专利名称：血脑屏障破坏的抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有吡唑啉酮衍生物、或其生理学上允许的盐、或其水合物或其溶剂化物作为有效成分的用于抑制血脑屏障破坏的抑制剂。
背景技术：
所谓的血脑屏障是限制血液中的物质进入脑组织内的屏障，由此保护脑组织免受有害物质的侵害。尼古丁、咖啡因或海洛因之类的脂溶性物质可容易地通过血脑屏障，但极性和强电解质之类的非脂溶性物质一般难以通过血脑屏障。一方面，已经知道的是，脑代谢所必需的D-葡萄糖等水溶性物质通过载体经血脑屏障而被运送到脑组织内。在脑毛细血管中，相互邻接的内皮细胞之间形成被称为“tight-junction”的紧密结合，因此，物质不能从细胞之间的间隙漏出，原则上必须是能通过脑毛细血管的内皮细胞的物质才能出入脑内。如上所述，脑毛细血管的内皮细胞不仅向脑内输送营养物质，还通过细胞膜上存在的各种转运系统将药物运送到脑内。
多发性硬化症、脑膜炎、大脑炎或脑脓肿等是血脑屏障被破坏引起的中枢神经系统的炎症性疾病，已有报告报道了这些疾病显示在脑脊液中存在大量的炎症性细胞因子，TNF-α和IL-1β。(S.L.Hauser，et al.，Cytokine accumulation in CSF of multiple sclerosis patientsfrequent detection of interleukin-1 and tumor necrosis factor but not interleukin-6.Neurology，401735-1739(1990))。
一方面，众所周知，下述通式(I)
(式中，R1表示氢原子、芳基、碳数为1～5的烷基或总碳数为3～6的烷氧基羰基烷基，R2表示氢原子、芳氧基、芳巯基、碳数为1～5的烷基或碳数为1～3的羟基烷基，或者R1和R2合在一起表示碳数为3～5的亚烷基，R3表示氢原子、碳数为1～5的烷基、碳数为5～7的环烷基、碳数为1～3的羟基烷基、苄基、萘基、苯基或由1～3个相同或不同的取代基取代的苯基，所述取代基选自由碳数为1～5的烷氧基、碳数为1～3的羟基烷基、总碳数为2～5的烷氧基羰基、碳数为1～3的烷基巯基、碳数为1～4的烷基氨基、总碳数为2～8的二烷基氨基、卤原子、三氟甲基、羧基、氰基、羟基、硝基、氨基及乙酰胺基组成的组)表示的吡唑啉酮衍生物在药物的应用中具有维持脑功能正常化的作用(请参见日本专利公告No.5-31523号公报)、抑制过氧化脂质生成的作用(请参见日本专利公告No.5-35128号公报)、抗溃疡的作用(请参见日本专利公开No.3-215425号公报)、以及抑制血糖上升的作用(请参见日本专利公开No.3-215426公报)等。
另外，上述通式(I)所示的化合物中，以3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮为有效成分的药剂已经自2001年6月作为脑保健剂(通用名为“依达拉奉”(ェダラボン)、商品名为“ラジカット”)，由三菱制药株式会社制造销售)上市。有报告报道该依达拉奉对活性氧具有很高的反应性(请参见Kawai，H.，et al.，J.Phamacol.Exp.Ther.，281(2)，921，1997；及Wu，TW.et al.，Life Sci，67(19)，2387，2000)。如上所述，依达拉奉是一种通过消除以活性氧为主的各种自由基而起到防止细胞损害等的作用的自由基清除剂。但是，到目前为止，还没有研究依达拉奉对血脑屏障的破坏是否有抑制作用的报告。
发明内容
本发明的课题在于提供一种血脑屏障破坏的抑制剂。
本发明者为了解决上述课题，采用体内和体外方法研究了式(I)所示吡唑啉酮衍生物用于抑制血脑屏障破坏的效果。结果发现，在给予了上述吡唑啉酮衍生物后，发现血脑屏障的破坏受到抑制，患有中枢神经系统炎症性疾病的患者的神经症状可以得到缓解。在上述发现的基础上完成了本发明。
也就是，本发明提供含有下述通式(I)表示的吡唑啉酮衍生物、或其生理学允许的盐、或其水合物或其溶剂化物作为有效成分的、用于抑制血脑屏障破坏的抑制剂， (式中，R1表示氢原子、芳基、碳数为1～5的烷基或总碳数为3～6的烷氧基羰基烷基，R2表示氢原子、芳氧基、芳巯基、碳数为1～5的烷基或碳数为1～3的羟基烷基，或者R1和R2合在一起表示碳数为3～5的亚烷基，R3表示氢原子、碳数为1～5的烷基、碳数为5～7的环烷基、碳数为1～3的羟基烷基、苄基、萘基、苯基或由1～3个相同或不同的取代基取代的苯基，所述取代基选自由碳数为1～5的烷基、碳数为1～5的烷氧基、碳数为1～3的羟基烷基、总碳数为2～5的烷氧基羰基、碳数为1～3的烷基巯基、碳数为1～4的烷基氨基、总碳数为2～8的二烷基氨基、卤原子、三氟甲基、羧基、氰基、羟基、硝基、氨基及乙酰胺基组成的组。)根据本发明的优选实施方式，提供了一种对血脑屏障的通透性增大具有抑制作用的血脑屏障破坏抑制剂，以及提供了一种对脑脊液中的炎症性细胞因子含量的增大具有抑制作用的血脑屏障破坏抑制剂。
根据本发明的优选实施方式，其中式(I)表示的吡唑啉酮衍生物是3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮、或其生理学允许的盐、或其水合物或其溶剂化物。
另一方面，本发明提供了含有式(I)表示的吡唑啉酮衍生物、或其生理学允许的盐、或其水合物或其溶剂化物作为有效成分的用于预防和/或治疗多发性硬化症、脑膜炎、大脑炎或脑脓肿的药物。在优选的实施方式中，式(I)表示的吡唑啉酮衍生物是3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮。
再一方面，本发明提供了一种血脑屏障破坏的抑制方法，该方法包括将有效剂量的以式(I)表示的吡唑啉酮衍生物、或其生理学允许的盐、或其水合物或其溶剂化物对包括人在内的哺乳动物给药的步骤；并且本发明还提供了一种用于预防和/或治疗多发性硬化症、脑膜炎、大脑炎或脑脓肿的方法，该方法包括将有效剂量的以式(I)表示的吡唑啉酮衍生物、或其生理学允许的盐、或其水合物或其溶剂化物对包括人在内的哺乳动物给药的步骤。
另一方面，本发明还提供了一种由式(I)表示的吡唑啉酮衍生物、或其生理学允许的盐、或其水合物或其溶剂化物在制造用于抑制血脑屏障破坏的抑制剂中的用途，以及由式(I)表示的吡唑啉酮衍生物、或其生理学允许的盐、或其水合物或其溶剂化物在制造用于预防和/或治疗多发性硬化症、脑膜炎、大脑炎或脑脓肿的药物中的用途。
图1是表示血脑屏障共培养模型的概貌的图(左图)以及在所制作的共培养模型中荧光素钠扩散速度和TEER(跨内皮细胞电阻)之间的关系的图(右图)。在图1中，术语“PSendo”代表在内皮细胞层中荧光素透过的清除率。向位于双层通透的培养皿(Transwell)顶层(内皮细胞侧)的培养基中添加荧光素，并且观察荧光素向位于Transwell底层(星形胶质细胞侧)的培养基中透过的情况。到了规定的时间，用透过底层的荧光素的量除以顶层培养基中的荧光素的浓度，以此得到所述的透过清除率。因为在实验中测定的该透过清除率是内皮细胞层+Transwell滤膜层+星形胶质细胞层各层合在一起的总的透过清除率(PStotal)，因而，还同时要用在Transwell滤膜中只培养星形胶质细胞的透过清除率(PSastro+filter)进行校正。校正公式为1/PStotal＝1/PSendo+1/PSastro+filter。
图2是表示TNFα(肿瘤坏死因子α)和IL-1β(白介素-1β)对TEER的影响的试验结果。术语“αMSH”代表α黑素细胞刺激激素。
图3是表示NK-κB(核因子-κB)抑制剂和iNOS(诱导型一氧化氮合酶)抑制剂对TEER的效果图。
图4是表示NK-κB抑制剂和iNOS抑制剂对NO产生量的效果图。
图5是表示依达拉奉对TEER的效果图。
图6是表示EAE大鼠中TNFα和IL-1β的量和BBB通透性的试验结果图。
图7是表示依达拉奉对EAE大鼠中TNFα和IL-1β的量和BBB通透性的效果图。术语“CSF”表示脑脊液。
图8是表示在EAE模型大鼠中，对未给药组(对照组)、地塞米松给药组以及依达拉奉给药组进行四肢神经麻痹得分评价的结果图。术语“i.p.”表示腹腔内给药。
具体实施例方式
作为本发明的用于抑制血脑屏障破坏的抑制剂和用于预防和/或治疗多发性硬化症、脑膜炎、大脑炎或脑脓肿的药物(以下将其总称为本发明的药物)，其包含本说明书定义的由通式(I)表示的吡唑啉酮衍生物或其生理学允许的盐、或其水合物或其溶剂化物。
由于互变异构性，本发明中使用的式(I)表示的化合物可以具有以下的通式(I’)或(I”)显示的不同结构。为了方便，本说明书中的通式(I)显示了互变异构体中的一种，本领域的技术人员显然知道存在下述的互变异构体。作为本发明药物的有效成分，也可以使用下述的通式(I’)或(I”)显示的化合物、或其生理学上允许的盐、或其水合物或其溶剂化物。
式(I)中，在R1定义中的芳基可以是单环或多环芳基中的一种。其实例包括苯基、萘基等以及由例如甲基、丁基等烷基、例如甲氧基、丁氧基等烷氧基、例如氯原子等卤原子、或者羟基等取代基取代的苯基等。其它具有芳基部分的取代基(例如芳氧基)中的芳基部分也同样如此。
在R1、R2、R3定义中的碳数为1～5的烷基可以是直链状、支链状中的任何一种。例如有甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基等。其它具有烷基部分的取代基(烷氧基羰基烷基)中的烷基部分也同样如此。
在R1定义中的总碳数为3～6的烷氧基羰基烷基的实例包括甲氧基羰基甲基、乙氧基羰基甲基、丙氧基羰基甲基、甲氧基羰基乙基、甲氧基羰基丙基等。
在R2定义中的芳氧基例如有对甲基苯氧基、对甲氧基苯氧基、对氯苯氧基、对羟基苯氧基等，芳基巯基例如有苯基巯基、对甲基苯基巯基、对甲氧基苯基巯基、对氯苯基巯基、对羟基苯基巯基等。
在R1和R2的定义中的碳数为3-5的亚烷基例如有三亚甲基、四亚甲基、五亚甲基、六亚甲基、甲基三亚甲基、乙基三亚甲基、二甲基三亚甲基、甲基四亚甲基等等。
在R2和R3定义中的碳数为1～3的羟基烷基例如有羟基甲基、2-羟基乙基、3-羟基丙基等。在R3定义中的碳数为5～7的环烷基例如有环戊基、环己基、环庚基等。
在R3的定义中，其中所述作为苯基取代基的碳数为1～5的烷氧基的实例包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、戊氧基等，总碳数为2～5的烷氧基羰基的实例包括甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基、丁氧基羰基等，碳数为1～3的烷基巯基的实例包括甲基巯基、乙基巯基、丙基巯基等，碳数为1～4的烷基氨基的实例包括甲基氨基、乙基氨基、丙基氨基、丁基氨基等，总碳数为2～8的二烷基氨基的实例包括二甲基氨基、二乙基氨基、二丙基氨基、二丁基氨基等。
作为本发明药物的有效成分优选使用的化合物(I)例如有如下的化合物。
3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮；3-甲基-1-(2-甲基苯基)-2-吡唑啉-5-酮；
3-甲基-1-(3-甲基苯基)-2-吡唑啉-5-酮；3-甲基-1-(4-甲基苯基)-2-吡唑啉-5-酮；3-甲基-1-(3，4-二甲基苯基)-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-乙基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；3-甲基-1-(4-丙基苯基)-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-丁基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(3-三氟甲基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-三氟甲基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(2-甲氧基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-甲氧基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(3，4-二甲氧基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-乙氧基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；3-甲基-1-(4-丙氧基苯基)-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-丁氧基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(2-氯代苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(3-氯代苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-氯代苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(3，4-二氯代苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-溴代苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-氟代苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(3-氯-4-甲基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(3-甲基巯基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-甲基巯基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；4-(3-甲基-5-氧代-2-吡唑啉-1-基)苯甲酸；1-(4-乙氧基羰基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-硝基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；3-乙基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮；1-苯基-3-丙基-2-吡唑啉-5-酮；1，3-二苯基-2-吡唑啉-5-酮；
3-苯基-1-(对甲苯基)-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-氯代苯基)-3-苯基-2-吡唑啉-5-酮；3，4-二甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮；4-异丁基-3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮；4-(2-羟基乙基)-3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮；3-甲基-4-苯氧基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮；3-甲基-4-苯基巯基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮；3，3’，4，5，6，7-六氢-2-苯基-2H-吲唑-3-酮；3-(乙氧基羰基甲基)-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮；1-苯基-2-吡唑啉-5-酮；3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1，3-二甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-乙基-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-丁基-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(2-羟基乙基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-环己基-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-苄基-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(α-萘基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-甲基-3-苯基-2-吡唑啉-5-酮；3-甲基-1-(4-甲基苯基)-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-丁基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-甲氧基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-丁氧基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-氯代苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-羟基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(3，4-二羟基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(2-羟基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(3-羟基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-羟基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；
1-(3，4-羟基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-羟基苯基)-3-苯基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-羟基甲基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-氨基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-甲基氨基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-乙基氨基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-丁基氨基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-二甲基氨基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(乙酰胺基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-氰基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；作为本发明药物的有效成分，除通式(I)表示的游离形态的化合物之外，也可以使用其生理学允许的盐。该生理学允许的盐例如可以使用与盐酸、硫酸、氢溴酸、磷酸等无机酸形成的盐，与甲磺酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、乙酸、乙醇酸、葡糖醛酸、马来酸、富马酸、草酸、抗坏血酸、柠檬酸、水杨酸、烟酸、酒石酸等有机酸形成的盐，与钠、钾等碱金属形成的盐，与镁、钙等碱土金属形成的盐，与氨、三(羟基甲基)氨基甲烷、N，N-二(羟基乙基)哌嗪、2-氨基-2-甲基-1-丙醇、乙醇胺、N-甲基谷氨酰胺、L-谷氨酰胺等胺形成的盐。另外，还可使用与甘氨酸等氨基酸形成的盐。
作为本发明药物的有效成分，例如可以使用上述通式(I)表示的化合物或其生理学允许的盐的水合物，或上述通式(I)表示的化合物或其生理学允许的盐的溶剂化物。对形成溶剂化物的有机溶剂的种类没有特别限制，例如有甲醇、乙醇、乙醚、二噁烷、四氢呋喃等。另外，上述通式(I)表示的化合物有时由于取代基的种类不同而具有1个或更多的不对称碳原子，有时存在光学异构体或非对映异构体等立体异构体。作为本发明药物的有效成分，也可以使用纯的立体异构体、立体异构体的任意混合物、外消旋体等。
通式(I)表示的所有化合物是公知的化合物，本领域的技术人员利用例如日本专利公报No.5-31523号等记载的方法可以容易地进行合成。
对本发明药物的给药量没有特别限定。通常，按照作为有效成分的由通式(I)表示的化合物的重量，一般口服的剂量为每天0.1～1000mg/kg体重，优选每天0.5～50mg/kg体重；非口服时，该剂量为每天0.01～100mg/kg体重，优选每天0.1～10mg/kg体重。上述剂量优选按一天一次或一天分几次(2～3次)服用，可以根据年龄、病情、症状适当增减。
作为本发明的药物，可以将上述通式(I)表示的化合物或其生理学上允许的盐，或其水合物或其溶剂化物直接给药，一般优选将之制备成含有上述物质作为有效成分以及含有药理学和药剂学允许的添加剂的药物组合物，并以该药物组合物的形式给药。
在本发明中可以使用的所述药理学和药剂学允许的添加剂例如有赋形剂、崩解剂或崩解助剂、粘合剂、润滑剂、包衣剂、色素、稀释剂、基剂、溶解剂或溶解助剂、等渗剂、pH调节剂、稳定剂、喷射剂及粘接剂等。
对于适合口服的药物组合物，作为添加剂例如可以使用，赋形剂如葡萄糖、乳糖、D-甘露糖醇、淀粉或结晶纤维素等；崩解剂或崩解助剂如羧基甲基纤维素、淀粉或羧基甲基纤维素钙等，粘合剂如羟基丙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或明胶等；润滑剂如硬脂酸镁或滑石粉等，包衣剂如羟基丙基甲基纤维素、蔗糖、聚乙二醇或氧化钛等，基剂如凡士林、液体石蜡、聚乙二醇、明胶、高龄土、丙三醇、纯净水或硬脂肪等。
对于适合注射或点滴用的药物组合物，可以使用诸如注射用蒸馏水、生理盐水、丙二醇等水性或在使用时可以构成溶液型注射剂的溶解剂或溶解助剂，诸如葡萄糖、氯化钠、D-甘露糖醇、丙三醇等的等渗剂，诸如无机酸、有机酸、无机碱或有机碱等的pH调节剂等添加剂。
对本发明的药物的形态没有限制，可以制成本领域技术人员可以利用的各种形态。作为适合口服的药物，例如可以使用固体药剂添加剂，制成片剂、粉剂、颗粒剂、硬胶囊剂、栓剂或锭剂等；可以使用液状的药剂添加剂，配制成糖浆、乳剂、软胶囊剂等。另外，作为适合非口服的药物，例如可以配制成注射剂、点滴剂、吸入剂、栓剂、经皮吸收剂、经粘膜吸收剂等。另外，以上述通式(I)所示的化合物为有效成分的脑保健剂(点滴剂)因为已经在临床上使用(通用名为依达拉奉(ェダラボン)、商品名“ラジカット”，由三菱制药株式会社制造、销售)，故在本发明的药物中可以直接使用上述市售的制剂。
本发明的药物可有效抑制中枢神经系统的炎症性疾病中的血脑屏障的破坏。作为中枢神经系统的炎症性疾病，可以举出多发性硬化症、脑膜炎、大脑炎和脑脓肿等，特别是多发性硬化症和脑膜炎。本发明优选的药物对血脑屏障的通透性增大具有抑制作用，并且对在脑脊液中炎症性细胞因子(TNF-α、IL-1β等)的含量增大具有抑制作用。
对本发明药物的给药方法没有特别限定，可以口服或非口服给药。对于非口服给药的方式没有特别的限制，可以经静脉内、肌肉内、皮内或皮下注射给药。
此外，在血脑屏障的破坏发生之前可以预防性地给予本发明的药物。对于已经发生了血脑屏障破坏的患者，为了防止症状恶化或使症状减轻，可以对该患者给予本发明的药物。
实施例下面，通过实施例更具体地说明本发明，本发明不限于下述的合成例3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮(下面称作依达拉奉)的合成在乙醇50ml中加入乙酰乙酸乙酯13.0g及苯肼10.8g，回流搅拌3小时。放置冷却该反应液之后，过滤收集析出的结晶，利用乙醇再结晶，得到无色结晶的标题化合物11.3g。
收率67％熔点127.5～128.5℃
实施例1使用血脑屏障共培养模型，评价依达拉奉对血脑屏障破坏的抑制作用(1)血脑屏障共培养模型的制作按照已经报道的方法制作血脑屏障共培养模型(Eur.J.Pharm.Sci.，12215-222，2001)。具体地讲，分离出脑微小毛细血管内皮细胞和大鼠的星形胶质细胞，以在TranswellTM滤膜的两面上进行培养的方式制作共培养模型。下面是该方法的说明。
从牛脑中分离出脑毛细血管。除去脑膜和白质，在添加了10％胎牛血清的DMEM(DMEM+S)中收集灰质。使用Wheaton匀化器通过手动匀化制备血管碎片，在150微米的尼龙筛上收获血管碎片。在DMEM+S中用胶原酶(コラゲナ一ザ)、胰蛋白酶和DNAse I在37摄氏度消化血管1小时，用200微米的尼龙筛过滤。将脑毛细血管级分重新悬浮于冷冻混合物(含有10％DMSO的胎牛血清(FCS))，于-80摄氏度保存。
从新生Wister大鼠(Harlan，Zeist，The Netherlands)分离星形胶质细胞。将分离出的皮质打碎，在37摄氏度与含有胰蛋白酶-EDTA的DMEM一起温育。所得的悬浮液用120微米和45微米的尼龙筛分别过滤，在塑料组织培养瓶(Greiner，Alphen a/d Rijn，TheNetherlands)内于DMEM+S中在37摄氏度在10％的CO2环境下培养3天。此后，每两日更换一次培养基。在培养至汇合时，按1∶3的比例将培养物在用多聚D-赖氨酸包覆的培养瓶中使用胰蛋白酶-EDTA进行继代培养。使培养物生长，直至再次汇合。接着，在两周的时间里，每隔一天回收星形胶质细胞的条件培养基，并用液氮保存在冷冻混合物中。
在用IV型胶原和纤连蛋白包覆的塑料组织培养瓶中接种脑毛细血管，4个小时使细胞黏附，此后，将培养基更换成生长培养基(添加了50％(v/v)星形胶质细胞条件培养基和125μg/ml肝素的DMEM+S)，在37摄氏度在10％CO2气氛下培养生长的细胞(大量的脑毛细血管内皮细胞以及各种少量的外皮细胞)。
在IV型胶原包覆的Transwell聚碳酸酯滤膜(表面积为0.33cm2，孔径为0.4μm；Corning Costar，Cambridge，MA，USA)上制备体外血脑屏障模型。在长到约70％汇合(接种脑毛细血管4或5天后)时，用胰蛋白酶-EDTA处理脑毛细血管内皮细胞约1分钟，使外皮细胞仍旧附着于下层。以45000个细胞/滤膜的密度将星形胶质细胞接种于滤膜的底部，以此制备脑毛细血管内皮细胞和星形胶质细胞的共培养物。10分钟内使星形胶质细胞在滤膜的底部黏附，此后2或3日后对脑毛细血管内皮细胞进行继代培养。以30000个细胞/滤膜的密度接种脑毛细血管内皮细胞。脑毛细血管内皮细胞和星形胶质细胞的共培养物，在刚开始的头2或3天用补充了125μg/ml肝素的DMEM+S培养，在最后的2或3天用DMEM+S或分化培养基(即，补充了5μg/ml的去铁铁传递蛋白、8μg/ml的腐胺、2.5μg/ml亚硒酸钠、312.5μM的8-(4-氯代苯基硫基(CPT))-cAMP、17.5μM的RO-20-1724和1μM的全反式视黄酸的DMEM+S培养基)培养，直至长成紧密的细胞单层。按照同样的方式培养脑毛细血管内皮细胞的单层，只是向培养基中添加50％(v/v)星形胶质细胞的条件培养基。
在图1的左侧的图中显示的是所制作的共培养模型的概貌。在所做成的共培养模型中，荧光素钠的扩散速度和TEER(跨内皮细胞电阻)之间的相互关系表示在图1中右侧的图中。采用Millipore公司的Millicell-ERS(产品编号MERS00001)测定TEER。
(2)TNFα和IL-1β对TEER的影响采用上述的血脑屏障共培养模型，向细胞中加入TNFa(50ng/mL)和IL-1β(5ng/mL)，采用Millipore公司的Millicell-ERS(产品编号MERS00001)测定作为通透性指标的TEER。在TranswellTM滤膜的BBS共培养模型的基底外侧添加TNF-α和IL-1β。结果(n＝3，平均值±SEM，*P＜0.05)显示在图2中从图2所示的结果可以看出，添加TNF-α(50ng/mL)和/或IL-1β(50ng/mL)使TEER显著下降。
(3)NF-κB抑制剂、iNOS抑制剂和依达拉奉使TEER减少的恢复在作为NF-κB抑制剂的BAY11-7082(CALBIOCHEM公司)(10μM)或α-MSH(Sigma公司)(1μM)、作为iNOS抑制剂的1400W(CALBIOCHEM公司)(0.5nM)或依达拉奉(10μM)的存在下，向细胞中添加TNF-α(50ng/mL)和/或IL-1β(5ng/mL)，使用Millipore公司的Millicell-ERS(产品编号MERS00001)测定作为通透性指标的TEER。而且，使用Griess法测定培养液中的NO。
结果显示在图3至图5中(在各实验中，n＝3，平均值±SEM，*P＜0.05)。图3表示的是NF-κB抑制剂和iNOS抑制剂对TEER的效果。图4显示的是NF-κB抑制剂和iNOS抑制剂对NO产生量的效果。图5显示的是依达拉奉对TEER的效果。从图3至图5的结果可以看出，由于添加了NF-κB抑制剂、iNOS抑制剂或依达拉奉，使得由TNF-α或IL-1β引起的TEER减少可以得以恢复。
实施例2采用实验用自体免疫性脑脊髓炎(EAE)模型评价依达拉奉对血脑屏障破坏的抑制作用利用已知的方法制做EAE(实验用自体免疫性脑脊髓炎)模型大鼠(Int.J.immunopharmacol，7497-503，1995)。首先制备由等量的豚鼠脊髓、无菌磷酸盐缓冲液(PBS)和不完全弗氏佐剂作成的脑炎诱发性乳液，向其中补充10mg/ml的结核杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)H37Ra(Difco Laboratories)。通过对各大鼠(近交雄性Lewis大鼠，体重200-250g)的两后肢的脚底皮下注射接种0.1ml如此制成的脑炎诱发性乳液，从而制成EAE模型大鼠。给对照大鼠接种不含脊髓的乳液。
在给对照大鼠和EAE模型大鼠给药依达拉奉的情况下和不给药依达拉奉的情况下，测定血浆和脑脊液中的TNF-α和IL-1β的浓度、脑脊液蛋白质/血浆蛋白质的比率和血脑屏障通透性(测定静脉注射荧光素钠20分钟后的脑/血浆浓度(Kp，app))。“Kp，app”表示表观分布比率(apparent distribution ratio)，是在静脉注射给药荧光素后其在脑组织中的浓度除以其在血浆中浓度所得的值(×100，以％表示)。而且，以脑组织的比重为1进行换算(因为浓度的单位为/g组织的重量)。从致敏(给予抗原溶液)后第10天每隔24小时在3日内(＝在致敏后第10天、第11天、第12天，共3次)给予依达拉奉，给药量为3mg/kg/日(腹腔内给药)。结果显示在图6和图7中(在各实验中，n＝3，平均值±SEM，*P＜0.05)。
从图6和图7显示的结果可以看出，与对照大鼠相比较而言，EAE模型大鼠脑脊液中的TNF-α和IL-1β的浓度增加，脑脊液蛋白质/血浆蛋白质的比率增大，而且血脑屏障通透性(静脉注射荧光素钠的脑/血浆浓度)也增大。但是，从图7的结果可以看出，证实了这些作用通过给予依达拉奉而被抑制。
而且，对没有给药的EAE模型大鼠(对照组)、地塞米松(1mg/kg/日，腹腔内给药)给药组和依达拉奉(3mg/kg/日，腹腔内给药)给药组的四肢神经麻痹的得分进行评。四肢神经麻痹的得分根据以下标准评价。
表1EAE大鼠的Paul临床得分得分 神经症状0正常1尾巴松弛以及步行运动失调2后肢部分麻痹3后肢完全麻痹并伴有失禁4四肢完全麻痹评价结果显示在图8中(在各实验中，n＝3，平均值±SEM，*P＜0.05)。如图8的结果所表明的那样，给药地塞米松的情况与给药依达拉奉的情况一样，EAE模型大鼠的四肢神经麻痹得分得到了恢复。
上述的实施例1和实施例2的结果证实，依达拉奉能保护血脑屏障系统、能改善多发性硬化症模型的神经症状。
产业上利用的可能性本发明的药物对抑制中枢神经系统的炎症性疾病中的血脑屏障破坏很有用。
本申请要求日本专利申请No.2003-004813的优选权，该基础申请的说明书中记载的全部内容，以引用方式并入本文，作为本说明书公开的一部分。
权利要求
1.一种血脑屏障破坏的抑制剂，其包含了作为有效成分的由下述通式(I)表示的吡唑啉酮衍生物或其生理学允许的盐、或其水合物或其溶剂化物 式(I)中，R1表示氢原子、芳基、碳数为1～5的烷基或总碳数为3～6的烷氧基羰基烷基，R2表示氢原子、芳氧基、芳巯基、碳数为1～5的烷基或碳数为1～3的羟基烷基，或者R1和R2合在一起表示碳数为3～5的亚烷基，R3表示氢原子、碳数为1～5的烷基、碳数为5～7的环烷基、碳数为1～3的羟基烷基、苄基、萘基、苯基或由1～3个相同或不同的取代基取代的苯基，所述取代基选自由碳数为1～5的烷基、碳数为1～5的烷氧基、碳数为1～3的羟基烷基、总碳数为2～5的烷氧基羰基、碳数为1～3的烷基巯基、碳数为1～4的烷基氨基、总碳数为2～8的二烷基氨基、卤原子、三氟甲基、羧基、氰基、羟基、硝基、氨基及乙酰胺基组成的组。
2.如权利要求1所述的血脑屏障破坏的抑制剂，其具有抑制血脑屏障的通透性增大的作用。
3.如权利要求1或2所述的血脑屏障破坏的抑制剂，其具有抑制脑脊液中炎症性细胞因子的含量增大的作用。
4.权利要求1-3中任意一项所述的血脑屏障破坏的抑制剂，其中由式(I)表示的吡唑啉酮衍生物是3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮。
5.一种用于预防和/或治疗多发性硬化症、脑膜炎、大脑炎或脑脓肿的药物，其含有作为有效成分的由下述通式(I)表示的吡唑啉酮衍生物、或其生理学允许的盐、或其水合物或其溶剂化物 式(I)中，R1表示氢原子、芳基、碳数为1～5的烷基或总碳数为3～6的烷氧基羰基烷基，R2表示氢原子、芳氧基、芳巯基、碳数为1～5的烷基或碳数为1～3的羟基烷基，或者R1和R2合在一起表示碳数为3～5的亚烷基，R3表示氢原子、碳数为1～5的烷基、碳数为5～7的环烷基、碳数为1～3的羟基烷基、苄基、萘基、苯基或由1～3个相同或不同的取代基取代的苯基，所述取代基选自由碳数为1～5的烷基、碳数为1～5的烷氧基、碳数为1～3的羟基烷基、总碳数为2～5的烷氧基羰基、碳数为1～3的烷基巯基、碳数为1～4的烷基氨基、总碳数为2～8的二烷基氨基、卤原子、三氟甲基、羧基、氰基、羟基、硝基、氨基及乙酰胺基组成的组。
6.如权利要求5所述的药物，其中由式(I)表示的吡唑啉酮衍生物是3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮。
7.一种抑制血脑屏障破坏的方法，其包括对包括人在内的哺乳动物给药有效量的由下述通式(I)表示的吡唑啉酮衍生物、或其生理学允许的盐、或其水合物或其溶剂化物的步骤 式(I)中，R1表示氢原子、芳基、碳数为1～5的烷基或总碳数为3～6的烷氧基羰基烷基，R2表示氢原子、芳氧基、芳巯基、碳数为1～5的烷基或碳数为1～3的羟基烷基，或者R1和R2合在一起表示碳数为3～5的亚烷基，R3表示氢原子、碳数为1～5的烷基、碳数为5～7的环烷基、碳数为1～3的羟基烷基、苄基、萘基、苯基或由1～3个相同或不同的取代基取代的苯基，所述取代基选自由碳数为1～5的烷基、碳数为1～5的烷氧基、碳数为1～3的羟基烷基、总碳数为2～5的烷氧基羰基、碳数为1～3的烷基巯基、碳数为1～4的烷基氨基、总碳数为2～8的二烷基氨基、卤原子、三氟甲基、羧基、氰基、羟基、硝基、氨基及乙酰胺基组成的组。
8.如权利要求7所述的方法，其中通过抑制血脑屏障的通透性增大来抑制血脑屏障的破坏。
9.如权利要求7或8所述的方法，其中通过抑制脑脊液中炎症性细胞因子数量的增多来抑制血脑屏障的破坏。
10.权利要求7-9中任意一项所述的方法，其中由式(I)表示的吡唑啉酮衍生物是3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮。
11.一种预防和/或治疗多发性硬化症、脑膜炎、大脑炎或脑脓肿的方法，其包括对包括人在内的哺乳动物给药有效量的由下述通式(I)表示的吡唑啉酮衍生物、或其生理学允许的盐、或其水合物或其溶剂化物的步骤 式(I)中，R1表示氢原子、芳基、碳数为1～5的烷基或总碳数为3～6的烷氧基羰基烷基，R2表示氢原子、芳氧基、芳巯基、碳数为1～5的烷基或碳数为1～3的羟基烷基，或者R1和R2合在一起表示碳数为3～5的亚烷基，R3表示氢原子、碳数为1～5的烷基、碳数为5～7的环烷基、碳数为1～3的羟基烷基、苄基、萘基、苯基或由1～3个相同或不同的取代基取代的苯基，所述取代基选自由碳数为1～5的烷基、碳数为1～5的烷氧基、碳数为1～3的羟基烷基、总碳数为2～5的烷氧基羰基、碳数为1～3的烷基巯基、碳数为1～4的烷基氨基、总碳数为2～8的二烷基氨基、卤原子、三氟甲基、羧基、氰基、羟基、硝基、氨基及乙酰胺基组成的组。
12.如权利要求11所述的方法，其中以式(I)表示的吡唑啉酮衍生物是3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮。
13.下述通式(I)表示的吡唑啉酮衍生物、或其生理学允许的盐、或其水合物或其溶剂化物在制备用于抑制血脑屏障破坏的抑制剂中的应用， 式(I)中，R1表示氢原子、芳基、碳数为1～5的烷基或总碳数为3～6的烷氧基羰基烷基，R2表示氢原子、芳氧基、芳巯基、碳数为1～5的烷基或碳数为1～3的羟基烷基，或者R1和R2合在一起表示碳数为3～5的亚烷基，R3表示氢原子、碳数为1～5的烷基、碳数为5～7的环烷基、碳数为1～3的羟基烷基、苄基、萘基、苯基或由1～3个相同或不同的取代基取代的苯基，所述取代基选自由碳数为1～5的烷基、碳数为1～5的烷氧基、碳数为1～3的羟基烷基、总碳数为2～5的烷氧基羰基、碳数为1～3的烷基巯基、碳数为1～4的烷基氨基、总碳数为2～8的二烷基氨基、卤原子、三氟甲基、羧基、氰基、羟基、硝基、氨基及乙酰胺基组成的组。
14.如权利要求13所述的应用，其中所述血脑屏障破坏的抑制剂具有抑制血脑屏障的通透性增大的作用。
15.如权利要求13或14所述的应用，其中所述血脑屏障破坏的抑制剂具有抑制脑脊液中炎症性细胞因子的含量增多的作用。
16.权利要求13-15中任意一项所述的应用，其中以式(I)表示的吡唑啉酮衍生物是3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮
17.由下述通式(I)表示的吡唑啉酮衍生物、或其生理学允许的盐、或其水合物或其溶剂化物在制备用于预防和/或治疗多发性硬化症、脑膜炎或大脑炎或脑脓肿的药物中的应用， 式(I)中，R1表示氢原子、芳基、碳数为1～5的烷基或总碳数为3～6的烷氧基羰基烷基，R2表示氢原子、芳氧基、芳巯基、碳数为1～5的烷基或碳数为1～3的羟基烷基，或者R1和R2合在一起表示碳数为3～5的亚烷基，R3表示氢原子、碳数为1～5的烷基、碳数为5～7的环烷基、碳数为1～3的羟基烷基、苄基、萘基、苯基或由1～3个相同或不同的取代基取代的苯基，所述取代基选自由碳数为1～5的烷基、碳数为1～5的烷氧基、碳数为1～3的羟基烷基、总碳数为2～5的烷氧基羰基、碳数为1～3的烷基巯基、碳数为1～4的烷基氨基、总碳数为2～8的二烷基氨基、卤原子、三氟甲基、羧基、氰基、羟基、硝基、氨基及乙酰胺基组成的组。
18.如权利要求17所述的应用，其中由通式(I)表示的吡唑啉酮衍生物是3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮。
全文摘要
本发明的目的在于提供一种血脑屏障破坏的抑制剂。本发明提供一种用于抑制血脑屏障破坏的抑制剂，其包含了作为有效成分的由下述通式(I)表示的吡唑啉酮衍生物或其生理学允许的盐、或其水合物或其溶剂化物，式(I)中，R
文档编号A61P7/00GK1723201SQ200480001908
公开日2006年1月18日 申请日期2004年1月9日 优先权日2003年1月10日
发明者川上纯一 申请人:三菱制药株式会社