Melan－a肽类似物－病毒样颗粒偶联物的制作方法

专利名称：Melan－a肽类似物－病毒样颗粒偶联物的制作方法
相关申请的交叉引用本申请要求2003年3月26日申请的美国临时申请No.60/457,348的优先权，其全部内容在此引用作为参考。
背景技术：
发明领域本发明涉及疫苗学、免疫学和医学领域。本发明提供用于增强针对MelanA肽类似物的免疫应答的组合物和方法，该MelanA肽类似物通过结合，优选通过将免疫刺激物，特别是免疫刺激性核酸，更具体而言是含有至少一种非甲基化CpG序列的寡核苷酸，包装到病毒样颗粒(VLP)内，而与病毒样颗粒(VLP)偶联、融合或以其他方式附着。本发明能用来诱发强烈、持续的T细胞应答，尤其可用于肿瘤的治疗。
相关技术免疫系统的本质建立在两个不同的基础支柱上一个是特异性或获得性免疫，其特征在于相对较慢的应答动力学和记忆能力；另一个是非特异性或先天免疫，其显示快速的应答动力学，但缺乏记忆。
已经明确，单独施用纯化蛋白质通常不足以引起强烈的免疫应答；分离的抗原通常必须与被称为佐剂的辅助物质一起施用。施用的抗原在这些佐剂内受到保护而免遭快速降解，佐剂导致长时间释放低水平抗原。
与分离的蛋白质不同，在不用任何佐剂、有及没有T细胞辅助的情况下，病毒能诱导快速、有效的免疫应答(Bachmann & Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol.15235-270(1997))。许多病毒展示一种准晶体表面，其表面显示规则的表位阵列，可有效地将表位特异性免疫球蛋白交联在B细胞上(Bachmann & Zinkernagel，Immunol.Today 17553-558(1996))。病毒结构甚至与自身免疫病中抗-抗体的产生有关，是对病原体的自然应答的一部分(参见Fehr，T.，et al.，J.Exp.Med.1851785-1792(1997))。因此，病毒颗粒上以有序且重复阵列组织起来的抗原具有高度的免疫原性，因为它们能够直接激活B细胞，并诱导细胞毒性T细胞应答的产生，后者是免疫系统的另一个重要武器。
作为抗原的病毒颗粒与其分离的成分相比表现出两个优点(1)由于具有高度重复的表面结构，它们能够直接激活B细胞，产生高抗体滴度和长期的B细胞记忆；(2)病毒颗粒，而不是可溶性蛋白质，具有诱发细胞毒性T细胞应答的能力，即使这些病毒是非感染性的且不使用佐剂。
另外，例如在细菌和大多数非脊椎动物中存在的富含非甲基化CG基序(CpG)的DNA，在体外及体内对B细胞、树突细胞和其它APC都显示强刺激活性。尽管细菌DNA在许多脊椎动物种之间是免疫刺激性的，但是各自的CpG基序可能不同。实际上，刺激小鼠免疫细胞的CpG基序可能不一定刺激人免疫细胞，反之亦然。另外，免疫刺激性CpG-寡脱氧核苷酸也诱发严重的副作用，在小鼠中引起髓外血细胞形成伴脾大和淋巴结病(Sparwasser et al.，J.Immunol.(1999)，1622368-74和实施例18)。
最近疫苗接种策略已经取得显著进展，但是现有策略仍然需要改进。特别是，本领域仍然需要研制新的改进的疫苗，该疫苗在不普遍激活APC和其它细胞的情况下，与天然病原体一样有效地引起强CTL免疫应答和抗病原体保护。
黑素瘤是黑色素细胞或黑色素细胞相关痣细胞引起的攻击性且通常转移性的肿瘤。黑素瘤占全部皮肤癌的约3％，对于妇女，世界上黑素瘤的增长超过除肺癌以外的其它所有肿瘤。甚至在黑素瘤明显位于皮肤上时，仍有高达30％的患者发展为全身转移，并且大多数将死亡。在过去十年中，已经发展了免疫治疗和基因治疗作为治疗黑素瘤的新的、有前途的方法，例如，在使用或不使用佐剂的情况下用MelanA/MART-1肽治疗黑素瘤患者。这些策略通常获得有限的成功。而且，大多数研究不是用MHCI类多聚体直接测定离体CTL应答，而是使用CTL培养物，并刺激它们几周时间，之后才能够最终测定MelanA特异性CTL应答。通常，肽本身不是免疫原性的，具有极短的半衰期。
另外一种免疫治疗方法是向树突细胞中加载MelanA/MART-1肽，或者用MelanA/MART-1-RNA转染树突细胞，并且重新注射给患者。这种方法的缺点是要从每一个体患者中纯化自体树突细胞并将其与细胞因子在体外孵育数天。这是非常精细的，因为为了具有免疫原性而不是可使T细胞不再对肿瘤应答的耐受原性，树突细胞必须保持正确的成熟状态。
Dudley，M.E.(Science.2002 Oct 25；298(5594)850-4)的另外一种方法是从患者的自体肿瘤物质中分离MelanA-特异性T细胞，体外培养和扩增，并且重新注射给供体。如上述方法一样，需要为每名个体患者分别制备特异性的疫苗，因此不是最有效的治疗方法。
因此，对于癌症，特别是黑素瘤的免疫治疗新策略的发展而言，有效黑素瘤疫苗的表征至关重要。
发明概述本发明基于以下的发现特定人MelanA肽类似物当结合到具有内在重复组织结构的核心颗粒时，特别是分别结合到包装有免疫刺激物(ISS)如DNA寡核苷酸的病毒样颗粒(VLP)和VLP亚单位时，是诱导特异性抗体的强免疫原。本发明进一步基于以下的发现免疫刺激物如DNA寡核苷酸能够包装到VLP内，使其免疫原性增强。出乎意料的是，VLP内的核酸和寡核苷酸分别能够用免疫刺激物和含有CpG基序的DNA-寡核苷酸来特异替换。令人吃惊的是，这些包装的免疫刺激物，特别是免疫刺激性核酸，如含非甲基化CpG的寡核苷酸，保留了其免疫刺激能力，但是不会广泛激活先天免疫系统。含有根据本发明的VLP和免疫刺激物，特别是CpG-VLP的组合物，免疫原性显著强于不含CpG的对应物，并且诱发更强的B细胞和T细胞应答。另外，针对VLP和MelanA肽类似物的T细胞应答尤其集中于Th1型。因此，附着于载有CpG的VLP上的人MelanA肽类似物可能是用于对抗肿瘤的预防性或治疗性接种的理想疫苗。
在第一个实施方案中，本发明提供一般且优选地用于增强动物中的免疫应答的组合物，该组合物包含病毒样颗粒，免疫刺激物，优选免疫刺激性核酸，更优选含非甲基化CpG的寡核苷酸，和至少一种抗原或抗原决定簇，其中所述免疫刺激物、核酸或寡核苷酸与病毒样颗粒偶联、融合或以其他方式附着，或被病毒样颗粒包封，即与之结合，并且其中所述抗原或抗原决定簇与所述病毒样颗粒结合，其中所述抗原包含、或者基本由、或者由人黑素瘤MelanA肽类似物组成。
在本发明的一个优选实施方案中，免疫刺激性核酸，特别是含非甲基化CpG的寡核苷酸，通过磷酸骨架的硫代磷酸修饰而稳定化。在另一个优选实施方案中，免疫刺激性核酸，特别是含非甲基化CpG的寡核苷酸，通过消化VLP内的RNA同时添加含有所选CpG的DNA寡核苷酸，而被包装到VLP内。在一个同样优选的实施方案中，可将VLP解装配，之后在CpG存在下重装配。
在一个进一步优选的实施方案中，免疫刺激性核酸不含CpG基序，但是显示免疫刺激活性。这些核酸在WO 01/22972中有描述。其中所述的所有序列都在此引用作为参考。
在一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒是重组病毒样颗粒。同样优选地，病毒样颗粒不含脂蛋白包膜。优选地，重组病毒样颗粒包含或者由下列成分组成乙型肝炎病毒、BK病毒或其它人多瘤病毒、麻疹病毒、辛德毕斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺瓦克病毒或人乳头瘤病毒、RNA-噬菌体、Qβ-噬菌体、GA-噬菌体、fr-噬菌体和Ty的重组蛋白。在一个具体实施方案中，病毒样颗粒包含或者由一种或多种不同的乙型肝炎病毒核心(衣壳)蛋白(HBcAg)组成。在一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含RNA-噬菌体的重组蛋白或其片段。优选的RNA-噬菌体是Qβ-噬菌体、AP 205-噬菌体、GA-噬菌体、fr-噬菌体。
在一个具体实施方案中，抗原包含或者由细胞毒性T细胞表位组成。在一个相关实施方案中，病毒样颗粒包含乙型肝炎病毒核心蛋白，细胞毒性T细胞表位与该乙型肝炎病毒核心蛋白的C端融合。在一个实施方案中，它们通过亮氨酸连接序列融合。在一个特别优选的实施方案中，所述抗原是适于诱发针对癌细胞的免疫应答的多肽。
在本发明的另一方面，提供了一种增强人或其它动物种中的免疫应答的方法，包括向该动物体内导入一种组合物，该组合物包含病毒样颗粒，免疫刺激物，优选免疫刺激性核酸，更优选含非甲基化CpG的寡核苷酸，和至少一种抗原或抗原决定簇，其中该免疫刺激物，优选核酸，更优选寡核苷酸，与该病毒样颗粒结合(即偶联、附着或包封)，并且其中所述抗原包含、或者基本由、或者由人黑素瘤MelanA肽类似物组成，并且其中所述人黑素瘤MelanA肽类似物与所述病毒样颗粒结合。
在本发明的另一个实施方案中，所述组合物通过皮下、肌肉内、鼻内、皮内、静脉内或直接导入淋巴结内而导入动物体内。在一个同样优选的实施方案中，在希望对其接种的肿瘤或局部病毒灶附近局部施用这种免疫增强组合物。
在本发明的一个优选方面，所述免疫应答是T细胞应答，并且针对抗原的T细胞应答增强。在一个具体实施方案中，该T细胞应答是细胞毒性T细胞应答，并且针对MelanA肽的细胞毒性T细胞应答增强。
本发明也涉及一种疫苗，其包含免疫有效量的本发明的免疫增强组合物，以及药学可接受的稀释剂、载体或赋形剂。在一个优选实施方案中，该疫苗进一步包含至少一种佐剂。本发明还提供一种免疫和/或治疗动物的方法，包括对动物施以免疫有效量的本发明公开的疫苗。
在本发明的一个优选实施方案中，含有免疫刺激物的VLP，优选含有免疫刺激性核酸的VLP，更优选含有非甲基化CpG的寡核苷酸VLP，用于接种动物，一般且优选地接种人，以分别对抗黑素瘤或MelanA肽。这种修饰过的VLP一般且优选地可以用来针对肿瘤接种。这种接种可以是用于预防或治疗目的，或者同时用于这两种目的。
注射途径优选的是皮下或肌肉内途径，但是也可以通过真皮内、鼻内、静脉内或直接导入淋巴结内来给予含CpG的VLP。在一个同样优选的实施方案中，在希望对其接种的肿瘤或局部病毒灶附近局部施用与含CpG的MelanA肽类似物偶联的或游离的VLP。
应当理解，以上的概述和下面的详述只是代表性和说明性的，旨在进一步说明要求保护的本发明。
附图简述

图1显示Qb-MelanA VLP的SDS-PAGE分析。如实施例20所述，MelanA-肽与Qb VLP偶联。终产物与样品缓冲液混合，在还原条件下在16％ NovexTris-甘氨酸凝胶上分离，125V，1.5小时。通过将凝胶浸泡在考马斯蓝溶液中染色分离的蛋白质。用50％甲醇，8％乙酸洗涤凝胶除去背景染色。分子量标准(P 77085，New England BioLabs，Beverly，USA)用作Qb-MelanA迁移速度的参照(泳道1)。加样14μg单独的Qb(泳道2)或SMPH衍化的Qb(泳道3)，用来与下列8μg各种终产物比较Qb-MelanA 16-35(泳道4)、Qb-MelanA 16-35A/L(泳道5)、Qb-MelanA 26-35(泳道6)和Qb-MelanA 26-35A/L(泳道7)。
图2A显示ISS处理的人PBMC的上清液中释放的IFNα。PBMC从血沉棕黄层获得，并且与5倍稀释的所示ISS一起孵育18小时。术语G10用于指寡核苷酸G10-PO，术语G3用于指寡核苷酸G3-6。收集上清液，使用PBL Biomedical Laboratories提供的一组抗体，通过ELISA测定IFNα。
图2B显示用ISS处理的人CD8+PBMC上CD69的上调。PBMC从血沉棕黄层获得，并且与5倍稀释的所示ISS一起孵育18小时。洗涤细胞，与抗CD8-FITC、抗CD19-PE和抗CD69-APC(均获自BDPharMingen)在冰上孵育20分钟。洗涤后，使用CellQuest软件在FACSCalibur上分析细胞。
图3显示用包装有poly(IC)、G3-6或G6的Qbx33免疫小鼠后的病毒滴度。C57B16小鼠通过注射以下成分免疫100μg Qbx33，100μg包装有poly(IC)并与p33偶联的Qb VLP(Qb-pIC-33，也被称为QbxZnxpolyICxp33GGC)，90μg包装有G3-6的Qbx33(Qbx33/G3-6)，或90μg包装有G6的Qbx33(Qbx33/G6)。8天后，用1.5×106噬斑形成单位的携带LCMV-p33表位的痘苗病毒攻击小鼠。5天后，杀死小鼠，取出卵巢。由卵巢制备单细胞悬液，以连续稀释加至BCS40细胞中。1天后，细胞层用含有50％乙醇、2％甲醛、0.8％NaCl和0.5％结晶紫的溶液染色，并计数病毒噬斑。
发明详述除非另外定义，此处使用的所有科技术语与本发明所属领域技术人员通常理解的含义相同。尽管在本发明的实施与试验中可以使用与此处所述相似或相当的任何材料与方法，但是下文描述了优选的材料与方法。
1.定义氨基酸接头本说明书中的“氨基酸接头”，也被称为“接头”，用来连接抗原或抗原决定簇和第二附着位点，或者更优选地，该接头已经包含或含有第二附着位点，该附着位点一般(但不是一定)是一个氨基酸残基，优选半胱氨酸残基。然而，如此处所用的术语“氨基酸接头”并非意味着这种氨基酸接头只由氨基酸残基组成，尽管由氨基酸残基组成的氨基酸接头是本发明的一个优选实施方案。氨基酸接头的氨基酸残基优选地由本领域公知的天然存在的氨基酸或非天然氨基酸、所有L-或所有D-氨基酸或其混合物组成。然而，本发明也包括含有带巯基或半胱氨酸残基的分子的氨基酸接头。该分子优选地含有C1-C6烷基、环烷基(C5，C6)、芳基或杂芳基部分。然而，除了氨基酸接头外，本发明范围内也包括优选含有C1-C6烷基、环烷基(C5，C6)、芳基或杂芳基部分且不含任何氨基酸的接头。抗原或抗原决定簇或任选地第二附着位点与氨基酸接头的连接优选地是通过至少一个共价键，更优选地是通过至少一个肽键。
动物如此处所用的术语“动物”包括，例如人、绵羊、马、牛、猪、狗、猫、大鼠、小鼠、哺乳动物、鸟类、爬行动物、鱼、昆虫和蜘蛛类动物。
抗体如此处所用的术语“抗体”是指能够结合表位或抗原决定簇的分子。该术语包括整个抗体及其抗原结合性片段，包括单链抗体。最优选地，这些抗体是人抗原结合性抗体片段，包括但不限于Fab、Fab’和F(ab’)2、Fd、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)，以及包含VL或VH域的片段。这些抗体可以来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。优选地，这些抗体是人、鼠、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡的抗体。如此处所用的“人”抗体包括含有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，包括分离自人免疫球蛋白文库的抗体，或者来自不表达内源性免疫球蛋白而表达一种或多种人免疫球蛋白的转基因动物的抗体，如Kucherlapati等人申请的美国专利No.5,939,598所述。
抗原如此处所用的术语“抗原”是指如果被MHC分子呈递时能够被抗体或T细胞受体(TCR)结合的分子。如此处所用的术语“抗原”也包括T细胞表位。抗原还能够被免疫系统识别，以及/或者能够诱导体液免疫应答和/或细胞免疫应答，导致B和/或T淋巴细胞的活化。然而，至少在某些情况下，这可能需要抗原含有或连接于T辅助细胞表位(Th细胞表位)，并且包含于佐剂中。一个抗原可能包含一个或多个表位(B和T表位)。上述特异性反应是指抗原优选地通常以高选择性方式与其相应的抗体或TCR反应，而不与可能由其它抗原诱导的许多其它抗体或TCR反应。如此处所用的抗原也可以是几种不同抗原的混合物。
如此处所用的“肿瘤抗原”是指与肿瘤或癌症相关并且能够引发免疫应答的化合物，如肽。特别是，该化合物在MHC分子中呈递时能够引发免疫应答。肿瘤抗原能够由癌细胞通过如下方法制备制备癌细胞的粗提物，如Cohen et al.，Cancer Research，541055(1994)所述；部分纯化抗原；利用重组技术或从头合成已知抗原。肿瘤抗原包括是整个肿瘤或癌症多肽或是其抗原性部分的抗原。这些抗原可以分离或者重组制备或通过本领域公知的其它任何方法制备。癌症或肿瘤包括但不限于胆管癌；脑癌；乳腺癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠癌；子宫内膜癌；食道癌；胃癌；上皮内癌；淋巴瘤；肝癌；肺癌(例如小细胞和非小细胞癌)；黑素瘤；神经母细胞瘤；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；直肠癌；肉瘤；皮肤癌；睾丸癌；甲状腺癌；肾癌，以及其它癌和肉瘤。
抗原决定簇如此处所用的术语“抗原决定簇”是指可被B或T淋巴细胞特异性识别的抗原的部分。B淋巴细胞通过产生抗体响应外源抗原决定簇，而T淋巴细胞是细胞免疫的介质。因此，抗原决定簇或表位是可被抗体识别或者(在MHC中)可被T细胞受体识别的抗原的那些部分。
抗原呈递细胞如此处所用的术语“抗原呈递细胞”是指具有免疫刺激能力的一群不均一的白细胞或骨髓来源的细胞。例如，这些细胞能够产生可与MHC分子结合而能够被T细胞识别的肽。该术语与术语“佐细胞”同义，包括如朗罕氏细胞、交错突细胞、B细胞、巨噬细胞和树突细胞。在某些条件下，上皮细胞、内皮细胞和其它非骨髓来源的细胞也可以作为抗原呈递细胞。
连接(association)如此处所用的术语“连接”当用于第一和第二附着位点时，是指第一附着位点与第二附着位点优选地通过至少一个非肽键的结合。连接的性质可以是共价、离子、疏水、极性的或其任意组合，优选地，连接的性质是共价的，更优选地，连接是通过至少一个，优选一个非肽键。如此处所用的术语“连接”当用于第一和第二附着位点时，不仅包括第一附着位点和第二附着位点直接结合或连接形成本发明的组合物，另外且优选地，还包括第一附着位点和第二附着位点间接连接或结合产生本发明的组合物，一般且优选地使用异双功能交联剂进行这种间接连接或结合。
第一附着位点如此处所用的短语“第一附着位点”是指通常且优选地包含于病毒样颗粒内的非天然或天然来源的一种组件，通常且优选地包含于本发明的MelanA肽类似物内的第二附着位点可与之连接。第一附着位点可以是蛋白质、多肽、氨基酸、肽、糖、多核苷酸、天然或合成的聚合物、次级代谢物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、洋地黄毒苷、金属离子、苯甲基磺酰氟)或其组合，或其化学反应基。第一附着位点通常且优选地位于病毒样颗粒的表面上。病毒样颗粒表面上存在多个第一附着位点，一般呈重复构型。优选地，第一附着位点是氨基酸或其化学反应基。
第二附着位点如此处所用的短语“第二附着位点”是指与本发明的MelanA肽类似物连接，通常且优选地包含于后者之内的组件，位于病毒样颗粒表面上的第一附着位点可与之连接。本发明的MelanA肽类似物的第二附着位点可以是蛋白质、多肽、肽、糖、多核苷酸、天然或合成的聚合物、次级代谢物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、洋地黄毒苷、金属离子、苯甲基磺酰氟)或其组合，或其化学反应基。本发明的MelanA肽类似物上存在至少一个第二附着位点。因此，术语“具有至少一个第二附着位点的MelanA肽类似物”是指至少含有本发明的MelanA肽类似物和该第二附着位点的抗原或抗原性构建体。然而，特别是对于非天然来源的第二附着位点，(即本发明的MelanA肽类似物内非天然存在)的第二附着位点，这些抗原或抗原性构建体含有“氨基酸接头”。
结合(bound)如此处所用的术语“结合”是指这样的结合它可以是共价的，例如通过化学偶联，或者是非共价的，例如离子相互作用、疏水相互作用、氢键等。共价键可能是，例如酯、醚、磷酯、酰胺、肽、亚胺、碳-硫键、碳-磷键等。术语“结合”比诸如“偶联”、“融合”、“连接”和“附着”的术语更广义，并且包括后面这些。而且，对于与病毒样颗粒结合的免疫刺激物，术语“结合”也包括免疫刺激物的包封或部分包封。因此，对于与病毒样颗粒结合的免疫刺激物，术语“结合”比诸如“偶联”、“融合”、“包封”、“包装”和“附着”的术语更广义，并且包括后面这些。例如，免疫刺激物，如含非甲基化CpG的寡核苷酸，可以被VLP包封，而不存在实际上的结合，不管是共价的还是非共价的。
外壳蛋白如此处所用的术语“外壳蛋白”是指能够掺入噬菌体或RNA-噬菌体的衣壳装配体内的噬菌体或RNA-噬菌体的蛋白质。然而，当指RNA-噬菌体的外壳蛋白基因的具体基因产物时，使用术语“CP”。例如，RNA-噬菌体Qβ的外壳蛋白基因的具体基因产物被称为“Qβ CP”，而噬菌体Qβ的“外壳蛋白”包含“Qβ CP”以及A1蛋白。噬菌体Qβ的衣壳主要由Qβ CP组成，含有少量A1蛋白。同样，VLP Qβ外壳蛋白主要含有Qβ CP，以及少量A1蛋白。
偶联如此处所用的术语“偶联”是指通过共价键或通过非共价相互作用而附着。对于抗原与病毒样颗粒的偶联，术语“偶联”优选地指通过共价键附着。此外，对于抗原与病毒样颗粒的偶联，术语“偶联”优选地指通过至少一个非肽键分别连接和附着。本领域技术人员常用的偶联生物活性物质的任何方法都可用于本发明。
融合如此处所用的术语“融合”是指不同来源的氨基酸序列通过其编码核苷酸序列的框内组合而组合在一条多肽链中。除了与末端之一融合外，术语“融合”显然还包括内部融合，即不同来源的序列插入一条多肽链内。
CpG如此处所用的术语“CpG”是指含有至少一个非甲基化胞嘧啶、鸟嘌呤二核苷酸序列的寡核苷酸(例如“CpG DNA”或含有胞嘧啶及随后的鸟嘌呤、并通过磷酸酯键连接的DNA)，它能刺激/激活脊椎动物细胞，例如对该细胞具有促细胞分裂作用，或诱导或提高该细胞的细胞因子表达。例如，CpG可用于激活B细胞、NK细胞和抗原呈递细胞，如单核细胞、树突细胞和巨噬细胞，以及T细胞。CpG也可包括核苷酸类似物，如含有磷酸硫酯键的类似物，并且可以是双链或单链的。通常双链分子在体内更稳定，而单链分子免疫活性更高。
表位如此处所用的术语“表位”是指在动物、优选哺乳动物、最优选在人中具有抗原性或免疫原活性的多肽的部分。如此处所用的“免疫原性表位”被定义为通过本领域公知的任何方法测定，能够在动物中引发抗体应答或诱发T细胞应答的多肽的一部分(参见，例如Geysen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 813998-4002(1983))。如此处所用的术语“抗原性表位”被定义为蛋白质的一部分，通过本领域公知的任何方法测定，抗体能够将它的抗原与该部分免疫特异性结合。免疫特异性结合不包括非特异性结合，但是不一定排除与其它抗原的交叉反应性。抗原性表位不需要必须是免疫原性的。抗原性表位也可以是T细胞表位，在这种情况下它们能被MHC分子内的T细胞受体免疫特异性地结合。
一个表位可以以该表位特有的空间构象包含3个氨基酸。一个表位通常由至少约5个这样的氨基酸组成，更常见地由至少约8-10个这样的氨基酸组成。如果表位是一种有机分子，它可以象硝基苯基一样小。优选的表位是本发明的MelanA-肽类似物。
免疫应答如此处所用的术语“免疫应答”是指导致B和/或T淋巴细胞激活或增殖的体液免疫应答和/或细胞免疫应答。然而，在某些情况下，免疫应答可能是低强度的，只有在使用至少一种本发明的物质时才能检测到。“免疫原性的”是指一种试剂，它用来刺激活生物的免疫系统，使得免疫系统的一种或多种功能增强，并且针对该免疫原性试剂。“免疫原性多肽”是这样一种多肽，无论它是单独的还是与载体相连接，使用还是不使用佐剂，它都能引发细胞和/或体液免疫应答。
免疫如此处所用的术语“免疫”或相关术语是指提供产生针对靶抗原或表位的实质性免疫应答(包括抗体和/或细胞免疫，如效应CTL)的能力。这些术语不要求产生完全免疫，而是产生实质性高于基线的免疫应答。例如，如果在使用本发明的方法后哺乳动物产生针对靶抗原的细胞和/或体液免疫应答，则可认为该动物针对该靶抗原进行了免疫。
免疫刺激性核酸如此处所用的术语免疫刺激性核酸是指能够诱发和/或增强免疫应答的核酸。如此处所用的免疫刺激性核酸包括核糖核酸，特别是脱氧核糖核酸。优选地，免疫刺激性核酸包含至少一个CpG基序，如CG二核苷酸，其中C未甲基化。CG二核苷酸可以是回文序列的一部分，或者可以包含于一种非回文序列内。如上所述的不含CpG基序的免疫刺激性核酸包括，例如，缺乏CpG二核苷酸的核酸，以及含有带有甲基化CG二核苷酸的CG基序的核酸。如此处所用的术语“免疫刺激性核酸”也指含有修饰碱基如4-溴-胞嘧啶的核酸。
免疫刺激物如此处所用的术语“免疫刺激物”是指能够诱发和/或增强免疫应答的物质。如此处所用的免疫刺激物包括但不限于toll样受体激活物和诱导细胞因子分泌的物质。Toll样受体激活物包括但不限于免疫刺激性核酸、肽聚糖、脂多糖、脂磷壁酸、咪唑并喹啉化合物、鞭毛蛋白、脂蛋白和免疫刺激性有机物，如紫杉醇。
如此处所用的术语“天然人Melan A肽”或“正常人Melan A肽”是指包含、或者基本由、或者由下列氨基酸序列组成的肽代表正常人MelanA蛋白质序列氨基酸位点26-35的氨基酸序列EAAGIGILTV(SEQ ID NO78)，或代表正常人MelanA蛋白质序列氨基酸位点27-35的AAGIGILTV(SEQ ID NO79)。
如此处所用的术语“MelanA肽类似物”或“人MelanA肽类似物”或“人黑素瘤MelanA肽类似物”被定义为相应正常MelanA肽的氨基酸序列改变了至少一个氨基酸或氨基酸衍生物的肽，其中这种改变可包括氨基酸置换和/或缺失和/或插入或其组合。在本发明的一个优选实施方案中，如此处所用的术语“MelanA肽类似物”被定义为相应正常MelanA肽的氨基酸序列(SEQ ID NO91)改变了三个、优选两个、更优选一个氨基酸或氨基酸衍生物的肽，其中这种改变可包括氨基酸置换和/或缺失和/或插入或其组合。在本发明的一个进一步优选的实施方案中，如此处所用的术语“MelanA肽类似物”被定义为相应正常MelanA肽的氨基酸序列改变三个、优选两个、更优选一个氨基酸或氨基酸衍生物的肽，其中这种改变可包括氨基酸置换和/或缺失和/或插入或其组合，并且其中这种改变位于正常人MelanA蛋白质序列(SEQ ID NO91)的位点26、27、28和/或35处，并且其中这种改变优选地是氨基酸置换。术语“MelanA肽类似物”、“人MelanA肽类似物”、“人黑素瘤MelanA肽类似物”和“人黑素瘤MelanA/MART-1肽类似物”可以互换使用。
天然来源如此处所用的术语“天然来源”是指其全部或部分不是合成的，而是天然存在或产生的。
非天然的如此处所用时，该术语通常是指并非来自天然，更具体而言，该术语是指来自人工。
非天然来源如此处所用的术语“非天然来源”通常是指合成的或者并非来自天然；更具体而言，该术语是指来自人工。
有序且重复的抗原或抗原决定簇阵列如此处所用的术语“有序且重复的抗原或抗原决定簇阵列”通常是指抗原或抗原决定簇的重复模式，其特征在于抗原或抗原决定簇分别相对于核心颗粒和病毒样颗粒一般且优选地均匀空间排列。在本发明的一个实施方案中，这种重复模式可以是一种几何模式。合适的有序且重复的抗原或抗原决定簇阵列的典型和优选实例具有严格重复的抗原或抗原决定簇类结晶排列，优选间隔0.5-30纳米，更优选3-15纳米，更优选3-8纳米。
寡核苷酸如此处所用的术语“寡核苷酸”或“寡聚体”是指一种核酸序列，其包含2个或更多的核苷酸，通常至少约6个核苷酸到约100,000个核苷酸，优选约6个到约2000个核苷酸，更优选约6个到约300个核苷酸，更优选约20个到约300个核苷酸，更优选地约20个到约100个核苷酸。术语“寡核苷酸”或“寡聚体”也指包含超过100个到约2000个核苷酸、优选超过100个到约1000个核苷酸、更优选超过100个到约500个核苷酸的核酸序列。“寡核苷酸”通常也指任何一种聚核糖核苷酸或聚脱氧核糖核苷酸，它可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。“寡核苷酸”包括但不限于单链和双链DNA，是单链区和双链区的混合物的DNA，单链和双链RNA，是单链区和双链区的混合物的RNA，包含DNA和RNA的杂合分子，其中的DNA和RNA可以是单链的，或者更一般而言是双链的，或是单链区和双链区的混合物。另外，“寡核苷酸”还指包含RNA或DNA或既含RNA又含DNA的三链区。此外，寡核苷酸也可以是合成的、基因组的或重组的，例如λ-DNA、粘粒DNA、人工细菌染色体、酵母人工染色体和丝状噬菌体，如M13。在本发明的一个非常优选的实施方案中，寡核苷酸是合成寡核苷酸。
术语“寡核苷酸”也包括含有一个或多个修饰碱基的DNA或RNA，和为了稳定性或其它原因而含有修饰骨架的DNA或RNA。例如，合适的核苷酸修饰/类似物包括肽核酸、肌苷、三苯甲基碱基、硫代磷酸酯、烷基硫代磷酸酯、5-硝基吲哚脱氧呋喃核糖基、5-甲基脱氧胞嘧啶和5，6-二氢-5，6-二羟基脱氧胸苷。已经对DNA和RNA进行了多种修饰；因此，“寡核苷酸”包括在自然界中常见的多核苷酸的化学、酶或代谢修饰形式，以及病毒和细胞特有的DNA和RNA的化学形式。其它核苷酸类似物/修饰对于本领域技术人员是显而易见的。
包装如此处所用的术语“包装”是指免疫刺激物，优选免疫刺激性核酸，与VLP有关的状态。如此处所用的术语“包装”包括结合，其可以是共价的，例如化学偶联，或者是非共价的，例如离子相互作用、疏水相互作用、氢键等。共价键可以是，例如酯、醚、磷酯、酰胺、肽、酰亚胺、碳-硫键如硫醚键、碳-磷键等。该术语也包括物质的包封或部分包封。术语“包装”包括如“偶联”、“包封”和“附着”等术语。例如，免疫刺激物如含非甲基化CpG的寡核苷酸可以被VLP包封，而不需存在实际上的结合，不管是共价的还是非共价的。具体而言，在优选实施方案中，如果免疫刺激性核酸是免疫刺激物，则术语“包装”是指处于包装状态的免疫刺激性核酸不能被DNase或RNase水解。在优选实施方案中，免疫刺激性核酸包装于VLP衣壳内，最优选地以非共价方式包装。
本发明的组合物可选地可以与药学可接受的载体组合。如此处所用的术语“药学可接受的载体”是指适于对人或其它动物施用的一种或多种相容的固体或液体填料、稀释剂或封装物。术语“载体”是指天然或合成的有机或无机成分，活性成分与之结合而利于应用。
肽如此处所用的术语“肽”，特别是对于人黑素瘤MelanA肽或正常人Melan A肽来说，是指由单体(氨基酸)通过酰胺键(也被称为肽键)通常且优选地线性连接组成的分子。它是指氨基酸分子链，而不是指特定长度的产物。
有机分子如此处所用的术语“有机分子”是指天然或合成来源的任何化学实体。具体而言，如此处所用的术语“有机分子”包括例如选自下列的任何一种分子天然或合成来源的核苷酸、脂类、碳水化合物、多糖、脂多糖、类固醇、生物碱、萜和脂肪酸。术语“有机分子”具体包括诸如烟碱、可卡因、海洛因的分子或滥用药品中所含的其它药理学活性分子。有机分子通常含有或经修饰后含有使它能够与根据本发明的病毒样颗粒偶联、结合或以其它方法附着的化学官能团。
多肽如此处所用的术语“多肽”是指由单体(氨基酸)通过酰胺键(也被称为肽键)线性连接组成的分子，是指氨基酸分子链，而不是指特定长度的产物。因此，多肽的定义内包括肽、寡肽和蛋白质。该术语也指多肽的表达后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。重组或衍生的多肽不一定由指定的核酸序列翻译而来。也可以用任何方法产生，包括化学合成。
“增强”免疫应答的物质是指这样一种物质与不添加该物质时测得的同一免疫应答相比，添加该物质时观察到更高或增强或偏离的免疫应答。
优选地，“增强”免疫应答的物质在此是指(i)与不添加该物质时测得的MelanA-特异性，优选地天然人MelanA肽特异性或人黑素瘤MelanA肽类似物特异性T细胞的频率相比，MelanA-特异性，优选地天然人MelanA肽特异性或人黑素瘤MelanA肽类似物特异性T细胞的频率提高的物质，或(ii)与不添加该物质时测得的MelanA-特异性，优选地天然人MelanA肽特异性或人黑素瘤MelanA肽类似物特异性T细胞的功能性相比，MelanA-特异性，优选地天然人MelanA肽特异性或人黑素瘤MelanA肽类似物特异性T细胞的功能性偏离，优选提高的物质，或(iii)与不添加该物质时测得的MelanA-特异性，优选地天然人MelanA肽特异性或人黑素瘤MelanA肽类似物特异性T细胞的增殖、凋亡或对肿瘤组织的寻靶(homing)相比，MelanA-特异性，优选地天然人MelanA肽特异性或人黑素瘤MelanA肽类似物特异性T细胞的表型偏离，例如产生的T细胞能够提高增殖、减少凋亡或更有效地对肿瘤组织寻靶的物质。
MelanA-特异性，优选地天然人MelanA肽特异性或人黑素瘤MelanA肽类似物特异性T细胞的频率通过MHC I类/肽复合物如四聚体或多聚体染色来测定，优选如Speiser，DE.et al.Eur J Immunol.2002，Vol.32，731-741所述的四聚体染色，而MelanA-特异性，优选地天然人MelanA肽特异性或人黑素瘤MelanA肽类似物特异性T细胞的功能性通过细胞因子释放来测定，如细胞内染色、细胞因子捕获测定、Elispot、ELISA，优选如Speiser，DE.et al.Eur J Immunol.2002，Vol.32，731-741所述的Elispot。而且，MelanA-特异性，优选地天然人MelanA肽特异性或人黑素瘤MelanA肽类似物特异性T细胞的功能性也可以通过在如Valmori，D.et al.J.Immunol.1998，161，6956-6962所述的铬或铕释放试验中测定MelanA-特异的，优选地天然人MelanA肽特异的或人黑素瘤MelanA肽类似物特异的溶细胞性CD8+T细胞应答来测定。MelanA-特异性，优选地天然人MelanA肽特异性或人黑素瘤MelanA肽类似物特异性T细胞的表型利用针对诸如细胞激活标记、细胞分化标记、寻靶标记、趋化因子和细胞因子受体、共刺激受体、死亡受体、杀伤激活或抑制受体、整联蛋白等细胞表面或细胞内蛋白质的抗体、抗凋亡蛋白的表达和衰老标记的缺乏来测定，优选利用如Speiser，DE.et al.Eur J Immunol.2002，Vol.32，731-741所述的细胞激活标记。
有效量如此处所用的术语“有效量”是指达到希望的生物学效应所必需的量或足以达到希望的生物学效应的量。组合物的有效量是能够达到这种选择的结果的量，此含量可由本领域技术人员常规确定。例如，治疗免疫系统缺陷的有效量是引起免疫系统激活、从而在接触抗原后产生抗原特异性免疫应答所必需的量。该术语也与“足量”同义。
用于任何特定用途的有效量可能根据如下因素而变化所治疗的疾病或状况、施用的具体组合物、患者个头和/或疾病或状况的严重程度。本领域技术人员能够根据经验确定本发明的具体组合物的有效量，而不需要过多的实验。
自身抗原如此处所用的术语“自身抗原”是指由宿主基因组或DNA编码的蛋白质，宿主基因组或DNA编码的蛋白质或RNA产生的产物被定义为自身的。优选地，如此处所用的术语“自身抗原”是指人基因组或DNA编码的蛋白质，人基因组或DNA编码的蛋白质或RNA产生的产物被定义为自身的。本发明的含有自身抗原的组合物、药物组合物和疫苗当对宿主施用时尤其能够打破对自身抗原的耐受。在上下文中，“打破对自身抗原的耐受”是指当对宿主施用本发明的含有自身抗原的组合物、药物组合物和疫苗时，如此处所定义的增强对自身抗原特异的免疫应答，优选地增强B或T细胞应答。另外，由两种或几种自身分子组合产生的或者代表自身分子一部分的蛋白质，以及含有高度同源性(＞95％，优选＞97％，更优选＞99％)的上述两种自身分子的蛋白质，也可以被认为是自身的。
治疗(treatment)如此处所用的术语“治疗”是指预防和/或治疗。例如，当用于传染病时，该术语是指提高受试者对病原体感染的抗性，或者换句话说，降低受试者感染病原体或表现感染所致病症的可能性的预防性处理，以及患者感染后的抗感染治疗，例如减轻或消除感染或阻止其恶化。
疫苗如此处所用的术语“疫苗”是指含有本发明的组合物，并且是能够对动物施用的形式的制剂。一般而言，疫苗包含常用的盐水或缓冲水溶液介质，本发明的组合物悬浮或溶解于其中。以这种形式，本发明的组合物能够方便地用来预防、改善或治疗疾病。在导入宿主后，疫苗能够引起免疫应答，包括但不限于抗体、细胞因子的产生和/或细胞毒性T细胞、抗原呈递细胞、辅助T细胞、树突细胞的激活和/或其它细胞应答。
可选地，本发明的疫苗还包含佐剂，与本发明的化合物相比，佐剂可能占一小部分或大部分。如此处所用的术语“佐剂”是指免疫应答的非特异性刺激物，或可以在宿主中产生一种储存站(depot)的物质，与本发明的疫苗组合时能够产生更强的免疫应答。有多种佐剂可以使用。实例包括弗氏不完全佐剂、氢氧化铝和修饰的胞壁酰二肽。如此处所用的术语“佐剂”也指通常特异性的免疫应答刺激剂，当与本发明的疫苗组合时能够产生更强且通常特异性的免疫应答。实例包括但不限于GM-CSF、IL-2、IL-12、IFNα。本领域技术人员知道更多的例子。
病毒样颗粒如此处所用时的术语“病毒样颗粒”是指类似于病毒颗粒但是未证明其具有致病性的结构。一般而言，根据本发明的病毒样颗粒不携带编码病毒样颗粒蛋白质的遗传信息。病毒样颗粒通常缺乏病毒基因组，因此是非感染性的。病毒样颗粒通常也能通过异源表达大量生产，且易于纯化。某些病毒样颗粒可能含有与其基因组不同的核酸。如上所述，根据本发明的病毒样颗粒是非复制性和非感染性的，因为它缺乏病毒基因组的全部或一部分，特别是病毒基因组的复制性和传染性部分。根据本发明的病毒样颗粒可能含有与其基因组不同的核酸。根据本发明的病毒样颗粒的一个典型且优选的实施方案是病毒衣壳，如相应病毒、噬菌体或RNA-噬菌体的病毒衣壳。术语“病毒衣壳”或“衣壳”在此可以互换使用，是指由病毒蛋白质亚单位组成的大分子装配体。一般且优选地，病毒蛋白质亚单位分别装配为病毒衣壳和衣壳，它具有固有重复组织的结构，其中这种结构一般是球形或管状。例如，RNA-噬菌体或HBcAg的衣壳是二十面体对称的球形。如此处所用的术语“衣壳样结构”是指由病毒蛋白质亚单位组成的大分子装配体，它类似于如上所述的衣壳形态，但是不同于典型的对称装配体，而保持足够程度的秩序和重复性。
噬菌体的病毒样颗粒如此处所用的术语“噬菌体的病毒样颗粒”是指类似于噬菌体结构的病毒样颗粒，它是非复制性和非感染性的，至少缺乏编码噬菌体复制机制的基因，一般也缺乏编码负责病毒附着于或进入宿主的蛋白质的基因。然而，该定义也应当包括其中上述基因仍然存在但是无活性的噬菌体病毒样颗粒，于是也产生非复制性和非感染性的噬菌体病毒样颗粒。
RNA噬菌体外壳蛋白的VLP由RNA噬菌体外壳蛋白的180个亚单位自装配而成、可选地含有宿主RNA的衣壳结构，被称为“RNA噬菌体外壳蛋白的VLP”。一个具体例子是Qβ外壳蛋白的VLP。在此具体情况中，Qβ外壳蛋白的VLP可能仅仅由Qβ CP亚单位(SEQ IDNo 10)装配而成，该Qβ CP亚单位通过表达含有如TAA终止密码子的Qβ CP基因产生，该终止密码子通过抑制阻止较长A1蛋白的表达，参见Kozlovska，T.M.et al.，Intervirology 399-15(1996))，或者在衣壳装配体中还含有A1蛋白亚单位(SEQ IDNo 11)。通读过程效率低，导致在VLP中只有极少量的A1蛋白。曾经用包装的ISS和偶联的抗原的不同组合进行了大量实施例。当使用仅由Qβ CP亚单位装配成的Qβ外壳蛋白的VLP或在衣壳中还含有A1蛋白亚单位的Qβ外壳蛋白的VLP时，未观察到偶联效率和包装的差异。而且，也未观察到这些Qβ VLP制剂之间有免疫应答的差异。因此，为了清楚起见，在实施例描述中，术语“Qβ VLP”用于仅由Qβ CP亚单位装配成的Qβ外壳蛋白的VLP或在衣壳中还含有A1蛋白亚单位的Qβ外壳蛋白的VLP。
如此处所用的术语“病毒颗粒”是指病毒的形态学形状。某些病毒类型含有被蛋白质衣壳围绕的基因组；其它一些具有附加结构(例如包膜、尾等)。
无包膜病毒颗粒由围绕并保护病毒基因组的蛋白质衣壳组成。包膜病毒也具有围绕病毒遗传物质的衣壳结构，另外还有围绕该衣壳的脂双层包膜。在本发明的一个优选实施方案中，VLP没有脂蛋白包膜或含脂蛋白的包膜。在一个进一步优选的实施方案中，VLP完全不含包膜。
一种术语“一种”在本公开内容中使用时，除非另外说明，是指“至少一种”或“一种或一种以上”。
本领域技术人员应当清楚，本发明的某些实施方案涉及重组核酸技术的应用，如克隆、聚合酶链反应、DNA和RNA的纯化、重组蛋白在原核和真核细胞中的表达等。这些方法是本领域技术人员公知的，在出版的实验室方法手册中常见(例如，Sambrook，J.et al.，eds.，MOLECULAR CLONING，A LABORATORY MANUAL，2nd.edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Habor，N.Y.(1989)；Ausubel，F.et al.，eds.，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY，John H.Wiley & Sons，Inc.(1997))。应用组织培养细胞系进行的基本实验室技术(Celis，J.，ed.，CELL BIOLOGY，AcademicPress，2nd edition，(1998))和基于抗体的技术(Harlow，E.and Lane，D.，″AntibodiesA Laboratory Manual，″Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Habor，N.Y.(1988)；Deutscher，M.P.，″Guide to ProteinPurification，″Meth.Enzymol.128，Academic Press San Diego(1990)；Scopes，R.K.，″Protein Purification Principles and Practice，″3rd ed.，Springer-Verlag，New York(1994))在文献中也有大量描述，这些文献均在此引用作为参考。
2.增强免疫应答的组合物和方法本发明提供增强动物对一种或多种抗原的免疫应答的组合物和方法。本发明的组合物包含、或者基本由、或者由下列成分组成病毒样颗粒，至少一种免疫刺激物，优选免疫刺激性核酸，更优选含非甲基化CpG的寡核苷酸，和至少一种抗原或抗原决定簇，其中该免疫刺激物、免疫刺激性核酸或寡核苷酸与该病毒样颗粒结合，并且其中所述抗原或抗原决定簇与所述病毒样颗粒结合，并且其中所述抗原包含、或者基本由、或者由人黑素瘤MelanA肽类似物组成。而且，本发明能够使技术人员方便地构建这种组合物，以用于多种治疗和/或预防目的，包括例如癌症的预防和/或治疗。
本申请书中的病毒样颗粒是指类似于病毒颗粒但是没有致病性的结构。病毒样颗粒通常缺乏病毒基因组，因此是非感染性的。另外，病毒样颗粒也能够通过异源表达大量产生，并且易于纯化。
在一个优选实施方案中，所述病毒样颗粒是重组病毒样颗粒。本领域技术人员能够利用重组DNA技术和可公开获得的病毒编码序列制备VLP。例如，为了使用可购得的杆状病毒载体在杆状病毒表达载体中表达，可以将病毒包膜或核心蛋白的编码序列构建在病毒启动子的调节控制下，并对序列进行适当修饰，以使编码序列与调节序列功能连接。例如，也可以为了在细菌表达载体中表达而构建病毒包膜或核心蛋白的编码序列。
VLP的例子包括但不限于乙型肝炎病毒、麻疹病毒、辛德毕斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、诺瓦克病毒的衣壳蛋白，逆转录病毒GAG蛋白，逆转录转座子Ty蛋白p1，乙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒、人多瘤病毒、BK病毒(BKV)、RNA噬菌体、Ty、fr-噬菌体、GA-噬菌体、AP 205-噬菌体、特别是Qβ-噬菌体的表面蛋白。
本领域技术人员应当理解，本发明的VLP不限于任何一种具体形式。该颗粒能够化学合成或通过生物学方法制备，可以是天然的或非天然的。例如，这种实施方案包括病毒样颗粒或其重组形式。
在一个更特别的实施方案中，VLP可以包含或者由下列成分组成轮状病毒的重组多肽；诺瓦克病毒的重组多肽；甲病毒的重组多肽；可形成细菌菌毛或菌毛样结构的重组蛋白；口蹄疫病毒的重组多肽；麻疹病毒的重组多肽；辛德毕斯病毒的重组多肽；逆转录病毒的重组多肽；乙型肝炎病毒的重组多肽(例如HBcAg)；烟草花叶病毒的重组多肽；禽兽棚病毒的重组多肽；人乳头瘤病毒的重组多肽；多瘤病毒的重组多肽，特别是人多瘤病毒的重组多肽，特别是BK病毒的重组多肽；噬菌体的重组多肽，RNA噬菌体的重组多肽；Ty的重组多肽；fr-噬菌体的重组多肽，GA-噬菌体的重组多肽，AP 205-噬菌体的重组多肽，特别是Qβ-噬菌体的重组多肽。该病毒样颗粒还可以包含或者由这些多肽的一个或多个片段以及这些多肽的变体组成。多肽的变体与其野生型对应物在氨基酸水平上可以例如至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同。
在一个优选实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由、或者由RNA-噬菌体的重组蛋白或其片段组成。优选地，RNA-噬菌体选自a)噬菌体Qβ；b)噬菌体R17；c)噬菌体fr；d)噬菌体GA；e)噬菌体SP；f)噬菌体MS2；g)噬菌体M11；h)噬菌体MX1；i)噬菌体NL95；k)噬菌体f2；1)噬菌体PP7；和m)噬菌体AP205。
在本发明的另一个优选实施方案中，病毒样颗粒包含、或基本由、或由RNA-噬菌体Qβ或RNA噬菌体fr或RNA噬菌体AP205的重组蛋白或其片段组成。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，重组蛋白包含、或基本由、或由RNA噬菌体的外壳蛋白组成。
因此，形成衣壳或VLP的RNA-噬菌体外壳蛋白，或者适于自装配为衣壳或VLP的噬菌体外壳蛋白的片段，是本发明的进一步优选的实施方案。例如，噬菌体Qβ外壳蛋白能够在大肠杆菌中重组表达。而且，这些蛋白质在表达后自发构成衣壳。另外，这些衣壳也能形成具有固有重复组织的结构。
能够用来制备本发明的组合物的噬菌体外壳蛋白的具体优选实例包括如下RNA噬菌体的外壳蛋白噬菌体Qβ(SEQ ID NO10；PIR数据库，登录号VCBPQβ，指Qβ CP，和SEQ ID NO11；登录号AAA16663，指Qβ A1蛋白)，噬菌体R17(PIR登录号VCBPR7)，噬菌体fr(SEQ ID NO13；PIR登录号VCBPFR)，噬菌体GA(SEQ ID NO14；GenBank登录号NP-040754)，噬菌体SP(GenBank登录号CAA30374，指SP CP，和登录号NP 695026，指SP A1蛋白)，噬菌体MS2(PIR登录号VCBPM2)，噬菌体M11(GenBank登录号AAC06250)，噬菌体MX1(GenBank登录号AAC14699)，噬菌体NL95(GenBank登录号AAC14704)，噬菌体f2(GenBank登录号P03611)，噬菌体PP7(SEQ ID NO19)和噬菌体AP205(SEQ ID NO31)。此外，噬菌体Qβ的A1蛋白或从C端丢失多达100、150或180个氨基酸的C端截短形式也可以掺入到Qβ外壳蛋白的衣壳装配体中。为了确保衣壳形成，衣壳装配体中Qβ A1蛋白相对于Qβ CP的百分比通常受到限制。噬菌体外壳蛋白的其它一些具体实例在WO02/056905的第45和46页有描述，该专利在此引用作为参考。RNA噬菌体，特别是本发明的Qβ的进一步优选的病毒样颗粒在WO 02/056905中公开，该专利在此全文引用作为参考。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、或基本由、或由RNA噬菌体的重组蛋白或其片段组成，其中该重组蛋白包含、基本由、或由RNA噬菌体的突变外壳蛋白、优选上述RNA噬菌体的突变外壳蛋白组成。在另一个优选实施方案中，RNA噬菌体的突变外壳蛋白已通过置换除去至少一个赖氨酸残基、或者通过置换添加至少一个赖氨酸残基而被修饰；此外，RNA噬菌体的突变外壳蛋白也可以通过删除至少一个赖氨酸残基、或通过插入添加至少一个赖氨酸残基而修饰。至少一个赖氨酸残基的缺失、置换或添加能够改变偶联的程度，即RNA噬菌体VLP每个亚单位上的人黑素瘤MelanA肽类似物的量，以匹配并适应疫苗的需要。在本发明的一个优选实施方案中，每个亚单位上平均有至少1.0个人黑素瘤MelanA肽类似物与RNA噬菌体的VLP连接。该值计算为RNA噬菌体VLP的所有亚单位或单体的平均值。在本发明的一个进一步优选的实施方案中，至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或至少2.0个人黑素瘤MelanA肽类似物与RNA噬菌体的VLP连接，计算为RNA噬菌体VLP的所有亚单位或单体的偶联平均值。
在另一个优选实施方案中，病毒样颗粒包含、或基本由、或由RNA噬菌体Qβ的重组蛋白或其片段组成，其中该重组蛋白包含、或基本由、或由下列成分组成具有SEQ ID NO10的氨基酸序列的外壳蛋白，或具有SEQ ID NO10和SEQ ID NO11的氨基酸序列的外壳蛋白的混合物，或SEQ ID NO11的突变体，其中N端甲硫氨酸优选地被切除。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由、或由Qβ的重组蛋白或其片段组成，其中该重组蛋白包含、或基本由、或由突变Qβ外壳蛋白组成。在另一个优选实施方案中，这些突变外壳蛋白通过置换去除至少一个赖氨酸残基或者通过置换添加至少一个赖氨酸残基而被修饰。此外，这些突变外壳蛋白也可以通过删除至少一个赖氨酸残基或通过插入添加至少一个赖氨酸残基而被修饰。
有4个赖氨酸残基暴露于Qβ外壳蛋白的衣壳表面。本发明也可以使用以精氨酸置换暴露赖氨酸残基的Qβ突变体。因此在本发明的实施中可以使用下列Qβ外壳蛋白突变体和突变QβVLP“Qβ-240”(Lys13-Arg；SEQ ID NO20)，“Qβ-243”(Asn 10-Lys；SEQ ID NO21)，“Qβ-250”(Lys 2-Arg，Lys13-Arg；SEQ ID NO22)，“Qβ-251”(SEQ IDNO23)和“Qβ-259”(Lys 2-Arg，Lys 16-Arg；SEQ ID NO24)。因此，在本发明的进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由、或由突变Qβ外壳蛋白的重组蛋白组成，包括具有选自下列的氨基酸序列的蛋白质a)SEQ ID NO20的氨基酸序列；b)SEQ ID NO21的氨基酸序列；c)SEQ ID NO22的氨基酸序列；d)SEQ ID NO23的氨基酸序列；e)SEQ ID NO24的氨基酸序列。上述Qβ外壳蛋白、突变Qβ外壳蛋白VLP和衣壳的构建、表达和纯化分别在WO02/056905中公开。具体参照上述申请的实施例18。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、或基本由、或由Qβ的重组蛋白或其片段组成，其中该重组蛋白包含、基本由、或由上述Qβ突变体之一和相应A1蛋白的混合物组成。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、或基本由、或由RNA噬菌体AP205的重组蛋白或其片段组成。
AP205基因组由成熟蛋白、外壳蛋白、复制酶和在有关噬菌体中不存在的两个开放阅读框组成；一种裂解基因和开放阅读框在成熟基因的翻译中起作用(Klovins，J.，et al.，J.Gen.Virol.831523-33(2002))。AP205外壳蛋白能够由质粒pAP283-58(SEQ ID NO30)表达，该质粒是pQb10(Kozlovska，T.M.，et al.，Gene 137133-37(1993))的衍生物，含有一个AP205核糖体结合位点。此外，也可以将AP205外壳蛋白克隆到pQb185内，使之位于载体中核糖体结合位点的下游。这两种方法都导致蛋白质的表达和衣壳的形成，如WO 04/007538所述，在此完整引用作为参考。载体pQb10和pQb185是由pGEM载体衍生的载体，克隆的基因在这些载体中的表达受trp启动子控制(Kozlovska，T.M.，et al.，Gene 137133-37(1993))。质粒pAP283-58(SEQ ID NO30)在如下序列中包含一个推断的AP205核糖体结合位点，该序列位于AP205外壳蛋白的XbaI位点下游和ATG起始密码子的直接上游tctagaATTTTCTGCGCACCCATCCCGGGTGGCGCCCAAAGTGAGGAAAATCACatg(SEQ ID NO30的碱基77-133)。载体pQb185在XbaI位点下游和起始密码子上游包含一个SD序列(tctagaTTAACCCAACGCGTAGGAGTCAGGCCatg(SEQ ID NO61)，SD序列以下划线标出)。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、或基本由、或由RNA噬菌体AP205的重组外壳蛋白或其片段组成。
本发明的这一优选实施方案因而包含可构成衣壳的AP205外壳蛋白。这些蛋白质是重组表达的或是从天然来源制备的。电子显微镜检查(EM)和免疫扩散证实，在细菌中产生的AP205外壳蛋白自发形成衣壳。在EM中可见，AP205外壳蛋白(SEQ ID NO31)形成的衣壳与AP205 RNA噬菌体外壳蛋白形成的衣壳的结构特征几乎无法辨别。AP205 VLP具有高度免疫原性，能够与抗原和/或抗原决定簇连接，而产生以重复方式定向展示抗原和/或抗原决定簇的疫苗构建体。能够产生针对这样展示的抗原的高滴度，这表明结合的抗原和/或抗原决定簇能够与抗体分子相互作用，并且具有免疫原性。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、或基本由、或由RNA噬菌体AP205的重组突变外壳蛋白或其片段组成。
AP205 VLP的可装配突变形式，包括氨基酸5处的脯氨酸被置换为苏氨酸的AP205外壳蛋白(SEQ ID NO32)，也可以在本发明的实施中使用，并且产生本发明的一个进一步优选的实施方案。这些VLP、来自天然来源的AP205 VLP或AP205病毒颗粒可以与抗原结合，而产生根据本发明的有序且重复的抗原阵列。
AP205 P5-T突变外壳蛋白能够由质粒pAP281-32(SEQ ID NO33)表达，该质粒由pQb185直接衍生而来，其中含有突变AP205外壳蛋白基因代替Qβ外壳蛋白基因。用表达AP205外壳蛋白的载体转染用来表达AP205外壳蛋白的大肠杆菌。
分别表达外壳蛋白和突变外壳蛋白、导致自装配为VLP的方法在WO 04/007538中描述，在此完整引用作为参考。合适的大肠杆菌株包括但不限于大肠杆菌K802、JM 109、RR1。合适的载体和菌株及其组合可以通过如下方法确定通过SDS-PAGE分别检测外壳蛋白和突变外壳蛋白的表达，并且可选地首先通过凝胶过滤纯化衣壳，随后通过免疫扩散试验(Ouchterlony试验)或电子显微镜检查(Kozlovska，T.M.et al.，Gene 137133-137(1993))对其进行检测，来检测衣壳的形成和装配。
由载体pAP283-58和pAP281-32表达的AP205外壳蛋白由于在大肠杆菌细胞质中加工，可能缺乏起始甲硫氨酸。AP205 VLP的切割、未切割形式或其混合物是本发明的进一步优选的实施方案。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、或基本由、或由RNA噬菌体AP205的重组外壳蛋白或其片段和RNA噬菌体AP205的重组突变外壳蛋白或其片段的混合物组成。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、或基本由、或由RNA噬菌体AP205的重组外壳蛋白或重组突变外壳蛋白的片段组成。
在本发明的实施中也可以使用能够分别装配为VLP和衣壳的重组AP205外壳蛋白片段。可以通过内部删除或分别在外壳蛋白和突变外壳蛋白的末端删除而产生这些片段。向外壳蛋白和突变外壳蛋白序列中插入抗原序列或抗原序列与外壳蛋白和突变外壳蛋白序列融合(与VLP装配相容)，是本发明的进一步的实施方案，分别产生嵌合AP205外壳蛋白和颗粒。插入、缺失以及与外壳蛋白序列融合的结果，以及是否与VLP装配相容，能够通过电子显微镜检查来确定。
由上述AP205外壳蛋白、外壳蛋白片段和嵌合外壳蛋白形成的颗粒能够分离为纯化形式，分离方法是组合使用通过沉淀的分级分离步骤和通过凝胶过滤的纯化步骤，例如使用Sepharose CL-4B、SepharoseCL-2B、Sepharose CL-6B柱及其组合，如WO 04/007538所述，在此完整引用作为参考。分离病毒样颗粒的其它方法在本领域公知，可以用来分离噬菌体AP205的病毒样颗粒(VLP)。例如，美国专利No.4,918,166描述了利用超速离心分离酵母逆转录转座子Ty的VLP，在此完整引用作为参考。
几种RNA噬菌体的晶体结构已经测定(Golmohammadi，R.et al.，Structure 4543-554(1996))。利用这些信息，本领域技术人员能够容易地鉴定表面暴露的残基，从而能够修饰噬菌体外壳蛋白，使得能够插入一个或多个反应性氨基酸残基。因此，本领域技术人员能够容易地产生并鉴定能够在本发明实施中使用的噬菌体包被蛋白的修饰形式。因此，也可以用形成衣壳或衣壳样结构的蛋白质变体(例如噬菌体Qβ、噬菌体R17、噬菌体fr、噬菌体GA、噬菌体SP和噬菌体MS2的外壳蛋白)制备本发明的组合物和疫苗组合物。WO 02/056905在第50页第33行到第52页第29行描述了修饰的RNA噬菌体以及形成衣壳或衣壳样结构的蛋白质变体和N端和C端截短突变体的其它可能的实例，以及分别制备适合本发明使用的这些组合物和疫苗组合物的方法。
因此，本发明包括由可形成衣壳或VLP的蛋白质制备的组合物和疫苗组合物，由各种蛋白质亚单位和VLP或衣壳制备这些组合物的方法，制备这些蛋白质亚单位的方法，编码这些亚单位的核酸分子，和利用本发明的这些组合物接种和/或在个体中引发免疫应答的方法。
在本发明的另一个优选实施方案中，VLP缺少脂蛋白包膜或含脂蛋白的包膜。在一个进一步优选的实施方案中，VLP完全不含包膜。
缺少脂蛋白包膜或含脂蛋白的包膜，特别是完全缺少包膜，产生结构和组成更加明确的病毒样颗粒。这些更加明确的病毒样颗粒可以使副作用减至最小。而且，缺少含脂蛋白的包膜，或者特别是完全缺少包膜，使得病毒样颗粒内掺入潜在毒性分子和热原的可能性消失或减至最小。
在一个实施方案中，本发明提供含有病毒样颗粒的本发明的疫苗组合物，其中优选地所述病毒样颗粒是重组病毒样颗粒。优选地，该病毒样颗粒包含、或基本由、或由RNA噬菌体的重组蛋白或其片段，优选RNA噬菌体外壳蛋白组成。此外，本发明的疫苗组合物的病毒样颗粒的重组蛋白包含、或基本由、或者由RNA噬菌体的突变外壳蛋白组成，其中该RNA噬菌体选自(a)噬菌体Qβ；(b)噬菌体R17；(c)噬菌体fr；(d)噬菌体GA；(e)噬菌体SP；(f)噬菌体MS2；(g)噬菌体M11；(h)噬菌体MX1；(i)噬菌体NL95；(k)噬菌体f2；(l)噬菌体PP7；和(m)噬菌体AP205。
在一个优选实施方案中，所述RNA噬菌体的突变外壳蛋白已经通过除去、或者通过置换添加至少一个赖氨酸残基而被修饰。在另一个优选实施方案中，所述RNA噬菌体的突变外壳蛋白已通过删除至少一个赖氨酸残基、或通过插入添加至少一个赖氨酸残基而修饰。在一个优选实施方案中，该病毒样颗粒包含RNA噬菌体Qβ、RNA噬菌体fr或RNA噬菌体AP205的重组蛋白或其片段。
如前所述，本发明包括病毒样颗粒或其重组形式。本领域技术人员了解如何制备这些颗粒并将其与抗原附着。本发明的进一步优选的实施方案在实施例部分描述。
在一个实施方案中，病毒样颗粒包含、或基本由、或由BK病毒(BKV)的重组蛋白或其片段组成，其中所述重组蛋白包含、或基本由、或由具有SEQ ID NO12的氨基酸序列的蛋白质组成。BK病毒(BKV)是一种无包膜的双链DNA病毒，属于乳多空病毒科多瘤病毒亚科。VP1是BKV的主要的衣壳蛋白。VP1含有362个氨基酸(SEQ ID NO12，Gene Bank登录号AAA46882)，大小为42kDa。当在大肠杆菌、昆虫细胞或酵母中产生时，VP1自发形成衣壳结构(Salunke D.M.，etal.，Cell 46(6)895-904(1986)；Sasnauskas，K.，et al.，Biol.Chem.380(3)381-6(1999)；Sasnauskas，K.，et al.，3rd International Workshop″Virus-like particles as vaccines″Berlin，September 26-29(2001)；Touze，A.，et al.，J Gen Virol.82(Pt 12)3005-9(2001)。该衣壳被组织为72VP1五聚体，形成二十面体结构。衣壳的直径约为45nm。
在一个实施方案中，本发明的组合物中使用的颗粒由修饰后除去或减少了游离半胱氨酸残基数量的乙型肝炎衣壳(核心)蛋白(HBcAg)或HBcAg片段构成。Zhou等人(J.Virol.665393-5398(1992))证实，修饰后除去天然存在的半胱氨酸残基的HBcAg保留结合并形成多聚体结构的能力。因此，适于在本发明的组合物中使用的核心颗粒包括那些包含修饰HBcAg或其片段的颗粒，其中一个或多个天然存在的半胱氨酸残基已被删除或被替换为另一种氨基酸残基(例如丝氨酸残基)。
HBcAg是通过加工乙型肝炎核心抗原前体蛋白产生的蛋白质。HBcAg的一些同种型已经被鉴定，本领域技术人员能够容易地获得其氨基酸序列。例如，具有SEQ ID NO16所示氨基酸序列的HBcAg蛋白长度为185个氨基酸，是通过加工212个氨基酸的乙型肝炎核心抗原前体蛋白而产生的。这种加工导致从乙型肝炎核心抗原前体蛋白的N端除去29个氨基酸。类似地，长度为185个氨基酸的HBcAg蛋白通过加工214个氨基酸的乙型肝炎核心抗原前体蛋白而产生。
在优选实施方案中，用HBcAg的加工形式(即已经除去乙型肝炎核心抗原前体蛋白的N端前导序列的HBcAg)制备本发明的疫苗组合物。
另外，在不发生加工的条件下制备HBcAg时，HBcAg通常以“加工的”形式表达。例如，细菌系统，如大肠杆菌，通常不会除去在真核细胞中正常表达的蛋白质的前导序列，也被称为“信号肽”。因此，当利用将蛋白质表达定向于细胞质的大肠杆菌表达系统来产生本发明的HBcAg时，这些蛋白质通常表达为不含乙型肝炎核心抗原前体蛋白N端前导序列的形式。
可用于本发明的乙型肝炎病毒样颗粒的制备在下列专利中公开，例如WO 00/32227、特别是其实施例17-19和21-24，以及WO01/85208、特别是其实施例17-19、21-24、31和41，和WO 02/056905。最后一个申请中具体参照实施例23、24、31和51。全部这三篇文献在此均明确引用作为参考。
本发明也包括经修饰后缺失或置换了一个或多个其它半胱氨酸残基的HBcAg变体。因此，本发明的疫苗组合物包括包含如下HBcAg的组合物，其中SEQ ID NO16所示氨基酸序列中不含的半胱氨酸残基已经被删除。
本领域公知，游离半胱氨酸残基可能参与一些化学副反应。这些副反应包括二硫交换，与例如在与其它物质联合治疗中注射或形成的化学物质或代谢物反应，或暴露于紫外线后的直接氧化以及与核苷酸的反应。因而可能产生毒性加合物，特别是考虑到HBcAg具有结合核酸的强烈倾向。毒性加合物将会以多种形式分布，它们单个可能以低浓度存在，但在一起时则达到毒性水平。
如上所述，在疫苗组合物中使用经修饰除去天然存在的半胱氨酸残基的HBcAg的一个优点是，当抗原或抗原决定簇附着时，毒性物质能够结合的位点在数量上减少或者完全消失。
适用于实施本发明的一些天然存在的HBcAg变体已经被鉴定。例如，Yuan等人(J.Virol.7310122-10128(1999))描述了在对应于SEQID NO25位点97的位点处异亮氨酸残基被置换为亮氨酸残基或苯丙氨酸残基的变体。一些HBcAg变体以及几种乙型肝炎核心抗原前体变体的氨基酸序列公开于GenBank报告AAF121240、AF121239、X85297、X02496、X85305、X85303、AF151735、X85259、X85286、X85260、X85317、X85298、AF043593、M20706、X85295、X80925、X85284、X85275、X72702、X85291、X65258、X85302、M32138、X85293、X85315、U95551、X85256、X85316、X85296、AB033559、X59795、X85299、X85307、X65257、X85311、X85301(SEQ ID NO26)、X85314、X85287、X85272、X85319、AB010289、X85285、AB010289、AF121242、M90520(SEQ ID NO27)、P03153、AF110999和M95589，其公开内容均在此引用作为参考。上述乙型肝炎核心抗原前体变体的序列进一步公开在WO01/85208中，申请WO 01/85208的SEQ ID NOs89-138中。这些HBcAg变体在氨基酸序列的多个位点处不同，包括对应于SEQ ID NO28中位点12、13、21、22、24、29、32、33、35、38、40、42、44、45、49、51、57、58、59、64、66、67、69、74、77、80、81、87、92、93、97、98、100、103、105、106、109、113、116、121、126、130、133、135、141、147、149、157、176、178、182和183处氨基酸残基的氨基酸残基。WO 01/98333、WO 00/177158和WO 00/214478中描述了适于在本发明的组合物中使用、并且可以根据本说明书公开内容进一步修饰的其它HBcAg变体。
适用于本发明的HBcAg可以来源于任何生物，只要它们能够包封或偶联或附着于、特别是能够包装含非甲基化CpG的寡核苷酸，并诱发免疫应答。
如上所述，一般将加工的HbcAg(即缺乏前导序列的)用于本发明的疫苗组合物中。本发明包括使用上述变异HBcAg的疫苗组合物，以及应用这些组合物的方法。
本发明的范围内进一步包括能够连接形成二聚或多聚结构的其它HBcAg变体。因此，本发明进一步包括如下疫苗组合物，其包含HBcAg多肽，该HBcAg多肽包含或由与任何一种野生型氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列组成，以及必要时加工除去N端前导序列的这些蛋白质的形式。
一种多肽的氨基酸序列是否具有与野生型氨基酸序列之一或其亚部分至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列，可以利用公知的计算机程序如Bestfit程序来常规确定。当利用Bestfit或其它任何序列比对程序来确定一种具体序列与参照氨基酸序列是否如95％相同时，参数设置为使得在参照氨基酸序列的全长上计算百分同一性，并且允许同源性缺口达参照序列中氨基酸残基总数的5％。
上述HBcAg变体和前体的氨基酸序列彼此相对相似。因此，HBcAg变体中位于对应于SEQ ID NO28特定位点的位点处的氨基酸残基，是指SEQ ID NO28所示氨基酸序列中该位点处的氨基酸残基。在感染哺乳动物的乙型肝炎病毒之间，这些HBcAg变体之间的同源性绝大部分足够高，因此本领域技术人员不难检查如SEQ ID NO28所示的氨基酸序列，以及特定HBcAg变体的氨基酸序列，并确定“相应的”氨基酸残基。此外，SEQ ID NO27所示HBcAg氨基酸序列，其显示来源于感染土拨鼠的病毒的HBcAg的氨基酸序列，与含有SEQID NO28所示氨基酸序列的HBcAg有足够的同源性，显然在SEQ IDNO27中，相当于在SEQ ID NO28的氨基酸残基155与156之间插入了3个氨基酸残基。
本发明也包括包含感染鸟类的乙型肝炎病毒HBcAg变体的疫苗组合物，以及包含这些HBcAg变体的片段的疫苗组合物。本领域技术人员会理解，在添加到本发明的疫苗组合物中之前，这些多肽中天然存在的1、2、3个或更多的半胱氨酸残基可以被置换为另一种氨基酸残基或者缺失。
如上所述，去除游离半胱氨酸残基减少了毒性成分能够与HBcAg结合的位点数，也除去了该HBcAg或相邻HBcAg分子的赖氨酸和半胱氨酸残基交联的位点。因此，在本发明的另一个实施方案中，乙型肝炎病毒衣壳蛋白的一个或多个半胱氨酸残基缺失或被替换为另一种氨基酸残基。HBcAg-Lys变体的表达与纯化在WO 02/056905的实施例24中有描述，不含游离半胱氨酸残基且含有插入的赖氨酸残基的HBcAg的构建在WO 02/056905的实施例31中有描述。
在其它实施方案中，本发明的组合物和疫苗组合物分别含有已经除去C端区(例如SEQ ID NO28的氨基酸残基145-185或150-185)的HBcAg。适于在本发明的实施中使用的其它修饰HBcAg包括C端截短突变体。合适的截短突变体包括已经从C端除去1、5、10、15、20、25、30、34、35个氨基酸的HBcAg。
适于在本发明的实施中使用的HBcAg还包括N端截短突变体。合适的截短突变体包括已经从N端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸的修饰HBcAg。
适于在本发明的实施中使用的HBcAg还包括N端和C端截短突变体。合适的截短突变体包括已经从N端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸并且从C端除去1、5、10、15、20、25、30、34、35个氨基酸的HBcAg。
本发明还包括分别包含HBcAg多肽的组合物和疫苗组合物，该多肽包含、或基本由、或由与上述截短突变体至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列组成。
在本发明的某些实施方案中，向HBcAg多肽内引入赖氨酸残基，以介导本发明的MelanA肽类似物与HBcAg的VLP的结合。在优选实施方案中，用一种HBcAg制备本发明的组合物，该HBcAg包含或由SEQ ID NO28的氨基酸1-144或1-149、1-185组成，对其进行修饰使得对应于位点79和80的氨基酸被置换为含Gly-Gly-Lys-Gly-Gly氨基酸序列的肽(SEQ ID NO18)，产生含有SEQ ID NO29所示序列的HBcAg多肽。这些组合物尤其可用于抗原决定簇与HBcAg的VLP相偶联的实施方案中。在进一步优选的实施方案中，SEQ ID NO28的位点48和107处的半胱氨酸残基突变为丝氨酸。本发明还包括包含相应多肽的组合物，该多肽含有上述任何一种乙型肝炎核心抗原前体变体所示的氨基酸序列，还含有上述氨基酸改变。本发明的范围内还包括能够连接形成衣壳或VLP并且含有上述氨基酸改变的其它HBcAg变体。因此，本发明进一步包括如下组合物和疫苗组合物，它们分别包含HBcAg多肽，该HBcAg多肽包含或由与任何一种野生型氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列组成，以及必要时加工除去N端前导序列和通过上述氨基酸改变修饰的这些蛋白质的变化形式。
本发明的组合物或疫苗组合物可包含不同HBcAg的混合物。因此，这些疫苗组合物可以由氨基酸序列不同的多种HBcAg组成。例如，可以制备包含“野生型”HBcAg和一个或多个氨基酸残基已经改变(例如缺失、插入或置换)的修饰HBcAg的疫苗组合物。本发明优选的疫苗组合物是呈现高度有序且重复的抗原阵列的组合物，其中所述抗原是人黑素瘤MelanA肽类似物。
如上所述，本发明部分基于以下的意外发现免疫刺激物，优选免疫刺激性核酸，更优选DNA寡核苷酸，或者poly(IC)，能够包装到VLP内。出乎意料的是，VLP内的核酸可被特异性地置换为免疫刺激物，优选免疫刺激性核酸，更优选含有CpG基序或poly(IC)的DNA-寡核苷酸。例如，CpG-VLP比不含CpG的对应物免疫原性更高、引发特异性更高的效应，并且诱发增强的B和T细胞应答。针对与VLP偶联、融合或以其他方式附着的抗原的免疫应答与针对VLP本身的免疫应答相似地增强。另外，针对VLP和抗原两者的T细胞应答都特别集中在Th1型。而且，包装的核酸和CpG分别受到保护而免遭降解，即它们更加稳定。而且，来自先天免疫系统的细胞的非特异性激活被大大降低。
先天免疫系统能够识别微生物病原体所共有的固定分子模式。最近的研究揭示，这种识别是诱发有效免疫应答的一个关键步骤。微生物产物增强免疫应答的主要机制是刺激APC，特别是树突细胞，从而产生促炎细胞因子，并且表达高水平的T细胞共同刺激分子。这些激活的树突细胞随后启动初次T细胞应答，并且决定T细胞介导的效应功能的类型。
两类核酸，即1)含有免疫刺激序列、特别是特定侧翼碱基内的非甲基化CpG二核苷酸(称为CpG基序)的细菌DNA，2)由多种病毒类型合成的双链RNA，是能增强免疫应答的微生物成分的重要成员。合成双链(ds)RNA，如聚肌苷酸-聚胞苷酸(poly IC)，能够诱导树突细胞产生促炎细胞因子并表达高水平的共刺激分子。
Tokunaga和Yamamoto等人的一系列研究表明，细菌DNA或合成寡脱氧核苷酸诱导人PBMC和小鼠脾细胞产生I型干扰素(IFN)(Yamamoto et al.，Springer Semin Immunopathol.2211-19综述)。最初合成Poly IC作为I型IFN的一种强诱导剂，但它也能诱导其它细胞因子如IL-12。
优选的核糖核酸包括聚肌苷酸-聚胞苷酸双链RNA(poly IC)。核糖核酸及其修饰及其制备方法在Levy，H.B.(Methods Enzymol.1981，78242-251)、DeClercq，E(Methods Enzymol.1981，78227-236)和Torrence，P.F.(Methods Enzymol 1981；78326-331)以及其中的参考文献中有描述。进一步优选的核糖核酸包括肌苷酸和胞苷酸的多核苷酸，如两条链形成双链RNA的poly(IC)。核糖核酸可以从生物中分离。核糖核酸也包括其它合成核糖核酸，特别是合成的poly(IC)寡核苷酸，它们通过磷酸二酯骨架的修饰、特别是通过硫代磷酸修饰而对核酸酶具有抗性。在另一个实施方案中，用脱氧核糖代替poly(IC)的核糖骨架。本领域技术人员了解合成寡核苷酸的合成方法。
在本发明的另一个优选实施方案中，包括可激活toll样受体(TLR)的分子。迄今为止已知10种人toll样受体。它们被多种配体激活。TLR2被肽聚糖、脂蛋白、脂多糖、脂磷壁酸和酵母聚糖和巨噬细胞活化脂肽MALP-2激活；TLR3被双链RNA如poly(IC)激活；TLR4被脂多糖、脂磷壁酸和紫杉醇和热休克蛋白如热休克蛋白HSP-60和Gp96激活；TLR5被细菌鞭毛、特别是鞭毛蛋白激活；TLR6被肽聚糖激活；TLR7被咪喹莫特和咪唑并喹啉化合物如R418、罗唑利宾和溴匹立明激活；TLR9被细菌DNA、特别是CpG DNA激活。TLR1、TLR8和TLR10的配体迄今为止还不清楚。然而，最近的报告表明，相同的受体能够与不同的配体反应，并且存在其它受体。以上所列配体并非穷举，本领域技术人员知道其它配体。
优选地，含非甲基化CpG的寡核苷酸包含序列5’X1X2CGX3X4 3’，其中X1、X2、X3、X4是任意一种核苷酸。另外，该寡核苷酸可以包含约6个到约100,000个核苷酸，优选约6个到约2000个核苷酸，更优选约20个到约2000个核苷酸，更优选地包含约20个到约300个核苷酸。另外，该寡核苷酸也可以包含超过100个到约2000个核苷酸，优选超过100个到约1000个核苷酸，更优选超过100个到约500个核苷酸。
在一个优选实施方案中，含CpG的寡核苷酸在磷酸骨架上含有一个或多个硫代磷酸修饰。例如，本发明的范围内包括其中有一个或多个磷酸骨架修饰或者全部磷酸骨架都被修饰的含CpG的寡核苷酸，以及其中一个、多个或全部核苷酸磷酸骨架修饰为硫代磷酸修饰的含CpG的寡核苷酸。因此，在一个优选实施方案中，核苷酸X1、X2、X3和X4至少之一含有磷酸骨架修饰。
在本发明的另外一个非常优选的实施方案中，免疫刺激物是含非甲基化CpG的寡核苷酸，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸具有选自下列的核酸序列(a)GGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQ IDNO2)；在此一般缩写为G3-6)，(b)GGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQ ID NO3)；在此一般缩写为G4-6)，(c)GGGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQ ID NO4)；在此一般缩写为G5-6)，(d)GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQ ID NO5)；在此一般缩写为G6-6)，(e)GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG((SEQ ID NO6)；在此一般缩写为G7-7)，(f)GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG((SEQ ID NO7)；在此一般缩写为G8-8)，(g)GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG((SEQ ID NO8)；在此一般缩写为G9-9)，(h)GGGGGGCGACGACGATCGTCGTCGGGGGGG((SEQ ID NO9)；在此一般缩写为G6)，(i)tccatgacgttcctgaataat((SEQ ID NO34)；在此一般缩写为CyCpGpt)，(j)TCCATGACGTTCCTGAATAAT((SEQ ID NO35)；在此一般缩写为CyCpG)，(k)tccatgacgttcctgacgtt((SEQ ID NO36)；在此一般缩写为B-CpGpt)，(l)TCCATGACGTTCCTGACGTT((SEQ ID NO37)；在此一般缩写为B-CpG)，(m)ggggtcaacgttgaggggg((SEQ ID NO38)；在此一般缩写为NKCpGpt)，(n)GGGGTCAACGTTGA GGGGG((SEQ ID NO39)；在此一般缩写为NKCpG)，(o)attattcaggaacgtcatgga((SEQ ID NO40)；在此一般缩写为CyCpG-rev-pt)， (p)GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG((SEQ ID NO41)；在此一般缩写为g10gacga-PO(G10-PO))， (q)gggggggggggacgatcgtcgggggggggg((SEQ ID NO42)；在此一般缩写为g10gacga-PS(G10-PS))，(r)CGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGAAATGCATGTCAAAGACAGCAT((SEQ ID NO43)；在此一般缩写为(CpG)20OpA)，(s)TCCATGACGTTCCTGAATAATCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCG((SEQ IDNO44)；在此一般缩写为Cy(CpG)20)， (t)TCCATGACGTTCCTGAATAATCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGAAATGCATGTCAAA GACAGCAT((SEQ ID NO45)；在此一般缩写为Cy(CpG)20-OpA)， (u)TCCATGACGTTCCTGAATAATAAATGCATGTCAAAGACAGCAT((SEQ ID NO46)；在此一般缩写为CyOpA)， (v)TCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTT CCTGAATAAT((SEQ ID NO47)；在此一般缩写为CyCyCy)， (w)TCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTGGATGACGTTGGTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCC((SEQ ID NO48)；在此一般缩写为Cy150-1)，和(x)CTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATTCATGACTTCCTGAATAATTCCATGACGTTGGTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAAAATTCCA ATCAAGCTTATCGATACCGTCGACC(SEQ ID NO49)，在此一般缩写为dsCyCpG-253(互补链未示出)。上述SEQ ID NO34至SEQ ID NO49序列中的小写字母表示通过硫代磷酸酯键连接的脱氧核苷酸，而大写字母表示通过磷酸二酯键连接的脱氧核苷酸。
在本发明的再一个非常优选的实施方案中，免疫刺激物是含非甲基化CpG的寡核苷酸，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸具有核酸序列GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG((SEQ IDNO41)；在此一般缩写为g10gacga-PO或G10-PO)。
含CpG的寡核苷酸也可以是重组的、基因组的、合成的、cDNA、质粒衍生的和单链或双链的。为在本发明中应用，可以利用本领域公知的多种方法之一从头合成核酸。例如，β-氰乙基亚磷酰胺法(Beaucage，S.L.and Caruthers，M.H.，Tet.Let.221859(1981)；核苷H-磷酸法(Garegg et al.，Tet.Let.274051-4054(1986)；Froehler et al.，Nucl.Acid.Res.145399-5407(1986)；Garegg et al.，Tet.Let.274055-4058(1986)；Gaffney et al.，Tet.Let.292619-2622(1988))。这些化学法可以用可购得的多种自动寡核苷酸合成仪进行。此外，CpG也可以在质粒中大规模产生(参见Sambrook，T.et al.，《分子克隆实验室手册》，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，1989)，它在对受试者施用后降解为寡核苷酸。可以利用已知技术，如使用限制性内切酶、外切核酸酶或内切核酸酶，由现有的核酸序列(例如基因组或cDNA序列)制备寡核苷酸。
免疫刺激物、免疫刺激性核酸以及含非甲基化CpG的寡核苷酸，可以用本领域已知的任何一种方法与VLP结合，只要该组合物能够增强动物中的免疫应答。例如，寡核苷酸可以共价或非共价结合。另外，VLP也可以完全或部分地包封免疫刺激物、免疫刺激性核酸以及含非甲基化CpG的寡核苷酸。优选地，免疫刺激性核酸以及含非甲基化CpG的寡核苷酸能够结合于VLP位点，如寡核苷酸结合位点(天然或非天然存在的)、DNA结合位点或RNA结合位点。在另一个实施方案中，VLP位点包含富含精氨酸的重复序列或富含赖氨酸的重复序列。
本发明组合物的一个具体用途是为了增强对抗原的特异性免疫应答而激活树突细胞。可以用离体(ex vivo)或体内技术增强免疫应答。离体技术可以用于自体或异源细胞，但优选地用于自体细胞。在优选实施方案中，树突细胞从外周血或骨髓中分离，但是也可以从任何树突细胞来源中分离。为了癌症免疫治疗而对树突细胞的离体操作在本领域的几篇参考文献中已有描述，包括Engleman，E.G.，Cytotechnology 251(1997)；Van Schooten，W.et al.，MolecularMedicine Today，June，255(1997)；Steinman，R.M.，ExperimentalHematology 24849(1996)；Gluckman，J.C.，Cytokines，Cellular andMolecular Therapy 3187(1997)。
也可以利用体内方法将树突细胞接触本发明的组合物。为了实现这一点，将CpG与可选地偶联、融合或以其他方式附着到抗原上的VLP组合，直接给予需要免疫治疗的患者。在一些实施方案中，优选地在肿瘤局部区域施用VLP/CpG，这可以用本领域公知的任何一种方法来实现，例如直接向肿瘤内注射。
本发明的一个优选实施方案是提供用于增强动物中的免疫应答的组合物，该组合物包含(a)病毒样颗粒；(b)至少一种免疫刺激物；和(c)至少一种抗原或抗原决定簇；其中所述抗原或所述抗原决定簇与所述病毒样颗粒结合，并且其中所述抗原包含、或基本由、或由人黑素瘤MelanA肽类似物组成，并且其中所述免疫刺激物与所述病毒样颗粒结合，并且其中所述免疫刺激物是含非甲基化CpG的寡核苷酸，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸的CpG基序是回文序列的一部分，其中所述回文序列是GACGATCGTC(SEQ ID NO1)，并且其中所述回文序列在其3’端和5’端侧翼为两个以上、11个以下的鸟苷，或者更优选8-10个鸟苷，或者最优选10个鸟苷。
我们发现，本发明的免疫刺激物，即含非甲基化CpG的寡核苷酸，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸的CpG基序是回文序列的一部分，其中所述回文序列是GACGATCGTC(SEQ ID NO1)，并且其中所述回文序列在其3’端和5’端侧翼为两个以上、11个以下的鸟苷，更优选8-10个鸟苷，或者最优选10个鸟苷，在体外刺激免疫细胞方面特别有效。
在本发明的一个优选实施方案中，所述回文序列是、或者包含、或者基本由、或者由GACGATCGTC(SEQ ID NO1)组成，其中所述回文序列在其5’端侧翼为至少3个、至多10个鸟苷，并且所述回文序列在其3’端侧翼为至少6个、至多10个鸟苷。在另一个实施方案中，所述回文序列在其5’端侧翼为至少3个、至多10个鸟苷，并且所述回文序列在其3’端侧翼为至少6个、至多10个鸟苷。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，免疫刺激物是含非甲基化CpG的寡核苷酸，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸的CpG基序是回文序列的一部分，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸具有选自下列的核酸序列(a)GGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQ IDNO2)；在此一般缩写为G3-6)，(b)GGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQ ID NO3)；在此一般缩写为G4-6)，(c)GGGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQ ID NO4)；在此一般缩写为G5-6)，(d)GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQ ID NO5)；在此一般缩写为G6-6)，(e)GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG((SEQ ID NO6)；在此一般缩写为G7-7)，(f)GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG((SEQ ID NO7)；在此一般缩写为G8-8)，(g)GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG((SEQ ID NO8)；在此一般缩写为G9-9)，(h)GGGGGGCGACGACGATCGTCGTCGGGGGGG((SEQ ID NO9)；在此一般缩写为G6)，和 (i)GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG((SEQ ID NO41)；在此一般缩写为G10-PO)。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，免疫刺激物是含非甲基化CpG的寡核苷酸，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸的CpG基序是回文序列的一部分，其中所述回文序列是GACGATCGTC(SEQ ID NO1)，并且其中所述回文序列在其5’端侧翼为至少4个、至多10个鸟苷，并且所述回文序列在其3’端侧翼为至少6个、至多10个鸟苷。
在本发明的另一个优选实施方案中，免疫刺激物是含非甲基化CpG的寡核苷酸，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸的CpG基序是回文序列的一部分，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸具有选自下列的核酸序列(a)GGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQ ID NO3)；在此一般缩写为G4-6)，(b)GGGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQ ID NO4)；在此一般缩写为G5-6)， (c)GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQ ID NO5)；在此一般缩写为G6-6)，(d)GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG((SEQ ID NO6)；在此一般缩写为G7-7)，(e)GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG((SEQ ID NO7)；在此一般缩写为G8-8)，(f)GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG((SEQ ID NO8)；在此一般缩写为G9-9)；和 (g)GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG((SEQ ID NO41)；在此一般缩写为G10-PO)。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，免疫刺激物是含非甲基化CpG的寡核苷酸，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸的CpG基序是回文序列的一部分，其中所述回文序列是GACGATCGTC(SEQ ID NO1)，并且其中所述回文序列在其5’端侧翼为至少5个、至多8个鸟苷，并且所述回文序列在其3’端侧翼为至少6个、至多10个鸟苷。
实验数据表明，对于本发明优选的免疫刺激物，即侧翼为鸟苷、含非甲基化CpG的回文寡核苷酸，其中该回文序列是GACGATCGTC(SEQ ID NO1)，并且该回文序列在其3′端和5′端侧为不到11个或不到10个鸟苷，如果回文序列侧翼的鸟苷较少，则更容易被包装到VLP内。然而，减少回文序列侧翼的鸟苷数量会降低对血细胞的体外刺激。因此，可包装性的代价是本发明所述免疫刺激物的生物活性降低。因此优选实施方案是可包装性与生物活性之间的折衷。
在本发明的另一个优选实施方案中，免疫刺激物是下述含非甲基化CpG的寡核苷酸，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸的CpG基序是回文序列的一部分，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸具有选自下列的核酸序列(a)GGGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQ IDNO4)，在此一般缩写为G5-6)； (b)GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG((SEQ ID NO5)，在此一般缩写为G6-6)；(c)GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG((SEQ ID NO6)，在此一般缩写为G7-7)； (d)GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG((SEQ ID NO7)，在此一般缩写为G8-8)；和 (e)GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG((SEQ ID NO41)；在此一般缩写为G10-PO)。
在本发明的一个优选实施方案中，免疫刺激物是下述含非甲基化CpG的寡核苷酸，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸的CpG基序是回文序列的一部分，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸具有SEQID NO7的核酸序列，即该免疫刺激物是G8-8，或者具有SEQ ID NO41的核酸序列，即该免疫刺激物是G10-PO。
在本发明的一个非常优选的实施方案中，免疫刺激物是下述含非甲基化CpG的寡核苷酸，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸的CpG基序是回文序列的一部分，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸具有SEQ ID NO41的核酸序列，即该免疫刺激物是G10-PO。因此，在一个非常优选的实施方案中，本发明提供一种增强动物中免疫应答的组合物，该组合物包含(a)病毒样颗粒；(b)至少一种免疫刺激物；和(c)至少一种抗原或抗原决定簇；其中所述抗原与所述病毒样颗粒结合，并且其中所述抗原包含、或基本由、或由人黑素瘤MelanA肽类似物组成，并且其中所述免疫刺激物与所述病毒样颗粒结合，并且其中所述免疫刺激物是含非甲基化CpG的寡核苷酸，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸的CpG基序是回文序列的一部分，其中所述回文序列是GACGATCGTC(SEQ ID NO1)，并且其中所述回文序列在其3’端和5’端侧翼为10个鸟苷。
如上所述，用来包装到VLP内的最佳序列是可包装性与生物活性之间的折衷。考虑到这一点，G8-8免疫刺激物是优选的，G10-PO免疫刺激物是本发明的非常优选的实施方案，因为它们具有高度的生物活性，同时仍然可以相当好地被包装。
本发明的组合物进一步包含与病毒样颗粒结合的本发明的人黑素瘤MelanA肽类似物。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，至少一个MelanA肽类似物与该病毒样颗粒融合。如上所述，VLP一般由至少一种可装配为VLP的亚单位组成。因此，在本发明的一个进一步优选的实施方案中，MelanA肽类似物与病毒样颗粒的或能够掺入VLP内的蛋白质的至少一个亚单位融合，产生嵌合的VLP-亚单位-抗原融合体。
MelanA肽类似物的融合可以如下实现插入VLP亚单位序列内，或与VLP亚单位或能够掺入VLP内的蛋白质的N端或C端融合。在下文中，当提到肽与VLP亚单位的融合蛋白时，包括该肽与亚单位序列任一端的融合或向亚单位序列内的内部插入。
也可以通过向VLP亚单位变体内插入MelanA肽类似物序列实现融合，其中亚单位序列的一部分缺失，故被称为截短突变体。截短突变体可以在N端或C端或内部缺失VLP亚单位的部分序列。例如，氨基酸残基79-81缺失的特定VLP HBcAg是含有内部缺失的截短突变体。抗原或抗原决定簇与截短突变体VLP-亚单位的N端或C端的融合也产生本发明的实施方案。同样，表位向VLP亚单位序列内的融合也可以通过置换来实现，例如对于特定VLP HBcAg，用外源表位代替氨基酸79-81。因此，如下文所说的融合可以如下实现向VLP亚单位的序列中插入MelanA肽类似物序列，用MelanA肽类似物置换VLP亚单位序列的一部分，或者利用缺失、置换或插入的组合。
嵌合MelanA肽类似物-VLP亚单位通常能够自装配为VLP。展示与亚单位融合的表位的VLP在此也被称为嵌合VLP。如上所述，病毒样颗粒包含或者由至少一种VLP亚单位组成。在本发明的另一实施方案中，病毒样颗粒包含或由嵌合VLP亚单位和非嵌合VLP亚单位(即不与抗原融合的VLP亚单位)的混合物组成，产生所谓的镶嵌颗粒。这可能有利于确保VLP的形成和装配。在这些实施方案中，嵌合VLP-亚单位的比例可以是1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95％或更高。
为了与VLP亚单位序列的任一端融合，或者为了向VLP亚单位序列内部插入这种肽序列，可以向肽或表位序列的任一端添加侧翼氨基酸残基。在添加到待融合肽上的侧翼序列中，甘氨酸和丝氨酸残基是特别有用的氨基酸。甘氨酸残基提供额外的柔性，这可降低外源序列与VLP亚单位序列融合中潜在的去稳定作用。
在本发明的一个具体实施方案中，VLP是一种乙型肝炎核心抗原VLP。与HBcAg N端的融合蛋白(Neyrinck，S.et al.，Nature Med.51157-1163(1999))或向所谓的主要免疫显性区(MIR)中的插入已经有描述(Pumpens，P.and Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001)，WO01/98333)，也是本发明的优选实施方案。在MIR中存在缺失的天然存在的HBcAg变体也已经有描述(Pumpens，P.and Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001)，在此完整引用作为参考)，与N端或C端的融合，以及与野生型HBcAg相比在对应于缺失位点的MIR位点处的插入，也是本发明的实施方案。与C端的融合也已经有描述(Pumpens，P.and Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001))。本领域技术人员可以容易地找到如何利用经典分子生物学技术构建融合蛋白的指南(Sambrook，J.et al.，eds.，《分子克隆实验室手册》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Habor，N.Y.(1989)；Ho et al.，Gene 7751(1989))。编码HBcAg和HBcAg融合蛋白并且可用于表达HBcAg和HBcAg融合蛋白的载体和质粒已经有描述(Pumpens，P.& Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001)，Neyrinck，S.et al.，Nature Med.51157-1163(1999))，可以在本发明的实施中使用。优化自装配效率和展示欲插入HBcAg MIR内的表位的一个重要因素是插入位点的选择，以及插入时将要从MIR内HBcAg序列上删除的氨基酸数量(Pumpens，P.and Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001)；EP 421635；U.S.6,231,864)，或者换句话说，HBcAg的哪些氨基酸将被置换为新的表位。例如，已经报道了用外源表位置换HBcAg氨基酸76-80、79-81、79-80、75-85或80-81(Pumpens，P.and Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001)；EP 421635；US 6,231,864)。HBcAg含有一个长精氨酸尾(Pumpens，P.and Grens，E.，Intervirology4498-114(2001))，该精氨酸尾不是衣壳装配所必需的，并能够结合核酸(Pumpens，P.and Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001))。包含或缺乏该精氨酸尾的HBcAg都是本发明的实施方案。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，VLP是RNA噬菌体的VLP。RNA噬菌体的主要外壳蛋白在细菌、特别是在大肠杆菌中表达后自发装配为VLP。可用来制备本发明组合物的噬菌体外壳蛋白的具体例子包括诸如噬菌体Qβ(SEQ ID NO10，PIR数据库，登录号VCBPQβ，指QβCP；和SEQ ID NO11，登录号AAA16663，指Qβ A1蛋白)和噬菌体fr(SEQ ID NO13，PIR登录号VCBPFR)的RNA噬菌体的外壳蛋白。
在另一个优选实施方案中，至少一个MelanA肽类似物与一个Qβ外壳蛋白融合。已经描述了如下融合蛋白构建体，其中表位与Qβ A1蛋白截短形式的C端融合，或插入A1蛋白内(Kozlovska，T.M.et al.，Intervirology，399-15(1996))。A1蛋白是通过UGA终止密码子处的抑制产生的，长度为329个氨基酸，或者如果考虑N端甲硫氨酸的切除，为328个氨基酸。丙氨酸(Qβ CP基因编码的第二个氨基酸)之前N端甲硫氨酸的切除在大肠杆菌中常常发生，Qβ外壳蛋白的N端就是如此。位于UGA琥珀密码子3’方向的A1基因的一部分编码长度为195个氨基酸的CP延伸。在CP延伸的位点72与73之间插入至少一个MelanA肽类似物产生了本发明另外的实施方案(Kozlovska，T.M.et al.，Intervirology 399-15(1996))。MelanA肽类似物在C端截短的Qβ A1蛋白C端处的融合产生了本发明的进一步优选的实施方案。例如，Kozlovska等人(Intervirology 399-15(1996))描述了表位在位点19处截短的Qβ CP延伸的C端处融合的Qβ A1蛋白融合。
如Kozlovska等人(Intervirology 399-15(1996))所述，展示融合表位的颗粒的装配可能需要存在A1蛋白-MelanA-肽类似物融合蛋白和野生型CP，以形成镶嵌颗粒。然而，本发明的范围内也包括下述实施方案其包含仅由与至少一个MelanA-肽类似物融合的VLP亚单位组成的病毒样颗粒，特别是RNA噬菌体Qβ外壳蛋白的VLP。
镶嵌颗粒的制备可以用数种方法实现。Kozlovska，et al.，Intervirology 399-15(1996)描述了3种方法，它们均可在本发明的实施中使用。第一种方法，通过在大肠杆菌菌株中表达在CP与CP延伸之间含有一个UGA终止密码子的编码Qβ A1融合蛋白的质粒，介导融合表位在VLP上的有效展示，该大肠杆菌菌株携带编码克隆UGA抑制性tRNA的质粒，使UGA密码子翻译为Trp(pISM3001质粒(Smiley B.K.，et al.，Gene 13433-40(1993))。另一种方法，将CP基因终止密码子修饰为UAA，并与表达A1蛋白-抗原融合体的第二种质粒共转化。该第二种质粒编码不同的抗生素抗性，并且其复制起点与第一种质粒相容(Kozlovska，T.M.，et al.，Intervirology 399-15(1996))。第三种方法，CP和A1蛋白-抗原融合体以双顺反子的形式编码，与启动子如Trp启动子有效连接，如Kozlovska，et al.，Intervirology 399-15(1996)的图1所示。
在另外一个实施方案中，MelanA肽类似物插入在frCP的氨基酸2与3之间(切割的CP的编号，其中N端甲硫氨酸已经切除)，从而产生MelanA肽类似物-fr CP融合蛋白。用于构建和表达可自装配为VLP的fr CP融合蛋白并且可用于本发明实施的载体和表达系统已经有报道(Pushko P.，et al.，Prot.Eng.6883-891(1993))。在一个具体实施方案中，MelanA肽类似物序列插入在fr CP缺失变体内氨基酸2之后，该变体中fr CP的残基3和4缺失。
表位在RNA噬菌体MS-2外壳蛋白的N端突起β-发夹中的融合，以及随后融合表位在RNA噬菌体MS-2的自装配VLP上的呈递，也已经有描述(WO 92/13081)，本发明的MelanA肽类似物通过插入或置换到MS-2RNA噬菌体的外壳蛋白内的融合也属于本发明的范围内。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的MelanA肽类似物与乳头瘤病毒的衣壳蛋白融合。在一个更特别的实施方案中，本发明的MelanA肽类似物与1型牛乳头瘤病毒(BPV-1)的主要衣壳蛋白L1融合。用于构建及在杆状病毒/昆虫细胞系统内表达BPV-1融合蛋白的载体和表达系统已经有描述(Chackerian，B.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 962373-2378(1999)，WO 00/23955)。用本发明的MelanA肽类似物置换BLV-1L1的氨基酸130-136产生BPV-1L1-MelanA肽类似物融合蛋白，这是本发明的一个优选实施方案。在杆状病毒载体中的克隆以及在杆状病毒感染的Sf9细胞中的表达已经有描述，可在本发明的实施中使用(Chackerian，B.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA962373-2378(1999)，WO 00/23955)。展示融合的本发明MelanA肽类似物的装配颗粒可以用多种方法进行纯化，如凝胶过滤或蔗糖梯度超速离心(Chackerian，B.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 962373-2378(1999)，WO 00/23955)。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的MelanA肽类似物与能够掺入Ty VLP内的Ty蛋白融合。在一个更特别的实施方案中，本发明的MelanA肽类似物与TYA基因编码的p1或衣壳蛋白融合(Roth，J.F.，Yeast 16785-795(2000))。酵母逆转录转座子Ty1、2、3、4已经从酿酒酵母(Saccharomyces serevisiae)中分离，而逆转录转座子Tf1已经从粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombae)中分离(Boeke，J.D.and Sandmeyer，S.B.，″Yeast Transposable elements，″in The molecularand Cellular Biology of the Yeast SaccharomycesGenome dynamics，Protein Synthesis，and Energetics，p.193，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1991))。逆转录转座子Ty1和2与植物和动物因子的copia类别有关，而Ty3属于逆转录转座子的gypsy家族，它与植物和动物逆转录病毒有关。在Ty1逆转录转座子中，p1蛋白(也称为Gag或衣壳蛋白)的长度为440个氨基酸。p1在VLP的成熟过程中在位点408处被切割，产生p2蛋白，p2蛋白是VLP的必要组分。
与p1融合的融合蛋白和用于在酵母中表达该融合蛋白的载体已经有描述(Adams，S.E.，et al.，Nature 32968-70(1987))。例如，通过向pMA5620质粒的BamHI位点内插入编码MelanA肽类似物的序列，本发明的MelanA肽类似物可与p1融合。将编码外源表位的序列克隆到pMA5620载体内导致融合蛋白的表达，该融合蛋白包含Ty1-15的p1的氨基酸1-381，其C端与外源表位的N端融合。同样，本发明的MelanA肽类似物的N端融合，或向p1序列内的内部插入，或p 1序列一部分的置换，也属于本发明的范围内。具体而言，将本发明的MelanA肽类似物插入Ty序列内Ty蛋白p1的氨基酸30-31、67-68、113-114和132-133之间(EP0677111)产生本发明的优选实施方案。
适用于本发明的MelanA或MelanA肽类似物融合的其它VLP有，例如逆转录病毒样颗粒(WO9630523)、HIV2Gag(Kang，Y.C.，et al.，Biol.Chem.380353-364(1999))、豇豆花叶病毒(Taylor，K.M.，et al.，Biol.Chem.380387-392(1999))、细小病毒VP2VLP(Rueda，P.，et al.，Virology 26389-99(1999))、HBsAg(US 4,722,840，EP0020416B1)。
适于实施本发明的嵌合VLP的实例也包括Intervirology 391(1996)中所描述的那些。预计可用于本发明的VLP的其它实例有HPV-1、HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18、HPV-33、HPV-45、CRPV、COPV、HIV GAG、烟草花叶病毒。也制备了SV40、多瘤病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、轮状病毒和诺瓦克病毒的病毒样颗粒，这些VLP的嵌合VLP也属于本发明的范围内。
如上所述，包含通过插入病毒样颗粒构建单体序列内而与病毒样颗粒融合的抗原的实施方案，也属于本发明的范围内。有些情况下，抗原可以插入到包含缺失的病毒样颗粒构建单体形式中。在这些情况下，如果没有插入抗原，病毒样颗粒构建单体可能不能形成病毒样结构。
有时，可以应用重组DNA技术使异源蛋白质与VLP蛋白相融合(Kratz，P.A.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 961915(1999))。例如，本发明包括与本发明的抗原(或其部分，优选至少10、20或50个氨基酸)重组融合或化学偶联(包括共价和非共价偶联)的VLP，产生融合蛋白或偶联物。这种融合不一定必须是直接融合，也可以通过接头序列发生。更一般而言，当使用与病毒样颗粒融合、偶联或以其它方式附着的表位作为根据本发明的抗原时，一般在该表位的一端或两端添加间隔或接头序列。这些接头序列优选地包含可被蛋白酶体、内体的蛋白酶或细胞的其它囊状区室识别的序列。
一种偶联方法是通过肽键偶联，其中偶联物可以是连续的多肽，即融合蛋白。对于根据本发明的融合蛋白，不同的肽或多肽在框内彼此连接，形成一条连续多肽。因此，该融合蛋白的第一部分包含抗原或免疫原，该融合蛋白的第二部分在第一部分的N端或C端包含VLP。或者，本发明也可以向VLP的内部插入，在抗原两端任选地带有连接序列。
当用HBcAg作为VLP时，优选地抗原与HBcAg颗粒的C端连接。展示C端融合MHC I类限制的、来源于淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)糖蛋白的肽p33的乙型肝炎核心抗原(HBcAg)可能是并且通常用作模型抗原(HBcAg-p33)。长度为185个氨基酸的野生型HBc蛋白装配为高度结构化的颗粒，该颗粒由180个亚单位组成，表现为几何二十面体。文献中很好地证明了HBcAg和其它VLP在不同位点处接纳相对较大的外源序列插入，而保留形成结构化衣壳的能力的这种柔性。这使得HBc VLP成为设计非复制性疫苗的有力候选者。
可以向融合蛋白的抗原与配体之间插入一个柔性的接头序列(例如，含聚甘氨酸/聚丝氨酸的序列，如[Gly4Ser]2(Huston et al.，Meth.Enzymol 20346-88(1991)))。也可以构建融合蛋白使之含有一个“表位标签”，该标签使融合蛋白能够结合一种抗体(例如单克隆抗体)，例如用于标记或纯化目的。表位标签的一个实例是Glu-Glu-Phe三肽，它可被单克隆抗体YL1/2识别。
本发明也涉及含有编码VLP的序列和编码MelanA肽类似物的序列的嵌合DNA。例如，该DNA可以在杆状病毒转化的昆虫细胞中、在酵母或在细菌中表达。对表达系统没有任何限制，常规应用可以有大量选择。优选使用允许蛋白质大量表达的系统。由于细菌表达系统的效率高，通常优选该系统。适合在本发明范围内使用的细菌表达系统的一个实例是Clarke et al.，J.Gen.Virol.711109-1117(1990)；Borisova et al.，J.Virol.673696-3701(1993)；Studier et al.，MethodsEnzymol.18560-89(1990)所述的系统。合适的酵母表达系统的一个例子是Emr.Methods Enzymol.185231-3(1990)所述的系统；以前用于制备衣壳蛋白的杆状病毒系统也是适用的。可以使用组成型或诱导型表达系统。通过对可以使用的表达系统的选择和可能的修饰，可能控制所获蛋白质的形式。
在本发明的一个具体实施方案中，希望增强对其免疫应答的抗原与乙型肝炎病毒衣壳(核心)蛋白(HBcAg)在框内偶联、融合或以其它方式附着。然而，本领域所有人员都应当清楚，在本发明的融合蛋白构建体中也可以使用其它病毒样颗粒。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，所述至少一种MelanA肽类似物通过至少一个共价键与病毒样颗粒结合。优选地，至少一种MelanA肽类似物通过至少一个共价键与病毒样颗粒结合，该共价键是非肽键，分别产生有序且重复的阵列和MelanA肽类似物-VLP偶联物。这种MelanA肽类似物阵列和偶联物一般且优选地分别具有重复且有序的结构，因为至少一种MelanA肽类似物以定向方式与VLP结合。优选地，等于及超过120个、更优选等于及超过180个、更优选超过270个、更优选等于及超过360个本发明的MelanA肽与VLP结合。所述至少一种MelanA肽类似物与VLP的定向及明确的结合和附着确保了重复且有序的MelanA肽类似物-VLP阵列和偶联物的分别形成，这在下文中将是显而易见的。而且，VLP固有的典型高度重复且组织化的结构有助于以高度有序且重复的方式展示MelanA肽类似物，分别产生高度组织化且重复的MelanA肽类似物-VLP阵列和偶联物。
因此，本发明优选的偶联物和阵列与现有技术中偶联物的不同在于高度组织化的结构、大小和抗原在阵列表面上的重复性。本发明优选的实施方案还允许该颗粒在保证VLP正确折叠和装配的表达宿主中表达，然后抗原，即至少一种本发明的MelanA肽类似物，进一步与之偶联。
本发明公开了本发明的MelanA肽类似物与VLP结合或连接的方法。如上所述，在本发明的一个方面，通过化学交联，一般且优选地通过使用异双功能交联剂，将至少一种本发明的MelanA肽类似物与VLP结合。有几种异双功能交联剂在本领域公知。在优选实施方案中，异双功能交联剂含有能够与优选的第一附着位点(即VLP或至少一个VLP亚单位的赖氨酸残基的侧链氨基)反应的一个官能团，和能够与优选的第二附着位点(即与本发明的MelanA肽类似物融合的、并且可选地也可通过还原用于反应的半胱氨酸残基)反应的另一个官能团。该方法的第一步，一般被称为衍生化，是VLP与交联剂反应。反应产物是活化的VLP，也被称为活化载体。第二步，使用常用方法如凝胶过滤或透析除去未反应的交联剂。第三步，本发明的MelanA肽类似物与活化的VLP反应，该步骤一般被称为偶联步骤。未反应的MelanA肽类似物可选地可在第四步除去，例如通过透析。有几种异双功能交联剂在本领域公知。其中包括优选的交联剂SMPH(Pierce)、Sulfo-MBS、Sulfo-EMCS、Sulfo-GMBS、Sulfo-SIAB、Sulfo-SMPB、Sulfo-SMCC、SVSB、SIA和例如可从Pierce Chemical Company(Rockford，IL，USA)获得的其它交联剂，其含有一个对氨基有反应性的官能团和一个对半胱氨酸残基有反应性的官能团。上述交联剂均导致硫醚键的形成。适用于实施本发明的另一类交联剂的特征在于偶联时在MelanA肽类似物与VLP之间引入二硫键。属于这一类的优选交联剂包括，例如SPDP和Sulfo-LC-SPDP(Pierce)。交联剂衍化VLP的程度可受不同实验条件的影响，如反应双方各自的浓度、一种试剂相对于另一种的过量、pH、温度和离子强度。偶联程度，即每个VLP亚单位上抗原或抗原决定簇的量，可通过改变上述实验条件来调节，以满足疫苗的要求。
抗原或抗原决定簇与VLP的一种特别有利的结合方法是VLP表面的赖氨酸残基与本发明的MelanA肽类似物上的半胱氨酸残基连接。在某些实施方案中，含有半胱氨酸残基作为第二附着位点或作为其一部分的氨基酸接头与本发明的MelanA肽类似物的融合、偶联、附着或结合，可能是与VLP偶联所必需的。含有所述氨基酸接头的这些构建体也可以利用本领域公知的简单肽合成方法获得。
因此，在本发明的一个进一步优选的实施方案中，抗原或抗原决定簇进一步包含氨基酸接头，其中优选地该氨基酸接头包含或由第二附着位点组成。
柔性的氨基酸接头通常是有利的。氨基酸接头的例子选自(a)CGG；(b)N-端γ1-接头；(c)N-端γ3-接头；(d)Ig铰链区；(e)N-端甘氨酸接头；(f)(G)kC(G)n，其中n＝0-12，k＝0-5；(g)N-端甘氨酸-丝氨酸接头；(h)(G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n，其中n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2(SEQ ID NO62)；(i)GGC；(k)GGC-NH2；(l)C端γ1-接头；(m)C-端γ3-接头；(n)C-端甘氨酸接头；(o)(G)nC(G)k，其中n＝0-12，k＝0-5；(p)C-端甘氨酸-丝氨酸接头；(q)(G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k，其中n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2，o＝0-8(SEQ ID NO63)。
氨基酸接头的其它实例包括免疫球蛋白的铰链区、甘氨酸丝氨酸接头(GGGGS)n(SEQ ID NO64)和甘氨酸接头(G)n，它们均还含有半胱氨酸残基作为第二附着位点，并且可选地含有另外的甘氨酸残基。这类氨基酸接头的典型优选实例是N-端γ1CGDKTHTSPP(SEQ IDNO65)；C-端γ1DKTHTSPPCG(SEQ ID NO66)；N-端γ3CGGPKPSTPPGSSGGAP(SEQ ID NO67)；C-端γ3PKPSTPPGSSGGAPGGCG(SEQ ID NO68)；N-端甘氨酸接头GCGGGG(SEQ ID NO69)；C-端甘氨酸接头GGGGCG(SEQ ID NO70)；C-端甘氨酸-赖氨酸接头GGKKGC(SEQ ID NO71)；N-端甘氨酸-赖氨酸接头CGKKGG(SEQ ID NO72)。
当疏水性抗原或抗原决定簇与VLP结合时，特别适于本发明实施的其它氨基酸接头有作为N-端接头的CGKKGG(SEQ ID NO73)或CGDEGG(SEQ ID NO74)，或者作为C-端接头的GGKKGC(SEQID NO75)和GGEDGC(SEQ ID NO76)。对于C-端接头，末端半胱氨酸可选地被C端酰胺化。
可用于本发明的其它接头有允许从VLP上释放抗原性肽，即人黑素瘤MelanA肽类似物的氨基酸序列。这些接头的实例在Toes RE etal.J Exp Med.2001 Jul 2；194(1)1-12中有描述。而且，可以使用用于蛋白酶体切割的PAProC-a预测算法(Nussbaum AK，et al.Immunogenetics.2001 Mar；53(2)87-94)来预测上述允许从VLP上释放抗原性肽，即人黑素瘤MelanA肽类似物的氨基酸序列。
在本发明的优选实施方案中，优选肽C-端的GGCG(SEQ ID NO77)、GGC或GGC-NH2(“NH2”表示酰胺化)接头或肽N-端的CGG作为氨基酸接头。甘氨酸残基通常插入大氨基酸与作为第二附着位点的半胱氨酸之间，以避免较大氨基酸在偶联反应中的可能的空间位阻。在本发明的最优选的实施方案中，氨基酸接头GGC-NH2与本发明的MelanA肽类似物的C-端融合。
添加到本发明的MelanA肽类似物上的半胱氨酸残基必须是还原状态，才能与活化的VLP上的异双功能交联剂反应，即必须有游离半胱氨酸或含有游离巯基的半胱氨酸残基。当作为结合位点的半胱氨酸残基是氧化形式时，例如，如果它形成二硫键，则需要用例如DTT、TCEP或β-巯基乙醇还原该二硫键。如WO 02/05690所述，低浓度还原剂适于偶联，技术人员应当知道，较高浓度还原剂抑制偶联反应，在这种情况下必须在偶联前除去还原剂，或者降低其浓度，例如通过透析、凝胶过滤或反相HPLC。
根据上述优选方法，利用异双功能交联剂使本发明的MelanA肽类似物与VLP结合，可使本发明的MelanA肽类似物与VLP以定向方式偶联。本发明的MelanA肽类似物与VLP结合的其它方法包括使用碳二亚胺EDC和NHS将本发明的MelanA肽类似物与VLP交联的方法。另外一些方法使用同双功能交联剂，如戊二醛、DSG、BM[PEO]4、BS3(Pierce Chemical Company，Rockford，IL，USA)或含有对VLP的胺基或羧基具有反应性的官能团的其它公知的同双功能交联剂，将本发明的MelanA肽类似物附着于VLP。
VLP与本发明的MelanA肽类似物结合的其它方法包括将VLP生物素化、并且将本发明的MelanA肽类似物表达为链亲和素-融合蛋白的方法，或本发明的MelanA肽类似物和VLP均被生物素化的方法，如WO 00/23955所述。在这种情况下，可以通过调节本发明的MelanA肽类似物与链亲和素的比例，首先使本发明的MelanA肽类似物与链亲和素或亲和素结合，并且使得仍有自由结合位点可与下一步添加的VLP结合。或者，所有成分也可以混合在“一锅”反应中。存在受体和配体的可溶形式、并且能够与VLP或本发明的MelanA肽类似物交联的其它配体-受体对也可以用作结合本发明的MelanA肽类似物与VLP的结合剂。或者，配体或受体可以与本发明的MelanA肽类似物融合，从而介导与分别化学结合或融合于该受体或配体的VLP的结合。也可以通过插入或置换实现融合。
如前所述，在本发明的一个优选实施方案中，VLP是RNA噬菌体的VLP，在一个更优选的实施方案中，VLP是RNA噬菌体Qβ外壳蛋白的VLP。
如果空间上允许，一个或几个抗原分子，即一个或几个抗原或抗原决定簇，能够附着于RNA噬菌体外壳蛋白的衣壳或VLP的一个亚单位上，优选地通过RNA噬菌体VLP的暴露赖氨酸残基附着。RNA噬菌体外壳蛋白的VLP，特别是Qβ外壳蛋白VLP的一个特殊特征是每个亚单位能够偶联几个抗原。这能够产生密集的抗原阵列。
在本发明的一个优选实施方案中，所述至少一种本发明的MelanA肽类似物与病毒样颗粒的结合和附着分别是通过病毒样颗粒的至少一个第一附着位点与本发明的MelanA肽类似物的至少一个第二附着位点之间的相互作用和连接实现的。
Qβ外壳蛋白的VLP或衣壳在其表面展示数量确定的赖氨酸残基，具有确定的拓扑学，有3个赖氨酸残基指向衣壳内部，并与RNA相互作用，另外4个赖氨酸残基暴露于衣壳外面。这些明确的特性有利于抗原附着于颗粒外部，而不是赖氨酸残基与RNA相互作用的颗粒内部。其它RNA噬菌体外壳蛋白的VLP在其表面也有数量确定的赖氨酸残基，这些赖氨酸残基有确定的拓扑学。
在本发明的进一步优选的实施方案中，第一附着位点是赖氨酸残基，并且/或者第二附着位点包含巯基或半胱氨酸残基。在本发明的一个非常优选的实施方案中，第一附着位点是赖氨酸残基，并且第二附着位点是半胱氨酸残基。
在本发明的一个非常优选的实施方案中，本发明的MelanA肽类似物通过半胱氨酸残基与RNA噬菌体外壳蛋白VLP的赖氨酸残基结合，特别是与Qβ外壳蛋白的VLP结合。
来源于RNA噬菌体的VLP的另一个优点是它们在细菌中的高表达量，这允许以较低的成本生产大量的物质。
如上所述，本发明的偶联物和阵列分别与现有技术中偶联物的不同在于高度组织化的结构、大小以及抗原在阵列表面上的重复性。而且，用VLP作为载体可以分别形成具有不同抗原密度的庞大的抗原阵列和偶联物。特别是，使用RNA噬菌体的VLP，尤其是使用RNA噬菌体Qβ外壳蛋白的VLP，能够获得极高的表位密度。具体而言，将肽(例如WO2004/016282所述的人Aβ1-6肽)与Qβ外壳蛋白的VLP偶联，能够获得每个亚单位1.5个以上表位的密度。具有高表位密度的RNA噬菌体外壳蛋白VLP组合物的制备可以根据本申请的教导来实现。在本发明的优选实施方案中，当本发明的MelanA肽类似物与Qβ外壳蛋白的VLP偶联时，每个亚单位上本发明的MelanA肽类似物的平均数量为0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或更高是优选的。
如此处定义的第二附着位点可以是本发明的MelanA肽类似物天然存在或非天然存在的。如果本发明的MelanA肽类似物上没有合适的天然存在的第二附着位点，则必须为该抗原构建非天然的第二附着位点。
如上所述，有4个赖氨酸残基暴露于Qβ外壳蛋白的VLP表面。这些残基一般在与交联剂分子反应时被衍化。如果不是所有的暴露赖氨酸残基都能与抗原偶联，则已经与交联剂反应的赖氨酸残基在衍化步骤后ε-氨基连接交联剂分子。这使得一个或几个正电荷丢失，这可能不利于VLP的可溶性和稳定性。通过用精氨酸代替一些赖氨酸残基，如在下文所述的Qβ外壳蛋白突变体中的那样，我们防止了正电荷的过多丢失，因为精氨酸残基不与交联剂反应。而且，用精氨酸置换赖氨酸残基可产生更明确的抗原阵列，因为有更少的位点可以与抗原反应。
因此，在本申请公开的下列Qβ外壳蛋白突变体和突变QβVLP中，用精氨酸替换了暴露的赖氨酸残基Qβ-240(Lys13-Arg；SEQ IDNO20)、Qβ-250(Lys2-Arg，Lys13-Arg；SEQ ID NO22)和Qβ-259(Lys2-Arg，Lys16-Arg；SEQ ID NO24)。克隆了这些构建体，表达了蛋白质，纯化了VLP，并用于与本发明的MelanA肽类似物偶联。也构建了Qβ-251(SEQ ID NO23)，在本申请中能够找到如何表达、纯化和偶联Qβ-251外壳蛋白VLP的指南。
在另一个实施方案中，我们公开了含有一个额外赖氨酸残基的Qβ突变外壳蛋白，它适用于获得更高密度的抗原阵列。克隆该突变Qβ外壳蛋白Qβ-243(Asn10-Lys；SEQ ID NO21)，表达蛋白质，分离并纯化衣壳或VLP，表明该额外赖氨酸残基的引入与亚单位自装配为衣壳或VLP相容。因此，可以用Qβ外壳蛋白突变体的VLP分别制备MelanA肽类似物阵列和偶联物。抗原与VLP、特别是与RNA噬菌体外壳蛋白VLP附着的一种特别优选的方法是将RNA噬菌体外壳蛋白VLP表面的赖氨酸残基与添加于抗原中的半胱氨酸残基连接。为了使半胱氨酸残基能够有效地作为第二附着位点，必须有一个巯基能用来偶联。因此，半胱氨酸残基必须是还原状态，即，必须有游离半胱氨酸或含有游离巯基的半胱氨酸残基。如果作为第二附着位点的半胱氨酸残基是氧化形式，例如，如果它形成二硫键，则需要使用如DTT、TCEP或β-巯基乙醇还原该二硫键。必须为每种抗原调节还原剂的浓度和还原剂超过抗原的摩尔数。必要时需要检测滴定范围，从低至10μM或更低到可达10-20mM或更高的还原剂浓度，并评价抗原与载体的偶联。尽管如WO 02/056905所述，低浓度还原剂适于偶联反应，较高浓度抑制偶联反应，但是本领域技术人员应当知道，在这种情况下必须除去还原剂或降低其浓度，例如通过透析、凝胶过滤或反相HPLC来实现。有利地，透析或平衡缓冲液的pH低于7，优选6。必须检测低pH缓冲液与抗原活性或稳定性的相容性。
通过选择交联剂和其它反应条件，能够调节RNA噬菌体外壳蛋白VLP上的表位密度。例如，交联剂Sulfo-GMBS和SMPH一般能够获得高表位密度。高浓度反应物正面影响衍生化，可以通过控制反应条件来控制与RNA噬菌体外壳蛋白VLP偶联、特别是与Qβ外壳蛋白VLP偶联的抗原数量。
在设计非天然的第二附着位点之前，必须选择融合、插入或通常构建的位置。第二附着位点的位置选择例如可以以抗原的晶体结构为基础。抗原的这种晶体结构可以提供关于分子C端或N端的可用性(例如取决于它们的溶剂可及性)或关于适于作为第二附着位点的残基(如半胱氨酸残基)暴露于溶剂的信息。如Fab片段那样，暴露的二硫键也可以是第二附着位点的来源，因为通过用例如2-巯基乙胺、TCEP、β-巯基乙醇或DTT温和还原，通常可以将它们转化为单个半胱氨酸残基。选择不影响抗原免疫原性的温和还原条件。如果用自身抗原免疫旨在抑制该自身抗原与其天然配体的相互作用，通常添加第二附着位点以产生针对与天然配体相互作用的位点的抗体。因此，第二附着位点的位置选择要避免第二附着位点或含有它的任何氨基酸接头引起的空间位阻。在其它一些实施方案中，希望有针对一个位点的抗体应答，该位点不同于自身抗原与其天然配体的相互作用位点。在这些实施方案中，可选择第二附着位点，以防止产生针对自身抗原与其天然配体的相互作用位点的抗体。
选择第二附着位点位置的其它标准包括抗原的寡聚状态，寡聚位点，辅因子的存在，以及揭示抗原结构和序列中位点的实验证据的可获得性，在该位点对该抗原的修饰与自身抗原的功能相容，或者适于产生可识别自身抗原的抗体。
在非常优选的实施方案中，本发明的MelanA肽类似物包含添加的单一的第二附着位点或单一的反应性附着位点，该位点分别能够与核心颗粒和VLP或VLP亚单位上的第一附着位点连接。这进一步确保至少有一个、但一般是一个以上、优选超过10、20、40、80、120、150、180、210、240、270、300、360、400、450个本发明的MelanA肽类似物分别与核心颗粒和VLP明确且均一地结合和连接。因此，抗原上含有单一的第二附着位点或单一的反应性附着位点确保了类型单一且均匀的结合和连接，分别产生高度有序且重复的阵列。例如，如果分别通过赖氨酸-(作为第一附着位点)和半胱氨酸-(作为第二附着位点)相互作用来实现结合和连接，根据本发明的这一优选实施方案，确保了每个抗原只有一个半胱氨酸残基能够分别与VLP和核心颗粒的第一附着位点结合和连接，而无论该半胱氨酸残基是抗原上天然存在的还是非天然存在的。
在某些实施方案中，向本发明的MelanA肽类似物上构建第二附着位点需要根据本发明的公开内容融合含有适于作为第二附着位点的氨基酸的氨基酸接头。因此，在本发明的一个优选实施方案中，氨基酸接头通过至少一个共价键与本发明的MelanA肽类似物结合。优选地，该氨基酸接头包含或由第二附着位点组成。在一个进一步优选的实施方案中，氨基酸接头包含巯基或半胱氨酸残基。在另一个优选实施方案中，该氨基酸接头是半胱氨酸。一些选择氨基酸接头的标准以及根据本发明的氨基酸接头的进一步优选实施方案在上文中已经提及。
在本发明的另一个具体实施方案中，附着位点选择为与HBcAg框内融合的赖氨酸或半胱氨酸残基。在一个优选实施方案中，抗原通过三亮氨酸接头与HBcAg的C端融合。
当抗原或抗原决定簇通过赖氨酸残基与VLP连接时，有利的是置换或删除一个或多个天然存在的赖氨酸残基，以及HBcAg变体中存在的其它赖氨酸残基。
在许多情况下，当天然存在的赖氨酸残基被去除时，向HBcAg内引入另一个赖氨酸作为抗原或抗原决定簇的附着位点。插入赖氨酸残基的方法在本领域公知。也可以在不除去已有赖氨酸残基的情况下添加赖氨酸残基。
已经证明HBcAg的C端可引导该蛋白质的核定位(Eckhardt，et al.，J.Virol.65575-582(1991))。而且也认为该蛋白质的这一区域使HBcAg具有结合核酸的能力。
如上所述，适于在本发明的实施中使用的HBcAg还包括N端截短突变体。合适的截短突变体包括已经从N端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸的修饰HBcAg。然而，在组成病毒样颗粒的亚单位序列内含有内部缺失的病毒样颗粒变体也适用于本发明，只要它们与病毒样颗粒的有序或颗粒状结构相容。例如，HBcAg序列内的内部缺失是适宜的(Preikschat，P.，et al.，J.Gen.Virol.801777-1788(1999))。
适于在本发明的实施中使用的其它HBcAg包括N端和C端截短突变体。合适的截短突变体包括已经从N端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15和17个氨基酸、并从C端除去1、5、10、15、20、25、30、34、35、36、37、38、39、40、41、42或48个氨基酸的HBcAg。
本发明的疫苗组合物可包含不同HBcAg的混合物。因此，这些疫苗组合物可以由氨基酸序列不同的多种HBcAg组成。例如，可以制备包含“野生型”HBcAg和其中一个或多个氨基酸残基已经改变(例如缺失、插入或置换)的修饰HBcAg的疫苗组合物。然而在大多数应用中，只使用一种类型的HBcAg。
在一个优选实施方案中，病毒样颗粒包含至少一个第一附着位点，且抗原或抗原决定簇包含至少一个第二附着位点。优选地，该第一附着位点包含或优选由氨基或赖氨酸残基组成。该第二附着位点优选选自(a)所述抗原或抗原决定簇中非天然存在的附着位点；和(b)所述抗原或抗原决定簇中天然存在的附着位点。再更优选地，该第二附着位点包含或者优选地由巯基或半胱氨酸残基组成。在一个优选实施方案中，抗原或抗原决定簇与病毒样颗粒的结合是通过第一附着位点和第二附着位点的连接实现的，其中优选地这种连接是通过至少一个非肽键实现的，并且其中优选地，抗原或抗原决定簇和病毒样颗粒通过所述连接相互作用，形成有序且重复的抗原阵列。在一个实施方案中，第一附着位点是赖氨酸残基，第二附着位点是半胱氨酸残基。在另一个实施方案中，第一附着位点是氨基，第二附着位点是巯基。
在本发明的一个具体实施方案中，抗原，在此特别指黑素瘤MelanA肽类似物，包含一种或多种细胞毒性T细胞表位、Th细胞表位或这两种表位的组合。因此，在一个实施方案中，抗原或抗原决定簇包含一种、两种或多种细胞毒性T细胞表位。在另一个实施方案中，抗原或抗原决定簇包含一种、两种或多种Th细胞表位。在另一个实施方案中，抗原或抗原决定簇包含一种、两种或多种细胞毒性T细胞表位和一种、两种或多种Th细胞表位。
天然MelanA/Mart-1表位，例如MelanA/Mart-126-35表位，只与人HLA-2低亲和力结合。因此，接种后天然MelanA表位和肽的分别体内呈递可能是一个限制因素。如果分别与VLP结合、偶联或融合的Melan A表位和肽用于接种，这特别重要，因为在这些条件下，MelanA肽通过交叉呈递携带HLA分子。但是，交叉呈递的过程不象传统抗原呈递途径那样有效，MelanA肽对HLA的亲和力甚至更重要。因此，对于基于VLP的接种，非常优选地是使用可与HLA相对高亲和力结合的MelanA肽类似物。同样，使用可被宿主的天然T细胞所有组成成分(repertoire)以较高亲和力识别的MelanA肽类似物也可能是有利的。一般来说，在适当位点含有锚定残基从而允许与MHC分子有效结合的MelanA表位和肽类似物分别是优选的。
因此，本发明的另一个方面和本发明的一个非常优选的实施方案提供一种增强动物中免疫应答的组合物，该组合物包含(a)病毒样颗粒；和(b)免疫刺激物，其中所述免疫刺激物与所述病毒样颗粒结合，并且其中所述组合物进一步包含至少一种抗原或抗原决定簇，其中所述抗原或抗原决定簇与所述病毒样颗粒结合，并且其中至少一种抗原或抗原决定簇包含、或基本由、或由人黑素瘤MelanA肽类似物组成，并且其中所述人黑素瘤MelanA肽类似物与所述病毒样颗粒结合。
在本发明的一个优选实施方案中，MelanA肽类似物能够允许与MHC分子有效结合。因此，MelanA肽类似物的使用特别能够允许引入这种导致改善与MHC分子结合的锚定残基。如果天然和正常的MelanA肽类似物分别不含这种锚定残基，或者只是不含次于新引入的锚定残基的锚定残基，以分别代替天然和正常的锚定残基，引入导致改善与MHC分子结合的锚定残基是特别有利的。
产生MelanA肽类似物的正常人MelanA肽的修饰，优选这些锚定残基的引入，如下实现(i)诱导突变(例如化学诱导、照射或本领域技术人员公知的其它方法)，然后筛选与MHC的结合改善的修饰肽，或者(ii)筛选与MHC的结合改善的修饰肽，这种改善是由于在蛋白质合成的任何水平上发生的天然突变引起的，包括但不限于在蛋白质表达的DNA、转录、RNA或翻译水平上发生的突变，或者(iii)使用本领域技术人员公知的经典的肽合成法，进行系统或随机氨基酸交换、缺失、置换或插入。这些锚定残基的鉴定一般且优选地使用如Rammensee et al.in Immunogenetics 50213-219(1999)所述的SYFPEITHI数据库来实现。SYFPEITHI数据库允许计算选择的任何肽的HLA结合效率，并且能够利用该程序在HLA结合效率方面对肽进行优化。此外，优选肽类似物的鉴定也能够通过MHC-肽结合测定来实现，包括但不限于突变细胞系中T细胞活化或识别或MHC上调的全细胞测定，MHC-四聚体-肽结合测定，使用标记肽的竞争性结合测定，表面等离共振测定，这些都是本领域技术人员公知的。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，MelanA肽类似物的特征在于相对于相应的正常MelanA肽有两个，更优选一个氨基酸置换。
在本发明的另一个优选实施方案中，MelanA肽类似物受到保护而免遭蛋白酶或肽酶介导的降解。使用受到保护而免遭蛋白酶或肽酶降解的MelanA肽类似物导致在对患者施用该肽后肽的体内稳定性提高，并且/或者在存在蛋白酶或肽酶的贮存过程中肽的稳定性提高。这种稳定性提高的后果是人黑素瘤MelanA肽类似物在MHC上更有效的、延长的呈递，从而提高特异性T细胞应答的刺激。
优选地，通过将选择的天然人MelanA肽的氨基酸残基置换为如Blanchet et al，J.Immunol.1675852-5861(2001)和此处引用的参考文献所举例说明的非天然氨基酸衍生物，保护人MelanA肽类似物。这克服了通常由于以下事实造成的限制分别与天然和正常的MelanA肽相比，化学修饰的MelanA肽和MelanA肽类似物可能不被T细胞同样好地识别。
在另一个优选实施方案中，所述抗原包含、或者基本由、或者由人黑素瘤MelanA/MART-1肽类似物组成，该肽类似物具有选自但不限于下列的氨基酸序列(a)LAGIGILTV(SEQ ID NO84)，(b)MAGIGILTV(SEQ ID NO85)，(c)EAMGIGILTV(SEQ ID NO86)，(d)ELAGIGILTV(SEQ ID NO50)，(e)EMAGIGILTV(SEQ ID NO87)，(f)YAAGIGILTV(SEQ ID NO88)，(g)FAAGIGILTV(SEQ ID NO89)，(h)GHGHSYTTAE ELAGIGILTV(SEQ ID NO51)，(i)SYTTAEELAGIGILTVILGVL(SEQ ID NO52)，和(j)ELAGIGILTVILGVL(SEQ ID NO53)。在一个非常优选的实施方案中，所述抗原包含、或基本由、或由人黑素瘤MelanA/MART-1肽类似物组成，该肽类似物具有选自但不限于下列的氨基酸序列(a)LAGIGILTV(SEQ ID NO84)，(b)MAGIGILTV(SEQ ID NO85)，(c)EAMGIGILTV(SEQ ID NO86)，(d)ELAGIGILTV(SEQ ID NO50)，(e)EMAGIGILTV(SEQ ID NO87)，(f)YAAGIGILTV(SEQ ID NO88)，和(g)FAAGIGILTV(SEQ ID NO89)。这些肽类似物以及它们的合成已经被Valmori at al.，J.Immunol.1601750-1758(1998)描述。这些肽类似物显示被针对天然黑素瘤肽的5个不同细胞毒性T细胞克隆的相对识别和靶细胞裂解提高。
在本发明的一个非常优选的实施方案中，人黑素瘤MelanA/MART-1肽类似物包含、或者基本由、或者由序列ELAGIGILTV(SEQ ID NO50)组成。如整个实施例部分所述，这一非常优选的实施方案在HLA-A2转基因小鼠中诱导功能性MelanA-特异性CD8+T细胞的扩增，代表HLA-结合与TCR-识别之间良好的折衷(参见Valmori at al.，J.Immunol.1601750-1758(1998))。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，带有第二附着位点的人黑素瘤MelanA/MART-1肽类似物具有选自但不限于下列的氨基酸序列(a)CGHGHSYTTAE EAAGIGILTV(SEQ ID NO54)；在此一般缩写为16-35，(b)CGHGHSYTTAEELAGIGILTV(SEQ ID NO55)；在此一般缩写为MelanA 16-35A/L)，(c)CGGEAAGIGILTV(SEQ IDNO56)；在此一般缩写为MelanA 26-35，(d)CGGELAGIGILTV(SEQID NO57)；在此一般缩写为MelanA 26-35A/L)，(e)CSYTTAEELAGIGILTVILGVL(SEQ ID NO58)；在此一般缩写为MelanA 20-40A/L)，(f)CGGELAGIGILTVILGVL(SEQ ID NO59)；在此一般缩写为MelamA 26-40A/L)，(g)ELAGIGILTVGGC(SEQ IDNO60)；在此一般缩写为MelanA 26-35-C A/L)，(h)CSPKSLELAGIGILTV(SEQ ID NO92)；在此一般缩写为CSPKSL-MelanA 26-35A/L；和(i)ELAGIGILTVILGVLGGC(SEQ IDNO93)；在此一般缩写为MelanA 26-40-C A/L。在本发明的一个非常优选的实施方案中，带有第二附着位点的人黑素瘤MelanA/MART-1肽类似物具有选自下列的氨基酸序列(a)CGHGHSYTTAEELAGIGILTV(SEQ ID NO55)；在此一般缩写为MelanA 16-35A/L)，(b)CGGELAGIGILTV(SEQ ID NO57)；在此一般缩写为MelanA 26-35A/L)，(c)CSYTTAEELAGIGILTVILGVL(SEQID NO58)；在此一般缩写为MelanA 20-40A/L)，(d)CGGELAGIGILTVILGVL(SEQ ID NO59)；在此一般缩写为MelanA26-40A/L)，(e)ELAGIGILTVGGC(SEQ ID NO60)；在此一般缩写为MelanA 26-35-C A/L)。
在本发明的另一个非常优选的实施方案中，带有第二附着位点的人黑素瘤MelanA/MART-1肽类似物具有氨基酸序列CGHGHSYTTAEELAGIGILTV(SEQ ID NO55)(MelanA 16-35A/L)。如实施例21所述，含有这种非常优选的实施方案的本发明的疫苗组合物，即QβMelanA 16-35A/L疫苗，被树突细胞加工。
在本发明的另一个实施方案中，与病毒样颗粒偶联、融合或以其它方式附着的本发明的MelanA肽类似物是T细胞表位，该表位是细胞毒性的或是Th细胞表位。在一个进一步优选的实施方案中，所述抗原是至少两种相似或不同的、优选不同的表位的组合，其中所述至少两种表位直接连接或通过连接序列连接。这些表位优选地选自对于黑素瘤所述的细胞毒性和Th细胞表位(gp100、酪氨酸酶、MAGE家族或NY-ESO-1)。
因此，在本发明的一个进一步优选的实施方案中，所述抗原包含或进一步包含细胞毒性T细胞表位、Th细胞表位或至少两种所述表位的组合，其中所述至少两种表位直接结合或者通过连接序列结合，并且其中优选地所述细胞毒性T细胞表位是病毒或肿瘤细胞毒性T细胞表位。
优选的细胞毒性T细胞表位有MelanA表位(16-36 A/L)(25-36A/L)；酪氨酸酶表位(1-9)和(368-376)(Panelli，M.C.et al.，J.Immunol.，2000，164，495-504)；Gp100表位(154-162)，(209-217(T210M))，(280-288)和(280-288(A288V))和(457-466)(Nielsen，M.B.et al.，2000.J Immunol.，164(4).，2287-96和Linette，G P.et al.J Immunol，2000，164，3402-3412和Skipper，J.C.，Int.J.Cancer，1999，82，669-677和Pass，H.A.，et al.，Cancer J Sci Am.，1998，4，316-323)；TRP2表位(180-188)(288-296)(455-463)(Sun，Y.et al.，Int.J Cancer，2000，87(3)，399-404和Parkhurst，M.R.et al.，Cancer Res.，1998，58，4895-8901和Harada，M.，et al.，Cancer Res.，2001，61，1089-1094))；NY-ESO-1表位157-165(Chen，J.L.，et al.，J.Immunol，2000，165，948-955)；和MAGE-A表位(248V9)(Graff-Dubois，S.，et al.，2002，J.Immunol，169，575-580)。
一个优选的细胞毒性T细胞表位组合是组合(25-36A/L)，酪氨酸酶(368-376)，Gp100(209-217(T210M))和(457-466)，和NY-ESO-1(157-165)。
优选的Th细胞表位有Mage-3表位(281-295)，(141-155)和(146-160)(Kobayashi，H.，et al.，Cabcer Res.，2001，61，4773-4778)；酪氨酸酶表位(188-208)，(193-203)(Kobayashi H.，et al.，Immunogenetics，1998，47，398-403)；GP 100表位(44-59)；和NY-ESO-1表位(115-132)，(121-138)，(139-156)，(119-143)和(134-148)(Zarour，H.M.，et al.，Cancer Res.，2002，62，213-218)。
优选的细胞毒性和Th细胞表位的组合有MelanA表位(1-118A/L)(SEQ ID NO94)；NY-ESO-1表位115-165；或MelanA(25-36A7L)、gp100(209-217(T210M)、Mage-3(146-160)和gap100(44-59)的组合。
同样应当理解，本发明范围内也包括镶嵌病毒样颗粒，例如由分别与不同抗原和表位附着的亚单位组成的病毒样颗粒。本发明的这种组合物可以如下获得例如，用两种相容的质粒转化大肠杆菌，这两种质粒分别编码与不同抗原和表位融合的组成病毒样颗粒的亚单位。在此情况中，镶嵌病毒样颗粒在细胞中直接装配或者在细胞裂解后装配。而且，通过将不同抗原和表位的混合物与分离的病毒样颗粒附着，也可以获得本发明的这种组合物。
本发明的MelanA肽类似物，特别是所述表位，可以被合成或重组表达，并且与病毒样颗粒偶联，或利用重组DNA技术与病毒样颗粒融合。抗原与病毒样颗粒附着的典型方法公开在WO 00/32227、WO 01/85208和WO 02/056905中，其公开内容在此完整地引用作为参考。
本发明也提供一种制备用于增强动物中免疫应答的组合物的方法，该组合物包含VLP和与VLP结合的免疫刺激物、优选含非甲基化CpG的寡核苷酸，该方法包括将VLP分别与免疫刺激物和寡核苷酸孵育，添加RNase，并纯化该组合物。优选地，该方法进一步包括抗原或抗原决定簇与该病毒样颗粒结合的步骤，其中所述抗原包含、或者基本由、或者由人黑素瘤MelanA肽类似物组成。在一个优选实施方案中，在病毒样颗粒与免疫刺激物孵育之前，抗原或抗原决定簇与病毒样颗粒结合。在另一个优选实施方案中，在纯化该组合物后，抗原或抗原决定簇与病毒样颗粒结合。在一个同样优选的实施方案中，该方法包括将VLP与RNase一起孵育，分别添加免疫刺激物和寡核苷酸，并纯化该组合物。优选地，该方法进一步包括结合抗原或抗原决定簇与所述病毒样颗粒的步骤，其中所述抗原包含、或者基本由、或者由人黑素瘤MelanA肽类似物组成。在一个优选实施方案中，在病毒样颗粒与RNase孵育之前，抗原或抗原决定簇与病毒样颗粒结合。在另一个优选实施方案中，在纯化该组合物后，抗原或抗原决定簇与病毒样颗粒结合。在一个实施方案中，VLP在细菌表达系统中产生。在另一个实施方案中，RNase是RNase A。
本发明进一步提供一种制备用于增强动物中免疫应答的组合物的方法，该组合物包含与免疫刺激物、优选与含非甲基化CpG的寡核苷酸结合的VLP，该方法包括解装配VLP，分别添加免疫刺激物和寡核苷酸，以及重装配VLP。该方法可进一步包括除去解装配的VLP的核酸，以及/或者在重装配后纯化该组合物。优选地，该方法进一步包括将抗原或抗原决定簇与病毒样颗粒结合的步骤，其中所述抗原包含、或者基本由、或者由人黑素瘤MelanA肽类似物组成。在一个优选实施方案中，在解装配病毒样颗粒之前，抗原或抗原决定簇与病毒样颗粒结合。在另一个优选实施方案中，在重装配病毒样颗粒之后，优选地在纯化该组合物之后，抗原或抗原决定簇与病毒样颗粒结合。
本发明也提供可用于预防和/或缓解疾病或状况的疫苗组合物。本发明的疫苗组合物包含、或者由免疫有效量的本发明的免疫增强组合物以及药学可接受的稀释剂、载体或赋形剂组成。该疫苗可选地也可含有佐剂。
因此，在一个优选实施方案中，本发明提供一种疫苗，该疫苗包含免疫有效量的本发明的免疫应答增强组合物，以及药学可接受的稀释剂、载体或赋形剂，其中该组合物含有(a)病毒样颗粒；(b)至少一种免疫刺激物；和(c)至少一种抗原或抗原决定簇；其中该抗原或抗原决定簇与该病毒样颗粒结合，并且其中该免疫刺激物与该病毒样颗粒结合，并且其中该抗原包含、或者基本由、或者由人黑素瘤MelanA肽类似物组成。优选地，该疫苗进一步含有佐剂。
本发明还提供用来预防和/或缓解动物疾病或状况的接种方法。在一个实施方案中，本发明提供用于预防多种动物物种，特别是哺乳动物，如人、猴、牛、狗、猫、马、猪等，优选人的癌症的疫苗。该疫苗可以设计为治疗所有类型的癌症，优选黑素瘤。
众所周知，使用蛋白质或病毒进行的同源引发-加强(prime-boost)接种策略大多数通常是不成功的。先前存在的抗体在重新遇到抗原时，被认为干扰记忆应答的诱导。令我们吃惊的是，在同源引发-加强接种程序中，RNA噬菌体来源的VLP，特别是来源于Qβ的VLP，非常有效地诱导记忆CD8+T细胞应答。相反，如实施例26所述，活痘苗病毒免疫在诱导初次CD8+T细胞应答方面无效，而用牛痘进行同源加强几乎不引起记忆CD8+T细胞的扩增。
因此，在另一方面，本发明提供一种免疫或治疗动物的方法，该方法包括通过施用免疫有效量的本发明的疫苗而在动物中引发T细胞应答。优选地，该方法进一步包括加强动物中的免疫应答的步骤，其中优选地这种加强是通过施用免疫有效量的本发明的疫苗或免疫有效量的异种疫苗来实现的，其中更优选地，所述异种疫苗是DNA疫苗、肽疫苗、重组病毒或树突细胞疫苗。
另外，在另一方面，本发明进一步提供一种免疫或治疗动物的方法，该方法包括在动物中引发T细胞应答以及加强动物中的T细胞应答的步骤，其中这种加强是通过施用免疫有效量的本发明的疫苗来实现的。优选地，这种引发是通过施用免疫有效量的本发明的疫苗或免疫有效量的异种疫苗来实现的，其中更优选地，所述异种疫苗是DNA疫苗、肽疫苗、重组病毒或树突细胞疫苗。
而且，在另一方面，本发明进一步提供一种组合物，该组合物含有病毒样颗粒、至少一种免疫刺激物和至少一种抗原或抗原决定簇；其中所述抗原或抗原决定簇与所述病毒样颗粒结合，并且其中所述免疫刺激物与所述病毒样颗粒结合，并且其中所述抗原包含细胞毒性T细胞表位、Th细胞表位或至少两种所述表位的组合，其中所述至少两种表位直接结合或者通过连接序列结合，并且其中优选地所述细胞毒性T细胞表位是病毒或肿瘤细胞毒性T细胞表位。
在另一方面，本发明提供一种通常且优选地用于增强动物中的免疫应答的组合物，该组合物含有(a)病毒样颗粒；(b)免疫刺激物；其中该免疫刺激物(b)与该病毒样颗粒(a)结合；和(c)抗原，其中该抗原与所述病毒样颗粒(a)混合，并且其中所述抗原包含、或基本由、或由人黑素瘤MelanA肽类似物组成。如此处所用的术语“混合”是指一起添加的两种或多种物质、成分或组分的组合，它们彼此不是化学结合，并且能够分开。混合抗原与病毒样颗粒的方法在WO 04/000351中有描述，该专利在此全文引用作为参考。
本领域技术人员应当理解，当对动物施用本发明的组合物时，该组合物中可以含有盐、缓冲剂、佐剂或希望用来提高组合物效力的其它物质。在大量资料中提供了适于制备药物组合物的材料的实例，包括Remington’s Pharmaceutical Sciences(Osol，A，ed.，Mack PublishingCo.，(1990))。
根据宿主物种的不同，可以用不同佐剂来增强免疫应答，包括但不限于弗氏(完全及不完全)佐剂，无机凝胶如氢氧化铝，表面活性剂如溶血卵磷脂，多聚醇(pluronic polyols)、聚阴离子、肽、油状乳剂、匙孔戚血蓝蛋白、二硝基酚，以及可能用于人的佐剂，如BCG(卡介苗)和小棒杆菌(Corynebacterium parvum)。这些佐剂是本领域公知的。可与本发明的组合物一起施用的其它佐剂包括但不限于单磷酸脂免疫调节剂、AdjuVax 100a、QS-21、QS-18、CRL1005、铝盐、MF-59和病毒体佐剂技术。佐剂也可包括这些物质的混合物。
如果接受个体能够耐受本发明的组合物的施用，则称该组合物是“药理学可接受的”。而且，本发明的组合物以“治疗有效量”施用(即产生希望的生理学效果的量)。
本发明的组合物可以通过本领域公知的多种方法施用。选择的具体方式当然取决于所选择的具体组合物、所治疗疾病的严重程度和达到治疗效果所需的剂量。一般来说，本发明的方法可以用医学上可接受的任何给药方式实施，即，产生有效水平的活性化合物而不会引起临床上不可接受的副作用的任何方式。这些给药方式包括口服、直肠、肠胃外、脑池内、阴道内、腹膜内、局部(通过粉末、软膏、液滴或透皮帖剂)、面颊或口或鼻喷雾。如此处使用的术语“肠胃外”是指包括静脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注射和输液在内的给药方式。本发明的组合物也可以直接注射到淋巴结中。
用于给药的组合物成分包括无菌水(例如生理盐水)或非水溶液和悬液。非水溶剂的例子包括丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、和注射用有机酯如油酸乙酯。可以利用载体或封闭性包衣来提高皮肤通透性并提高抗原吸收。
联合给药可以同时(例如作为混合物，或分开但同时或共同给药)或相继施用。这包括组合药剂作为治疗混合物一起施用的形式，以及组合药剂分开但同时施用的方法，例如通过不同的静脉输入同一个体中。“联合”给药还包括先给予这些化合物或药剂之一，随后再给予第二种。
剂量水平取决于给药方式、患者状况和载体/佐剂制剂的质量。典型用量为每名患者约0.1μg至约20mg。优选的量是每名患者至少约1μg至约1mg，更优选至少约10μg至约400μg。优选多次给药以对患者进行免疫，给药方案是本领域中适合所述患者的标准方案。
该组合物可以方便地制成单位剂量形式，可以按制药领域公知的任何方法制备。这些方法包括将本发明的组合物与构成一种或多种辅助成分的载体相结合的步骤。这些组合物通常按如下制备将本发明的组合物均匀、密切地与一种液体载体、细碎的固体载体或这两种载体混合，然后在必要时使产品成形。
适于口服的组合物可以是分散的单位形式，如胶囊、片剂或锭剂，每个单位含有预定量的本发明的组合物。其它形式的组合物包括在水溶液或非水液体中的悬液，如糖浆、酏剂或乳剂。
其它给药系统包括定时释放、延时释放或缓释给药系统。这些系统可以避免重复施用上述本发明的组合物，从而大大方便了患者和医生。有多种类型的释放给药系统可以应用，这些是本领域技术人员公知的。
本发明的其它实施方案包括制备本发明的组合物的方法，和利用所述组合物治疗癌症和变态反应的方法。
通过下列实施例和所附权利要求书，本发明的其它方面和实施方案将是显而易见的。
下列实施例只是说明性的，并非限制如所附权利要求书所限定的本发明的范围。本领域技术人员应当理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明的方法进行多种修改和变化。因此，本发明覆盖对本发明的这些修改和变化，只要它们属于所附权利要求及其等同物的范围。
本文提到的所有专利和公开文献均明确地完整引用作为参考。
实施例1p33-HBcAg VLP的产生SEQ ID NO15给出了含有来自LCMV的肽p33的HBcAg的DNA序列。p33-HBcAg VLP如下产生含有乙型肝炎病毒完整病毒基因组的乙型肝炎克隆pEco63购自ATCC。将编码HBcAg的基因导入表达载体pkk223.3(Pharmacia)的EcoRI/HindIII限制酶切位点内，置于强tac启动子的控制下。通过标准PCR方法，将来源于淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)的p33肽(KAVYNFATM)(SEQ ID NO80)与HBcAg的C端(1-185)通过一个三亮氨酸接头融合。用该质粒转染为了良好表达而选择的大肠杆菌K802克隆，培养细胞，并将其重悬浮于5ml裂解缓冲液(10mM Na2HPO4，30mM NaCl，10mM EDTA，0.25％ Tween-20，pH7.0)中。添加200μl溶菌酶溶液(20mg/ml)。超声处理后，添加4μl Benzonase和10mM MgCl2，悬液在室温下孵育30分钟，在4℃下以15000rpm离心15分钟，保留上清液。
然后，向上清液中添加20％(w/v)(0.2g/ml裂解液)硫酸铵。在冰上孵育30分钟，并在4℃下以20,000rpm离心15分钟后，弃去上清液，将沉淀重悬浮于2-3ml PBS中。将20ml PBS溶液上SephacrylS-400凝胶过滤柱(Amersham Pharmacia Biotechnology AG)，将级分加样到SDS-PAGE凝胶上，合并含有纯化p33-VLP衣壳的级分。将合并的级分上羟磷灰石柱。收集流出液(含有纯化的p33-VLP衣壳)，并将其加样到还原SDS-PAGE凝胶上进行单体分子量分析。电子显微镜检查按照标准程序进行。
p33-VLP的结构通过电子显微镜检查和SDS-PAGE来分析。将重组产生的HBcAg野生型VLP(由HBcAg[aa 1-185]单体组成)和p33-VLP上Sephacryl S-400凝胶过滤柱(Amersham PharmaciaBioteclmology AG)进行纯化。合并的级分上羟磷灰石柱。收集流出液(含有纯化的p33-VLP)，并将其加样到还原SDS-PAGE凝胶上进行单体分子量分析。
在整个说明书中，术语p33-HBcAg VLP、HBcAg-p33 VLP、p33-VLP和HBc33可以互换使用。
实施例2GA VLP的克隆、表达和纯化使用RevertAid第一链cDNA合成试剂盒(Fermentas)，通过反转录及随后的PCR扩增步骤，从GA噬菌体中扩增GA噬菌体外壳蛋白的cDNA。该cDNA用NcoI和HindIII酶切，克隆到预先用相同的酶酶切的载体pQβ185中，产生带有GA cDNA的质粒355.24。插入的cDNA的序列通过DNA测序来检查。
用质粒355.24转化大肠杆菌JM109。基本如对于QβVLP所述进行表达。用单菌落接种含20mg/L氨苄青霉素的LB培养基，在不振摇的情况下放置过夜。次日将该接种物转移到含有添加了1％酪蛋白氨基酸、0.2％葡萄糖和20mg/L氨苄青霉素的M9培养基的较大摇瓶中，在振摇下孵育14-20小时。
GA VLP基本如对于QβVLP所述分离。裂解细胞，澄清后的裂解液上Sepharose CL-4B柱(Amersham Pharmacia)。洗脱液经硫酸铵沉淀浓缩，并上Sepharose CL-6B柱(Amersham Pharmacia)再次层析。最后一步是在蔗糖梯度(20-50％ w/v)或CsCl上超速离心。分离的VLP然后用20mM Tris，150mM NaCl，pH8.0透析。
实施例3荧光素标记的含CpG的寡核苷酸可被包装于BKV、HBcAg和Qβ-VLP内在酵母中产生的VLP含有少量RNA，该RNA可被容易地消化，因此通过VLP与RNase A一起孵育而除去。高活性RNase A酶的分子量约为14kDa，它小得足以进入VLP，从而除去不需要的核糖核酸。重组产生的BKV VLP(SEQ ID NO12)在PBS缓冲液pH7.2中浓缩为1mg/ml，并且在存在或不存在RNase A(200μg/ml，RocheDiagnostics Ltd，Switzerland)的条件下37℃孵育3小时。在RNase A消化后，向BKV VLP中添加75nmol/ml 5′-荧光素标记的硫代磷酸CpG-FAM寡核苷酸(来自SEQ ID NO34的寡核苷酸)，并在37℃下孵育3小时。随后BKV VLP在37℃下用DNaseI消化3小时(40u/mlAMPD1，Sigma，Divison of Fluka AG，Switzerland)，或者不经DNaseI消化即加样。向样品中加入6倍浓缩的DNA加样缓冲液(10mM TrispH7.5，10％v/v甘油，0.4％橘黄G)，在65伏电压下在0.8％非变性tris-乙酸pH7.5琼脂糖凝胶中电泳1小时。用溴化乙锭染色后检测核酸，而在不含溴化乙锭时，紫外线激发使CpG-FAM中的荧光素标记产生荧光。
BKV VLP(15μg)在对照孵育后或在RNase A消化并且随后与双链(ds)DNA(246bp)(SEQ ID NO17)孵育后，通过非变性0.8％琼脂糖凝胶电泳经溴化乙锭或考马斯蓝染色进行分析。加样到凝胶上的是下列样品1未处理的BKV VLP；2RNase A处理的BKV VLP；3RNase A处理并与dsDNA一起孵育的BKV VLP；泳道MGene Ruler1kb DNA分子量片段(MBI Fermentas GmbH，Heidelberg，Germany)。
BKV VLP(15μg)在对照孵育后或在RNase A消化并且随后与CpG-寡核苷酸(含有磷酸或硫代磷酸酯(pt)骨架)孵育后，通过非变性0.8％琼脂糖凝胶电泳经溴化乙锭或考马斯蓝染色进行分析。加样到凝胶上的是下列样品1BKV VLP贮存液(PBS/50％甘油)；2未处理的BKV VLP(PBS缓冲液)；3RNase A处理的BKV VLP；4RNaseA处理的BKV VLP，透析后；5RNase A处理的与CpG-寡核苷酸孵育的BKV VLP；6RNase A处理的与CpG(pt)-寡聚体孵育的BKVVLP；7RNase A处理的与CpG(pt)-寡聚体孵育的BKV VLP，透析后；泳道MGene Ruler 1 kb DNA分子量片段(MBI Fermentas GmbH，Heidelberg，Germany)。
RNase A消化使VLP的迁移改变，这在考马斯蓝染色的琼脂糖凝胶上可见，这可能是由于RNA缺乏负电荷所致。添加CpG-寡核苷酸恢复了BKV VLP的迁移，并且产生与未处理的VLP中存在的RNA带同样迁移的荧光带。这清楚地表明，CpG-FAM寡核苷酸已经被包装于VLP内。
实施例4大的双链寡核苷酸可被包装于BKV VLP内为了导入双链(ds)核苷酸序列，向RNase A处理过的重组BKVVLP(实施例3)中添加50μg/ml(ds)DNA片段(长246bp，dsDNA，SEQID NO17)，并在37℃下孵育3小时。向样品中加入6倍浓缩的DNA加样缓冲液(10mM Tris pH8.0，10％v/v甘油，0.4％橘黄G)，在65伏电压下在0.8％非变性tris-乙酸pH8.0琼脂糖凝胶中电泳1小时。在对照孵育后或在RNase A消化并且随后与(ds)DNA孵育后，将BKVVLP(15μg)加样到非变性0.8％琼脂糖凝胶电泳中，经溴化乙锭或考马斯蓝染色进行分析，以检测RNA/DNA或蛋白质的存在。在溴化乙锭存在下，包装的DNA分子显现为与考马斯蓝显色的VLP带同样迁移的一条带。
添加(ds)DNA恢复了BKV VLP的迁移，并且产生与考马斯蓝染色的VLP同样迁移的DNA带。这清楚地表明，(ds)DNA已经被包装于BKV VLP内。
实施例5含CpG的寡核苷酸能够被包装于BKV VLP内为了导入免疫刺激性CpG-寡核苷酸，向RNase A处理过的重组BKV VLP(实施例3)中添加150nmol/ml具有磷酸二酯骨架的CpG-寡核苷酸CyCpG或具有硫代磷酸酯骨架的CyCpGpt，并在37℃下孵育3小时。使用300kDa MWCO透析膜(Spectrum MedicalindustriesInc.，Houston，USA)，将用于免疫小鼠的VLP制剂用PBS pH7.2充分透析(10,000倍稀释)24小时，以除去RNase A和过量的CpG-寡核苷酸。向样品中加入6倍浓缩的DNA加样缓冲液(10mM Tris pH7.5，10％ v/v甘油，0.4％橘黄G)，在65伏电压下在0.8％非变性tris-乙酸pH7.5琼脂糖凝胶中电泳1小时。在对照孵育后或在RNase A消化并且随后与CpG-寡核苷酸(具有磷酸二酯骨架或硫代磷酸酯骨架)孵育后，将BKV VLP(15μg)加样到非变性0.8％琼脂糖凝胶电泳中，经溴化乙锭或考马斯蓝染色进行分析，以检测RNA/DNA或蛋白质的存在，以及透析后未结合的CpG-寡核苷酸的减少。未结合的CpG-寡核苷酸显现为一条低分子量溴化乙锭染色带。添加CpG-寡核苷酸恢复了BKV VLP的迁移，并且产生与考马斯蓝染色的VLP同样迁移的DNA带。这清楚地表明，CpG-寡核苷酸已经被包装于BKV VLP内。
实施例6含CpG-寡核苷酸(磷酸骨架上有硫代磷酸修饰)的VLP诱发增强的Th1指导的免疫应答雌性BALB/C小鼠(每组3只小鼠)皮下注射10μg含硫代磷酸CpG-寡核苷酸CyCpGpt(SEQ ID NO34)的BKV VLP。对照小鼠皮下注射溶于200μl PBS pH7.2中的10μg单独的RNase处理的BKV VLP或与0.3nmol或20nmol硫代磷酸CpG-寡核苷酸混合的BKV VLP，或者不予处理。BKV VLP如实施例5所述制备，并且在免疫之前通过透析从未结合的CpG-寡核苷酸中充分纯化。免疫后第14天，采血，测定对BKV VLP的IgG1和IgG2a抗体应答(见表1)。
表1用BKV VLP和硫代磷酸(pt)CpG-寡核苷酸免疫后第14天，小鼠对BKV VLP的IgG1和IgG2a OD50％抗体滴度。
与用相同量(0.3nmol)的与BKV VLP混合的CpG-寡核苷酸或用单独的BKV VLP免疫相比，用RNase A处理的含硫代磷酸CpG-寡核苷酸CyCpGpt的BKV VLP免疫导致IgG1滴度降低和抗BKV VLPIgG2a滴度增加。用与20nmol硫代磷酸CpG-寡核苷酸CyCpGpt混合的BKV VLP免疫的小鼠显示极低的IgG1滴度和高IgG2a滴度。与对照相比，IgG1滴度降低且IgG2a滴度升高，说明包装于BKV VLP中的硫代磷酸CpG-寡核苷酸诱发了Th1细胞指导的免疫应答。表1清楚地显示，相比与CpG-寡核苷酸简单混合的BKV VLP，含有包装于颗粒内的CpG-寡核苷酸的BKV VLP具有更好的效果。
实施例7免疫刺激性核酸能够被包装于含有与抗原融合的融合蛋白的HBcAg VLP内HBcAg VLP当通过表达乙型肝炎核心抗原融合蛋白p33-HBcAg(HBc33)(见实施例1)或与肽P1A融合的融合蛋白(HBcP1A)而在大肠杆菌中产生时，它含有RNA，该RNA可被消化，因此通过VLP与RNase A孵育将其除去。
基因P1A编码由肥大细胞瘤肿瘤细胞系P815表达的一种蛋白质。被称为P1A肽的显性CTL表位与MHCI类(Ld)结合，该复合物被特异性CTL克隆识别(Brndle et al.，1998，Eur.J.Immunol.284010-4019)。利用标准分子生物学技术，使用合适的引物，通过PCR进行肽P1A-1(LPYLGWLVF)(SEQ ID NO90)与HBcAg的C端(氨基酸185，参见实施例1)的融合。将一个三亮氨酸接头克隆到HBcAg与肽序列之间。如实施例1所述进行表达。HBcAg与P1A的融合蛋白被称为HBcP1A，当在大肠杆菌中表达时形成衣壳，可以按类似于实施例1所述的方法进行纯化。
酶RNA水解重组产生的HBcAg-p33(HBc33)和HBcAg-P1A(HBcP1A)VLP在1×PBS缓冲液(KCl 0.2g/l，KH2PO40.2g/l，NaCl 8g/l，Na2HPO41.15g/l)pH7.4中以1.0mg/ml的浓度，在300μg/ml RNase A(Qiagen AG，Switzerland)存在下，在恒温混匀器中以650rpm 37℃孵育3小时。
免疫刺激性核酸的包装RNA用RNase A消化后，向HBcAg-p33VLP中补加130nmol/ml CpG-寡核苷酸B-CpG、NKCpG、G10-PO(表2)。类似地，分别以130nmol/ml或1.2nmol/ml的浓度添加150mer单链Cy150-1和253mer双链dsCyCpG-253，它们均含有多个拷贝的CpG基序，并在恒温混匀器中37℃孵育3小时。通过将CyCpG的双链多聚体克隆到pBluescript KS-的EcoRV位点内产生双链CyCpG-253DNA。在大肠杆菌XL1-blue中产生并用Qiagen Endofree质粒Giga试剂盒分离获得的质粒，用限制性内切核酸酶XhoI和XbaI消化，产生的限制酶切产物通过琼脂糖电泳分离。253bp的插入片段通过电洗脱和乙醇沉淀分离。通过对两条链进行测序检验其序列。
表2实施例中使用的免疫刺激性核酸的命名和序列小写字母表示通过硫代磷酸酯键连接的脱氧核苷酸，而大写字母表示通过磷酸二酯键连接的脱氧核苷酸
DNase I处理包装的HBcAg-p33 VLP随后在37℃下用DNase I消化(5U/ml)3小时(DNase I，不含RNase，Fluka AG，Switzerland)，并用300kDa MWCO透析膜(Spectrum MedicalIndustries Inc.，Houston，USA)用PBS pH7.4充分透析(2次，透析液为200倍体积)24小时，以除去RNase A和过量的CpG-寡核苷酸。
Benzonase处理由于某些单链寡脱氧核苷酸对DNase I处理有部分抗性，利用Benzonase处理从制品中除去游离的寡核苷酸。在透析前添加100-120U/ml Benzonase(Merck KGaA，Darmstadt，Germany)和5mM MgCl2，37℃孵育3小时。
透析使用300kDa MWCO透析膜(Spectrum Medical IndustriesInc.，Houston，US)，在小鼠免疫实验中使用的包装有免疫刺激性核酸的VLP制剂用PBS pH7.4充分透析(2次，透析液为200倍体积)24小时，以除去添加的酶和游离的核酸。
包装的分析包装的免疫刺激性核酸的释放向50μl衣壳溶液中加入1μl蛋白酶K(600U/ml，Roche，Mannheim，Germany)、3μl 10％SDS-溶液和6μl 10倍蛋白酶缓冲液(0.5M NaCl，50mM EDTA，0.1MTris pH7.4)，随后在37℃下孵育过夜。VLP在该条件下完全水解。在65℃下加热20分钟灭活蛋白酶K。向25μl衣壳中加入1μl RNaseA(Qiagen，100μg/ml，稀释250倍)。2-30μg衣壳与1倍体积的2×加样缓冲液(1×TBE，42％w/v尿素，12％w/v Ficoll，0.01％溴酚蓝)混合，95℃加热3分钟，加样到10％(对于约20nt长的寡核苷酸)或15％(对于＞40mer的核酸)TBE/尿素聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)上。此外，样品也可以与6×加样染料(10mM Tris pH7.5，50mM EDTA，10％v/v甘油，0.4％橘黄G)一起加样到1％琼脂糖凝胶上。TBE/尿素凝胶用CYBRGold染色，琼脂糖凝胶用溴化乙锭染色。
寡核苷酸B-CpG、NKCpG和G10-PO被包装于HBc33内。利用溴化乙锭和考马斯蓝染色的1％琼脂糖凝胶分析被包装于HBc33 VLP内的B-CpG。加样到凝胶上的是50μg下列样品1.未处理的HBc33VLP；2.RNase A处理的HBc33 VLP；3.RNase A处理并包装有B-CpG的HBc33 VLP；4.RNase A处理、包装有B-CpG并用DNase I处理的HBc33 VLP；5.RNase A处理、包装有B-CpG、DNase I处理并透析的HBc33 VLP；6.1kb MBI Fermentas DNA标准分子量片段。利用溴化乙锭染色的1.5％琼脂糖凝胶分析从VLP中提取的包装的B-CpG的量。加样到凝胶上的是下列样品1.0.5nmol B-CpG对照；2.0.5nmolB-CpG对照；3.酚/氯仿抽提后HBc33中的B-CpG oligo内容物；4.酚/氯仿抽提并且用RNase A处理后HBc33中的B-CpG oligo内容物；5.酚/氯仿抽提并且用DNase I处理后HBc33中的B-CpG oligo内容物；6.空；7.MBI Fermentas 100bp DNA标准分子量片段。
利用溴化乙锭和考马斯蓝染色的1％琼脂糖凝胶分析被包装于HBc33VLP内的NKCpG。加样到凝胶上的是15μg下列样品1.未处理的HBc33 VLP；2.RNase A处理的HBc33 VLP；3.RNase A处理的且包装有NKCpG的HBc33 VLP；4.RNase A处理、包装有NKCpG、DNase I处理并且透析的HBc33 VLP；5.1kb MBI Fermentas DNA标准分子量片段。利用CYBR Gold染色的15％ TBE/尿素凝胶分析从VLP中提取的包装的NKCpG的量。加样到凝胶上的是下列样品1.蛋白酶K消化及RNase A处理后HBc33中的NKCpG oligo内容物；2.20pmol NKCpG对照；3.10pmol NKCpG对照；4.40pmol NKCpG对照。
利用溴化乙锭和考马斯蓝染色的1％琼脂糖凝胶分析被包装于HBc33VLP内的g10gacga-PO。加样到凝胶上的是15μg下列样品1.1kb MBI Fermentas DNA标准分子量片段；2.未处理的HBc33 VLP；3.RNase A处理的HBc33 VLP；4.RNase A处理的且包装有g10gacga-PO的HBc33 VLP；5.RNase A处理、包装有g10gacga-PO、Benzonase处理并透析的HBc33 VLP。
RNaseA处理后VLP中的RNA内容物极大地减少，而大多数衣壳以缓慢迁移的弥散带(smear)迁移，这大概是由于除去了带负电荷的RNA。与过量寡核苷酸一起孵育后的衣壳比RNaseA处理的衣壳含有更高含量的核酸，因此以与未处理的衣壳类似的速度迁移。另外用DNAse I或Benzonase处理能降解游离寡核苷酸，而包装在衣壳内的寡核苷酸不被降解，清楚地显示了寡核苷酸的包装。在某些情况下，在DNase I/Benzonase处理并透析后，通过蛋白酶K消化证实寡核苷酸的包装。利用上述方法从衣壳中释放的寡核苷酸与用于包装的寡核苷酸大小相同，这一发现清楚地证实了寡核苷酸的包装。
大的单链寡核苷酸Cy150-1被包装于HBc33内。Cy150-1含有7.5个重复的CyCpG，按照标准寡核苷酸合成方法(IBA，Gttingen，Germany)合成。包装于HBc33VLP内的Cy150-1用溴化乙锭和考马斯蓝染色的1％琼脂糖凝胶进行分析。加样到凝胶上的是15μg下列样品1.1kb MBI Fermentas DNA标准分子量片段；2.未处理的HBc33 VLP；3.RNase A处理的HBc33 VLP；4.RNase A处理的且包装有Cy150-1的HBc33 VLP；5.RNase A处理、包装有Cy150-1、DNaseI处理并透析的HBc33 VLP；6.RNase A处理、包装有Cy150-1、DNaseI处理并透析的HBc33 VLP。从VLP中提取的包装的Cy150-1的量用SYBR Gold染色的10％ TBE/尿素凝胶分析。加样到凝胶上的是下列样品1.20pmol Cy150-1对照；2.10pmol Cy150-1对照；3.4pmolCy150-1对照；4.4μg HBc33在与1倍体积的TBE/尿素样品缓冲液95℃孵育3分钟后的Cy150-1 oligo内容物。衣壳中的RNA内容物在RNase A处理后极大减少，而大多数衣壳以缓慢迁移的弥散带迁移。衣壳用4倍体积的水稀释，并浓缩到1mg/ml。与过量的Cy150-1孵育后，衣壳含有大量核酸，因此以类似于未处理衣壳的速度迁移。另外用DNase I处理能降解游离的、未包装的寡核苷酸，而衣壳内的寡核苷酸不被降解。在TBE/尿素加样缓冲液中95℃加热3分钟从包装的VLP中释放出DNase I抗性的核酸，这表明存在150mer。
寡核苷酸NKCpGpt也被包装于HBcP1A内。被包装于HBcP1AVLP内的NKCpGpt用溴化乙锭和考马斯蓝染色的1％琼脂糖凝胶来分析。加样到凝胶上的是15μg下列样品1.1kb MBI Fermentas DNA标准分子量片段；2.未处理的HBcP1A VLP；3.RNase A处理的HBcP1A VLP；4.RNase A处理的且包装有NKCpGpt的HBcP1A VLP。RNase处理减少了核酸内容物，并使衣壳的迁移减慢。添加NKCpGpt恢复了衣壳中的核酸内容物并使迁移变快。
实施例8免疫刺激性核酸能够被包装到与抗原偶联的HBcAg-wt内重组产生的HBcAg-wt VLP在与来自淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)的肽p33(CGG-KAVYNFATM)(SEQ ID NO81)偶联后被包装。为了偶联，HBcAg-wt VLP(2mg/ml)在恒温混匀器中用25×摩尔过量的SMPH(琥珀酰亚胺基-6-[(β-马来酰亚氨基-丙酰氨基)己酸]，Pierce)25℃衍化1小时。使用MWCO 10,000kD透析膜，将衍化的VLP在4℃下用Mes缓冲液(2-(N-吗啉代)乙磺酸)pH7.4透析2次各2小时。随后在恒温混匀器中25℃孵育2小时，在此期间VLP(50μM)与p33肽(250μM)的N端半胱氨酸偶联。样品用1×PBS pH7.4充分透析(MWCO 300,000)，以除去不需要的游离肽。
用SMPH衍化并与p33肽偶联的HBcAg-wt VLP通过SDS-PAGE进行分析。样品通过16％ SDS-PAGE经考马斯蓝染色进行分析。加样到凝胶上的是下列样品1.NEB预染色的蛋白质标准，宽范围(#7708S)，10μl；2.p33肽；3.SMPH衍化的HBcAg-wt VLP，透析前；4.SMPH衍化的HBcAg-wt VLP，透析后；5.与p33偶联的HBcAg-wt VLP，上清液；6.与p33偶联的HBcAg-wt VLP，沉淀。HBcAg-wt显现为一条21kD蛋白带。由于SMPH的分子量低，衍化产物仅仅略微增大，不能通过SDS-PAGE鉴别。单独的肽显现为一条3kD条带，而被称为HBx33的偶联产物在约24kD处显示第二条强条带，占总HBcAg-wt的50％以上。
酶RNA水解在RNase A(300μg/ml，Qiagen AG，Switzerland)存在下，用4倍体积的H2O稀释HBx33 VLP(0.5-1.0mg/ml，1×PBS缓冲液pH7.4)，使盐浓度降低至0.2×PBS的终浓度，并在恒温混匀器中以650rpm 37℃孵育3小时。
免疫刺激性核酸的包装RNase A消化后，用Millipore Microcon或Centriplus浓缩器浓缩HBx33 VLP，然后添加130nmol/ml CpG-寡核苷酸B-CpGpt，在恒温混匀器中在0.2×PBS pH7.4中37℃孵育3小时。随后，反应混合物在37℃下用DNaseI(5U/ml)消化3小时(DNaseI，不含RNase，Fluka AG，Switzerland)。使用300kDa MWCO透析膜(Spectrum MedicalIndustries Inc.，Houston，USA)，将用于免疫小鼠的VLP制剂用PBS pH7.4充分透析(2次，透析液为200倍体积)24小时，以除去RNase A和过量的CpG-寡核苷酸。用溴化乙锭和考马斯蓝染色的1％琼脂糖凝胶分析被包装于HBx33 VLP内的B-CpGpt。加样到凝胶上的是50μg下列样品1.未处理的HBx33VLP；2.RNase A处理的HBx33 VLP；3.RNase A处理且包装有B-CpGpt的HBx33 VLP；4.RNase A处理、包装有B-CpGpt并用DNaseI处理的HBx33 VLP；5.RNase A处理、包装有B-CpGpt、DNase I处理并透析的HBx33 VLP；6.1kb MBI Fermentas DNA标准分子量片段。显示RNase处理减少了衣壳的核酸内容物，并且减慢了它们的迁移。添加B-CpGpt可恢复衣壳的核酸内容物并使其迁移加快。DNaseI仅消化游离寡核苷酸，而包装的寡核苷酸在透析后仍保留在VLP中。
实施例9免疫刺激性核酸能够被包装于与抗原偶联的Qβ VLP内p33肽与Qβ VLP的偶联重组产生的RNA噬菌体Qb的病毒样颗粒(Qβ VLP)不经处理即使用，或者在与含有N端CGG和/或C端GGC延伸(CGG-KAVYNFATM(SEQ ID NO81)和KAVYNFATM-GGC(SEQID NO82))的p33肽偶联后使用。重组产生的Qβ VLP在25℃下用10倍摩尔过量的SMPH(Pierce)衍化0.5小时，随后在4℃下用20mMHEPES，150mM NaCl，pH7.2透析，以除去未反应的SMPH。添加5倍摩尔过量的肽，并且在30％乙腈存在下在恒温混匀器中25℃反应2小时。利用SDS-PAGE经考马斯蓝染色分析与Qb VLP偶联的p33。加样到凝胶上的是下列样品(A)1.NEB预染色的蛋白质标准，宽范围(#7708S)，10μl；2.Qb VLP，14μg；3.SMPH衍化的Qb VLP，透析后；4.与CGG-p33偶联的Qb VLP，上清液。(B)1.NEB预染色的蛋白质标准，宽范围(#7708S)，10μl；2.Qb VLP，10μg；3.与GGC-p33偶联的Qb VLP，上清液。SDS-PAGE分析证明了由一个、两个或三个与Qβ单体偶联的肽组成的多偶联带。为了简单起见，尤其在实施例部分中，将肽p33与Qβ VLP的偶联产物称为Qbx33。
当Qβ VLP通过表达噬菌体Qβ衣壳蛋白在大肠杆菌中产生时，它含有RNA，该RNA能被消化，因此通过VLP与RNase A孵育除去。
低离子强度和低Qβ浓度使RNase A水解Qβ VLP中的RNA在20mM Hepes/150mM NaCl缓冲液(HBS)pH7.4中浓度为1.0mg/ml的Qβ VLP，通过添加RNase A(300μg/ml，Qiagen AG，Switzerland)直接消化，或者用4倍体积的H2O稀释至终浓度为0.2×HBS，然后与RNase A(60μg/ml，Qiagen AG，Switzerland)一起孵育。孵育在恒温混匀器中以650rpm 37℃进行3小时。用溴化乙锭和考马斯蓝染色的1％琼脂糖凝胶分析在低及高离子强度下RNase A对Qb VLP中RNA的水解。加样到凝胶上的是下列样品(A，B)1.MBIFermentas 1kb DNA标准分子量片段；2.未处理的Qb VLP；3.在1×HBS缓冲液pH7.2中用RNase A处理的Qb VLP。(C，D)1.MBIFermentas 1kb DNA标准分子量片段；2.未处理的Qb VLP；3.在0.2×HBS缓冲液pH7.2中用RNase A处理的Qb VLP。证实在1×HBS中只观察到极弱的RNA内容物的减少，而在0.2×HBS中大多数RNA均水解。与之一致的是，向1×HBS中添加RNase A后衣壳的迁移不改变，而向0.2×HBS中添加RNase后迁移减慢。
低离子强度增加核酸在Qβ VLP中的包装在0.2×HBS中RNase A消化后，用Millipore Microcon或Centriplus浓缩器将Qβ VLP浓缩至1mg/ml，其等份样品用1×HBS或0.2×HBS透析。向Qβ VLP中添加130nmol/ml CpG-寡核苷酸B-CpG，在恒温混匀器中37℃孵育3小时。随后，在37℃下用Benzonase(100U/ml)消化Qβ VLP 3小时。利用1％琼脂糖凝胶经溴化乙锭或考马斯蓝染色分析样品。加样到凝胶上的是下列样品1.未处理的Qb VLP；2.RNase A处理的Qb VLP；3.RNase A处理、在0.2×HBS缓冲液pH7.2中包装B-CpG并用Benzonase处理的Qb VLP；4.RNase A处理、在1×HBS缓冲液pH7.2中包装B-CpG并用Benzonase处理的HBx33 VLP(见实施例12)。在1×HBS中只有极少量的寡核苷酸能被包装，而在0.2×HBS中可检测到强溴化乙锭染色带，该条带与衣壳的考马斯蓝染色位置重叠。
不同免疫刺激性核酸能够被包装于Qβ和Qbx33 VLP中在0.2×HBS中RNase A消化后，用Millipore Microcon或Centriplus浓缩器将Qβ VLP或Qbx33 VLP浓缩至1mg/ml，并添加130nmol/ml CpG-寡核苷酸B-CpGpt、g10gacga和253merdsCyCpG-253(表2)，并在恒温混匀器中37℃孵育3小时。随后，在37℃下用DNaseI(5U/ml)或Benzonase(100U/ml)消化Qβ VLP或Qbx33 VLP 3小时。利用1％琼脂糖凝胶经溴化乙锭或考马斯蓝染色后分析样品。
加样到凝胶上的是50μg下列样品1.未处理的Qbx33 VLP；2.RNase A处理的Qbx33 VLP；3.RNase A处理并包装有B-CpGpt的Qbx33 VLP；4.RNase A处理、包装有B-CpGpt、DNase I处理并透析的Qbx33 VLP；5.1kb MBI Fermentas DNA标准分子量片段。(C)显示利用CYBR Gold染色的15％TBE/尿素凝胶对从VLP中提取的包装oligo的量所进行的分析。加样到凝胶上的是下列样品1.蛋白酶K消化和RNase A处理后2μg Qbx33 VLP中的B-CpGpt oligo内容物；2.20pmol B-CpGpt对照；3.10pmol B-CpGpt对照；4.5pmolB-CpGpt对照。
加样到另一块凝胶上的是15μg下列样品1.MBI Fermentas 1kbDNA标准分子量片段；2.未处理的Qbx33 VLP；3.RNase A处理的Qbx33 VLP；4.RNase A处理并包装有g10gacga-PO的Qbx33 VLP；5.RNase A处理、包装有g10gacga-PO、Benzonase处理并透析的Qbx33VLP。
加样到第三块凝胶上的是15μg下列样品1.MBI Fermentas 1kbDNA标准分子量片段；2.未处理的Qbx33 VLP；3.RNase A处理的Qbx33 VLP；4.RNase A处理、包装有dsCyCpG-253并用DNaseI处理的Qbx33 VLP；5.RNase A处理、包装有dsCyCpG-253、用DNaseI处理并透析的Qbx33 VLP。
不同的核酸B-CpGpt、g10gacga和253mer dsDNA能够被包装于Qbx33内。包装的核酸对DNaseI消化有抗性，在透析过程中保持包装状态。通过蛋白酶K消化释放核酸，随后进行琼脂糖电泳和溴化乙锭染色，来证实B-CpGpt的包装。
实施例10AP205的解装配-纯化-重装配和免疫刺激性核酸的包装A.AP205VLP的解装配，以及由在不添加寡核苷酸的条件下能够重装配的材料重装配解装配40mg冻干纯化的AP205VLP(SEQ-ID80或81)溶解于4ml 6M GuHCl中，4℃孵育过夜。解装配混合物以8000rpm离心(Eppendorf 5810R，固定角转头F34-6-38，在下列所有步骤中使用)。将沉淀溶解于7M尿素中，上清液用NET缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.8，5mM EDTA，150mM NaCl)透析3天，其中更换3次缓冲液。另外，也以连续方式透析4天。透析过的溶液以8000rpm离心20分钟，将沉淀溶解于7M尿素中，上清液用硫酸铵(60％饱和)沉淀，并溶解于含有10mM DTT的7M尿素缓冲液中。合并溶解于7M尿素中的上述所有沉淀，用硫酸铵(60％饱和)沉淀，并且再溶解于含有10mMDTT的7M尿素缓冲液中。合并溶解于含有10mM DTT的7M尿素缓冲液中的物质，上Sephadex G75柱，该柱用含有10mM DTT的7M尿素缓冲液平衡并以2ml/h的流速洗脱。从柱上洗脱下一个峰。以3ml收集级分。合并含有AP205外壳蛋白的峰级分，用硫酸铵(60％饱和)沉淀。以8000rpm离心20分钟分离沉淀。将沉淀溶解于7M尿素，10mM DTT中，上短Sepharose 4B柱(1.5×27cm Sepharose 4B，2ml/h，7M尿素，10mM DTT作为洗脱缓冲液)。从该柱上主要洗脱下一个峰，其含有一个小肩部。含有AP205外壳蛋白的级分通过SDS-PAGE鉴定，合并，除去肩部。获得10.3ml样品。通过分光光度法测定稀释25倍的蛋白质等份，使用下列公式来估计蛋白质浓度(1.55×OD280-0.76×OD260)×体积。平均浓度为1nmol/ml VLP(2.6mg/ml)。280nm与260nm处的吸光度之比为0.12/0.105。
重装配向样品中加入1.1ml β-巯基乙醇，建立下列重装配反应体系1ml AP205外壳蛋白，不含核酸1ml AP205外壳蛋白，rRNA(约200OD260单位，10nmol)9ml AP205外壳蛋白，CyCpG(370μl 225pmol/μl溶液，即83nmol)。
这些混合物用30ml含10％β-巯基乙醇的NET缓冲液透析1小时。不含核酸的混合物分开透析。然后以连续方式继续透析3天，更换1l NET缓冲液。反应混合物随后用水充分透析(更换5次缓冲液)，并冻干。将其再溶解于水中，用电子显微镜(EM)分析。所有混合物均含有衣壳，表明AP205 VLP重装配不依赖于可检测的核酸的存在，如同利用琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色所测定的。EM程序如下蛋白质悬液吸附到覆盖碳-聚醋酸甲基乙烯脂(formvar)的网格上，用2％磷钨酸(pH6.8)染色。用JEM 100C(JEOL，日本)电子显微镜以80kV的加速电压检查该网格。在Kodak电子成像胶片上进行照相记录(负片)，在Kodak Polymax相纸上洗印负片获得电子显微照片。在CyCpG存在下重装配的VLP通过Sepharose 4B柱(1×50cm)纯化，用NET缓冲液洗脱(1ml/h)。级分通过Ouchterlony试验分析，并合并含有VLP的级分。获得8ml样品，用水透析脱盐，干燥。衣壳产量为10mg。用0.6％琼脂糖凝胶经溴化乙锭染色分析溶解物质，结果表明衣壳不含核酸。在重装配步骤之后和充分透析之前采集的含CyCpG的重装配反应样品用0.6％琼脂糖凝胶经溴化乙锭和考马斯蓝染色分析。能够获得迁移高度与完整的AP205 VLP相同并且能够用溴化乙锭和考马斯蓝染色的一条带，表明含有寡脱氧核苷酸的AP205 VLP已经被重装配。重装配程序后的充分透析步骤可能导致寡脱氧核苷酸扩散到VLP之外。值得注意的是，如利用溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳所测定的，在不含可检测的寡脱氧核苷酸的条件下，AP205VLP也能被重装配。因此，在最初的VLP解装配、从核酸中纯化解装配的外壳蛋白以及随后VLP在寡脱氧核苷酸存在下重装配后，寡脱氧核苷酸能够与AP205 VLP成功结合。
B.使用在不添加寡核苷酸的条件下不能重装配的解装配材料重装配AP205 VLP解装配100mg纯化并干燥的重组AP205 VLP如上所述解装配。所有步骤都基本如部分A的解装配所述进行，只是使用8M尿素溶解硫酸铵沉淀步骤的沉淀物，并且省去了重装配之前使用CL-4B柱的凝胶过滤步骤。通过光谱测定，使用部分A所述公式计算，合并的Sephadex G-75柱级分含有21mg蛋白质。样品的280nm吸光度与260nm吸光度之比为0.16∶0.125。样品稀释50倍进行测定。
重装配Sephadex G-75凝胶过滤纯化步骤获得的蛋白质制品用60％饱和的硫酸铵沉淀，获得的沉淀物溶解于2ml 7M尿素，10mMDTT中。样品用含10％β-巯基乙醇的8ml NET缓冲液稀释，用40ml含10％β-巯基乙醇的NET缓冲液透析1小时。通过向透析袋内的蛋白质样品中添加0.4ml CyCpG溶液(109nmol/ml)启动重装配。建立连续模式的透析，NET缓冲液用作洗脱液。继续透析2天，在完成该透析步骤后采集样品进行EM分析。透析过的重装配溶液随后用含50％v/v甘油的NET缓冲液透析，以实现浓缩。透析一天后更换一次缓冲液。透析继续进行总共3天。
通过在Sepharose 4-B柱(1×60cm)上用NET缓冲液以1ml/h的流速进行凝胶过滤，来纯化透析并浓缩的重装配溶液。级分用Ouchterlony试验检测，并且对含衣壳的级分进行干燥，将其重悬浮于水中，并在用20mM Hepes pH7.6平衡的4-B柱上重新层析。使用下列三个公式1.(183×OD230nm-75.8×OD260nm)×体积(ml)2.((OD235nm-OD280nm)/2.51)×体积3.((OD228.5nm-OD234.5nm)×0.37)×体积检测到6-26mg重装配VLP的蛋白质含量。
重装配的AP205VLP通过如上所述的EM、琼脂糖凝胶电泳和非还原条件下的SDS-PAGE进行分析。
解装配材料的EM分析显示，用盐酸胍处理AP205VLP从根本上破坏了VLP的衣壳装配。该解装配材料与寡核苷酸的重装配产生衣壳，衣壳通过凝胶过滤纯化并进一步富集。获得两种大小的颗粒；在电子显微照片上可见直径约25nm的颗粒和较小的颗粒。没有寡核苷酸时无法获得重装配。将重装配的颗粒加样到琼脂糖电泳上，显示重装配的颗粒含有核酸。通过酚抽提提取核酸内容物，随后将其加样到琼脂糖凝胶上电泳，经溴化乙锭染色，显示该颗粒含有用于重装配的寡核苷酸。通过将该寡核苷酸样品与从颗粒中提取的核酸物质从左到右加样，确定包装的寡核苷酸的特性。已经加样了重装配的AP205VLP并且已用溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶再用考马斯蓝染色，显示该颗粒的寡核苷酸内容物与蛋白质内容物共迁移，表明寡核苷酸已经被包装到颗粒中。加样到凝胶上的样品是未处理的AP205 VLP，含有不同含量的与CyCpG重装配并纯化的AP205 VLP的3个样品，未处理的Qβ VLP。
向SDS-PAGE凝胶上加样重装配的AP205 VLP，在不含还原剂的条件下电泳，证实重装配的颗粒已经形成二硫键，如同未处理的AP205 VLP一样。而且，二硫键模式也与未处理的颗粒相同。加样到SDS凝胶上的样品是蛋白质分子量标准，未处理的野生型Qβ，重装配的野生型Qβ，未处理的AP205 VLP，重装配的AP205 VLP。AP205VLP亚单位的分子量是14.0kDa，而Qβ亚单位的分子量为14.3kDa(这两个分子量都是根据N端甲硫氨酸计算出来的)。
C.p33表位(序列H2N-KAVYNFATMGGC-COOH，含游离N端和C端(SEQ ID NO82))与同CyCpG重装配的AP205 VLP的偶联如部分B所述获得的重装配AP205 VLP，在20mM Hepes，150mM NaCl，pH7.4中，以1.4mg/ml的浓度与5倍过量的由50mMDMSO贮存液稀释而成的交联剂SMPH在15℃下反应30分钟。获得的所谓衍化AP205 VLP用至少1000倍体积的20mM Hepes，150mMNaCl，pH7.4缓冲液透析2次各2小时。衍化的AP205以1mg/ml的浓度与2.5倍或5倍过量的由20mM DMSO贮存液稀释而成的肽在15℃下反应2小时。样品随后在液氮中骤冻用于贮存。
偶联反应通过SDS-PAGE分析。加样到凝胶上的是下列样品蛋白质分子量标准；衍化的AP205 VLP(d)；与2.5倍过量的肽偶联的AP205 VLP，上清液(s)；与2.5倍过量的肽偶联的AP205 VLP，沉淀物(p)；与5倍过量的肽偶联的AP205 VLP，上清液(s)；与5倍过量的肽偶联的AP205 VLP，沉淀物(p)。偶联反应的结果显示，在偶联反应中使用5倍过量的肽比使用2.5倍过量的肽能够达到更高的偶联程度。
实施例11VLP的RNA内容物的非酶水解和免疫刺激性核酸的包装VLP核酸内容物的ZnSO4依赖的降解溶于20mM HEPES，pH7.4，150mM NaCl中的5mg Qβ VLP(通过Bradfold分析测定)在SnakeSkin折叠透析管(Pierce，货号68035)中在4℃下用2000ml 50mM TrisHCl pH8.0，50mM NaCl，5％甘油，10mM MgCl2或2000ml 4mM HEPES，pH7.4，30mM NaCl透析2小时。每种透析缓冲液均更换一次，在4℃下再继续透析16小时。透析过的溶液以14000rpm澄清10分钟(Eppendorf 5417 R，固定角转头F45-30-11，在下列所有步骤中使用)，再次通过Bradfold分析测定蛋白质浓度。溶于50mM TrisHCl pH8.0，50mM NaCl，5％甘油，10mMMgCl2中的Qβ VLP用相应缓冲液稀释至蛋白质终浓度为1mg/ml，而溶于4mM HEPES pH7.4，30mM NaCl中的Qβ VLP用相应缓冲液稀释至蛋白质终浓度为0.5mg/ml。这种含衣壳的溶液在4℃下以14000rpm再次离心10分钟。上清液与加至2.5mM终浓度的ZnSO4添在Eppendorf恒温混匀器装置中以550rpm 60℃孵育24小时。24小时后溶液以14000rpm澄清10分钟，弃去沉淀。ZnSO4依赖的核酸降解效率通过琼脂糖凝胶电泳证实。上清液在4C下用5000ml 4mMHEPES pH7.4，30mM NaCl透析2小时。更换一次5000ml缓冲液，在4℃下继续透析过夜。透析过的溶液在4℃下以14000rpm澄清10分钟，弃去微小的沉淀物，上清液的蛋白质浓度通过Bradfold分析测定。以氯化铜/二氮杂菲/过氧化氢处理衣壳获得类似的结果。本领域技术人员公知用于水解RNA的备选的非酶方法。
通过琼脂糖凝胶电泳分析ZnSO4处理的Qβ VLP从大肠杆菌中纯化并用缓冲液1(50mM TrisHCl pH8.0，50mM NaCl，5％甘油，10mM MgCl2)或缓冲液2(4mM HEPES pH7.4，30mM NaCl)透析的QβVLP在存在或不存在2.5mM硫酸锌(ZnSO4)的条件下60℃孵育24小时。该处理后，等量指定样品(5μg蛋白质)与加样染料混合，加样到0.8％琼脂糖凝胶上。电泳后，凝胶用溴化乙锭染色。用ZnSO4处理VLP导致核酸内容物降解，而假处理的对照不受影响。
将寡脱氧核苷酸包装于ZnSO4处理的VLP内寡脱氧核苷酸的包装使用ZnSO4处理且透析过的Qβ衣壳，其蛋白质浓度(通过Bradfold分析测定)为0.4mg/ml-0.9mg/ml(分别对应于159nM和357.5nM的衣壳浓度)。加入相对于Qβ VLP衣壳300倍摩尔过量的寡脱氧核苷酸，在Eppendorf恒温混匀器中以550rpm 37℃孵育3小时。3小时后反应液在4℃下以14000rpm离心10分钟。上清液在MWCO 300000的Spectra/PorCE Dispo透析器(Spectrum，货号135526)中在4℃下用5000ml 20mM HEPES pH7.4，150mM NaCl透析8小时。更换一次5000ml缓冲液，在4℃下继续透析过夜。透析过的样品的蛋白质浓度通过Bradfold分析测定。Qβ衣壳及其核酸内容物如实施例7和9所述分析。
寡脱氧核苷酸向ZnSO4处理的VLP内的包装通过琼脂糖凝胶电泳来分析。以2.5mM硫酸锌(+ZnSO4)处理的QβVLP用4mM HEPESpH7.4，30mM NaCl透析，并且与过量的寡脱氧核苷酸37℃孵育3小时(由于透析，ZnSO4的浓度降低106数量级，因此只在括号中标明)。在寡脱氧核苷酸存在下孵育后，等量的指定样品(5μg蛋白质)与加样染料混合，加样到0.8％琼脂糖凝胶上。电泳后，凝胶用溴化乙锭染色。与从大肠杆菌中纯化的未处理的Qβ衣壳相比，向ZnSO4处理的Qβ VLP中添加寡脱氧核苷酸能够恢复这样处理的衣壳的电泳行为。
ZnSO4和寡脱氧核苷酸处理的Qβ VLP的核酸内容物通过Benzonase和蛋白酶K消化和聚丙烯酰胺TBE/尿素凝胶电泳来分析如上所述，将寡脱氧核苷酸包装于ZnSO4处理的Qβ VLP内。按照使用说明用25μl Benzonase(Merck，货号1.01694.0001)消化25μg该VLP。在热灭活核酸酶后(80℃ 30分钟)，按照使用说明用蛋白酶K(酶的终浓度为0.5mg/ml)处理VLP。3小时后，将Benzonase和蛋白酶K消化的等量2μg Qβ VLP与TBE-尿素样品缓冲液混合，并加样到15％聚丙烯酰胺TBE-尿素凝胶(Novex，Invitrogen，货号EC6885)上。加于第2泳道的衣壳在缓冲液1(见上文)存在下用2.5mM ZnSO4处理，而加于第3泳道的衣壳在缓冲液2(见上文)存在下用2.5mM ZnSO4处理。将用于重装配反应的1pmol、5pmol和10pmol寡脱氧核苷酸加样到同一凝胶上(泳道4-6)作为定性及定量标准。作为对照，从大肠杆菌中纯化的Qβ衣壳进行完全相同的处理，并在同一块聚丙烯酰胺TBE-尿素凝胶上进行分析(泳道1)。完成电泳后，将凝胶固定，平衡至中性pH，用SYBR-Gold(Molecular Probes，货号S-11494)染色。完整的Qβ VLP(从大肠杆菌中纯化)不含与从ZnSO4和寡脱氧核苷酸处理的Qβ衣壳中提取的大小相似的核酸。另外，从后一种VLP中分离的核酸与重装配反应中使用的寡脱氧核苷酸共迁移。该结果证实，所用的寡脱氧核苷酸被包装于ZnSO4处理的Qβ衣壳内。
实施例12向VLP内包装免疫刺激性核酸后抗原性肽的偶联
RNaseA和ZnSO4介导的VLP核酸内容物的降解Qβ VLP如实施例9所述在低离子强度条件下(20mM Hepes pH7.4或4mM Hepes，30mM NaCl，pH7.4)用RNaseA处理。类似地处理如实施例2、3、7、10所述的其它VLP，即GA、BKV、HBcAg和AP205。此外，Qβ VLP和AP205 VLP也在如实施例11所述的低离子强度条件(20mM Hepes pH7.4或4mM Hepes，30mM NaCl pH7.4)下用ZnSO4处理。在Eppendorf恒温混匀器中，溶于20mM Hepes pH7.4或20mM Hepes，1mM Tris，pH7.4中的AP205 VLP(1mg/ml)在50℃和550rpm下用2.5mM ZnSO4处理48小时。Qβ和AP205 VLP样品如实施例11所述澄清，上清液在10,000 MWCO Spectra/Por透析管(Spectrum，货号128 118)中在4℃下首先用2L 20mM Hepes，pH7.4透析2小时，然后在更换缓冲液后透析过夜。如实施例11所述，在透析后澄清样品，通过Bradford分析测定上清液中的蛋白质浓度。
将ISS包装到RNaseA和ZnSO4处理的VLP内在RNA水解和透析后，Qβ和AP205 VLP(1-1.5mg/ml)与每mlVLP 130μl CpG寡核苷酸(NKCpG，G10-PO-参见表2；G3-6，G8-8-参见表3；在10mM Tris pH8中的1mM寡核苷酸贮存液)混合。样品在恒温摇床上以650rpm 37℃孵育3小时。随后在透析前，在2mMMgCl2存在下，用125U Benzonase/ml VLP(Merck KGaA，Darmstadt，德国)处理样品，并37℃孵育3小时。样品在4℃下在300,000 MWCOSpectra/Por透析管(Spectrum，货号131 447)中用20mM Hepes，pH7.4透析2小时，更换缓冲液后用相同缓冲液透析过夜。透析后，样品如实施例11所述澄清，上清液中的蛋白质浓度通过Bradford分析来测定。
免疫原性肽与包装有ISS的VLP的偶联包装有ISS的Qβ VLP与含有C端GGC延伸(KAVYNFATM-GGC)(SEQ ID NO82)的p33肽偶联，产生被称为Qb-ISS-33 VLP的QβVLP。包装的Qβ VLP在20mM Hepes，pH7.4中用10倍摩尔过量的SMPH(Pierce)在25℃下衍化0.5小时，然后在4℃下用20mM HEPES，pH7.4透析两次各2小时，以除去未反应的SMPH。向透析过的衍化混合物中加入5倍摩尔过量的肽，使之在恒温混匀器中25℃反应2小时。样品在300,000 MWCO Spectra/Por透析管中用20mM Hepes，pH7.4在4℃下透析2小时，并在更换缓冲液后，用相同缓冲液透析过夜。透析后，如实施例11所述澄清样品，上清液中的蛋白质浓度通过Bradford分析来测定。肽p33与Qβ的偶联在16％ PAGE Tris-甘氨酸凝胶(Novex，Invitrogen，货号EC64952)上通过SDS-PAGE分析，其中使用含有2％ SDS和β-巯基乙醇或DTT的样品缓冲液。如实施例7所述，包装在1％琼脂糖凝胶上分析，并且在蛋白酶K消化后在TBE/尿素凝胶上分析。
对如上所述的包装有G8-8寡核苷酸的AP205 VLP(1.24mg/ml)进行衍化，并且与含有N端C延伸的MelanA 16-35 A/L(cGHGHSYTTAE ELAGIGILTV)(SEQ ID NO55)偶联，产生AP205-G8-8-MelanA VLP。AP205 VLP(包装有G8-8)在20mM Hepes，pH7.4中用20倍摩尔过量的SMPH 25℃衍化0.5小时，然后在4℃下用20mM HEPES，pH7.4透析两次，以除去未反应的SMPH。向透析过的衍化混合物中加入10倍摩尔过量的肽，使之在恒温混匀器中25℃反应2小时。样品在4℃下在10,000 MWCO透析管中用20mMHepes pH7.4透析2小时，并且在更换缓冲液后用相同的缓冲液透析过夜。透析后，样品如实施例11所述澄清，上清液中的蛋白质浓度通过Bradford分析来测定。肽MelanA 16-35 A/L与AP205的偶联效率在16％ PAGE Tris-甘氨酸凝胶上通过SDS-PAGE分析。包装于AP205内的G8-8寡核苷酸利用1％琼脂糖凝胶分析，并且如实施例7所述在蛋白酶K消化后利用TBE/尿素凝胶分析AP205-G8-8-MelanA16-35 A/L中G8-8寡核苷酸的量。
RNAseA和ZnSO4处理的Qβ VLP在与p33肽偶联之前及之后与NKCpG的包装通过琼脂糖凝胶电泳加以分析。含有NKCpG寡核苷酸并且随后与p33肽偶联的Qβ VLP被称为Qb-NKCpG-33 VLP。在1％琼脂糖凝胶上，在溴化乙锭染色的凝胶上可见的荧光带与在考马斯蓝染色的凝胶上可见的蛋白带共迁移，证明了包装。因此，在包装后，RNaseA和ZnSO4处理的Qβ VLP在与p33肽偶联之前及之后都含有NKCpG寡核苷酸。p33肽的偶联效率仍然保持，这可以根据在16％PAGE Tris-甘氨酸凝胶上进行SDS-PAGE分析后可见的多偶联产物来判断，这些产物显现为比残余的不与肽反应的Qβ VLP亚单位单体迁移更慢的条带。包装效率可以根据TBE/尿素凝胶的分析，通过比较包装的Qb-NKCpG-33泳道中的寡核苷酸信号与加样到同一块凝胶上的寡核苷酸标准的信号来估计。包装的NKCpG的量为1-4nmol/100μg Qb-NKCpG-33 VLP。
G8-8寡核苷酸向Qβ VLP内的包装以及随后与p33肽的偶联通过琼脂糖凝胶电泳来分析。含有G8-8寡核苷酸并且随后与p33肽偶联的Qβ VLP被称为Qb-G8-8-33 VLP。包装有G8-8的Qβ VLP的溴化乙锭染色在溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶上可以看到。溴化乙锭荧光带与在随后用考马斯蓝染色的同一块凝胶上可见的Qβ VLP蛋白带共迁移，证明了包装。通过在16％ PAGE Tris-甘氨酸凝胶上进行SDS-PAGE分析，估计偶联效率为30％。Qb-G8-8-33 VLP的G8-8含量的分析在1％琼脂糖凝胶上进行，其中包装的寡核苷酸的量约为1nmol/100μg Qb-G8-8-33 VLP。
G8-8寡核苷酸向AP205 VLP内的包装通过琼脂糖凝胶电泳分析。包装有G8-8的AP205 VLP的染色在溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶上可见。在随后用考马斯蓝染色的同一凝胶上检测到的AP205VLP蛋白带的共迁移证明了包装。与MelanA 16-35A/L肽的偶联效率可以根据在16％ PAGE Tris-甘氨酸凝胶上进行的SDS-PAGE分析来估计，其中可见多偶联带，它们的迁移慢于残余的不与该肽反应的AP205 VLP单体亚单位。将偶联效率与获得的Qb-G8-8-33 VLP的偶联效率相比较。与MelanA 16-35 A/L偶联后对AP205 VLP的G8-8寡核苷酸内容物的分析可以在TBE/尿素凝胶电泳上看到。
实施例13向VLP内包装侧翼为鸟苷的免疫刺激性寡核苷酸Qbx33 VLP(与肽p33偶联的Qβ VLP，参见实施例9)在如实施例9所述的低离子强度条件(20mM Hepes pH7.4)下用RNaseA处理，以水解Qbx33 VLP的RNA内容物。用20mM Hepes，pH7.4透析后，Qbx33 VLP与侧翼为鸟苷的寡核苷酸(表2G10-PO；表3G3-6，G7-7，G8-8，G9-9或G6，来自在10mM Tris pH8中的1mM贮存液)混合，并如实施例12所述孵育。随后，Qbx33 VLP用Benzonase处理，并在300,000 MWC0管中透析。含oligos G7-7、G8-8和G9-9的样品充分透析3天，其中更换4次缓冲液，以除去游离的oligo。如实施例7所述，利用1％琼脂糖凝胶、以及在蛋白酶K消化后利用TBE/尿素凝胶来分析包装。
表3.在实施例中使用的免疫刺激性核酸的序列
G3-6、G6、G8-8寡核苷酸在RNaseA处理的Qbx33 VLP中的包装通过琼脂糖凝胶电泳来分析。在寡核苷酸包装后，在溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶上可见比未处理的参照Qβ VLP迁移略慢的荧光带，表明寡核苷酸的存在。该信号在Benzonase处理后仍然保留，表明寡核苷酸在Qbx33 VLP内的包装。包装效率可以根据TBE/尿素凝胶电泳来估计。包装的G3-6寡核苷酸的量(约4nmol/100μg Qbx33 VLP)大大高于包装的G8-8寡核苷酸的量(约1nmol/100μg Qbx33 VLP)。这表明包装能力对位于CpG基序侧翼的鸟苷核苷酸尾的长度的依赖性。
实施例14向VLP内包装核糖核酸VLP核酸内容物的ZnSO4依赖的降解Qβ VLP在如实施例11所述的低离子强度条件(20mM Hepes pH7.4或4mM Hepes，30mM NaCl，pH7.4)下用ZnSO4处理。在Eppendorf恒温混匀器中，在20mM Hepes pH7.4或20mM Hepes，1mM Tris，pH7.4中的AP205 VLP(1mg/ml)用2.5mM ZnSO4在50℃和550rpm下处理48小时。如实施例11所述澄清Qβ和AP205 VLP样品，并如实施例12所述用20mM Hepes，pH7.4透析。
向ZnSO4处理的VLP内包装Poly(IC)将免疫刺激性核糖核酸Poly(IC)(货号27-4732-01，poly(I)·poly(C)，Pharmacia Biotech)溶解于PBS(Invitrogen，货号14040)或水中，使浓度为4mg/ml(9μM)。Poly(IC)在60℃下孵育10分钟，然后冷却至37℃。将孵育的Poly(IC)以10倍摩尔过量加到ZnSO4处理的Qβ或AP205 VLP(1-1.5mg/ml)中，混合物在恒温混匀器中以650rpm37℃孵育3小时。随后在恒温混匀器中以300rpm，在2mM MgCl2存在下与每ml VLP混合物125U Benzonase 37℃孵育3小时，来酶水解过量的游离Poly(IC)。Benzonase水解后，如实施例11所述澄清样品，上清液在4℃下在300,000 MWCO Spectra/Por透析管(Spectrum，货号131 447)中用2L 20mM Hepes，pH7.4透析2小时，并且在更换缓冲液后用相同缓冲液透析过夜。透析后，如实施例11所述澄清样品，上清液中的蛋白质浓度通过Bradford分析测定。
免疫原性肽与包装有Poly(IC)的VLP的偶联对包装有Poly(IC)的QβVLP(1mg/ml)进行衍化，并且与如实施例12所述的p33肽(KAVYNFATM-GGC)(SEQ ID NO82)或MelanA肽(MelanA 16-35A/L CGHGHSYTTAEELAGIGILTV)(SEQ ID NO55)偶联，分别得到Qb-pIC-33和Qb-pIC-MelanA VLP。为了与MelanA肽偶联，包装的QβVLP用2.1倍摩尔过量的SMPH(Pierce)在25℃下衍化0.5小时，然后在4℃下用20mM HEPES，pH7.4进行两次透析步骤，以除去未反应的SMPH。加入2.1倍摩尔过量的肽，使之在恒温混匀器中25℃反应1.5小时。样品在300,000 MWCO Spectra/PorCE Dispo透析器中用20mM Hepes，pH7.2在4℃下透析3小时，并且在更换缓冲液后用相同缓冲液透析过夜。透析后，如实施例11所述澄清样品，上清液中的蛋白质浓度通过Bradford分析来测定。肽p33和肽MelanA与Qβ的偶联通过在16％ PAGE Tris-甘氨酸凝胶上进行的SDS-PAGE来分析。如实施例7所述，利用1％琼脂糖凝胶，以及在蛋白酶K消化后利用TBE/尿素凝胶来分析包装。
Poly(IC)包装到ZnSO4处理的Qβ VLP内以及与MelanA肽偶联产生Qb-pIC-MelanA VLP通过琼脂糖凝胶电泳来分析。在溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶上可见的荧光信号表明存在核酸，它与在考马斯蓝染色凝胶后可见的蛋白带共迁移，证明了包装。MelanA肽的偶联效率通过在16％PAGE Tris-甘氨酸凝胶上进行的SDS-PAGE分析来估计。多偶联产物显现为比不与肽反应的Qβ VLP单体亚单位迁移慢的条带。MelanA的偶联效率与Qb-G8-8-33 VLP获得的偶联效率(实施例12)大体上相当，但是略低。向Qb-pIC-MelanA内的包装效率可以根据TBE/尿素凝胶来估计；Qβ中Poly(IC)的包装量约为25pmol，在MelanA偶联后仍然相同。
对包装有Poly(IC)的AP205VLP(1mg/ml)进行衍化，并且与含有N端C延伸的MelanA 16-35A/L(cGHGHSYTTAE ELAGIGILTV)(SEQ ID NO55)偶联，产生AP205-G8-8-MelanA VLP。AP205 VLP在20mM Hepes，pH7.4中用20倍摩尔过量的SMPH在25℃下衍化0.5小时，然后用20mM HEPES，pH7.4在4℃下透析两次，以除去未反应的SMPH。向透析过的衍化混合物中加入10倍摩尔过量的肽，使之在恒温混匀器中25℃反应2小时。样品在4℃下在10,000 MWCO透析管中用20mM Hepes pH7.4透析2小时，并且在更换缓冲液后用相同的缓冲液透析过夜。透析后，样品如实施例11所述澄清，上清液中的蛋白质浓度通过Bradford分析来测定。肽MelanA 16-35 A/L与AP205的偶联效率通过在16％ PAGE Tris-甘氨酸凝胶上进行的SDS-PAGE来分析。如实施例7所述，利用1％琼脂糖凝胶，以及在蛋白酶K消化后利用TBE凝胶来分析Poly(IC)的包装。
Poly(IC)向ZnSO4处理的AP205 VLP内的包装以及与MelanA肽偶联后的偶联产物AP205-pIC-MelanA通过琼脂糖凝胶电泳分析。经16％ PAGE Tris-甘氨酸凝胶电泳进行SDS-PAGE分析后，根据多偶联产物的出现来估计MelanA肽的偶联效率，这些偶联产物显示为比不与肽反应的AP205 VLP亚单位单体迁移更慢的条带。包装效率可以根据TBE凝胶来估计。
实施例15向HBcAg VLP内包装侧翼为鸟苷的免疫刺激性寡核苷酸HBcAg VLP在如实施例9所述的低离子强度条件(20mM HepespH 7.4)下用RNaseA处理，以水解VLP的RNA内容物。用20mMHepes，pH7.4透析后，VLP与侧翼为鸟苷的寡核苷酸(表3；G3-6，G7-7，G8-8，G9-9，G10-PO或G6，在10mM Tris pH8中的1mM贮存液)混合，如实施例12所述孵育。然后用Benzonase处理VLP，并在300,000 MWCO管中透析。如实施例7所述，利用1％琼脂糖凝胶、以及在蛋白酶K消化后利用TBE/尿素凝胶来分析包装。
实施例16向GA VLP内包装侧翼为鸟苷的免疫刺激性寡核苷酸GA VLP在如实施例9所述的低离子强度条件(20mM Hepes pH7.4)下用RNaseA处理，以水解VLP的RNA内容物。用20mM Hepes，pH 7.4透析后，VLP与侧翼为鸟苷的寡核苷酸(表3；G3-6，G7-7，G8-8，G9-9，G10-PO或G6，在10mM Tris pH8中的1mM贮存液)混合，并如实施例12所述孵育。之后用Benzonase处理VLP，并在300,000 MWCO管中透析。如实施例7所述，利用1％琼脂糖凝胶、以及在蛋白酶K消化后利用TBE/尿素凝胶来分析包装。
实施例17向HBcAg VLP内包装核糖核酸HBcAg VLP在如实施例11所述的低离子强度条件(20mM HepespH7.4或4mM Hepes，30mM NaCl，pH7.4)下用ZnSO4处理，并且如实施例12所述用20mM Hepes，pH7.4透析。向HBcAg VLP(1-1.5mg/ml)中加入10倍摩尔过量的Poly(IC)，如实施例14所述在恒温混匀器中以650rpm 37℃孵育3小时。随后在恒温混匀器中以300rpm，在2mM MgCl2存在下与每ml VLP混合物125U Benzonase 37℃孵育3小时，从而酶水解过量的游离Poly(IC)。样品如实施例11所述在Benzonase水解后澄清，并且如实施例14所述透析。透析后，如实施例11所述澄清样品，上清液中的蛋白质浓度通过Bradford分析测定。将包装有Poly(IC)的HBcAg VLP(1mg/ml)进行衍化并且与MelanA偶联，如实施例14所述透析。
实施例18向GA VLP内包装核糖核酸GA VLP在如实施例11所述的低离子强度条件(20mM Hepes pH7.4或4mM Hepes，30mM NaCl，pH7.4)下用ZnSO4处理，并且如实施例12所述用20mM Hepes，pH7.4透析。向GA VLP(1-1.5mg/ml)中加入10倍摩尔过量的Poly(IC)，如实施例14所述在恒温混匀器中以650rpm 37℃孵育3小时。随后在恒温混匀器中以300rpm，在2mMMgCl2存在下与每ml VLP混合物125U Benzonase 37℃孵育3小时，从而酶水解过量的游离Poly(IC)。样品如实施例11所述在Benzonase水解后澄清，并且如实施例14所述透析。透析后，如实施例11所述澄清样品，上清液中的蛋白质浓度通过Bradford分析测定。将包装有Poly(IC)的GA VLP(1mg/ml)进行衍化并与MelanA偶联，如实施例14所述透析。
实施例19Qβ的解装配、重装配及寡脱氧核苷酸的包装Qβ VLP的解装配和重装配解装配在室温及搅拌条件下，45mg Qβ VLP(2.5mg/ml，通过Bradford分析测定)在PBS(20mM磷酸盐，150mM NaCl，pH7.5)中用10mM DTT还原15分钟。加入氯化镁至终浓度为700mM后在室温和搅拌条件下进行15分钟的第二次孵育，使包裹的宿主细胞RNA沉淀，并伴随着VLP的分解。溶液在4℃下以4000rpm离心10分钟(Eppendorf 5810R，下列所有步骤中均使用的固定角转头A-4-62)，以从溶液中分离沉淀的RNA。对含有释放的二聚体Qβ外壳蛋白的上清液进行层析纯化步骤。
通过阳离子交换层析和大小排阻层析对Qβ外壳蛋白的两步纯化法解装配反应的上清液含有二聚体外壳蛋白、宿主细胞蛋白质和剩余的宿主细胞RNA，将该上清液上SP-Sepharose FF柱(xk16/20；6ml；Amersham Bioscience)。在以5ml/min的流速在室温下进行的层析过程中，监测260nm和280nm处的吸光度。层析柱用20mM磷酸钠缓冲液pH7平衡；样品用水1∶15稀释，以将电导率调节为低于10mS/cm，以便实现外壳蛋白与该柱的适当结合。用达到20mM磷酸钠/500mM氯化钠的分步梯度对结合的外壳蛋白进行洗脱，以约25ml的级分体积收集蛋白质。该柱用0.5M NaOH再生。
第二步，将分离的Qβ外壳蛋白二聚体(从阳离子交换柱上洗脱下来的级分)上到(分两次)用20mM磷酸钠/250mM氯化钠；pH6.5平衡的Sephacryl S-100HR柱上(xk26/60；320ml；Amersham Bioscience)。在室温下以2.5ml/min的流速进行层析。监测260nm和280nm处的吸光度。以每份5ml收集级分。该柱用0.5M NaOH再生。
通过透析重装配在寡脱氧核苷酸G8-8或G10-PO的存在下QβVLP的重装配使用浓度为2mg/ml的纯化Qβ外壳蛋白二聚体的贮存液。重装配混合物中寡脱氧核苷酸的浓度为10μM。重装配混合物中外壳蛋白二聚体的浓度为40μM(约1.13mg/ml)。向溶液中加入尿素和DTT的贮存液，使终浓度分别为1M尿素和5mM DTT。加入寡脱氧核苷酸作为最后的成分，并且加入H2O，使重装配反应的终体积为3ml。该溶液在4℃下用1500ml含有20mM TrisHCl、150mM NaCl pH8.0的缓冲液透析72小时。透析后的重装配混合物在4℃下以14000rpm离心10分钟。弃去微量的沉淀，而上清液中含有重装配且包装的VLP。重装配且包装的VLP用离心过滤装置(Millipore，UFV4BCC25，5K NMWL)浓缩至蛋白质终浓度为3mg/ml。蛋白质浓度通过Bradford分析来测定。
利用大小排阻层析纯化重装配且包装的VLP将可达10mg的总蛋白质上到用20mM HEPES，150mM NaCl，pH7.4平衡的SepharoseTMCL-4B柱上(xk16/70，Amersham Biosciences)。在室温下以0.4ml/min的流速进行层析。监测260nm和280nm处的吸光度。观察到两个峰，以0.5ml的级分体积收集，并且通过SDS-PAGE分析。通过非还原SDS-PAGE分析重装配且纯化的Qβ衣壳中的二硫键模式。5μg所述衣壳与不含还原剂的样品缓冲液(含有SDS)混合，并加样到16％Tris-甘氨酸凝胶上。电泳完成后，凝胶用考马斯蓝染色。与从大肠杆菌中纯化的“完整”衣壳相比，重装配的Qβ VLP展示相同的二硫键模式，具有对应于Qb外壳蛋白的二聚体、三聚体、四聚体、五聚体和六聚体的条带。用来自大肠杆菌的完整和高度纯化的Qβ衣壳校准该柱显示第一主峰的表观分子量与Qβ衣壳相符。
通过渗滤重装配(优化的方法)20ml纯化外壳蛋白的贮存液(1.5mg/ml)与尿素、DTT、寡脱氧核苷酸G10-PO的贮存液和水混合。加入寡脱氧核苷酸作为最后的成分。该混合液的体积为30ml，各成分的终浓度为35μM二聚体外壳蛋白(对应于1mg/ml)、35μM寡脱氧核苷酸、1M尿素和2.5mM DTT。然后在正切流动过滤装置中使用Pellicon XL膜柱(Biomax 5K，Millipore)，在室温下用300ml 20mM磷酸钠/250mM氯化钠，pH7.2渗滤该混合物。总流速设置为10ml/min，渗透流速设置为2.5ml/min。渗滤步骤结束后，向溶液中加入H2O2至终浓度为7mM，溶液进一步在室温下孵育60分钟，以加速形成的VLP中结构二硫键的形成。通过使用Pellicon XL膜柱(PLCMK 300K，Millipore)，用600ml 20mM磷酸钠/250mM氯化钠，pH7.2进行第二次渗滤，来去除未掺入的寡脱氧核苷酸和外壳蛋白。
在寡脱氧核苷酸存在下重装配的Qβ VLP的分析A)重装配衣壳的流体动力学大小在寡脱氧核苷酸G8-8存在下重装配的Qβ衣壳通过动态光散射(DLS)进行分析，并与从大肠杆菌中纯化的完整Qβ VLP进行比较。重装配的衣壳显示与完整Qβ VLP相同的流体动力学大小(取决于质量和构象)。
B)重装配的衣壳中二硫键的形成重装配的Qβ VLP通过非还原聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析，并与从大肠杆菌中纯化的完整QβVLP进行比较。重装配的衣壳显示与完整Qβ VLP(如上所述)相似的带型，存在二硫键连接的五聚体和六聚体形式的外壳蛋白。
C)通过变性聚丙烯酰胺TBE-尿素凝胶电泳对在寡脱氧核苷酸存在下重装配的Qβ VLP的核酸内容物进行分析在2mM MgCl2存在下，含有G8-8寡脱氧核苷酸的重装配的Qβ VLP(0.4mg/ml)与每mlQβ VLP 125 U benzonase一起37℃孵育2小时。随后如实施例7所述，用蛋白酶K(PCR级，Roche Molecular Biochemicals，货号1964364)处理经benzonase处理的Qβ VLP。反应液然后与TBE-尿素样品缓冲液混合，并加样到15％聚丙烯酰胺TBE-尿素凝胶上(Novex，Invitrogen，货号EC6885)。将1pmol、5pmol和10pmol用于重装配反应的寡脱氧核苷酸加样到同一块凝胶上，作为定性及定量标准。该凝胶用SYBR-Gold(Molecular Probes货号S-11494)染色。SYBR-Gold染色显示，重装配的Qβ衣壳含有与重装配反应中使用的寡脱氧核苷酸共迁移的核酸。在寡脱氧核苷酸存在下重装配的Qβ VLP的核酸内容物对benzonase消化具有抗性，而且通过蛋白酶K消化从纯化的颗粒中分离到寡脱氧核苷酸，将这些综合起来，证明了寡脱氧核苷酸的包装。
实施例20来源于MelanA黑素瘤抗原的肽与Qb的偶联表4.化学合成下列MelanA肽部分
*A/L表示与原始野生型MelanA肽相比，丙氨酸变为赖氨酸**来自接头序列的氨基酸用小写字母表示
MelanA肽部分与Qb VLP的化学偶联使用下列程序对于肽MelanA 16-35、MelanA 16-35A/L和MelanA 26-35-C A/L2ml 3.06mg/ml Qb VLP在20mM Hepes，pH7.2中的溶液与18.4μl 50mM SMPH(琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚氨基丙酰氨基)己酸，Pierce)在DMSO中的溶液在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液然后用2L 20mM Hepes，pH7.2在4℃下透析2次各2小时。2ml透析过的反应混合物然后与18.4μl 50mM肽贮存液(溶于DMSO)在25℃摇床上反应2小时。反应混合物然后在4℃下用2升20mM Hepes，pH7.2透析2次各2小时。偶联产物被称为Qb-MelanA 16-35(SEQ ID NO54)、Qb-MelanA 16-35 A/L(SEQ ID NO55)和Qb-MelanA 26-35-C A/L(SEQ ID NO60)。对于MelanA 26-352ml 3.06mg/ml Qb衣壳蛋白在20mM Hepes，pH7.2中的溶液与75.3μl 50mM SMPH的DMSO溶液在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液然后在4℃下用2L 20mMHepes，pH7.2透析两次各2小时。2ml透析过的反应混合物然后与37.7μl 50mM肽贮存液(溶于DMSO)在25℃摇床上反应4小时。反应混合物然后在4℃下用2升20mM Hepes，pH7.2透析2次各2小时。偶联产物被称为Qb-MelanA 26-35。
对于MelanA 26-35A/L(SEQ ID NO57)2ml 3.06mg/ml Qb VLP在20mM Hepes，pH7.2中的溶液与37.7μl 50mM SMPH的DMSO溶液在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液然后在4℃下用2L 20mMHepes，pH7.2透析2次各2小时。2ml透析后的反应混合物然后与18.4μl 50mM肽贮存液(溶于DMSO)在25℃摇床上反应4小时。反应混合物然后在4℃下用2升20mM Hepes，pH7.2透析2次各2小时。偶联产物被称为Qb-MelanA 26-35A/L。
对于MelanA 20-40A/L(SEQ ID NO58)2ml 3.06mg/ml Qb VLP在20mM Hepes，pH7.2中的溶液与18.4μl 50mM SMPH的DMSO溶液在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液然后在4℃下用2L 20mMHepes，pH7.2透析2次各2小时。2ml透析后的反应混合物然后与184μl 50mM肽贮存液(溶于DMSO)在25℃摇床上反应4小时。反应混合物然后在4℃下用2升20mM Hepes，pH7.2透析2次各2小时。偶联产物被称为Qb-MelanA 20-40 A/L。
对于MelanA 26-40A/L(SEQ ID NO59)2ml 3.06mg/ml Qb VLP在20mM Hepes，pH7.2中的溶液与37.7μl 50mM SMPH的DMSO溶液在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液然后在4℃下用2升20mMHepes，pH7.2透析2次各小时。2ml透析后的反应混合物然后与184μl5mM肽贮存液(溶于DMSO)在25℃摇床上反应4小时。反应混合物然后在4℃下用2升20mM Hepes，pH7.2透析2次各2小时。偶联产物被称为Qb-MelanA 26-40A/L。
偶联效率通过SDS-PAGE分析来检测。图1显示Qb-MelanA VLP的SDS-PAGE分析。MelanA-肽与Qb VLP偶联。终产物与样品缓冲液混合，并且在125V电压和还原条件下在16％ Novex Tris-甘氨酸凝胶上分离1.5小时。通过将凝胶浸没在考马斯蓝溶液中来染色分离的蛋白质。在50％甲醇、8％乙酸中洗涤凝胶以除去背景染色。分子量标准(P 77085，New England BioLabs，Beverly，USA)用作Qb-MelanA迁移速度的参照(泳道1)。加样14μg单独的Qb(泳道2)或用SMPH衍化的Qb(泳道3)，与8μg的下列各种终产物进行比较Qb-MelanA16-35(泳道4)，Qb-MelanA 16-35A/L(泳道5)，Qb-MelanA 26-35(泳道6)和Qb-MelanA 26-35A/L(泳道7)。
MelanA 16-35A/L肽含有细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位MelanA26-35，进一步研究Qb-MelanA 16-35A/L在体外和体内的免疫原性。
实施例21Qβ MelanA 16-35A/L VLP被树突细胞加工，并且在体外呈递给T细胞MelanA-特异性T细胞的体外产生为了评价Qb-MelanA 16-35 A/L疫苗的免疫原性，在体外产生MelanA-特异性T细胞。如前所述(Salusto，F.et al.1994，J.Exp.Med.1791109)，从HLA-A2健康志愿者中获得未成熟的单核细胞来源的树突细胞(DC)。在37℃下对DC(0.5×106/孔)进行模拟脉冲或用40μg/ml Qb-MelanA 16-35A/L脉冲2小时。为了提高MelanA-特异性CTL前体的频率，通过磁力分选(Miltenyi Biotech)从PBMC中分离自体CD8T细胞。向抗原脉冲的DC中加入1×106/孔CD8T细胞。在第3天向细胞培养物中加入浓度为10U/ml的IL-2，到第12天提高到可达50U/ml。
如前所述(Romero，P.et al，1998，J.Exp.Med.1998，1881641)，通过用由载有MelanA 26-35肽的HLA-A2(HLA-A2-MelanA-PE)制得的藻红蛋白(PE)-标记的四聚体染色，分析细胞系中MelanA-特异性CD8T细胞的扩增。细胞在室温下用HLA-A2-MelanA 26-35-PE标记1小时，然后加入抗-CD8-FITC抗体(BD PharMingen，San Jose，USA)，在冰上保持30分钟。洗涤后，利用CellQuest软件在FACS Calibur上分析细胞。在前向散射和侧向散射中获得细胞，并且门控(gate)淋巴细胞。从该淋巴细胞群体中只选择CD8阳性T细胞进行进一步分析。MelanA-特异性CD8+T细胞的量计算为HLA-A2-MelanA阳性细胞占CD8+淋巴细胞的百分数。Qb-MelanA 16-35 A/L疫苗诱导MelanA26-35 A/L-特异性CTL(CD8 T细胞的9.7％)增殖，证明该疫苗被人DC有效吸收，被加工为CTL表位(MelanA 26-35 A/L)，并且被呈递给T细胞。
如前所述(Knuth，A.1989，PNAS，862804)，MelanA CTL通过FACS分选法富集(FACSVantage，Becton Dickenson)，并且通过有限稀释来克隆。选择CTL克隆用HLA-A2-MelanA-PE四聚体进行正染色。CTL定期用植物凝集素活化的照射的异源PBMC再刺激。
CTL克隆的抗原识别的分析进行51Cr释放试验，来分析MelanA CTL克隆的功能活性。APC与10-6M MelanA 26-35 A/L肽一起孵育1.5小时，或者与10-6M流感M1肽孵育作为阴性对照。APC与Cr51孵育，以测定肽脉冲时放射性核苷酸的非特异性摄取。在充分洗涤以除去残留的抗原和放射性后，104/孔APC与不同数量的MelanA特异性T细胞一起孵育5小时。收集上清液，按照下列公式计算MelanA特异性T细胞对呈递MelanA的APC的特异性裂解％特异性裂解＝((cpm实验-cpm自发)/(cpm最大-cpm自发))×100，其中cpm实验是实验样品中测得的放射性计数，cpm自发是不加入T细胞而从51Cr脉冲的APC中获得的计数，cpm最大是从用1％NP-40裂解的51Cr脉冲的APC中获得的计数。
载有MelanA 26-35 A/L而不载有无关M1肽的APC被CTL有效裂解(70-85％特异性裂解)，这证实了CTL克隆的抗原特异性。
实施例22免疫刺激性序列(ISS)在体外激活人细胞的能力为了选择将要装入Qb-MelanA疫苗中的最佳ISS，检测含有不同数量侧翼G或双链RNA如Poly(IC)的系列CpG上调人CD8 T细胞上的CD69以及诱导人PBMC分泌IFNα和IL-12的能力。
从血沉棕黄层中分离人PBMC，在含有10％ FCS的RPMI培养基中用所述ISS处理18小时。使用PBL Biomedical Laboratories提供的抗体组，通过ELISA测定上清液中的IFNα。PBMC周小鼠抗人CD8-FITC、小鼠抗人CD19-PE和抗人CD69-APC染色，并且通过流式细胞法分析。G10-PO是在诱导IFNα分泌方面最具活性的ISS(图2A)。G9-9和G8-8比G10-PO活性略低，尽管它们也诱导高水平的IFNα分泌。减少其它寡核苷酸中的侧翼G的数量导致IFNα分泌减少。Poly(IC)处理的PBMC不释放任何IFNα，尽管Poly(IC)处理的来自PBMC的T细胞和B细胞上调CD69(图2B)。Poly(IC)也诱导PBMC和单核细胞来源的DC分泌IL-12。
用G10-PO、G9-9和G8-8处理PBMC将CD8T细胞的细胞膜上的CD69上调到几乎相似的程度。减少其它寡核苷酸中侧翼G的数量(少于7个)降低了它们诱导IFNα分泌(图2A)和上调T细胞上的CD69的能力(图2B)。这些数据表明，G10-PO、G9-9和G8-8对人细胞有相似的高活性，因此它们能够在Qb-MelanA疫苗中用作ISS。
实施例23G10-PO增强MelanA-特异性T细胞的体外扩增在存在或不存在G10-PO的条件下检测了Qb-MelanA VLP诱导MelanA特异性CTL体外增殖的能力。未成熟的人单核细胞来源的DC(0.5×106/孔)如实施例21所述用Qb-MelanA 16-35 A/L或MelanA26-35A/L肽脉冲或模拟脉冲。人单核细胞来源的DC是toll样受体-9(TLR-9)阴性的，因此不对CpG应答。人PBMC中存在的B细胞和类浆细胞DC是TLR-9阳性的，响应CpG处理产生细胞因子(IFNα、IL-12)。为了研究G10-PO对单核细胞来源的DC的抗原呈递能力的作用，洗涤抗原脉冲的DC，并且在存在或不存在2μM G10-PO的条件下将其与1×106自体PBMC一起孵育2小时。向APC中加入通过磁力分选分离的自体CD8T细胞(1×106)，使用实施例21所述的细胞培养条件孵育12天。MelanA-特异性CTL通过HLA-A2-MelanA-PE四聚体染色和流式细胞分析来检测。向Qb-MelanA-脉冲的DC中加入G10-PO提高了特异性CTL的频率(从10％到14％)，这表明CpG刺激产生的细胞因子环境有利于CTL的体外扩增。
实施例24载有G3-6、G6、G10-PO或Poly(IC)的Qbx33 VLP诱导对抗p33-重组痘苗病毒攻击的保护B6小鼠用单独的Qbx33或载有G3-6或G6或Poly(IC)的Qbx33(参见实施例12和14)皮下免疫。8天后，小鼠用1.5×106pfu的表达LCMV-p33抗原的重组痘苗病毒进行攻击。4天后，杀死小鼠，如前所述测定卵巢中的病毒滴度(Bachmann et al，Eur.J.Imunol.1994，242228)。如图3所示，接受载有G3-6或G6或Poly(IC)的Qbx33疫苗的所有小鼠都受到对抗病毒攻击的保护。相反，幼稚(naive)小鼠和用单独的Qbx33免疫的小鼠未从卵巢中清除病毒。这些数据证明，单独的VLP不足以诱导保护性CTL免疫应答，而载有CpG或Poly(IC)的VLP在引发幼稚CTL方面非常有效。
同样，用载有G10-PO的Qbx33免疫小鼠引发了p33特异性CTL(6.2％+/-1.4％，相对于幼稚小鼠中的0.2％+/-0.1％)，并且诱导了对抗重组痘苗病毒攻击的保护。
实施例25在HLA-A2转基因小鼠中，Qβ MelanA 16-35A/L VLP被加工并且被人MHC I类等位基因HLA-A0201呈递，并且诱导功能性MelanA-特异性CD8+T细胞的扩增HHD小鼠表达嵌合单链I类分子，该分子含有的人β2-微球蛋白共价连接到与Db α3域融合的A2 α1和α2域的N端(Firat，H.et al1999，Eur.J.Immunol.，293112)。HLA-A2转基因在这些小鼠中的表达允许研究Qβ MelanA 16-35A/L VLP被加工并且被作为CTL表位MelanA 26-35呈递以及在体内引发CTL的能力。此外，也能够在体内研究佐剂作为ISS的作用。
HHD小鼠不予处理或者通过皮下注射100μg Qb-MelanA 16-35A/L或Qb-pIC-MelanA 16-35 A/L进行免疫。8天后分离脾细胞，将其重悬浮于FACS缓冲液(PBS，2％ FCS，5mM EDTA，pH8.2)，用HLA-A2-MelanA-PE标记的四聚体在室温下染色30分钟。第二步，加入大鼠抗小鼠CD8-APC(BD PharMingen，San Jose，USA)和抗小鼠Mel14-FITC(BD PharMingen，San Jose，USA)，4℃下保持30分钟。洗涤后，在室温下用BD-裂解溶液(BD Biosciences，San Jose，USA)裂解红细胞10分钟。最后，利用CellQuest软件在FACS Calibur上分析脾细胞。首先，在前向散射和侧向散射中获得细胞，并且门控淋巴细胞。从该淋巴细胞群体中只选择CD8阳性T细胞进行进一步分析。HLA-A2-MelanA-PE和Me114-FITC标记的细胞分别用FL2和FL1检测器检测。MelanA-特异性活化CD8+T细胞的量计算为HLA-A2-MelanA阳性Mel14阴性细胞占总CD8+淋巴细胞的百分数。
流式细胞分析表明，Qb-pIC-MelanA 16-35 A/L诱导MelanA-特异性活化CD8+Mel14-T细胞的高得惊人的扩增(2.43％和0.73％)，其高于未处理的动物(0.22％和0.37％)。应当指出，只有当Qb-MelanA载有Poly(IC)时该疫苗的能力才显著提高。
如上所述使用的人HLA-A2-MelanA四聚体不能非常有效地与小鼠MelanA-特异性T细胞结合，因为该蛋白质是嵌合蛋白。因此，我们可以假定在这些小鼠中有相当高程度的抗原特异性T细胞。
在一个类似的实验中，我们通过用与CpG和IFA混合的肽接种分析了Qb-G10-MelanA 16-35 A/L在体内引发CTL的效率。HHD小鼠用200μg Qβ-G10-MelanA 16-35A/L免疫，或者用与20nmol CpG和弗氏不完全佐剂(IFA)混合的50μg MelanA 16-35A/L免疫，或者不予处理。8天后从脾脏中分离活淋巴细胞，对MelanA-特异性CD8+T细胞进行染色。在37℃下和FACS缓冲液中，用PE-标记的对于载有MelanA 26-35肽的嵌合HLA-A2α1α2Kbα3MHC I类分子特异的四聚体染色1.5小时。第二步，加入大鼠抗小鼠CD8-APC(BD PharMingen，San Jose，USA)和抗小鼠Mel14-FITC(BD PharMingen，San Jose，USA)，在4℃下保持30分钟。最后，使用CellQuest软件在FACS Calibur上分析脾细胞。
流式细胞分析显示，Qβ-G10-MelanA 16-35A/L诱导MelanA-特异性活化CD8+Mel14-T细胞的扩增(18.2％)，其高于未处理的动物(2％)或接受与20nmol CpG和IFA混合的等摩尔量MelanA A/L 16-35的动物(2.0％)。应当指出，只有在Qb-MelanA载有G10-PO时该疫苗的能力才提高。
在一个类似的实验方案中，用载有G8-8或G10-PO的Qb-MelanA16-35 A/L或Qb-MelanA 26-35 A/L免疫HHD小鼠诱导了HLA-A2-MelanA-阳性且Mel14阴性CD8T细胞的扩增。
这些发现综合进来证明了载有ISS的Qb-肽疫苗非常有效地引发针对外源及自身抗原的CTL的能力。
实施例26载有CpG的Qbx33能够在用于诱导长期记忆CD8+T细胞应答的同源及异源引发-加强方案中使用小鼠用150μg Qbx33/NKCpG免疫，8天后经抗原特异性MHC/肽四聚体测定，p33特异性T细胞的频率从幼稚小鼠中的0.4％+/-0.2％升高为免疫动物中的7.5％+/-2.2％。20天后，肽特异性CD8+T细胞群体降至1.6％+/-0.7％。第一次免疫30天后用150μg Qbx33/NKPS对这些小鼠进行第二次免疫能够加强记忆T细胞应答至可达8.4％+/-1.9％特异性T细胞。该应答缓慢降低，但是能够在第一次加强4个月后用150μg Qbx33/NKPS再次加强，达到23.8％+/-5.2％的T细胞水平。
当3只小鼠用与20nmol NKPS和IFA混合的50μg p33肽引发时，到免疫后第8天只能诱导0.6％+/-0.4％的特异性CD8+T细胞。但是，这种低应答能够在7周后用Qbx33/NKPS有效加强，达到28.5％+/-9.8％的水平。
用1×106噬斑形成单位的表达p33-肽的重组痘苗病毒免疫几乎不能诱导任何T细胞应答(1.1％+/-0.5％)，但是在6个月后能够用150μgQbx33/NKPS非常有效地加强，达到28.1+/-4.2％的T细胞水平。
这些结果表明，在异源以及同源引发加强方案中，载有CpG的Qb能够非常有效地加强任何预先存在的T细胞应答。应当指出，Qb/NKPS甚至能够加强用肽或重组病毒几乎无法引发的T细胞应答。另外，当用Qbx33/NKPS诱导强T细胞应答时，我们能够用免疫有效量的异种疫苗如单独的p33肽、表达p33的重组病毒、或与VLP融合或偶联的p33来加强这种应答。在后一种情况中，使用的VLP不是来源于RNA噬菌体Qb的VLP，而是例如HBcAg或来源于AP205的VLP。
序列表<110>赛托斯生物技术公司巴赫曼，马丁马诺勒夫，瓦尼阿麦亚林克，埃德温普罗巴，卡尔施万茨，卡特林<120>MelanA-肽类似物-载体偶联物<130>PA058WO<150>US 60/457,348<151>2003-03-26<160>94<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>10<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸ISS<400>1gacgatcgtc 10<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸G3-6<400>2ggggacgatc gtcgggggg 19<210>3
<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸G4-6<400>3gggggacgat cgtcgggggg 20<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸G5-6<400>4ggggggacga tcgtcggggg g21<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸G6-6<400>5gggggggacg atcgtcgggg gg 22<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸G7-7<400>6
ggggggggac gatcgtcggg gggg24<210>7<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸G8-8<400>7ggggggggga cgatcgtcgg gggggg 26<210>8<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸G9-9<400>8gggggggggg acgatcgtcg gggggggg28<210>9<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸G6<400>9ggggggcgac gacgatcgtc gtcggggggg 30<210>10<211>132<212>PRT<213>噬菌体Q-beta
<400>10Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Lys1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr130<210>11<211>328<212>PRT<213>噬菌体Q-beta<400>11
Met Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly1 5 10 15Lys Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly20 25 30Val Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg35 40 45Val Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys50 55 60Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser65 70 75 80Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser85 90 95Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu100 105 110Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln115 120 125Leu Asn Pro Ala Tyr Trp Leu Leu Ile Ala Gly Gly Gly Ser Gly Ser130 135 140Lys Pro Asp Pro Val Ile Pro Asp Pro Pro Ile Asp Pro Pro Pro Gly145 150 155 160Thr Gly Lys Tyr Thr Cys Pro Phe Ala Ile Trp Ser Leu Glu Glu Val165 170 175
Tyr Glu Pro Pro Thr Lys Asn Arg Pro Trp Pro Ile Tyr Asn Ala Val180 185 190Glu Leu Gln Pro Arg Glu Phe Asp Val Ala Leu Lys Asp Leu Leu Gly195 200 205Asn Thr Lys Trp Arg Asp Trp Asp Ser Arg Leu Ser Tyr Thr Thr Phe210 215 220Arg Gly Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp Ala Thr Tyr Leu225 230 235 240Ala Thr Asp Gln Ala Met Arg Asp Gln Lys Tyr Asp Ile Arg Glu Gly245 250 255Lys Lys Pro Gly Ala Phe Gly Asn Ile Glu Arg Phe Ile Tyr Leu Lys260 265 270Ser Ile Asn Ala Tyr Cys Ser Leu Ser Asp Ile Ala Ala Tyr His Ala275 280 285Asp Gly Val Ile Val Gly Phe Trp Arg Asp Pro Ser Ser Gly Gly Ala290 295 300Ile Pro Phe Asp Phe Thr Lys Phe Asp Lys Thr Lys Cys Pro Ile Gln305 310 315 320Ala Val Ile Val Val Pro Arg Ala325<210>12<211>362<212>PRT
<213>BK病毒<400>12Met Ala Pro Thr Lys Arg Lys Gly Glu Cys Pro Gly Ala Ala Pro Lys1 5 10 15Lys Pro Lys Glu Pro Val Gln Val Pro Lys Leu Leu Ile Lys Gly Gly20 25 30Val Glu Val Leu Glu Val Lys Thr Gly Val Asp Ala Ile Thr Glu Val35 40 45Glu Cys Phe Leu Asn Pro Glu Met Gly Asp Pro Asp Asp Asn Leu Arg50 55 60Gly Tyr Ser Gln His Leu Ser Ala Glu Asn Ala Phe Glu Ser Asp Ser65 70 75 80Pro Asp Arg Lys Met Leu Pro Cys Tyr Ser Thr Ala Arg Ile Pro Leu85 90 95Pro Asn Leu Asn Glu Asp Leu Thr Cys Gly Asn Leu Leu Met Trp Glu100 105 110Ala Val Thr Val Lys Thr Glu Val Ile Gly Ile Thr Ser Met Leu Asn115 120 125Leu His Ala Gly Ser Gln Lys Val His Glu Asn Gly Gly Gly Lys Pro130 135 140Val Gln Gly Ser Asn Phe His Phe Phe Ala Val Gly Gly Asp Pro Leu145 150 155 160
Glu Met Gln Gly Val Leu Met Asn Tyr Arg Thr Lys Tyr Pro Gln Gly165 170 175Thr Ile Thr Pro Lys Asn Pro Thr Ala Gln Ser Gln Val Met Asn Thr180 185 190Asp His Lys Ala Tyr Leu Asp Lys Asn Asn Ala Tyr Pro Val Glu Cys195 200 205Trp Ile Pro Asp Pro Ser Arg Asn Glu Asn Thr Arg Tyr Phe Gly Thr210 215 220Tyr Thr Gly Gly Glu Asn Val Pro Pro Val Leu His Val Thr Asn Thr225 230 235 240Ala Thr Thr Val Leu Leu Asp Glu Gln Gly Val Gly Pro Leu Cys Lys245 250 255Ala Asp Ser Leu Tyr Val Ser Ala Ala Asp Ile Cys Gly Leu Phe Thr260 265 270Asn Ser Ser Gly Thr Gln Gln Trp Arg Gly Leu Ala Arg Tyr Phe Lys275 280 285Ile Arg Leu Arg Lys Arg Ser Val Lys Asn Pro Tyr Pro Ile Ser Phe290 295 300Leu Leu Ser Asp Leu Ile Asn Arg Arg Thr Gln Lys Val Asp Gly Gln305 310 315 320Pro Met Tyr Gly Met Glu Ser Gln Val Glu Glu Val Arg Val Phe Asp325 330 335
Gly Thr Glu Gln Leu Pro Gly Asp Pro Asp Met Ile Arg Tyr Ile Asp340 345 350Arg Gln Gly Gln Leu Gln Thr Lys Met Val355 360<210>13<211>130<212>PRT<213>噬菌体fr<400>13Met Ala Ser Asn Phe Glu Glu Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr1 5 10 15Gly Asp Val Lys Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu20 25 30Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser35 40 45Val Arg Gln Ser Ser Ala Asn Asn Arg Lys Tyr Thr Val Lys Val Glu50 55 60Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Val Gln Gly Gly Val Glu Leu Pro Val65 70 75 80Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Met Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Val Phe85 90 95Ala Thr Asn Asp Asp Cys Ala Leu Ile Val Lys Ala Leu Gln Gly Thr100 105 110Phe Lys Thr Gly Asn Pro Ile Ala Thr Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly
115 120 125Ile Tyr130<210>14<211>130<212>PRT<213>噬菌体GA<400>14Met Ala Thr Leu Arg Ser Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly1 5 10 15Asn Val Thr Val Val Pro Val Ser Asn Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp20 25 30Leu Ser Asn Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Arg Val Thr Ala Ser Tyr35 40 45Arg Ala Ser Gly Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Ala Ile Lys Leu Glu Val50 55 60Pro Lys Ile Val Thr Gln Val Val Asn Gly Val Glu Leu Pro Gly Ser65 70 75 80Ala Trp Lys Ala Tyr Ala Ser Ile Asp Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala85 90 95Ala Thr Asp Asp Val Thr Val Ile Ser Lys Ser Leu Ala Gly Leu Phe100 105 110Lys Val Gly Asn Pro Ile Ala Glu Ala Ile Ser Ser Gln Ser Gly Phe115 120 125
Tyr Ala130<210>15<211>594<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有来自LCMV的p33的HBcAg<220>
<221>CDS<222>(1)..(594)<400>15atg gac att gac cct tat aaa gaa ttt gga gct act gtg gag tta ctc48Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15tcg ttt ttg cct tct gac ttc ttt cct tcc gtc aga gat ctc cta gac96Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30acc gcc tca gct ctg tat cga gaa gcc tta gag tct cct gag cat tgc144Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45tca cct cac cat act gca ctc agg caa gcc att ctc tgc tgg ggg gaa192Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60ttg atg act cta gct acc tgg gtg ggt aat aat ttg gaa gat cca gca240Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala65 70 75 80tcc agg gat cta gta gtc aat tat gtt aat act aac atg ggt tta aag288Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95atc agg caa cta ttg tgg ttt cat ata tct tgc ctt act ttt gga aga336Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
100 105 110gag act gta ctt gaa tat ttg gtc tct ttc gga gtg tgg att cgc act384Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125cct cca gcc tat aga cca cca aat gcc cct atc tta tca aca ctt ccg432Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140gaa act act gtt gtt aga cga cgg gac cga ggc agg tcc cct aga aga480Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg145 150 155 160aga act ccc tcg cct cgc aga cgc aga tct caa tcg ccg cgt cgc aga528Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg165 170 175aga tct caa tct cgg gaa tct caa tgt ctt ctc ctt aaa gct gtt tac576Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys Leu Leu Leu Lys Ala Val Tyr180 185 190aac ttc gct acc atg taa594Asn Phe Ala Thr Met195<210>16<211>197<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>含有来自LCMV的p33的HBcAg<400>16Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala65 70 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg145 150 155 160Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg165 170 175Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys Leu Leu Leu Lys Ala Val Tyr180 185 190Asn Phe Ala Thr Met195
<210>17<211>246<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于BKV包装和稳定的dsDNA片段<400>17ggcggtggtg tcagatctac aatgatcgtc atcaccttgg tgatgctgaa gaagaaacag 60tacacatcca ttcatcatgg tgtggtggag gttgacgccg ctgtcacccc agaggagcgc 120cacctgtcca agatgcagca gaacggctac gaaaatccaa cctacaagtt ctttgagcag 180atgcagaacg ctagctatcc atacgatgtc cctgattacg cctaacgcga attcgccagc 240acagtg 246<210>18<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>GGKGG接头<400>18Gly Gly Lys Gly Gly1 5<210>19<211>128<212>PRT<213>噬菌体PP7<400>19Met Ser Lys Thr Ile Val Leu Ser Val Gly Glu Ala Thr Arg Thr Leu1 5 10 15
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<223>质粒pAP283-58
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<223>NKCpG<400>39ggggtcaacg ttgaggggg19<210>40<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CyCpG-rev-pt<400>40attattcagg aacgtcatgg a 21<210>41<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>g10gacga-PO(G10-PO)
<400>41gggggggggg gacgatcgtc gggggggggg 30<210>42<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>g10gacga-PS<400>42gggggggggg gacgatcgtc gggggggggg 30<210>43<211>62<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>(CPG)200pA<400>43cgcgcgcgcg cgcgcgcgcg cgcgcgcgcg cgcgcgcgcg aaatgcatgt caaagacagc60at 62<210>44<211>61<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Cy(CpG)20<400>44tccatgacgt tcctgaataa tcgcgcgcgc gcgcgcgcgc gcgcgcgcgc gcgcgcgcgc60g61
<210>45<211>83<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Cy(CpG)20-OpA<400>45tccatgacgt tcctgaataa tcgcgcgcgc gcgcgcgcgc gcgcgcgcgc gcgcgcgcgc60gaaatgcatg tcaaagacag cat83<210>46<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CyOpA<400>46tccatgacgt tcctgaataa taaatgcatg tcaaagacag cat 43<210>47<211>63<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CyCyCy<400>47tccatgacgt tcctgaataa ttccatgacg ttcctgaata attccatgac gttcctgaat60aat 63<210>48<211>150<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>Cy150-1<400>48tccatgacgt tcctgaataa ttccatgacg ttcctgaata attccatgac gttcctgaat60aattggatga cgttggtgaa taattccatg acgttcctga ataattccat gacgttcctg 120aataattcca tgacgttcct gaataattcc150<210>49<211>253<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>dsCyCpG-253<400>49ctagaactag tggatccccc gggctgcagg aattcgattc atgacttcct gaataattcc60atgacgttgg tgaataattc catgacgttc ctgaataatt ccatgacgtt cctgaataat 120tccatgacgt tcctgaataa ttccatgacg ttcctgaata attccatgac gttcctgaat 180aattccatga cgttcctgaa taattccatg acgttcctga aaattccaat caagcttatc 240gataccgtcg acc 253<210>50<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Melan A 26-35 A/L<400>50Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val1 5 10
<210>51<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Melan A 16-35 A/L<400>51Gly His Gly His Ser Tyr Thr Thr Ala Glu Glu Leu Ala Gly Ile Gly1 5 10 15Ile Leu Thr Val20<210>52<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>MelanA 20-40 A/L<400>52Ser Tyr Thr Thr Ala Glu Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val1 5 10 15Ile Leu Gly Val Leu20<210>53<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>MelanA 26-40 A/L<400>53Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val Ile Leu Gly Val1 5 10<210>54<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>MelanA 16-35<400>54Cys Gly His Gly His Ser Tyr Thr Thr Ala Glu Glu Ala Ala Gly Ile1 5 10 15Gly Ile Leu Thr Val20<210>55<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>MelanA 16-35 A/L<400>55Cys Gly His Gly His Ser Tyr Thr Thr Ala Glu Glu Leu Ala Gly Ile1 5 10 15Gly Ile Leu Thr Val20
<210>56<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>MelanA 26-35<400>56Cys Gly Gly Glu Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val1 5 10<210>57<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>MelanA 26-35 A/L<400>57Cys Gly Gly Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val1 5 10<210>58<211>22<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>MelanA 20-40 A/L<400>58Cys Ser Tyr Thr Thr Ala Glu Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr1 5 10 15Val Ile Leu Gly Val Leu20
<210>59<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>MelanA 26-40 A/L<400>59Cys Gly Gly Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val Ile Leu Gly1 5 10 15Val Leu<210>60<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>MelanA 26-35-C<400>60Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val Gly Gly Cys1 5 10<210>61<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>载体pAb185的序列<400>61tctagattaa cccaacgcgt aggagtcagg ccatg 35
<210>62<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>N端甘氨酸丝氨酸接头<220>
<221>重复<222>(1)..(1)<223>甘氨酸可以重复0至5次<220>
<221>重复<222>(3)..(3)<223>甘氨酸可以重复0至10次<220>
<221>重复<222>(4)..(4)<223>丝氨酸可以重复0至2次<220>
<221>重复<222>(5)..(9)<223>这些残基可以重复0至3次作为一组<400>62Gly Cys Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 5<210>63<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>C端甘氨酸丝氨酸接头
<220>
<221>重复<222>(1)..(1)<223>甘氨酸可以重复0至10次<220>
<221>重复<222>(2)..(2)<223>丝氨酸可以重复0至2次<220>
<221>重复<222>(3)..(7)<223>这些残基可以重复0至3次作为一组<220>
<221>重复<222>(8)..(8)<223>甘氨酸可以重复0至8次<220>
<221>重复<222>(10)..(10)<223>甘氨酸可以重复0至5次<400>63Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Cys Gly1 5 10<210>64<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>甘氨酸丝氨酸接头<400>64Gly Gly Gly Gly Ser
1 5<210>65<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>N-端gamma1<400>65Cys Gly Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro1 5 10<210>66<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>C-端gamma 1<400>66Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Gly1 5 10<210>67<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>N-端gamma 3<400>67Cys Gly Gly Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala1 5 10 15
Pro<210>68<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>C-端gamma 3<400>68Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Gly Gly1 5 10 15Cys Gly<210>69<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>N-端甘氨酸接头<400>69Gly Cys Gly Gly Gly Gly1 5<210>70<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>C-端甘氨酸接头
<400>70Gly Gly Gly Gly Cys Gly1 5<210>71<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>C-端甘氨酸-赖氨酸接头<400>71Gly Gly Lys Lys Gly Cys1 5<210>72<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>N-端甘氨酸-赖氨酸接头<400>72Cys Gly Lys Lys Gly Gly1 5<210>73<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>N-端接头1<400>73
Cys Gly Lys Lys Gly Gly1 5<210>74<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>N-端接头2<400>74Cys Gly Asp Glu Gly Gly1 5<210>75<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>C-端接头<400>75Gly Gly Lys Lys Gly Cys1 5<210>76<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>C-端接头2<400>76Gly Gly Glu Asp Gly Cys
1 5<210>77<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>C-端接头3<400>77Gly Gly Cys Gly1<210>78<211>10<212>PRT<213>人类<400>78Glu Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val1 5 10<210>79<211>9<212>PRT<213>人类<400>79Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val1 5<210>80<211>9<212>PRT<213>人类
<400>80Lys Ala Val Tyr Asn Phe Ala Thr Met1 5<210>81<211>12<212>PRT<213>人类<400>81Cys Gly Gly Lys Ala Val Tyr Asn Phe Ala Thr Met1 5 10<210>82<211>12<212>PRT<213>人类<400>82Lys Ala Val Tyr Asn Phe Ala Thr Met Gly Gly Cys1 5 10<210>83<211>18<212>PRT<213>人类<400>83Cys Gly Gly Gly Ser Glu Glu Ile Arg Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala1 5 10 15Thr Leu<210>84
<211>9<212>PRT<213>人类<400>84Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val1 5<210>85<211>9<212>PRT<213>人类<400>85Met Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val1 5<210>86<211>10<212>PRT<213>人类<400>86Glu Ala Met Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val1 5 10<210>87<211>10<212>PRT<213>人类<400>87Glu Met Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val1 5 10<210>88
<211>10<212>PRT<213>人类<400>88Tyr Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val1 5 10<210>89<211>10<212>PRT<213>人类<400>89Phe Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val1 5 10<210>90<211>9<212>PRT<213>人类<400>90Leu Pro Tyr Leu Gly Trp Leu Val Phe1 5<210>91<211>118<212>PRT<213>人类<400>91Met Pro Arg Glu Asp Ala His Phe Ile Tyr Gly Tyr Pro Lys Lys Gly1 5 10 15His Gly His Ser Tyr Thr Thr Ala Glu Glu Ala Ala Gly Ile Gly Ile
20 25 30Leu Thr Val Ile Leu Gly Val Leu Leu Leu Ile Gly Cys Trp Tyr Cys35 40 45Arg Arg Arg Asn Gly Tyr Arg Ala Leu Met Asp Lys Ser Leu His Val50 55 60Gly Thr Gln Cys Ala Leu Thr Arg Arg Cys Pro Gln Glu Gly Phe Asp65 70 75 80His Arg Asp Ser Lys Val Ser Leu Gln Glu Lys Asn Cys Glu Pro Val85 90 95Val Pro Asn Ala Pro Pro Ala Tyr Glu Lys Leu Ser Ala Glu Gln Ser100 105 110Pro Pro Pro Tyr Ser Pro115<210>92<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CSPKSL-MelanA 26-35 A/L<400>92Cys Ser Pro Lys Ser Leu Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val1 5 10 15<210>93<211>18<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>MelanA 26-40-C A/L<400>93Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val Ile Leu Gly Val Leu Gly1 5 10 15Gly Cys<210>94<211>118<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>MelanA 1-118 A/L<400>94Met Pro Arg Glu Asp Ala His Phe Ile Tyr Gly Tyr Pro Lys Lys Gly1 5 10 15His Gly His Ser Tyr Thr Thr Ala Glu Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile20 25 30Leu Thr Val Ile Leu Gly Val Leu Leu Leu Ile Gly Cys Trp Tyr Cys35 40 45Arg Arg Arg Asn Gly Tyr Arg Ala Leu Met Asp Lys Ser Leu His Val50 55 60Gly Thr Gln Cys Ala Leu Thr Arg Arg Cys Pro Gln Glu Gly Phe Asp65 70 75 80
His Arg Asp Ser Lys Val Ser Leu Gln Glu Lys Asn Cys Glu Pro Val85 90 95Val Pro Asn Ala Pro Pro Ala Tyr Glu Lys Leu Ser Ala Glu Gln Ser100 105 110Pro Pro Pro Tyr Ser Pro11权利要求
1.一种组合物，其包含(a)病毒样颗粒；和(b)至少一种免疫刺激物；和(c)至少一种抗原或抗原决定簇；其中所述抗原或抗原决定簇与所述病毒样颗粒结合，并且其中所述免疫刺激物与所述病毒样颗粒结合，并且其中所述抗原包含、或者基本由、或者由人黑素瘤MelanA肽类似物组成。
2.根据权利要求1的组合物，其中所述至少一种抗原或抗原决定簇与所述病毒样颗粒通过至少一个共价键结合，其中优选地，所述共价键是非肽键。
3.根据权利要求1的组合物，其中所述至少一种抗原或抗原决定簇与所述病毒样颗粒融合。
4.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中所述人黑素瘤MelanA肽类似物能够允许与MHC分子有效结合。
5.根据权利要求1-4中任一项的组合物，其中所述人黑素瘤MelanA肽类似物的特征在于，相对于相应的正常MelanA肽，具有两个、优选一个氨基酸置换。
6.根据权利要求1-4中任一项的组合物，其中所述人黑素瘤MelanA肽类似物受到保护而免遭蛋白酶或肽酶介导的降解。
7.根据权利要求1-4中任一项的组合物，其中所述人黑素瘤MelanA肽类似物具有选自下列的氨基酸序列(a)LAGIGILTV(SEQ ID NO84)；(b)MAGIGILTV(SEQ ID NO85)；(c)EAMGIGILTV(SEQ ID NO86)；(d)ELAGIGILTV(SEQ ID NO50)；(e)EMAGIGILTV(SEQ ID NO87)；(f)YAAGIGILTV(SEQ ID NO88)；和(g)FAAGIGILTV(SEQ ID NO89)。
8.根据权利要求1-4中任一项的组合物，其中所述人黑素瘤MelanA/MART-1肽类似物包含、或者基本由、或者由序列ELAGIGILTV(SEQ ID NO50)组成。
9.根据权利要求1-8中任一项的组合物，其中所述病毒样颗粒含有至少一个第一附着位点，并且其中所述抗原或抗原决定簇进一步含有至少一个选自下列的第二附着位点(a)所述抗原或抗原决定簇非天然存在的附着位点；和(b)所述抗原或抗原决定簇天然存在的附着位点；其中所述抗原或抗原决定簇与所述病毒样颗粒的结合是通过所述第一附着位点与所述第二附着位点之间的连接实现的，其中优选地这种连接是通过至少一个非肽键。
10.根据权利要求9的组合物，其中所述抗原或抗原决定簇与所述病毒样颗粒通过所述连接相互作用，形成有序且重复的抗原阵列。
11.根据权利要求9或10的组合物，其中所述第一附着位点包含，或者优选地由氨基或赖氨酸残基组成。
12.根据权利要求9-11中任一项的组合物，其中所述第二附着位点包含，或者优选地由巯基或半胱氨酸残基组成。
13.根据权利要求9-12中任一项的组合物，其中所述第一附着位点是赖氨酸残基，并且所述第二附着位点是半胱氨酸残基。
14.根据权利要求9-13中任一项的组合物，其中所述第一附着位点是氨基，并且所述第二附着位点是巯基。
15.根据权利要求9-14中任一项的组合物，其中带有所述第二附着位点的所述人黑素瘤MelanA/MART-l肽类似物具有选自下列的氨基酸序列(a)CGHGHSYTTAEELAGIGILTV(SEQ ID NO55)；(b)CGGELAGIGILTV(SEQ ID NO57)；(c)CSYTTAEELAGIGILTVILGVL(SEQ ID NO58)；(d)CGGELAGIGILTVILGVL(SEQ ID NO59)；(e)ELAGIGILTVGGC(SEQ ID NO60)；(f)CSPKSLELAGIGILTV(SEQ ID NO92)；和(g)ELAGIGILTVILGVLGGC(SEQ ID NO93)。
16.根据权利要求9-14中任一项的组合物，其中带有所述第二附着位点的所述人黑素瘤MelanA/MART-1肽类似物具有氨基酸序列CGHGHSYTTAEELAGIGILTV(SEQ ID NO55)。
17.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中所述病毒样颗粒缺乏含脂蛋白的包膜。
18.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中所述病毒样颗粒是重组病毒样颗粒，其中优选地所述病毒样颗粒选自(a)乙型肝炎病毒的重组蛋白；(b)麻疹病毒的重组蛋白；(c)辛德毕斯病毒的重组蛋白；(d)轮状病毒的重组蛋白；(e)口蹄疫病毒的重组蛋白；(f)逆转录病毒的重组蛋白；(g)诺瓦克病毒的重组蛋白；(h)人乳头瘤病毒的重组蛋白；(i)BK病毒的重组蛋白；(j)噬菌体的重组蛋白；(k)RNA噬菌体的重组蛋白；(l)Ty的重组蛋白；和(m)(a)-(l)中任何一种重组蛋白的片段。
19.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中所述病毒样颗粒是乙型肝炎病毒核心蛋白或BK病毒VP1蛋白。
20.根据权利要求19的组合物，其中所述人黑素瘤MelanA/MART-1肽类似物与所述乙型肝炎病毒核心蛋白或所述BK病毒VP1蛋白的C端融合，优选地通过连接序列融合。
21.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中所述病毒样颗粒包含、或者基本由、或者由RNA噬菌体的重组蛋白或其片段组成，其中优选地所述RNA噬菌体选自(a)噬菌体Qβ；(b)噬菌体R17；(c)噬菌体fr；(d)噬菌体GA；(e)噬菌体SP；(f)噬菌体MS2；(g)噬菌体M11；(h)噬菌体MX1；(i)噬菌体NL95；(j)噬菌体f2；(k)噬菌体PP7；和(l)噬菌体AP205。
22.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中所述病毒样颗粒包含、或者基本由、或者由噬菌体Qβ或噬菌体AP205的重组蛋白或其片段组成。
23.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中所述免疫刺激物是toll样受体激活物或细胞因子分泌诱导物，其中优选地该Toll样受体激活物选自，或基本由下列成分组成(a)免疫刺激性核酸；(b)肽聚糖；(c)脂多糖；(d)脂磷壁酸；(e)咪唑并喹啉化合物；(f)鞭毛蛋白；(g)脂蛋白；(h)免疫刺激性有机分子；(i)含非甲基化CpG的寡核苷酸；和(j)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)和/或(i)中至少一种物质的任意混合物。
24.权利要求23的组合物，其中所述免疫刺激性核酸选自，或者基本由下列成分组成(a)核糖核酸；(b)脱氧核糖核酸；(c)嵌合核酸；和(d)(a)、(b)和/或(c)中至少一种核酸的任意混合物。
25.权利要求24的组合物，其中所述核糖核酸是poly-(I:C)或其衍生物。
26.权利要求24的组合物，其中所述脱氧核糖核酸选自，或者基本由下列成分组成(a)含非甲基化CpG的寡核苷酸；和(b)不含非甲基化CpG基序的寡核苷酸。
27.权利要求1-24和权利要求26中任一项的组合物，其中所述免疫刺激物是含非甲基化CpG的寡核苷酸。
28.权利要求27的组合物，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸包含序列5’X1X2CGX3X43’，其中X1、X2、X3和X4是任一种核苷酸。
29.权利要求28的组合物，其中所述核苷酸X1、X2、X3和X4中的至少一个含有磷酸骨架的修饰。
30.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中所述至少一种免疫刺激物，优选所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，包含、或者基本由、或者由回文序列组成。
31.权利要求27的组合物，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸包含、或者基本由、或者由选自下列的序列组成(a)TCCATGACGTTCCTGAATAAT(SEQ ID NO35)；(b)TCCATGACGTTCCTGACGTT(SEQ ID NO37)；(c)GGGGTCAACGTTGAGGGGG(SEQ ID NO39)；(d)GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ IDNO41)；和(e)如表2所述的“dsCyCpG-253”(SEQ ID NO49)，其中优选地，所述含非甲基化CpG的寡核苷酸含有一个或多个磷酸骨架的硫代磷酸修饰，或者其中所述寡核苷酸的磷酸骨架的每个磷酸部分是一个硫代磷酸修饰。
32.权利要求27的组合物，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸包含、或者基本由、或者由序列GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ ID NO41)组成。
33.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中所述至少一种免疫刺激物，优选所述免疫刺激性核酸，更优选所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，含有一个或多个磷酸骨架的硫代磷酸修饰，或者其中所述寡核苷酸的磷酸骨架的每个磷酸部分是一个硫代磷酸修饰。
34.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中所述免疫刺激物与所述病毒样颗粒非共价结合。
35.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中所述至少一种免疫刺激物，优选所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，与所述病毒样颗粒非共价结合。
36.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中所述至少一种免疫刺激物，优选所述免疫刺激性核酸，更优选所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，含有约6个至约100,000个核苷酸，优选约6个至约2000个核苷酸，更优选约20个至约500个核苷酸，更优选约20个至约100个核苷酸。
37.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中所述至少一种免疫刺激物，优选所述免疫刺激性核酸，更优选所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，选自(a)重组寡核苷酸；(b)基因组寡核苷酸；(c)合成寡核苷酸；(d)质粒衍生的寡核苷酸；(e)单链寡核苷酸；和(f)双链寡核苷酸。
38.权利要求30的组合物，其中所述回文序列包含、或者基本由、或者由GACGATCGTC(SEQ ID NO1)组成。
39.权利要求38的组合物，其中所述回文序列在其5’端侧翼为至少3个、至多10个鸟苷，并且其中所述回文序列在其3’端侧翼为至少6个、至多10个鸟苷。
40.权利要求38的组合物，其中所述回文序列在其5’端侧翼为至少4个、至多10个鸟苷，并且其中所述回文序列在其3’端侧翼为至少6个、至多10个鸟苷。
41.权利要求38的组合物，其中所述回文序列在其5’端侧翼为至少5个、至多10个鸟苷，并且其中所述回文序列在其3’端侧翼为至少6个、至多10个鸟苷。
42.权利要求38的组合物，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸具有选自下列的核酸序列(a)GGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO2)；(b)GGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO3)；(c)GGGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO4)；(d)GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO5)；(e)GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG(SEQ ID NO6)；(f)GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG(SEQ ID NO7)；(g)GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG(SEQ ID NO8)；(h)GGGGGGCGACGACGATCGTCGTCGGGGGGG(SEQ ID NO9)；和(i)GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ IDNO41)。
43.权利要求27或38的组合物，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸具有SEQ ID NO7或SEQ ID NO41的核酸序列。
44.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中所述抗原包含细胞毒性T细胞表位、Th细胞表位或至少两种所述表位的组合，其中所述至少两种表位直接结合或者通过连接序列结合，并且其中优选地所述细胞毒性T细胞表位是病毒或肿瘤细胞毒性T细胞表位。
45.权利要求44的组合物，其中所述抗原包含至少一种细胞毒性T细胞表位和至少一种Th细胞表位的组合，并且其中所述组合是MelanA 1-118A/L(SEQ ID NO94)。
46.一种增强动物中免疫应答的方法，包括向该动物中导入一种组合物，该组合物包含(a)病毒样颗粒；(b)至少一种免疫刺激物；和(c)至少一种抗原或抗原决定簇；其中所述抗原或抗原决定簇与所述病毒样颗粒结合，其中所述免疫刺激物与所述病毒样颗粒结合，并且其中所述抗原包含、或基本由、或由人黑素瘤MelanA肽类似物组成。
47.权利要求46的方法，其中所述至少一种抗原或抗原决定簇与所述病毒样颗粒通过至少一个共价键结合，其中所述共价键是非肽键。
48.权利要求46的方法，其中所述至少一种抗原或抗原决定簇与所述病毒样颗粒融合。
49.权利要求46-48中任一项的方法，其中所述人黑素瘤MelanA肽类似物能够允许与MHC分子有效结合。
50.权利要求46-49中任一项的方法，其中所述人黑素瘤MelanA肽类似物的特征在于，相对于相应的正常MelanA肽有两个，优选一个氨基酸置换。
51.权利要求46-50中任一项的方法，其中所述人黑素瘤MelanA肽类似物受到保护而免遭蛋白酶或肽酶介导的降解。
52.权利要求46-51中任一项的方法，其中所述人黑素瘤MelanA肽类似物具有选自下列的氨基酸序列(a)LAGIGILTV(SEQ ID NO84)；(b)MAGIGILTV(SEQ ID NO85)；(c)EAMGIGILTV(SEQ ID NO86)；(d)ELAGIGILTV(SEQ ID NO50)；(e)EMAGIGILTV(SEQ ID NO87)；(f)YAAGIGILTV(SEQ ID NO88)；和(g)FAAGIGILTV(SEQ ID NO89)。
53.权利要求46-51中任一项的方法，其中所述人黑素瘤MelanA/MART-1肽类似物包含、或者基本由、或者由序列ELAGIGILTV(SEQ ID NO50)组成。
54.权利要求46-53中任一项的方法，其中所述病毒样颗粒含有至少一个第一附着位点，并且其中所述抗原或抗原决定簇进一步含有至少一个选自下列的第二附着位点(a)所述抗原或抗原决定簇非天然存在的附着位点；和(b)所述抗原或抗原决定簇天然存在的附着位点；其中所述抗原或抗原决定簇与所述病毒样颗粒的结合是通过所述第一附着位点与所述第二附着位点之间的连接实现的，其中优选地这种连接是通过至少一个非肽键。
55.权利要求54的方法，其中所述抗原或抗原决定簇与所述病毒样颗粒通过所述连接相互作用，形成有序且重复的抗原阵列。
56.根据权利要求54或55的方法，其中所述第一附着位点包含，或者优选地由氨基或赖氨酸残基组成。
57.根据权利要求54-56中任一项的方法，其中所述第二附着位点包含，或者优选地由巯基或半胱氨酸残基组成。
58.根据权利要求54-57中任一项的方法，其中所述第一附着位点是赖氨酸残基，并且所述第二附着位点是半胱氨酸残基。
59.根据权利要求54-58中任一项的方法，其中所述第一附着位点是氨基，并且所述第二附着位点是巯基。
60.根据权利要求54-59中任一项的方法，其中带有所述第二附着位点的所述人黑素瘤MelanA/MART-1肽类似物具有选自下列的氨基酸序列(a)CGHGHSYTTAEELAGIGILTV(SEQ ID NO55)；(b)CGGELAGIGILTV(SEQ ID NO57)；(c)CSYTTAEELAGIGILTV ILGVL(SEQ ID NO58)；(d)CGGELAGIGILTVILGVL(SEQ ID NO59)；和(e)ELAGIGILTVGGC(SEQ ID NO60)；(f)CSPKSLELAGIGILTV(SEQ ID NO92)；和(g)ELAGIGILTVILGVLGGC(SEQ ID NO93)。
61.根据权利要求54-59中任一项的方法，其中带有所述第二附着位点的所述人黑素瘤MelanA/MART-1肽类似物具有氨基酸序列CGHGHSYTTAEELAGIGILTV(SEQ ID NO55)。
62.根据权利要求46-61中任一项的方法，其中所述病毒样颗粒是重组病毒样颗粒，其中优选地所述病毒样颗粒选自(a)乙型肝炎病毒的重组蛋白；(b)麻疹病毒的重组蛋白；(c)辛德毕斯病毒的重组蛋白；(d)轮状病毒的重组蛋白；(e)口蹄疫病毒的重组蛋白；(f)逆转录病毒的重组蛋白；(g)诺瓦克病毒的重组蛋白；(h)人乳头瘤病毒的重组蛋白；(i)BK病毒的重组蛋白；(j)噬菌体的重组蛋白；(k)RNA噬菌体的重组蛋白；(l)Ty的重组蛋白；和(m)(a)-(l)中任何一种重组蛋白的片段。
63.根据权利要求46-62中任一项的方法，其中所述病毒样颗粒是乙型肝炎病毒核心蛋白或BK病毒VP 1蛋白。
64.根据权利要求63的方法，其中所述人黑素瘤MelanA/MART-1肽类似物与所述乙型肝炎病毒核心蛋白或所述BK病毒VP 1蛋白的C端融合，优选地通过连接序列融合。
65.根据权利要求46-64中任一项的方法，其中所述病毒样颗粒包含RNA噬菌体的重组蛋白或其片段，其中优选地所述RNA噬菌体选自(a)噬菌体Qβ；(b)噬菌体R17；(c)噬菌体fr；(d)噬菌体GA；(e)噬菌体SP；(f)噬菌体MS2；(g)噬菌体M11；(h)噬菌体MX1；(i)噬菌体NL95；(j)噬菌体f2；(k)噬菌体PP7；和(l)噬菌体AP205。
66.根据权利要求46-65中任一项的方法，其中所述病毒样颗粒包含、或者基本由、或者由噬菌体Qβ或噬菌体AP205的重组蛋白或其片段组成。
67.根据权利要求46-66中任一项的方法，其中所述免疫刺激物是toll样受体激活物或细胞因子分泌诱导物，其中优选地该Toll样受体激活物选自，或基本由下列成分组成(a)免疫刺激性核酸；(b)肽聚糖；(c)脂多糖；(d)脂磷壁酸；(e)咪唑并喹啉化合物；(f)鞭毛蛋白；(g)脂蛋白；(h)免疫刺激性有机分子；(i)含非甲基化CpG的寡核苷酸；和(j)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)和/或(i)中至少一种物质的任意混合物。
68.权利要求67的方法，其中所述免疫刺激性核酸选自，或者基本由下列成分组成(a)核糖核酸；(b)脱氧核糖核酸；(c)嵌合核酸；和(d)(a)、(b)和/或(c)中至少一种核酸的任意混合物。
69.权利要求68的方法，其中所述核糖核酸是poly-(I:C)或其衍生物。
70.权利要求68的方法，其中所述脱氧核糖核酸选自，或者基本由下列成分组成(a)含非甲基化CpG的寡核苷酸；和(b)不含非甲基化CpG基序的寡核苷酸。
71.权利要求46-68和权利要求70中任一项的方法，其中所述免疫刺激物是含非甲基化CpG的寡核苷酸。
72.权利要求71的方法，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸含有序列5’X1X2CGX3X43’，其中X1、X2、X3和X4是任一种核苷酸。
73.权利要求72的方法，其中所述核苷酸X1、X2、X3和X4中的至少一个含有磷酸骨架的修饰。
74.根据权利要求46-73中任一项的方法，其中所述至少一种免疫刺激物，优选所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，包含、或者基本由、或者由回文序列组成。
75.权利要求71的方法，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸包含、或者基本由、或者由选自下列的序列组成(a)TCCATGACGTTCCTGAATAAT(SEQ ID NO35)；(b)TCCATGACGTTCCTGACGTT(SEQ ID NO37)；(c)GGGGTCAACGTTGAGGGGG(SEQ ID NO39)；(d)GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ IDNO41)；和(e)如表2所述的“dsCyCpG-253”(SEQ ID NO49)；其中优选地，所述含非甲基化CpG的寡核苷酸含有一个或多个磷酸骨架的硫代磷酸修饰，或者其中所述寡核苷酸的磷酸骨架的每个磷酸部分是一个硫代磷酸修饰。
76.权利要求71的方法，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸是回文的，并且其中优选地，所述含非甲基化CpG的回文寡核苷酸包含，或者由序列GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ ID NO41)组成。
77.根据权利要求46-76中任一项的方法，其中所述至少一种免疫刺激物，优选所述免疫刺激性核酸，更优选所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，含有一个或多个磷酸骨架的硫代磷酸修饰，或者其中所述寡核苷酸的磷酸骨架的每个磷酸部分是一个硫代磷酸修饰。
78.根据权利要求46-77中任一项的方法，其中所述免疫刺激物，优选所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，与所述病毒样颗粒非共价结合。
79.根据权利要求46-78中任一项的方法，其中所述免疫刺激物，优选所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，被所述病毒样颗粒包装，优选地包封。
80.根据权利要求46-79中任一项的方法，其中所述至少一种免疫刺激物，优选所述免疫刺激性核酸，更优选所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，含有约6个至约100,000个核苷酸，并且优选地，其中所述免疫刺激性核酸，优选所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，含有20至100个核苷酸。
81.根据权利要求46-80中任一项的方法，其中所述至少一种免疫刺激物，优选所述免疫刺激性核酸，更优选所述含非甲基化CpG的寡核苷酸，选自(a)重组寡核苷酸；(b)基因组寡核苷酸；(c)合成寡核苷酸；(d)质粒衍生的寡核苷酸；(e)单链寡核苷酸；和(f)双链寡核苷酸。
82.权利要求74的方法，其中所述回文序列包含、或者基本由、或者由GACGATCGTC(SEQ ID NO1)组成。
83.权利要求82的方法，其中所述回文序列在其5’端侧翼为至少3个、至多10个鸟苷，并且其中所述回文序列在其3’端侧翼为至少6个、至多10个鸟苷。
84.权利要求82的方法，其中所述回文序列在其5’端侧翼为至少4个、至多10个鸟苷，并且其中所述回文序列在其3’端侧翼为至少6个、至多10个鸟苷。
85.权利要求82的方法，其中所述回文序列在其5’端侧翼为至少5个、至多10个鸟苷，并且其中所述回文序列在其3’端侧翼为至少6个、至多10个鸟苷。
86.权利要求82的方法，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸具有选自下列的核酸序列(a)GGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO2)；(b)GGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO3)；(c)GGGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO4)；(d)GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO5)；(e)GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG(SEQ ID NO6)；(f)GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG(SEQ ID NO7)；(g)GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG(SEQ ID NO8)；(h)GGGGGGCGACGACGATCGTCGTCGGGGGGG(SEQ ID NO9)；和(i)GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ IDNO41)。
87.权利要求71或82的方法，其中所述含非甲基化CpG的寡核苷酸具有SEQ ID NO7或SEQ ID NO41的核酸序列。
88.权利要求46-87中任一项的方法，其中所述抗原包含细胞毒性T细胞表位、Th细胞表位或至少两种所述表位的组合，其中所述至少两种表位直接连接或者通过连接序列连接，并且其中优选地所述细胞毒性T细胞表位是病毒或肿瘤细胞毒性T细胞表位。
89.权利要求46-87中任一项的方法，其中所述免疫应答是增强的B细胞应答或增强的T细胞应答，其中优选地所述T细胞应答是CTL应答或Th细胞应答，并且其中更优选地所述Th细胞应答是Th1细胞应答。
90.权利要求46-89中任一项的方法，其中所述动物是哺乳动物，并且其中优选地所述哺乳动物是人。
91.权利要求46-90中任一项的方法，其中所述组合物经皮下、肌肉内、静脉内、鼻内或直接导入淋巴结内而导入所述动物内。
92.一种疫苗，其含有免疫有效量的权利要求1-45中任一项的组合物以及药学可接受的稀释剂、载体或赋形剂，并且其中优选地所述疫苗进一步含有佐剂。
93.一种免疫或治疗动物的方法，包括对该动物施用免疫有效量的权利要求92的疫苗。
94.权利要求93的方法，其中所述动物是哺乳动物，并且其中优选地所述哺乳动物是人。
95.一种免疫或治疗动物的方法，包括通过施用免疫有效量的权利要求92的疫苗，而在所述动物中引发T细胞应答。
96.权利要求95的方法，其进一步包括加强所述动物中的免疫应答的步骤，其中优选地，这种加强是通过施用免疫有效量的权利要求92的疫苗或免疫有效量的异种疫苗来实现的，其中更优选地，所述异种疫苗是DNA疫苗。
97.一种免疫或治疗动物的方法，包括在所述动物中引发T细胞应答和加强所述动物中的T细胞应答的步骤，其中这种加强是通过施用免疫有效量的权利要求92的疫苗来实现的。
98.权利要求97的方法，其中所述引发是通过施用免疫有效量的权利要求92的疫苗或免疫有效量的异种疫苗来实现的，其中更优选地，所述异种疫苗是DNA疫苗。
全文摘要
本发明涉及分子生物学、病毒学、免疫学和医学领域。本发明提供修饰的病毒样颗粒(VLP)，包括能够载有免疫刺激物，特别是载有含非甲基化C和G(CpG)的DNA寡核苷酸的VLP，并且来源于MelanA的具体肽与之连接。这些CpG VLP比不含CpG的对应物具有显著更强的免疫原性，并且诱导增强的B和T细胞应答。针对任选地与该VLP偶联、融合或以其他方式附着的MelanA肽类似物的免疫应答与针对该VLP本身的免疫应答相似地增强。另外，针对MelanA肽类似物的T细胞应答特别集中在Th1型。因此，与载有CpG的VLP附着的抗原可能是用于针对变态反应、肿瘤和其它自体分子和慢性病毒病的预防性或治疗性接种的理想疫苗。
文档编号A61K39/00GK1764719SQ200480007906
公开日2006年4月26日 申请日期2004年3月25日 优先权日2003年3月26日
发明者马丁·F·巴赫曼, 瓦尼阿·马诺勒夫, 埃德温·麦亚林克, 卡尔·G·普罗巴, 卡特林·施万茨 申请人:赛托斯生物技术公司