基)-3，4-二氢喹唑啉(KYS05034)，4-{N-[4-(4-甲基苯磺酰氨基)苄基]乙酰氨基}-3-苯基-2-(哌啶-1-基)-3，4-二氢喹唑啉(KYS05041)，以及4-{N-[4-(4-氟苯磺酰氨基)苄基]乙酰氨基}-3-苯基-2-(哌啶-1-基)-3，4-二氢喹唑啉(KYS05042)。上述化合物各自的化学式如下
本发明的化合物可以通过如反应图解1和2所示的方法制备，这些方法仅仅是为了示范性目的，而不是对本发明的范围进行限定。
反应图解1 本发明化合物的碳化二亚胺化合物(4)中间体可以按照Wang，F.等所描述的常规方法(Tetrahedron Lett.1997，38，8651-8654)适当地加以改进来合成。在本发明的一个优选的实施方式中，在合适的温度(优选70℃)下用SnCl2处理起始物2-硝基肉桂酸酯(1)将硝基还原成氨基。通常，碳化二亚胺通过使亚氨基正膦与杂-累积多烯(异氰酸酯或硫代异氰酸酯(tioisocyanate))进行氮杂-维蒂希反应制得(Wamhoff，H.等，Adv.Heterocycl.Chem.1995，64，159；Molina，P.等，Synthesis 1994，1197-1217)。然而，当脲型化合物制备，而非具有三个苯基环的亚氨基正膦时，在室温下可以得到定量的产率。因此，其反应条件更加简单。因此，本发明采用由脲型化合物制备碳化二亚胺的方法。
因此，将如此得到的胺化合物(2)溶于四氢呋喃(THF)或苯(优选苯)中，向其中加入异氰酸苯酯。然后，将混合物在室温下搅拌以获得脲型化合物(3)。将脲型化合物用二溴三苯基膦和三乙胺进行脱水反应制得碳化二亚胺化合物(4)(Gololobov，Y.G.等，Tetrahedron 1992，48，1353-1406；Larksarp，C.等J.Org.Chem.1998，63，6229-6233)。在该步骤中，若用异氰酸酯或硫代异氰酸酯(tioisocyanate)代替异氰酸苯酯，则可以在二氢喹唑啉的3位上引入各种取代基。
当碳化二亚胺化合物(4)与各种杂原子亲核试剂如醇、硫醇和胺(优选反应图解1中所示的哌啶)在溶剂(如苯)的存在下进行反应时，杂原子对碳化二亚胺基团的中间碳进行亲核加成反应。使化合物(5)进行分子间连续1，4-加成反应，以制得本发明化合物中间体的3，4-二氢喹唑啉(6)。
反应图解2 本发明中间体化合物(6)的甲基酯基团在溶于THF和水的混合溶剂的氢氧化锂中于适当的温度(优选60℃)下定量地水解，得到游离的羧酸化合物(7)。采用1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和1-羟基苯并三唑(HOBT)使游离羧酸化合物(7)与各种醇和胺(优选反应1图解2中的硝基苄胺)进行偶合反应，以制得酰胺化合物(8)(Gaucher，A.等，TetrahedronAsymmetry 2001，12，2571-2580；Dhaon，M.K.等，J.Org.Chem.1982，47，1962-1965)。在作为溶剂的甲醇和作为催化剂的钯(Pd)的存在下，将酰胺化合物(8)进行氢化使其硝基还原成氨基。这样获得胺化合物(9)。将胺化合物(9)与各种磺酰卤(优选反应图解2中的4-氟苯磺酰氯)进行偶合反应，制得磺酰胺化合物(10)，即本发明的最终产物。
现在参照以下实施例对本发明进行详细的描述，但不是对本发明的范围进行限定。
实施例12-氨基肉桂酸甲酯(2)的制备将2-硝基肉桂酸甲酯(1)(0.202g，0.975mmol)溶于20ml乙酸乙酯中，向其中加入SnCl2·2H2O(1.11g，4.87mmol)。将反应混合物于70℃下加热1小时。反应完成后，将反应混合物冷却至室温。将反应混合物用饱和碳酸氢钠溶液调节至弱碱性溶液，然后用细粘土层(Celite545)过滤。水层用乙酸乙酯萃取三次，将从中收集的有机层用无水硫酸镁干燥。此后，减压除去溶剂。将反应混合物通过柱色谱(己烷∶乙酸乙酯＝5∶1)加以纯化，得到黄色晶体状态的标题化合物(2)(0.161g，93％)(mp 67℃)。
IR(KBr)3365，2364，1704，1622，1330，1198，756cm-1；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.86(d，J＝15.9Hz，1H，-CH＝CH-CO2Me)，7.40(d，J＝7.5Hz，1H，芳香族的)，7.19(t，J＝7.2Hz，1H，芳香族的)，6.78(t，J＝7.8Hz，1H，芳香族的)，6.72(d，J＝7.5Hz，1H，芳香族的)，6.38(d，J＝15.9Hz，1H，-CH＝CH-CO2Me)4.02(br，2H，-NH2)，3.82(s，3H，-OCH3)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ168.0，145.9，140.6，131.6，128.3，120.1，119.2，117.9，117.0，51.9.
实施例23-[2-(3-苯基脲基)苯基]丙烯酸甲酯(3)的制备将2-氨基肉桂酸甲酯(2)(6.35g，35.8mmol)溶于150ml苯中，在室温下向其中缓慢滴加异氰酸苯酯(5.12g，43.0mmol)。将反应混合物搅拌12小时，得到固体沉淀。然后，将沉淀用乙醚洗涤，得到标题化合物(3)白色晶体(10.2g，96％)(mp 184℃)。
IR(KBr)3346，3278，1724，1650，1548，1322，1172，758，672cm-1；1H NMR(300MHz，DMSO)δ8.94(s，1H，-NH-CO-)8.49(s，1H，-NH-CO-)7.89(d，J＝15.9Hz，1H，-CH＝CH-CO2Me)，7.76(d，J＝7.8Hz，2H，芳香族的)，7.46(d，J＝8.4Hz，2H，芳香族的)7.39(t，J＝8.1Hz，1H，芳香族的)，7.28(t，J＝7.8Hz，2H，芳香族的)7.12(t，J＝7.5Hz，1H，芳香族的)6.97(t，J＝7.8Hz，1H，芳香族的)，6.58(d，J＝15.3Hz，1H，-CH＝CH-CO2Me)，3.73(s，3H，-OCH3)；13C NMR(75MHz，DMSO)δ167.4，153.5，140.5，140.3，138.5，131.4，129.5，127.8，126.8，124.6，124.4，122.7，119.5，118.9，52.2.
实施例33-[2-(苯基亚氨基亚甲基氨基)苯基]丙烯酸甲酯(4)的制备将化合物(3)(6.04g，20.4mmol)和三乙胺(6.19g，6.12mmol)溶于30ml二氯甲烷中，在0℃下向其中缓和地加入二溴三苯基膦(12.9g，30.6mmol)。将反应混合物搅拌1小时，并用二氯甲烷萃取三次。将从中收集的有机层用无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂。将反应混合物通过柱色谱(己烷∶乙酸乙酯＝20∶1)纯化标题化合物(4)，得到白色晶体碳化二亚胺(4)，(4.26g，75％)(mp 54℃)。
IR(KBr)2142，1716，1484，1172，756，59cm-1；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.18(d，J＝16.2Hz，1H，-CH＝CH-CO2Me)，7.56(d，J＝7.8Hz，1H，芳香族的)，7.36-7.29(m，3H，芳香族的)，7.25(d，J＝7.8Hz，1H，芳香族的)，7.20-7.13(m，4H，芳香族的)，6.52(d，J＝16.2Hz，1H，-CH＝CH-CO2Me)，3.80(s，3H，-OCH3)；13CNMR(75MHz，CDCl3)δ167.5，140.5，138.4，138.0，134.3，131.3，129.8，129.0，127.8，126.1，126.0，125.9，124.6，119.6，52.0.
实施例44-甲氧羰基甲基-2-(1-哌啶基)-3-苯基-3，4-二氢喹唑啉(6)的制备将化合物(4)(0.605g，2.17mmol)溶于20ml苯中，在室温下向其中缓和地滴加哌啶(0.222g，2.60mmol)。将反应混合物搅拌2小时。两小时后，将反应混合物用水和盐水洗涤。有机层用无水硫酸镁干燥，减压除去溶剂。将反应混合物通过柱色谱(CH2Cl2∶MeOH＝10∶1)纯化标题化合物(6)，得到白色晶体(0.632g，80％)(mp 109℃)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.28-7.17(m，4H，芳香族的)，7.09-7.01(m，3H，芳香族的)，6.97-6.89(m，2H，芳香族的)，5.10(dd，J＝4.5和10.8Hz，1H，-CH2-CH-N-)，3.79(s，3H，-OCH3)，3.42(s，4H，哌啶基)，2.85(dd，J＝10.8和15.3Hz，1H，-CO-CH2-)，2.52(dd，J＝4.7和15.5Hz，1H，-CO-CH2-)，1.55-1.50(m，2H，哌啶基)，1.43-1.40(m，4H，哌啶基)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ172.2，153.2，146.3，144.4，129.4，128.6，126.1，124.9，124.1，123.1，122.6，122.4，61.2，52.0，47.0，39.8，25.7，25.0；HRMS(FAB，M+H)计算值C22H26N3O2364.2025，实测值364.2019.
实施例54-羧基-2-(1-哌啶基)-3-苯基-3，4-二氢喹唑啉(7)的制备将化合物(6)(0.235g，0.645mmol)溶于10ml THF/水(1∶1)中，在室温下向其中加入水合氢氧化锂(0.135g，3.23mmol)。将反应混合物在60℃下搅拌2小时。反应完成后，将反应混合物的pH值调至3～4，然后用二氯甲烷将反应混合物萃取三次。有机层用无水硫酸镁干燥，减压除去溶剂，定量地获得标题化合物白色晶体(7)(mp 238℃)。
1H NMR(300MHz，DMSO)δ7.57(d，J＝7.8Hz，1H，芳香族的)，7.45-7.26(m，7H，芳香族的)，7.19(m，1H，芳香族的)，5.29(dd，J＝6.3和9.3Hz，1H，-CH2-CH-N-)，3.36(s，4H，哌啶基)，2.88(dd，J＝9.3和15.0Hz，1H，-CO-CH2-)，2.69(dd，J＝6.3和15.1Hz，1H，-CO-CH2-)，1.46-1.23(m，6H，哌啶基)；13C NMR(75MHz，CD3OD)δ174.6，153.1，143.7，132.7，130.1，129.1，127.5，127.3，126.3，125.7，124.7，118.0，62.8，49.5，42.6，24.6，23.3.
实施例64-[N-(4-硝基苄基)乙酰氨基)-2-(1-哌啶基)-3-苯基-3，4-二氢喹唑啉(8)的制备将化合物(7)(0.22g，0.63mmol)和1-羟基苯并三唑(HOBT)(0.13g，0.94mmol)溶于20ml二氯甲烷/THF(1∶1)中，在0℃下向其中滴加4-硝基苄胺(0.18mg，0.94mmol)。将反应混合物在相同的温度下搅拌1小时。然后向反应混合物中加入1-[3-(二甲基胺)丙基]-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(RDC)(0.14g，0.75mmol)，进一步搅拌12小时。反应完成后，减压除去溶剂，将所得溶液溶于二氯甲烷中。将反应混合物用0.5M盐酸水溶液连续萃取两次。然后，用NaHCO3水溶液饱和两次，以及用水饱和一次，然后用盐水洗涤。有机层用无水硫酸镁干燥，减压除去溶剂。将反应混合物通过柱色谱(CH2Cl2∶MeOH＝10∶1)纯化标题化合物，得到白色晶体(8)(0.24g，80％)。
IR(KBr)3192，2932，2848，1668，1552，1486，1430，1344，1282，756cm-1；1HNMR(300MHz，CDCl3)δ8.58(br，1H，-CO-NH-CH2-)，8.15(d，J＝8.7Hz，2H，-CH2-C4H4-NO2)，7.49(d，J＝8.1Hz，2H，-CH2-C4H4-NO2)，7.27-7.20(m，2H，芳香族的)，7.15-7.02(m，4H，芳香族的)，6.95-6.87(m，3H，芳香族的)，5.23(dd，J＝6.0和8.7Hz，1H，-CH2-CH-N-)，4.67(dd，J＝6.7和12.1Hz，1H，-NH-CH2-)，4.58(dd，J＝5.7Hz和15.3Hz，1H，-NH-CH2-)，3.10(br，4H，哌啶基)，2.58(dd，J＝9.0和14.7Hz，1H，-CO-CH2)，2.32(dd，J＝6.1和14.2Hz，1H，-CO-CH2-)，1.35(br，2H，哌啶基)，1.13(br，4H，哌啶基)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ170.9，154.3，147.4，146.5，145.9，143.1，129.5，129.0，128.5，127.0，125.4，124.7，124.0，123.1，123.0，122.0，60.8，47.5，43.2，41.6，25.2，24.6；HRMS(FAB，M+H)计算值C28H30N5O3484.2349，实测值484.2341.
实施例74-[N-(4-氨基苄基)乙酰氨基)-2-(1-哌啶基)-3-苯基-3，4-二氢喹唑啉(9)的制备将化合物(8)(1.39g，2.87mmol)和10％Pd(C)(0.28g)溶于40ml甲醇中，在氢气氛围下搅拌2小时。反应完成后，将反应混合物用Celite545过滤，减压除去溶剂。将反应混合物通过柱色谱(CH2Cl2∶MeOH＝10∶1)纯化胺化合物(1.26g，97％)。
IR(KBr)3218，2930，2850，1648，1550，1480，1430，1350，1282，732cm-1；1HNMR(300MHz，CDCl3)δ7.26-7.22(m，2H，芳香族的)，7.20-7.11(m，4H，芳香族的)，7.07-7.02(m，3H，芳香族的)，6.96-6.90(m，2H，芳香族的)，6.60-6.56(m，2H，芳香族的)，6.37(br，1H，-CO-NH-CH2-)，5.17(dd，J＝5.1和9.6Hz，1H，-CH2-CH-N-)，4.32(d，J＝5.7Hz，2H，-NH-CE2-)，3.51(br，2H，-C4H4-NH2)，3.26(br，4H，哌啶基)，2.57(dd，J＝10.2和14.1Hz，1H，-CO-CH2)，2.31(dd，J＝5.4和14.1Hz，1H，-CO-CH2-)，1.43(br，2H，哌啶基)，1.26(br，4H，哌啶基)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ169.7，153.3，145.7，145.2，141.0，129.5，129.2，128.2，128.1，126.7，124.8，124.6，123.2，123.1，121.5，115.0，61.2，47.6，43.2，41.7，24.8，24.2；HRMS(FAB，M+H)计算值C28H32N5O 454.2607，实测值454.2654.
实施例84-{N-[4-(4-氟苯磺酰氨基)苄基]乙酰氨基}-3-苯基-2-(哌啶-1-基)-3，4-二氢喹唑啉(10KYS05042)的制备将化合物(9)(0.11g，0.26mmol)溶于10ml二氯甲烷中，向其中加入吡啶(0.06g，0.76mmol)。在0℃下将4-氟苯磺酰氯(0.06g，0.31mmol)溶于5ml二氯甲烷中，将其缓慢滴加到反应混合物中，室温搅拌24小时。反应完成后，将反应混合物用二氯甲烷萃取三次，并用盐水洗涤。有机层用无水硫酸镁干燥，减压除去溶剂。将反应混合物通过柱色谱(CH2Cl2∶MeOH＝10∶1)纯化标题化合物，得到白色晶体(10)(0.11g，73％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.66-7.62(m，2H，芳香族的)，7.28-7.23(m，2H，芳香族的)，7.20-7.06(m，9H，芳香族的)，7.04-6.90(m，4H，芳香族的)，6.72(br，1H，-CO-NH-CH2-)，5.19(dd，J＝6.0和9.9 Hz，1H，-CH2-CH-N-)，4.41(dd，J＝6.1和14.8Hz，-NH-CH2-)，4.24(dd，J＝5.5和14.8Hz，-NH-CH2-)，3.28(br，4H，哌啶基)，2.74(dd，J＝9.6Hz和14.1Hz，1H，-CO-CH2)，2.44(dd，J＝6.0和14.1Hz，1H，-CO-CH2-)，1.39(br，2H，哌啶基)，1.25(br，4H，哌啶基)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ170.1，166.7，153.9，145.3，141.7，135.9，135.0，129.9，129.7，129.3，128.9，128.4，126.7，125.2，124.8，123.2，121.5，116.3，116.0，61.4，47.9，43.3，42.0，25.2，24.6；HRMS(FAB，M+H)计算值C34H35FN5O3S 612.2445，实测值612.2436.
实施例3至8所制备的化合物的理化性质列于下表1中。
表1





生物活性测试为了筛选有效的T-型钙通道阻滞剂，作为初筛方法，采用表达T-型钙通道α1H的蛙未受精卵母细胞对上述实施例中制备的化合物进行通道抑制活性测试。作为初筛结果，选取显示50％或更强抑制效果的T-型钙通道阻滞受试化合物，按照电生理全细胞膜片钳方法测试其对T-型钙通道的活性。这种方法采用在T-型钙通道编码基因中选择性表达α1G的哺乳动物HEK 293细胞系，其中α1G主要在神经细胞中被表达(来源于人肾癌细胞，由美国弗吉尼亚的弗吉尼亚大学的Edwards Ferez-Reyes教授确定)。对确认具有T-型钙通道阻滞活性的受试化合物，按照3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二甲基四唑溴化物(MTT)试验测试其细胞毒性。结果发现本发明化合物显示良好的T-型钙通道抑制活性。
试验实施例1-1未受精非洲蟾蜍卵母细胞的制备以及α1HT-型钙通道的cRNA合成为了在未受精非洲蟾蜍卵母细胞中表达基因编码的T-型钙通道α1H(Cav3.2)(Cribbs，L.L.等，Circ.Res.，1998，83，103-109)，用限制酶AflII处理pGEM-HEA，得到DNA片段(AF051946)该片段含具有T-型钙通道cDNA的5’-末端区。用T7 RNA聚合酶按照厂商的说明书(mMESSAGEmMACHINE试剂盒，Ambion，奥斯汀，美国)合成具有与该片段的序列相对应的序列的cRNA。合成的cRNA通过分光光度计测定O.D.值进行定量。此时，根据以下方法由雌爪蟾(Xenopus laevis)(Xenopus I，美国)制备未受精卵母细胞。将蛙的腹部切开约1cm后，用剪刀从中分离出三到四叶，并分离成其上附着一些卵母细胞的小碎片。将小碎片在OR溶液(82.5mM NaCl，2.5mM KCl，1mM MgCl2，5mM HEPES，pH7.6)中进行水解，并补充IA型胶原酶(Sigma，美国)以去除脱泡囊作用(defolliculation)。通过解剖显微镜筛选健康卵母细胞后，将其在SOS溶液(100mM NaCl，2mM KCl，1.8mM CaCl2，1mM MgCl2，5mM HEPES，2.5mM丙酮酸盐，50μM/ml庆大霉素，pH7.6)中浸泡3至4小时使其复活。用毫微注射器向每个卵母细胞中注射2至5ngcRNA。注射后在18℃维持4至5天后，测试卵母细胞，以测定由其所表达的通道的电性能。
试验实施例1-2采用双电极电压钳方法测定α1HT-型钙通道的电生理性能由非洲蟾蜍(Xenopus)未受精卵母细胞表达的钙通道的电流，根据双电极电压钳方法进行测定。在10mM Ba2+溶液(10mM Ba(OH)2，90mM NaOH，1mM KCl，0.1mM EDTA，5mM HEPES，用甲磺酸调节至pH7.4)中进行电流测定。此时，电压钳和电流测定通过一个用于未受精卵母细胞的放大器(Model OC-725C，Warner Instrument Corp.，美国)进行调节，并用Digidata2000A(模拟-数字转换器，Axon Instrument)将模拟信号转换成数字信号。所有数据的收集、储存和分析通过pCLAMP8记录在Pentium IV计算机上。主要在5KHz处收集数据，并在1KHz处进行过滤(902型滤波器，频率装置安置于Harverhill，MA，美国)。通过每隔15秒钟向未受精卵母细胞施加-20mV测试电位，产生T-型电流，其电位固定在-90mV处。通过对药物处理前后的电位进行比较，计算阻滞百分数。结果列于表2。
试验实施例2HEK 293细胞的培养方法以及用电生理方法测定T-型钙通道活性的方法在补充10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素(v/v)的Dulbecco’s改性Eagle’s介质(DMEM)中，在36.5℃加湿培养箱(95％空气-5％CO2)中培养HEK 293细胞。每隔3至4天用新鲜介质更换培养液，且每周将培养的细胞进行次代培养。此时，将培养液用G-418(0.5mg/ml)溶液处理，使只表达α1G-T型钙通道的HEK 293细胞能够生长。当次代培养时，均将用于T-型钙通道活性分析的细胞在涂有聚-L-赖氨酸(0.5mg/ml)的盖玻片上进行培养，且在培养2至7天后记录其钙通道活性。单细胞水平的T-型钙通道电流采用EPC-9放大器(HEKA，德国)，按照电生理全细胞膜片钳方法进行测定。此时，应用细胞外液[140mM NaCl，2mM CaCl2，10mM HEPES(pH 7.4)]和细胞内液[KCl 130mM，HEPES 10mM，EGTA 11mM，MgATP 5mM(pH 7.4)]。由T-型钙通道活化导致的向内电流，根据低电流激活的T-型钙通道规程(protocol)进行测定。当通过插入一个电阻为3～4MΩ的微玻璃电极而将细胞转化成全细胞记录模式时会产生这种电流，该电极充有细胞内液，插入单细胞中，每隔10秒钟在-30mV(50ms持续时间)下进行去极化，使固定膜电位达到-100mV。
试验实施例3采用电生理方法筛选T-型钙通道阻滞剂的方法为了确证试验实施例2中所使用的细胞和方法是否是一种合适的选择T-型钙通道阻滞剂的筛选系统，将实施例2中所得结果与发表的文献(Monteil，A.等，J.Biol.Chem.275，6090-6100，2000)中所报道的α1G-T型钙通道研究结果进行比较。从图1中可见，既然本发明筛选系统显示1)在-30mV的低电压下被最大激活(图1)；2)激活电流的快速激活-灭活(图2)；以及3)与被作为T-型钙通道阻滞剂的Ni2+和咪拉地尔具有相同的IC50(图3和图4)，因而证实其适合于筛选T-型钙通道阻滞剂。因此，受试化合物对T-型钙通道的抑制效果按照本发明筛选系统进行如下测试。将每个化合物溶于100％二甲基亚砜(DMSO)中配成10mM原液。对T-型钙通道电流的抑制效果通过将原液稀释1000倍配成10μM的样品溶液(含0.1％DMSO)进行测定。将细胞用含有细胞外液的浓度为10μM的每种化合物处理30至60秒钟。然后，计算化合物所导致的峰电流的抑制百分数，如图5所示。
试验实施例4采用MTT分析法分析T-型钙通道阻滞剂的细胞毒性为了分析HEK 293细胞中T-型钙通道阻滞剂的细胞毒性，进行如下MTT分析试验。将培养的HEK 293细胞用10μM和100μM浓度的每一种化合物进行处理。此时，用溶剂(即0.1％DMSO)处理的细胞作为阴性对照，用H2O2(125μM)处理引发细胞毒性的细胞作为阳性对照。用药物处理6小时后，将细胞用50μl溶于pBS的MTT(1mg/ml)处理4小时。然后，离心反应混合物，除去上清液，把这样得到的甲晶体溶于100μl的DMSO中。用自动分光光度板读数器在560nm处测定溶液的吸光度。结果，所有对HEK 293细胞显示50％或更强抑制活性的化合物在10μM浓度下没有显示出任何细胞毒性，一些化合物仅仅在高浓度(10OμM)下显示出细胞毒性(图6)。
本发明化合物对非洲蟾蜍未受精卵母细胞(α1H)和HEK 293细胞(α1G)中T-型钙通道抑制效果的测定结果汇总在表2中。
表2
作为对照的咪拉地尔的钙通道抑制效果按照本发明活性筛选方法进行测定。如图2所示，咪拉地尔对非洲蟾蜍受精卵母细胞(α1H)显示86％的抑制效果(100μM)，对HEK293细胞(α1G)显示95.9％的抑制效果(10μM，IC50＝0.84μM)。同时，本发明的一个化合物KYS05001，对非洲蟾蜍受精卵母细胞(α1H)显示77％的抑制效果(100μM)，对HEK 293细胞(α1G)显示90.1％的抑制效果(10μM，IC50＝0.9μM)。此外，KYS05041和KYS05042对非洲蟾蜍受精卵母细胞(α1H)分别显示84.7％和80.5％的抑制效果(100μM)，对HEK 293细胞(α1G)分别显示89.9％和89.0％的抑制效果(10μM)。它们的IC50值分别为0.25μM和0.20μM。因此，当对IC50进行比较时，KYS05001与咪拉地尔几乎具有相同的钙通道抑制效果，而KYS05041和KYS05042比咪拉地尔的钙通道抑制效果分别强3.4和4.2倍。
试验实施例5确证化合物对其它离子通道的选择性为了测定本发明化合物对其它离子通道的选择性，用MPG(主骨盆神经节)按照常规方法(Lee，J.-H.等，J.Neurophysiol.2002，87，2844-2850)，对KYS05001、KYS05041和KYS05042对Na+通道和高电压-激活Ca2+通道(HVA)的抑制效果进行测定。
用平均体重为约250g的雄性Sprague-Dawley大鼠作为试验动物。用戊巴比妥钠(50mg/kg，i.p.)将大鼠麻醉以后，立即切开腹部。提取前列腺左侧的MPG，然后转移至冷(4℃)Hank’s平衡盐溶液(HBSS，GibcoBRL)中。分离出包裹神经节的结缔组织，用快刀小心地在剥离出的神经节上切一个小口。然后将神经节在补充了0.7mg/ml胶原酶(D型)、0.3mg/ml胰蛋白酶以及0.1mg/ml I型DNA酶的10ml改性Earle’s平衡盐溶液(EBSS，pH7.4，GibcoBRL)中，在35℃下培养1小时(Zhu等，J.Physiol.Lond.1995，489，363～375)。此时，向EBSS中加入3.6g/l的葡萄糖和10mM HEPES。培养完成后，振摇培养瓶将细胞簇分离成单个神经细胞，并在临床离心机(International Equipment Company，MA，美国)中，于100rpm下进行离心。将分离的单个神经细胞于补充于10％胎牛血清、1％谷酰胺和1％青霉素/链霉素的MEM(GibcoBRL)中再混悬。然后，将其铺在涂有聚-L-赖氨酸的聚苯乙烯培养皿(35mm)上。将培养皿置于加湿培养箱(95％空气-5％CO2)中在37℃下进行培养，分出细胞后在24小时内将其用于下面的试验。
电压依赖性钙电流和钠电流应用膜片钳放大器(Axopatch 1D，AxonInstruments，Foster City，CA，美国)，按照典型的膜片钳方法以全细胞破裂构造(whole-cell ruptured configuration)(Hamill等，Pflügers Arch.1981，391，85-100)进行记录。电极由硼硅酸盐玻璃毛细管(外径1.65mm，内径1.2mm，Corning 7052，Garner Glass Co.，Claremont，CA，美国)使用P-97 Flaming-Brown微量移液管拉制仪(Sutter Instrument Co.，Novato，CA，美国)制成，并用显微拉制仪加热使铸造光滑。电极充满液体后，显示电阻为1～3MΩ，将其用于以下试验。将含有神经细胞的培养皿置于倒装显微镜上，使细胞外液以约1～2ml/分钟的流速流入培养皿中。用放大器将膜电容和串联电阻用80％或更大进行校正。采用装在Macintosh计算机中的S4软件(由Dr.Stephen R.Ikeda，National Institute on Alcohol Abuse和Alcoholism，NIH，USA提供)进行电压的产生和钙电流的记录，该计算机与模拟/数字转换器(Digidata1200，Axon Instruments Co.)相联。把经过2～5kHz低频段滤过器的钙电流存储在Macintosh计算机中，并通过IGOR PRO(Wave-Metrics，Lake Oswego，OR，U.S.A)进行分析。所有试验均在20～22℃的室温下进行。
用于测定钙电流的电极充满含有N-甲基-D-葡糖胺(NMG)甲磺酸盐(MS)120mM、20mM四乙基铵(TEA)-MS、20mM HCl、11mM EGTA、10mMHEPES、1mM CaCl2、4mM MgATP、0.3mM Na2GTP和14mM三-磷酸肌酸(pH7.2，290mOsm)的溶液。细胞外输注液包括140mM MS、145mM TEA-OH、10mM HEPES、15mM葡萄糖、10mM CaCl2和0.0003mM河豚毒素(TTX，pH7.4，320mOsm)。用于测定钠电流的电极充满含有30mM NaCl、140mMNMG-MS、11mM EGTA、10mM HEPES、1mM CaCl2、4mM MgATP和0.3mMNa2GTP(pH 7.2，290mOsm)的溶液。细胞外输注液包括50mM NaCl、90mMTEACl、10mM HEPES、15mM葡萄糖、10mM CaCl2和10mM MgCl2(pH 7.4，320mOsm)。
结果汇总于表3。
表3

从表3可见，KYS05001、KYS05041和KYS05042对钙通道比对钠通道具有更高的选择性。而且，当对钙通道亚型的选择性进行测定时，KYS05041和KYS05042显示相对较小的选择性。这是因为它们对T-型(LVA)和N-型(HVA)钙通道都能够抑制。然而，KYS05001显示出更高的选择性，其仅仅选择性地抑制T-型(LVA)通道。
权利要求
1.化学式1的3，4-二氢喹唑啉衍生物或其盐 其中，n为1至4的整数d；R1选自氢、羟基、卤素、硝基、C1-C8烷基、C3-C6环烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、取代或未取代的芳基和杂芳基、C1-C6烷氧基、C3-C6环烷氧基、(芳基或杂芳基)氧基、C1-C6硫代烷氧基、C3-C6环硫代烷氧基、(芳基或杂芳基)硫代氧基以及氨基；R2为C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C1-C6烷氧基烷基、C3-C6环烷氧基烷基、C1-C6链烯基；取代或未取代的芳基和杂芳基；4-吗啉基；4位上随机取代的哌嗪基；1-吡咯烷基；1-哌啶基；或-NR1R2，其中R1和R2各自独立地选自C1-C6烷基、C3-C6环烷基、取代或未取代的芳基和杂芳基；R3选自C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C1-C6烷氧基烷基、C3-C6环烷氧基烷基、取代或未取代的芳基和杂芳基；R4为X-(CH2)n-Y(NH)o-S(O)m-Z，其中X为氧或氮；n为1至4的整数；Y为取代或未取代的C3-C6环烷基、芳基或杂芳基；o为0或1的整数；m为0至2的整数；Z选自取代或未取代的C3-C6环烷基、芳基或杂芳基；在o为0的条件下，-S(O)m-Z不存在。
2.权利要求1的3，4-二氢喹唑啉衍生物或其盐，其为4-(N-苄基乙酰氨基)-3-苯基-2-(哌啶-1-基)-3，4-二氢喹唑啉。
3.权利要求1的3，4-二氢喹唑啉衍生物或其盐，其为4-(N-苄基乙酰氨基)-3-苯基-2-(吗啉-1-基)-3，4-二氢喹唑啉。
4.权利要求1的3，4-二氢喹唑啉衍生物或其盐，其为4-(N-苄基乙酰氨基)-3-苯基-2-(4-甲基哌嗪基)-3，4-二氢喹唑啉。
5.权利要求1的3，4-二氢喹唑啉衍生物或其盐，其为4-[N-(4-硝基苄基)乙酰氨基)-3-苯基-2-(哌啶-1-基)-3，4-二氢喹唑啉。
6.权利要求1的3，4-二氢喹唑啉衍生物或其盐，其为4-{N-[4-(4-甲基苯磺酰氨基)苄基]乙酰氨基}-3-苯基-2-(哌啶-1-基)-3，4-二氢喹唑啉。
7.权利要求1的3，4-二氢喹唑啉衍生物或其盐，其为4-{N-[4-(4-氟苯磺酰氨基)苄基]乙酰氨基}-3-苯基-2-(哌啶-1-基)-3，4-二氢喹唑啉。
全文摘要
本发明涉及作为T－型钙通道阻滞剂的3，4－二氢喹唑啉衍生物及其制备方法。本发明进一步涉及含有上述化合物的组合物。含有本发明的3，4－二氢喹唑啉衍生物的组合物可以通过阻滞T－型钙通道有效地用于预防或治疗心绞痛、高血压、心肌疾病、疼痛和癫痫。
文档编号A61P25/04GK1660820SQ20041009544
公开日2005年8月31日 申请日期2004年12月27日 优先权日2004年2月24日
发明者李龙燮, 李在烈, 林惠媛 申请人:韩国科学技术研究院