专利名称：一种河鲀油制剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种河鲀油制剂及其制备方法，具体来说，本发明涉及一种从河鲀鱼的肝脏、卵巢等内脏中提取河鲀油及其河鲀油制剂的制备方法。
背景技术：
河鲀鱼是一种含有剧毒的条件可食鱼类，在我国是市场上禁止销鲜的有毒鱼类。已知全世界河鲀鱼大约有40多种，主要分布在太平洋西部的中国沿海、日本海及印度洋和地中海等海域，目前河鲀鱼还有人工养殖，其中，中国河鲀鱼产量约占世界产量的70％。在远东地区，自古以来河鲀被视为一种美味佳肴，据测定，河鲀肉中含蛋白质18.7％，脂肪0.26％，维生素B1为0.2PPM，B2为1PPM。河鲀鱼内脏有很高的生理活性，因此，河鲀又是一种宝贵的海洋药物资源。
河鲀有毒但可以药用，古籍医著多有记述，如《本草纲目》就有“鱼毒最甚”，“肝及籽有大毒，可主治疥癣虫疤”的记述；《开宝本草》有“主补虚，去湿气、理腰脚、去痔疾、杀虫”的记述。在国外，古亚述人、巴比伦人也知道“球鱼”即河鲀鱼，有毒，可治病。由此可见，河鲀鱼药用已有悠久而广泛的历史。河鲀鱼因含毒使人畏惧而不受欢迎，所以，如何将河鲀鱼利用起来，化害为利，提高其经济价值，已为许多学者所关注。在国内，五十年代就有人开始河鲀肝油工业利用和食用的研究(1958年，水产科学技术成果汇编.“河鲀的综合利用”，上海科学技术出版社，IV-46～56，)；六十年代有的学者专门对虫纹东方鲀的肝油和红鳍东方鲀肝油开展医用试验(侯文璞.太平洋西部渔业会议论文集，P40-45，1962；高辉.海洋药物研究论文集，青岛市医药科学研究所，P55-61，1979)；七十年代有人将河鲀肝油制成新生油，用于肿瘤临床试验(伍汉霖.中国有毒鱼类和药用鱼类，P274，1977)；七十年代至八十年代，河北省水产研究所等，研制出有明显的抑癌、镇痛、抗炎、增强机体免疫功能等作用的“除毒河鲀肝油”(卫寄英等.1983，海洋药物，285～88；侯俊阁等.1988，1-255～56；蔡仙德等.1987，214～16；蒋韵等.1984，海洋药物，433～35；舒荣华.1985，37～9)，但是，因为“除毒河鲀肝油”的有效成分不清楚，结果未能获得国家药物注册申请，而中止研究；1980年日本尾高誉男的“由河鲀肝油制作的外用药”申请日本专利(昭94317)；1997年王维国等申请了河鲀肝油的戒毒专利(CN1193516A，CN1279957A)，但是，该专利没有明确河鲀肝油戒毒的有效成分。
上述成果和专利所制备的除毒河鲀肝油，存在两大缺点一是，河鲀肝油的药效成分不清楚，很难保证药物的稳定疗效和用药安全；二是，用水煮或灯烤肝脏提取肝油和传统的冷冻除硬脂方法，存在出油率低，河鲀肝油存放后容易出现沉淀物等质量问题。
为了解决上述难题，我们进行了各种分析和研究，用一种相反的思路，我们发现河鲀毒素有特殊的量效关系，即河鲀毒素在一定的稀释浓度范围内，没有戒毒作用，而在特定的稀释浓度范围内，有很好的戒除药物依赖性的作用(黄致强，任雷鸣等.中国专利ZL98102072.0)，据此，推测河鲀肝油的药效成分或组分，是二个或以上，其中，戒毒和镇痛的有效成分，推测是“除毒河鲀肝油”中残留的微量河鲀毒素。为了保证用药安全，必需明确河鲀油有效成分及研究提高质量和出油率的制备方法。
发明内容
本发明的目的，在于提供一种镇痛、戒毒疗效确切，有效成分清楚，安全、无成瘾性的河鲀油制剂。
本发明提供了一种河鲀油制剂，其特征在于，所述河鲀油制剂的有效成分为河鲀毒素。
所述河鲀油制剂是河鲀肝油制剂或河鲀卵巢油制剂；所述河鲀油制剂中河鲀毒素的浓度为0.01μg/ml～15μg/ml。
本发明另一目的在于，提供一种工艺简单，容易实施，出油率高，质量稳定的河鲀油制剂的制备方法。
所述的上述河鲀油制剂的制备方法，其特征在于，(1)将河鲀肝脏切块后均浆，按肝脏重量比例加0.5～3倍水，加热到30～60℃后，调节pH值至7～10，再加热到60～90℃，保温20～60分钟，按重量比例加5％～20％铵盐，搅拌使其充分水解，水解液趁热过滤，分离出油层，经水洗，脱水，得粗品油，(2)粗品油加有机溶剂混合，于-3℃～-20℃下冷冻结晶，待结晶完全后，低温过滤，滤油蒸脱有机溶剂后，调节滤油中河鲀毒素的浓度为0.01μg/ml～15μg/ml，再加稳定剂使其在制剂中的质量百分浓度达0.001％～0.2％，即得河鲀油制剂。
其中所述的内脏为河鲀肝脏或河鲀卵巢；所述的铵盐选自以下物质中的一种或多种碳酸铵、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵；所述的弱碱为氢氧化铵；所述的有机溶剂选自以下物质中的一种或多种正已烷、丙酮、异丙酮、苯、乙醇，其中粗油与有机溶剂之体积比例为1∶0.5～3；所述的稳定剂选自以下物质中的一种或多种没食子酸丙酯、特丁基苯二酚、叔丁基对羟基茴香醚、Vc、Ve。
各种铵盐之间和各种稳定剂之间的重量比例没有特别的要求。
所述的河鲀油制剂，当河鲀油中河鲀毒素浓度高时，加医用油；当河鲀油中河鲀毒素浓度低时，可以添加以下其中之一的河鲀毒素含量高的河鲀油或河鲀毒素油制剂。将油中河鲀毒素的浓度调节在要求的范围内。
所述制备用的铵盐，在制备溶液中所占重量比例为5％-20％。
所述的医用油，为中国药典规定注射油或口服油为花生油、麻油、豆油、棉子油、杏仁油、茶油和鱼油。
所述的稳定剂在制剂中所占体积的比例为0.001％～0.2％。
所述制备的河鲀油制剂，可以按照常规的药物制备工艺，制成胶囊、乳剂或栓剂(庄越等著，《实用药物制剂技术》，人民卫生出版社，1999，P263-276；陆彬著，《药物新剂型与新技术》，人民卫生出版社，1998，P66-75；龙晓英著，《流程药剂学》，中国医药科技出版社，2003，P107-116)。
本发明制剂具有以下优点1、本发明明确了河鲀油制剂镇痛、戒毒的主要有效成是河鲀毒素，并以河鲀毒素作为质量控制标准；此外，本发明制剂富含高度不饱和脂肪酸，强化了综合治疗效果和增强免疫功能。2、本发明制剂具有显著的镇痛作用，药物疗效确切，特点为起效缓慢，延效时间长，对吗啡或杜冷丁耐受成瘾者仍有效，无成瘾性和毒副作用，是安全的。3、本发明的口服制剂，储存方便、携带方便、服用方便，可为患者用药带来极大的方便，减轻患者的痛苦。4、本发明的制备方法，出油率高，油质量好，质量稳定，贮藏过程不出现沉淀物。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1(1)取河鲀肝脏1000克，切块加1倍水，搅拌20～60分钟，离心过滤(滤液供提取河鲀毒素用)，滤后肝块匀浆后，加0.5倍水，搅拌加热到30℃，加入10％氨水，调到pH＝8，继续搅拌加热至70℃，保温30分钟，加碳酸铵80g，继续搅拌，使其充分水解，水解液趁热离心分离，将油、水、肝渣分别收集；(2)水洗用50℃热水洗油(油与水的体积比例为1∶1)2次，充分搅拌，静置45分钟后，使油水分层，收集油层；(3)脱水用真空机脱去油中水，得粗品油；
(4)脱固脂粗品油经初步冷却后，加入油体积0.5倍的正已烷与油混合，在-8℃的条件下进行结晶，结晶完全后在-8℃～-6℃下过滤。滤油真空浓缩回收有机溶剂后，加入花生油(油中TTX浓度高于要求含量)，调节河鲀毒素在油中所占比例为0.01μg/ml，再加没食子酸丙酯，使其在制剂中浓度为0.2％，即得河鲀油制剂。
实施例2(1)河鲀肝脏1000克切块匀浆后，加1.5倍水，搅拌加热到40℃，分二次加入12％氨水，调到pH＝7，继续搅拌加热至90℃，保温40分钟，加入碳酸铵、150克，继续搅拌，使其充分水解，水解液趁热离心分离，将油、水、肝渣分别收集；(2)水洗用60℃热水洗油(油与水的体积比例为1∶1.5)2次，充分搅拌，静置35分钟后，使油水分层，收集油层；(3)脱水油中加入3％无水CaCl2脱水，过滤后，得粗品油；(4)脱固脂粗品油经初步冷却后加入1.5倍量丙酮混合，在-3℃的条件下进行结晶，结晶完全后在-11℃～-8℃条件下过滤。滤油真空浓缩回收有机溶剂后，油中TTX浓度为0.6μg/ml(河鲀毒素与制剂要求的浓度一致)，加特丁基苯二酚使其在制剂中浓度为0.1％，即得河鲀油制剂。
实施例3(1)河鲀肝脏1000克切块，加1倍水，搅拌20～60分钟，离心过滤(滤液供提取河鲀毒素用)，滤后肝块加1倍水，搅拌加热到50℃，加入13％氨水，调到pH＝9，继续搅拌加热至60℃，保温45分钟，加氯化铵140克，继续搅拌，使其充分水解，水解液趁热离心分离，将油、水、肝渣分别收集；(2)水洗用65℃热水洗油(油与水的体积比例为1∶2)1次，充分搅拌，静置20分钟后，使油水分层，收集油层；(3)脱水油中加入4％无水CaCl2脱水，过滤后，得粗品油；
(4)脱固脂粗品油经初步冷却后加入2倍量异丙酮混合，在-15℃的条件下进行结晶，结晶完全后在-15℃～-10℃条件下过滤，滤油真空浓缩回收有机溶剂后，加入河鲀毒素含量高的河鲀油(油中TTX低于要求浓度)，调节河鲀毒素在油中所占比例为5μg/ml，即得河鲀油制剂。
实施例4(1)河鲀卵巢1000克切块，加3倍水，搅拌20～60分钟后加热到60℃，加入7％氨水，调到pH＝8.5，继续搅拌加热至80℃，保温60分钟，加硝酸铵210克，继续搅拌，使其充分水解，水解液趁热离心分离，将油、水、卵巢渣分别收集；(2)水洗用65℃热水洗油(油与水的体积比例为1∶1.5)2次，充分搅拌，静置20分钟后，使油水分层，收集油层；(3)脱水用真空机脱去油中水，得粗品油；(4)脱固脂粗品油经初步冷却后加入2倍量正已烷和丙酮混合液〔15％正已烷、85％含水丙酮(含水1.4％)〕，在-14℃的条件下进行结晶，结晶完全后在-10℃～-5℃条件下过滤，滤油真空浓缩回收有机溶剂后，加入河鲀毒素油制剂(油中TTX低于要求浓度)，调节油中河鲀毒素浓度为10μg/ml，加入叔丁基对羟基茴香醚使其在制剂中浓度为0.2％，即得河鲀油制剂。
实验例1河鲀肝油脂肪酸成分将虫纹东方鲀、黄鳍东方鲀、菊黄东方鲀、红鳍东方鲀和人工养殖红鳍东方鲀的肝脏用乙醚萃取出肝油，分别制备成脂肪酸甲酯混合体，与脂肪酸甲酯混合标准样(Sigma公司)，在同一条件下进行气相色谱保留时间作对照，定量方法采用峰面积归一法。结果(见表1)四种野生河鲀鱼的肝油和人工养殖河鲀鱼的肝油所含脂肪酸的种类基本相同，虽然各种脂肪酸百分含量不尽相同，但是差别并不太大。能测得含量脂肪酸18种，其中饱和脂肪酸含量占脂肪酸总量的25％左右，以C16含量最高；不饱和脂肪酸占总脂量的71％，是饱和脂肪酸2.8倍，其中，二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)占总脂量的9.3％和17.3％。EPA和DHA等多烯酸是构成细胞和组织成分，具有防治心血管病、抗炎、抗癌、增强免疫力等特殊疗效(抗癌剂—C20:5(日本)公开特许公报，昭和62-77319；张朝晖.《海洋药物研究与开发》，人民卫生出版社，2003，P49)。在河鲀油脂肪酸的含量中未发现不可食用的化合物存在。
表1 五种河鲀肝油脂肪酸组成的百分比
实验例2河鲀肝油的抑瘤实验取小白鼠(18～20克)60只，接种肝癌瘤株3天后，选择瘤株大小一致的小白鼠分成实验组与对照组，每组10只。其中实验分三组，①河鲀肝原油；②河鲀油制剂；③河鲀毒素水溶液(含河鲀毒素0.2μg/ml)。每天腹腔注射二次，每次0.2ml/只，给药10天，停止给药3天后，解剖取瘤和对主要内脏进行检查，对实验组与对照组瘤重进行对比，计算出抑制率。实验结果(见表2)①河鲀肝原油对瘤的抑制率是54％，抑瘤效果明显，P＜0.05；②河鲀油制剂对瘤的抑制率达59％，抑瘤效果非常明显，P＜0.01；③河鲀毒素水溶液组对瘤体无抑制作用。说明河鲀肝油确实存在抑瘤组分，但不是河鲀毒素；抑瘤组分可能与河鲀肝油中高度不饱和脂肪酸有关。
表2河鲀肝脏提取物抑瘤实验
实验例3河鲀肝油的小鼠热板镇痛实验选用体重18～22g雌小鼠，每组10只，给药前先测定各鼠的正常痛阀。腹腔注射河鲀肝油制剂和生理盐水对照组(0.2ml/只)，测定30、60、90、120及150分钟的小鼠痛阀一次，每天二次，共给药五次。实验结果首次给药后小鼠痛阀提高百分率是29％，尚未显出明显效应(P＞0.05)；第2至4次给药后，小鼠痛阀提高百分率分别是33％、34％、49％、(P＜0.05及P＜0.01)；末次给药48小时后，小鼠痛阀提高百分率是47％(P＜0.01)，这说明河鲀油制剂镇痛效应起效缓慢，连续给药后，镇痛效应能持续上升，镇痛作用明显，且镇痛持续时间长。对照组药前与药后的痛阀反应无明显差别。
实验例4河鲀肝油镇痛有效成分的筛选实验装有层析硅胶玻璃柱一根，加入河鲀肝油10ml，当肝油降至硅胶面时，先加入石油醚洗脱，分瓶收集洗脱液，每瓶50ml，检查洗脱液无组分流出为止，再按同一方法，先后加入乙醚、石油醚—乙酸乙酯(10∶1)、石油醚—乙酸乙酯(10∶1)和乙醇。挥发掉收集瓶中的溶剂，并结合小鼠扭体镇痛法进行跟踪测定。结果，在石油醚—乙酸乙酯(10∶1)收集馏分中，有几瓶检测出有镇痛作用，其它收集馏分，没有镇痛作用。
合并有镇痛作用的馏分，倒入分液漏斗内，加醋酸水(pH4.8)振摇，使油水充分混合，静置，收集水层溶液。油层如此反复用无离子水洗涤几次，合并水溶液，用D152#弱酸性阳离子交换树脂进行交换，8％醋酸洗脱，用小白鼠跟踪毒性，收集含毒馏分，减压浓缩。取浓缩液进行薄层层析，以河鲀毒素鲀品对照，展开剂为正丁醇∶醋酸∶水＝4∶2∶2，韦伯试剂喷雾显色。薄层层析结果，河鲀毒素鲀品为一桃红园斑，Rf＝0.48，试样在Rf＝0.48处也有一个桃红色斑。所以，初步认定河鲀肝油镇痛的有效成分是河鲀毒素。
实验例5河鲀肝油镇痛有效成分的验证实验采用小白鼠扭体法。小白鼠体重18～23g，雌雄兼用，实验分二组，每组小白鼠10只。实验药剂①河鲀肝油制剂，②花生油加河鲀毒素(河鲀毒素含量为0.2μg/ml)，用专利“河鲀毒素油相制剂的制备方法”制备(黄致强等，中国专利申请号200410080557.7)。
分别用实验药剂给小鼠灌胃(0.1ml/10g)，每天二次，共给药三次。首次给药前先测定各鼠扭体反应数，给药后3小时，腹腔注射0.6％醋酸0.2ml/只，记录20分钟内小鼠扭体数，与给药前扭体反应比较。结果(见表3)小鼠扭体反应抑制率是①组为9％；②组为24％，二个组均未显出明显效应，P＞0.05；第三次给药后3小时，测定醋酸对小白鼠扭体反应抑制率分别是90％和85％，镇痛作用明显P＜0.01。而给药二个组比较，差异不显著，P＞0.05。这一结果证明河鲀肝油制剂镇痛的有效成分是河鲀毒素。
表3 小鼠扭体法对河鲀油的镇痛作用
临床试验镇痛效果收住院癌症患者22例，男性16例，女性6例，年龄，男50至67岁，女32至80岁。共观察病种有胃癌4例，肝癌4例，肺癌3例，直肠癌2例，鼻烟癌2例，结肠癌、甲状腺癌、宫颈癌、卵巢癌、食道癌、膀胱癌、淋巴癌各1例。癌患者都有其它脏器及淋巴结转移，这些病人大都拌有持续性(多数)或阵发性(少数)疼痛。用药量每天三次，每次饭后口服软胶囊1～2粒(每粒含河豚油一毫升)。对疼痛观察是在服药后3小时左右，结果服药1天，止痛起效4例，占18.2％；2天起效11例，占50％；3天起效5例，占22.7％；4天不起效2例，占9％。从止痛效果看无止痛作用2例，占9.1％；轻度缓解1例，占4.5％；中度止痛10例，占45.5％；明显止痛5例，占22.7％；完全止痛4例，占18.2％，总有效率86.4％。止痛特点是起效缓慢，但止痛持续时间长；对使用麻醉性镇痛药耐受成瘾患者仍有镇痛作用。其镇痛特点与动物实验结果基本一致。
权利要求
1.一种河鲀油制剂，其特征在于，所述河鲀油制剂的有效成分为河鲀毒素。
2.如权利要求1所述的河鲀油制剂，其特征在于所述河鲀油制剂是河鲀肝油制剂或河鲀卵巢油制剂。
3.如权利要求1或2所述的河鲀油制剂，其特征在于，所述河鲀油制剂中河鲀毒素所占比例为0.01μg/ml～15μg/ml。
4.如权利要求1所述的河鲀油制剂的制备方法，其特征在于，(1)将河鲀肝脏切块后均浆，按肝脏重量比例加0.5～3倍水，加热到30～60℃后，调节pH值至7～10，再加热到60～90℃，保温20～60分钟，按重量比例加5％～20％铵盐，搅拌使其充分水解，水解液趁热过滤，分离出油层，经水洗，脱水，得粗品油，(2)粗品油加有机溶剂混合，于-3℃～-20℃下冷冻结晶，待结晶完全后，低温过滤，滤油蒸脱有机溶剂后，调节滤油中河鲀毒素的浓度为0.01μg/ml～15μg/ml，再加稳定剂使其在制剂中的质量百分浓度达0.001％～0.2％，即得河鲀油制剂。
5.如权利要求4所述的制备方法，其中所述的内脏为河鲀肝脏或河鲀卵巢。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的铵盐选自以下物质中的一种或多种碳酸铵、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵，所述的弱碱为氢氧化铵。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的有机溶剂选自以下物质中的一种或多种正己烷、丙酮、异丙酮、苯、乙醇。
8.如权利要求4所述的制备方法，其中粗油与有机溶剂之体积比例为1∶0.5～3。
9.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述的稳定剂选自以下物质中的一种或多种没食子酸丙酯、特丁基苯二酚、叔丁基对羟基茴香醚、Vc、Ve。
全文摘要
本发明公开了一种河鲀油制剂，其主要有效成分是河鲀毒素(TTX)，河鲀油制剂可以按照常规的药物制备工艺，制成软胶囊、乳剂、营养补剂或栓剂，用于镇痛或戒除药物的依赖性；本发明还公开了一种上述制剂的制备方法，其步骤是将河鲀内脏均浆，加水、加热，分别加弱碱和铵盐水解，分离出河鲀油。河鲀油经水洗，再加有机溶剂混合，于低温下结晶后，离心过滤。滤油去除有机溶剂后，再加适量稳定剂，即制成河鲀油制剂，该方法具有工艺简单，容易实施，出油率高，质量稳定的优点。
文档编号A61K35/60GK1647800SQ200410103909
公开日2005年8月3日 申请日期2004年12月30日 优先权日2004年12月30日
发明者黄致强, 黄海燕, 黄海枫 申请人:黄致强