专利名称：利用脐带血治疗患有疾病、紊乱或状况的个体的用途的制作方法
1.导言本发明涉及没有进行输血前HLA分型的大剂量脐血组合物的用途。脐血具有许多用途和应用，包括但不限于，用于移植的治疗用途、诊断和研究的用途。特别地，脐血可用于疾病或紊乱的治疗，包括血管病、神经病学疾病或紊乱、自身免疫病或紊乱、和涉及炎症的疾病或紊乱。
2.发明背景对人干细胞的鉴定、分离和产生存在着相当大的兴趣。人干细胞是全能性或多能性的前体细胞，能够产生多种成熟的人细胞系。这种能力起着器官和组织发育所必需的细胞分化和特化基础的作用。
在这种干细胞移植中的最新成就已经为由于疾病而进行的骨髓去除、暴露于有毒的化学药品和/或辐射后恢复和/或补充骨髓提供了新的临床工具。存在进一步的证据表明可使用干细胞来使许多、不一定是所有的组织重新建群，并且恢复生理性和解剖学功能。干细胞在组织工程、基因治疗递送和细胞治疗学中的应用也是突飞猛进的。
已经表征了许多不同类型的哺乳动物干细胞。例如，胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、成人干细胞或其他分型的干细胞或祖细胞是已知的。不只分离和表征了某些干细胞，也已经在容许分化至有限程度的条件下进行培养。然而仍然存在基本的问题，因为获得能够分化成为所有细胞类型的足够数量和群体的人干细胞近乎是不可能的。提供足够数量和品质的匹配的干细胞单元仍然是个挑战，尽管这对于治疗多种紊乱，包括恶性肿瘤、先天性代谢缺陷、血红蛋白病和免疫缺陷是很重要的。
脐带血(″脐血″)是造血祖代干细胞的已知备选来源。通常冷藏来自脐血的干细胞供造血重建，即用于骨髓和其他相关移植的广泛使用的治疗方法之用(参见例如，Boyse等人，US 5,004,681，″血液的胎儿和新生儿促红细胞生成素干和祖细胞的保存″，Boyse等人，美国专利号5,192,553，名称为″血液的胎儿和新生儿造血干和祖细胞的分离和保存和治疗使用的方法″，1993年3月9日公开)。用于收集脐血的常规技术是以针或插管的使用为基础的，其被用于借助重力从胎盘排干脐血(即，放血)(Boyse等人，美国专利号5,192,553，1993年3月9日公开；Boyse等人，美国专利号5,004,681，1991年4月2日公开；Anderson，美国专利号5,372,581，名称为用于胎盘血收集的方法和装置，1994年12月13日公开；Hessel等人，美国专利号5,415,665，名称为脐带卡钳、截点、和血液收集的设备和方法，1995年5月16日公开)。通常将针或插管置于脐静脉中，并且温和地按揉胎盘以帮助从胎盘排干脐血。然而此后，认为排干的胎盘已经没有进一步的用途而一般加以丢弃。此外从脐血获得干细胞的主要限制是经常不能获得足够体积的脐带血，而导致细胞数目不足以在移植后有效地重建骨髓。
Naughton等人(美国专利号5,962,325，名称为″三维基质的组织培养″，1999年10月5日公开)公开了可从脐带或胎盘组织或脐带血获得胎儿细胞，包括成纤维细胞样细胞和软骨祖细胞。
用于离体扩增细胞群的现用方法也是劳动强度很大的。例如，Emerson等人(美国专利号6,326,198，名称为″用于离体复制干细胞、用于优化造血祖细胞培养、和用于增加人基质细胞的代谢、GM-CSF分泌和/或IL-6分泌的方法和组合物″，2001 12月4日公开)；公开了用于离体培养人干细胞分裂和/或优化人造血祖代干细胞的方法和培养基条件。根据公开的方法，将来源于骨髓的人干细胞或祖细胞在以每ml培养物每大约24至大约48小时期间1ml培养基的比率，连续地或周期性地替换，优选灌流的液体培养基中培养。除去代谢产物并且补足消耗的营养成分，而保持在生理学可接受的条件下进行培养。
Kraus等人(美国专利号6,338,942，名称为″靶细胞群体的选择性扩增″，2002年1月15日公开)公开了可通过将来自脐血或外周血的细胞起始样品导入生长培养基，导致靶细胞群体的细胞分裂，并且使生长培养基中的细胞与包括具有针对预定的细胞群体(例如CD34细胞)的特异亲合力(例如针对CD34的单克隆抗体)的结合分子的选择元件接触，以使得从生长培养基中的其它细胞选择出预定的靶群体细胞，来选择性地扩增预定的细胞靶群体。
Rodgers等人(美国专利号6,335,195，名称为″用于促进造血和间质细胞增殖和分化的方法，″2002年1月1日公开)公开了用于离体培养造血和间质干细胞，并且通过在存在单独或与其它生长因子和细胞因子组合的血管紧张素原、血管紧张素I(AI)、AI类似物、AI片段及其类似物、血管紧张素II(AII)、AII类似物、AII片段及其类似物或AII AT22型受体拮抗剂时生长，来诱导谱系-特异的细胞增殖和分化的方法。干细胞来源于骨髓、外周血或脐带血。然而正如上文所论述的，这种方法的缺陷是用于诱导干细胞增殖和分化的这种离体方法是耗时的，并且也导致了干细胞的低产率。
Naughton等人(美国专利号6,022,743，名称为″体外制备培养的活基质组织的胰腺实质细胞的三维培养，″2002年2月8日公开)公开了其中使干细胞或祖细胞(例如基质细胞，例如来源于脐带细胞、胎盘细胞、间质干细胞或胎儿细胞的基质细胞)在例如培养容器，例如培养瓶或培养皿中的三维支持物而不是二维单层上增殖的组织培养系统。
由于对干细胞收集和使用的限制，和一般从脐血收集的细胞的数目不足，干细胞是极其短缺的。干细胞具有用于治疗多种紊乱，包括恶性肿瘤、先天性代谢缺陷、血红蛋白病和免疫缺陷的潜能。存在对大量人干细胞的易得到来源用于多种治疗和其他医学上相关目的的关键需要。本发明强调了这种需要和其它需要。
另外，预期本发明的组合物可用于治疗神经病学状况，例如肌萎缩性侧索硬化(ALS)。利用家族性ALS，即一种较不普遍形式的ALS的经辐射小鼠模型的若干最近的研究已经暗示了脐血可用于治疗这种疾病。参见Ende等人，Life Sci.6753059(2000)。
3.发明概述本发明提供治疗个体的方法，包括将脐带血或由此而来的细胞级分单独或与来源于包括胎盘的其它来源的细胞组合施用于所述的个体。将高剂量的脐带血提供给个体，即每个个体每次施用5-25×109个总的有核细胞。本发明的方法也具体说明了可从多个不同来源收集脐血，而不特异地需要在受体和供体之间匹配HLA型。
本发明涉及使用脐血组合物或由此而来的干或祖细胞来治疗疾病、紊乱或状况的用途。这种疾病、紊乱或状况可能是本质是自身免疫，或包括炎症症状，并且可能影响机体的任何器官或组织，特别是神经系统或血管系统。
在一个实施方案中，本发明提供治疗有需要的患者的方法，包括施用大量脐带血细胞。在具体的实施方案中，所述的患者患有神经系统疾病、紊乱或状况。在更具体的实施方案中，所述的疾病、紊乱或状况影响中枢神经系统。在更具体的实施方案中，所述的疾病、紊乱或状况是肌萎缩性侧索硬化。在另一个更具体的实施方案中，所述的疾病、紊乱或状况是多发性硬化。在另一个更具体的实施方案中，所述的疾病、紊乱或状况影响周围神经系统。在另一个更具体的实施方案中，所述的疾病、紊乱或状况影响血管系统。在另一个更具体的实施方案中，所述的疾病、紊乱或状况涉及炎症或由炎症所引起。在另一个更具体的实施方案中，所述的疾病、紊乱或状况是自身免疫病、紊乱或状况。
在另一个实施方案中，本发明提供治疗脊髓发育不良的方法，其包括将脐带血细胞(或由其分离的干细胞)施用于需要其的患者。
3.1.定义如在此所使用的，术语″同种异基因细胞″是指″外源的″细胞，即异源的细胞(即，来源于除了胎盘供体之外的来源的″非自身″的细胞)或自体的细胞(即，来源于胎盘供体的″自身″细胞)，其来源于除了胎盘外的器官或组织。
如在此所使用的，术语″祖细胞″是指定向分化为细胞的特定类型或形成特定组织类型的细胞。
如在此所使用的，术语″干细胞″是指可不确定地分化以形成组织和器官的特化细胞的主要细胞。干细胞是发育性地全能或多能细胞。干细胞可分裂产生2个子代干细胞，或1个子代干细胞和1个祖代(″转变的″)细胞，然后其增殖成为组织的成熟的、完全形成的细胞。
如在此所使用的，术语″脐血来源的干细胞″包括脐血来源的祖细胞，除非另外具体地指出。
4.发明详述本发明部分地基于发明人的出乎意料的发现，即可将高剂量的脐血施用于个体而不需要HLA分型。这是令人惊讶的，因为组织移植一般包括供体和受体组织类型的精细匹配以容许同种异基因细胞成功、耐久地移植入受体并且减少移植物抗宿主疾病(GvHD)的发生率。这极大地便于从多个供体收集脐血用于施用于单个个体。高剂量的施用容许提供足够的脐血来源的干细胞以提供所施用细胞长期植入的高可能性。根据本发明，高剂量的脐血具有许多用途和应用，包括但不限于，用于移植的治疗用途和疾病的治疗和预防、以及诊断和研究的用途。
本发明也提供用生长因子，例如细胞因子和/或白细胞介素处理脐血以诱导细胞分化的方法。
本发明提供包括单独的脐血或与来自胎盘的细胞组合的脐血的药物组合物。根据本发明，来自脐带血的干细胞群具有许多用途，包括治疗和诊断的用途。干细胞可用于移植或治疗或预防疾病。在本发明的一个实施方案中，脐血或脐血来源的干细胞用来更新和恢复组织和器官，由此替换或修复病变组织、器官或其部分。在另一个实施方案中，脐血或脐血来源的干细胞可用来诊断筛选遗传性紊乱或对于特定疾病或紊乱的易患病体质。
本发明也提供通过施用脐血或脐血来源的干细胞治疗有需要的患者的方法。
4.1.脐带血的收集可以任何医学上或药物学上可接受的方式收集脐带血。已经描述了用于收集脐血的多种方法。参见例如，Coe，美国专利号6,102,871；Haswell，美国专利号6,179,819B1.可将脐血收集进入例如，血袋、转送袋、或无菌的塑料试管。脐血或由其来源的干细胞可储存为收集自单个个体(即，作为单个单位)而用于施用，或可与其它用于稍后施用的单位合并。
4.2.脐血来源的干细胞根据本发明的方法获得的脐血来源的干细胞可包括多潜能的细胞，即具有自我更新的完全分化多能性，并且可在组织内保持静止或休眠状态的细胞。脐血主要包含CD34+和CD38+造血祖细胞，以及更未分化的或原始的干细胞的较小群体。
可诱导通过本发明的方法获得的脐血来源的干细胞沿着特定的细胞系分化，包括造血的、血管生成的、神经原的、和生成肝组织的细胞系。在某些实施方案中，诱导脐血来源的干细胞分化供移植和离体的治疗方法之用。在某些实施方案中，诱导通过本发明的方法获得的脐血来源的干细胞分化成为特定的细胞类型并且进行遗传工程化以提供治疗性的基因产物。
收集后也可利用本领域公知的方法，例如通过在饲养细胞，例如经辐射的成纤维细胞上，或在获得自饲养细胞培养物的条件培养基中培养，以便获得连续的长期培养物来进一步培养脐血来源的干细胞。也可在收集前或体外收集后扩增干细胞。在某些实施方案中，使待扩增的干细胞暴露于抑制细胞分化的试剂，或在存在该试剂时进行培养。这种试剂是本领域已知的，包括但不限于人Delta-1和人Serrate-1多肽(参见，Sakano等人，美国专利号6,337,387，名称为″抑制分化的多肽″，2002年1月8日公开)、白血病抑制因子(LIF)和干细胞因子。用于扩增细胞群的方法也是本领域已知的(参见例如，Emerson等人，美国专利号6,326,198，名称为″用于离体复制干细胞、用于优化造血祖细胞培养、和用于增加人基质细胞的代谢、GM-CSF分泌和/或IL-6分泌的方法和组合物″，2001年12月4日公开；Kraus等人，美国专利号6,338,942，名称为″靶细胞群的选择性扩增″，2002年1月16日公开)。
可利用本领域已知的标准技术评估脐血来源的干细胞的存活力、增殖潜力、和寿命，例如台盼蓝排染测定、荧光素二乙酸酯摄取测定、碘化丙啶摄取测定(评估存活力)；和胸腺嘧啶脱氧核苷摄取测定、MTT细胞增殖测定(评估增殖)。可通过本领域公知的方法测定寿命，例如通过测定扩充的培养中群体加倍的最大数目。
可诱导干或祖细胞分化的试剂是本领域已知的，包括但不限于Ca2+、EGF、α-FGF、β-FGF、PDGF、角质细胞生长因子(KGF)、TGF-β、细胞因子(例如，IL-1α、IL-1β、IL-1γ、TFN)、视黄酸、转铁蛋白、激素(例如，雄激素、雌激素、胰岛素、催乳激素、三碘甲腺原氨酸、氢化可的松、地塞米松)、丁酸钠、TPA、DMSO、NMF、DMF、基质因子(例如，胶原、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素、MatrigelTM)、或其组合。在某些实施方案中，根据本领域公知的方法，通过暴露于生长因子而诱导脐血来源的干或祖细胞分化成为特定的细胞类型。在具体的实施方案中，生长因子是GM-CSF、IL-4、Flt3L、CD40L、IFN-α、TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6、视黄酸、碱性成纤维细胞生长因子、TGF-β-1、TGF-β-3、肝细胞生长因子、表皮生长因子、促心肌素-1、血管紧张素原、血管紧张素I(AI)、血管紧张素II(AII)、AII AT22型受体拮抗剂、或其类似物或片段。
抑制细胞分化的试剂也是本领域已知的，包括但不限于人Delta-1和人Serrate-1多肽(参见，Sakano等人，美国专利号6,337,387，名称为″抑制分化的多肽″，2002年1月8日公开)、白血病抑制因子(LIF)和干细胞因子。
确定干细胞已经分化成为特定细胞类型，可伴随有本领域众所周知的方法，例如，利用例如流式细胞术或免疫细胞化学(例如，用组织特异的或细胞标记特异的抗体染色细胞)的技术测量形态学变化和细胞表面标记，利用光或共聚焦显微镜术检验细胞的形态学，或利用本领域公知的技术，例如PCR和基因-表达图谱测量基因表达的变化。
在一个实施方案中，根据本领域公知的方法，例如根据第5.1.1.s节中公开的方法，通过暴露于β-巯基乙醇或DMSO/丁基化羟基苯甲醚诱导脐血来源的干或祖细胞分化成为神经元。
在另一个实施方案中，根据本领域公知的方法，例如根据第5.1.2节中公开的方法，通过暴露于地塞米松、吲哚美辛、胰岛素和IBMX诱导干或祖细胞分化成为脂肪细胞。
在另一个实施方案中，根据本领域公知的方法，例如根据第5.1.3节中公开的方法，通过暴露于TGF-β-3诱导干或祖细胞分化成为软骨细胞。
在另一个实施方案中，根据本领域公知的方法，例如根据第5.1.4节中公开的方法通过暴露于地塞米松、抗坏血酸-2-磷酸酯和β-磷酸甘油诱导干或祖细胞分化成为骨细胞。
在另一个实施方案中，根据本领域公知的方法，例如根据第5.1.5节中公开的方法，通过暴露于IL-6+/-IL-15诱导干或祖细胞分化成为肝细胞。
在另一个实施方案中，根据本领域公知的方法，例如根据第5.1.6节中公开的方法，通过暴露于碱性成纤维细胞生长因子，和转化生长因子β-1诱导干或祖细胞分化成为胰腺细胞。
在另一个实施方案中，根据本领域公知的方法，例如根据第5.1.7节公开的方法，通过暴露于视黄酸、碱性成纤维细胞生长因子、TGF-β-1和表皮生长因子、通过暴露于促心肌素-1或通过暴露于人心肌提取物诱导干或祖细胞分化成为心脏细胞。
在另一个实施方案中，例如，通过施用促红细胞生成素、细胞因子、淋巴激活素、干扰素、集落刺激因子(CSF′s)、干扰素、趋化因子、白细胞介素、重组的人造血生长因子，包括配体、干细胞因子、血小板生成素(Tpo)、白细胞介素，以及粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或其他生长因子来刺激干细胞增殖。
可将包含转基因的载体通过本领域公知的方法导入令人感兴趣的干细胞，例如，转染、转化、转导、电穿孔、感染、微注射、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、脂质体、LIEPOFECTETM、溶酶体融合、合成的阳离子脂类、利用基因枪或DNA载体运送蛋白，以使转基因转送到子代细胞。对于转化或转染哺乳动物细胞的多种技术，参见Keown等人，1990，Methods Enzymol.185527-37；Sambrook等人，2001，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第三版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，N.Y.。
优选地，利用任何技术导入转基因，只要不是对细胞的核膜或其他存在的细胞或遗传结构有害的。在某些实施方案中，通过微注射将转基因插入核遗传物质中。细胞和细胞结构的微注射通常是本领域已知和可实施的。
对于培养的哺乳动物细胞的稳定转染，只有小部分细胞可将外源DNA整合到其基因组中。整合的效率取决于所使用的载体和转染技术。为了鉴定和选择整合体，一般将编码可选择标记(例如，对于抗生素的抗药性)的基因与目的基因序列一起导入干细胞。优选的可选择标记包括赋予抗药性的标记，例如G418、潮霉素和氨甲蝶呤。可通过药物选择(例如，已经整合可选择的标记基因的细胞将存活，而其他的细胞将死亡)鉴定用导入的核酸稳定转染的细胞。这些方法对涉及在导入或移植重组细胞进入受试个体或患者前，在哺乳动物细胞中同源重组的方法是特别有用的。
许多选择系统可用来选择转化的脐血来源的干细胞。特别地，载体可包含某些可检测的或可选择的标记。选择的其它方法包括但不限于选择另一个标记，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，1977，Cell 11223)、次黄嘌呤-鸟嘌呤转磷酸核糖基转移酶(Szybalska和Szybalski，1962，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 482026)、和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等人，1980，Cell 22817)基因可分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞。也可使用抗代谢物抗性作为选择下列基因的基础dhfr，其赋予对氨甲蝶呤的抗性(Wigler等人，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 773567；O′Hare等人，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 781527)；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan和Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 782072)；neo，其赋予对氨基糖苷类G-418的抗性(Colberre-Garapin等人，1981，J.Mol.Biol.1501)；和hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre等人，1984，基因Gene 30147).
转基因可整合进入令人感兴趣的细胞的基因组，优选为随机整合。在其他的实施方案中，转基因可通过直接的方法，例如通过直接的同源重组整合(即，在令人感兴趣的细胞基因组中″敲入″或″敲除″令人感兴趣的基因)，Chappel，美国专利号5,272,071；和1991年5月16日公开的PCT公开号WO 91/06667；Capecchi等人，1995年11月7日公开的美国专利5,464,764；Capecehi等人，1997年5月6日公开的美国专利5,627,059；Capecchi等人，1996年1月30日发表的美国专利5,487,992)。
用于通过同源重组产生具有靶基因修饰的细胞的方法是本领域已知的。构建体可包括令人感兴趣的、具有所需要的遗传修饰的基因的至少一部分，并且可包括与靶基因座同源的区域，即宿主基因组中靶基因的内源性拷贝。用于随机整合的DNA构建体，与用于同源重组的构建体相比，不必包括同源区域以介导重组。可将标记包括入用于进行阳性和阴性选择转基因插入的靶构建体或随机构建体中。
为了产生同源重组细胞，例如同源重组的脐血来源的干细胞，制备同源重组载体，其中令人感兴趣的基因在与靶细胞基因组内源的基因序列的5′和3′末端的侧翼，以容许同源重组发生在由载体携带的令人感兴趣的基因和靶细胞基因组中的内源基因之间。附加的侧翼核酸序列具有足够的长度以用于与靶细胞基因组中的内源基因成功地同源重组。一般地，侧翼DNA的几千个碱基(在5′和3′末端)包括在载体中。用于构建同源重组载体的方法和来自重组干细胞的同源重组动物通常是本领域已知的(参见例如，Thomas和Capecchi，1987，Cell 51503；Bradley，1991，Curr.Opin.Bio/Technol.2823-29；和PCT公开号WO90/11354、WO 91/01140、和WO 93/04169。
在具体的实施方案中，使用Bonadio等人的方法(1999年8月24日公开，题目为用于将多种基因转入骨细胞的方法和组合物的美国专利号5,942,496；和1995年8月24日公开，题目为用于刺激骨细胞的方法和组合物的PCT W095/22611)将核酸导入令人感兴趣的细胞，例如胎盘中培养的干细胞、祖细胞或外源细胞，例如骨祖细胞。
可使用脐血来源的干细胞，在具体的实施方案中，在自体的或异体的酶代替治疗中治疗的具体疾病或状况，包括但不限于，溶酶体贮存疾病，例如Tay-Sachs、Niemann-Pick、Fabry′s、Gaucher′s、Hunter′s和Hurler′s综合征，以及其他神经节苷脂贮积症、粘多糖贮积症和糖原贮积症。
在其他的实施方案中，该细胞可用作基因治疗中自体的或异体的转基因载体，来矫正先天性代谢缺陷、肾上腺脑白质营养不良、囊性纤维化、糖原贮积病、甲状腺机能减退症、镰刀形红细胞贫血病、Pearson综合征、Pompe′s病、苯丙酮尿症(PKU)、卟啉症、槭糖尿病、高胱氨酸尿症、粘多糖沉积症、慢性肉芽肿病和酪氨酸血症和泰-萨二氏病或治疗癌症、肿瘤或其他病理学状况。
在其他的实施方案中，该细胞可用于自体的或异体的组织再生或替代治疗或方法，包括但不限于治疗角膜上皮细胞缺陷、软骨修复、面部皮肤擦除、粘膜、鼓膜、肠被膜、神经学结构(例如，视网膜、基底膜中的听觉神经元、嗅上皮中的嗅觉神经元)、用于皮肤创伤性损伤的烧伤和创伤修复，或用于其他受损或病变器官或组织的重建。
用于本发明方法的大量脐血来源的干细胞和/或祖细胞可在某些实施方案中减少对大量骨髓捐赠的需要。每千克患者的重量必须注入大约1×108至2×108个骨髓单核细胞，用于骨髓移植中的移入(即，对于70kg的供体大约70ml的骨髓)。为了获得70ml，在捐赠过程中需要大量的捐赠和显著的失血。在具体的实施方案中，来自小的骨髓捐赠物(例如，7-10ml)的细胞可在输注进入受体前通过在胎盘生物反应器中增殖而扩大。
此外，少量干细胞和祖细胞在血流中正常循环。在另一个实施方案中，通过血液提取法收集这种外源干细胞或外源祖细胞，在该方法中取出血液，有选择地除去一种或多种成分，而将血液的其余部分再注入供体。
在另一个实施方案中，施用高剂量的脐血或脐血来源的干细胞用作除化疗外的辅助治疗。大多数用于导向和破坏癌细胞的化疗试剂通过杀死所有的增殖细胞，即经历细胞分裂的细胞而起作用。因为骨髓是机体内最活跃增殖的一种组织，造血干细胞经常由于化疗试剂而受到损伤或破坏并因此减少或降低血细胞的产生。必须以一定间隔终止化疗以容许患者的造血系统在重新开始化疗前补足血细胞供给。这可能需要1个月或更多时间，使原先休眠的干细胞增殖，并使白细胞计数增加到可接受的水平，以便化疗可重新开始(当再次进行，骨髓干细胞被破坏)。
血细胞在化疗治疗之间再生，然而，癌症也有时间生长并且可能由于自然选择对化疗药物变得更有抗性。因此，化疗进行越久以及治疗之间持续时间越短，成功杀灭癌症的几率越大。为了缩短化疗治疗之间的时间，可将脐血或脐血来源的干细胞导入患者。这种治疗可减少患者显示低血细胞计数的时间，并且因此容许化学治疗的较早再开始。
4.3.脐血和脐血来源的干细胞的用途脐血和脐血来源的干细胞可用于多种治疗性方法，其中机体的组织或器官通过移入、移植或输注所需要的细胞群，例如干细胞或祖细胞群而增大、修复或替代。
在本发明优选的实施方案中，脐血或脐血来源的干细胞可使用作自体的和异体的，包括匹配和错配的HLA型造血移植物。然而根据利用脐血或脐血来源的干细胞作为异源造血的移植物，可处理宿主以减少供体细胞的免疫排斥，例如如1998年9月1日公开的美国专利号5,800,539；和1998年9月15日公开的美国专利号5,806,529所描述的，其在此引入作为参考。
脐血或脐血来源的干细胞可用于修复由疾病导致的组织和器官的损伤。在这种实施方案中，可对患者施用脐血或脐血来源的干细胞来使已经由于疾病而损伤的组织或器官再生或恢复，例如，在化疗或放疗后增强免疫系统，在心肌梗塞后修复心脏组织。
脐血或脐血来源的干细胞可用于在骨髓移植中增加或替代骨髓细胞。目前将人自体和异体的骨髓移植用于治疗疾病，例如白血病、淋巴瘤和其他危胁生命的紊乱。然而这些方法的缺陷是必须移出大量的供体骨髓以保证有足够的细胞用于移入。
脐血或脐血来源的干细胞可提供减少对大量骨髓捐赠的需要的干细胞和祖细胞。根据本发明的方法也获得小的骨髓捐赠物，然后在输注或移植进入受体前，在胎盘中培养和扩增增加干细胞和祖细胞的数目。
可使用脐血或脐血来源的干细胞，在具体的实施方案中，在自体的或异体的酶代替治疗中治疗的具体疾病或状况，包括但不限于，溶酶体贮存疾病，例如Tay-Sachs、Niemann-Pick、Fabry′s、Gaucher′s、Hunter′s和Hurler′s综合征，以及其他神经节苷脂贮积症、粘多糖贮积症和糖原贮积症。
在其他的实施方案中，可使用细胞作为基因治疗中自体的或异体的转基因载体，来矫正先天性代谢缺陷，例如肾上腺脑白质营养不良、囊性纤维化、糖原贮积病、甲状腺机能减退症、镰刀形红细胞贫血病、Pearson综合征、Pompe′s病、苯丙酮尿症(PKU)、和泰-萨二氏病、卟啉症、械糖尿病、高胱氨酸尿症、粘多糖沉积症、慢性肉芽肿病和酪氨酸血症，或治疗癌症、肿瘤或其他病理学或肿瘤状况。
在其他的实施方案中，该细胞可用于自体的或异体的组织再生或置换治疗或方法，包括但不限于治疗角膜上皮细胞缺陷、软骨、面部皮肤擦除、粘膜、鼓膜、肠被膜、神经学结构(例如，视网膜、基底膜中的听觉神经元、嗅上皮中的嗅觉神经元)、用于皮肤创伤性损伤的烧伤和创伤修复，头皮(毛发)移植，或用于其他受损或病变器官或组织的重建。
大量的脐血或大量的脐血或脐血来源的干细胞可在某些实施方案中减少对大量的骨髓捐赠的需要。每千克患者的重量必须注入大约1×108至2×108个骨髓单核细胞，用于骨髓移植中的移入(即，对于70kg的供体大约70ml的骨髓)。为了获得70ml，在捐赠过程中需要大量的捐赠和显著的失血。在具体的实施方案中，来自小的骨髓捐赠物(例如，7-10ml)的细胞可在输注进入受体前通过在胎盘生物反应器中增殖而扩大。
在另一个实施方案中，脐血或脐血来源的干细胞可被用于除化疗外的辅助治疗。大多数用于导向和破坏癌细胞的化疗试剂通过杀死所有的增殖细胞，即经历细胞分裂的细胞而起作用。因为骨髓是体内最活跃增殖的一种组织，造血干细胞经常由于化疗试剂而受到损伤或破坏并因此减少或降低血细胞的产生。必须以一定间隔终止化疗以容许患者的造血系统在重新开始化疗前补足血细胞供给。这可能需要1个月或更多时间，使原先休眠的干细胞增殖，并使白细胞计数增加到可接受的水平，以便化疗可重新开始(当再次进行，骨髓干细胞被破坏)。
血细胞在化疗治疗之间再生，然而，癌症也有时间生长并且可能由于自然选择对化疗药物变得更有抗性。因此，化疗进行越久以及治疗之间持续时间越短，成功杀灭癌症的几率越大。为了缩短化疗治疗之间的时间，可将脐血或脐血来源的干细胞导入患者。这种治疗可减少患者显示低血细胞计数的时间，并且因此容许化学治疗的较早再开始。
在另一个实施方案中，人胎盘干细胞可用于治疗或防止例如慢性肉芽肿病的遗传性疾病。
4.4.药物组合物本发明包括药物组合物，其包括当单次或多次施用时的剂量和/或有效剂量，在移植调节的或未调节的人祖代干细胞前或之后，发挥作用足够抑制、调制和/或调节人全能和多能的胎盘起源的祖代干细胞分化成为中胚层和/或造血系细胞。
在一个实施方案中，本发明提供具有高浓度(或更大群体)的同质造血干细胞的药物组合物，包括但不限于CD34+/CD38-细胞；和CD34-/CD38-细胞。可将一种或多种的这些细胞群体与其它的干细胞或与其它的干细胞作为混合物进行使用，供移植和其他用途之用。
在具体的实施方案中，使脐血或脐血来源的干细胞包含在袋子中。在另一个实施方案中，本发明提供在冷冻前″调节的(conditioned)″脐血或脐血来源的干细胞。
在另一个实施方案中，可根据标准方法通过除去红细胞和/或粒细胞调节脐血或脐血来源的干细胞，因此保持有核细胞的群体用于富集干细胞。可不解冻而使用这种干细胞的富集群体，或冷冻后稍晚再使用。如果将要冷冻细胞群体，在冷冻前向富集的细胞群加入标准的冷冻保护剂(例如，DMSO、甘油、EpilifeTM细胞冷冻培养基(CascadeBiologics))。
在另一个实施方案中，可在已经冷冻和解冻后通过除去红细胞和/或粒细胞调节脐血或脐血来源的干细胞。
根据本发明，诱导细胞分化的试剂可用来调节脐血或脐血来源的干细胞。在某些实施方案中，可向容器内的细胞群加入诱导分化的试剂，包括但不限于Ca2+、EGF、α-FGF、β-FGF、PDGF、角质细胞生长因子(KGF)、TGF-β、细胞因子(例如，IL-1α、IL-1β、IFN-γ、TFN)、视黄酸、转铁蛋白、激素(例如，雄激素、雌激素、胰岛素、催乳激素、三碘甲腺原氨酸、氢化可的松、地塞米松)、丁酸钠、TPA、DMSO、NMF、DMF、基质因子(例如，胶原、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素、MatrigelTM)、或其组合。
在另一个实施方案中，可向脐血或脐血来源的干细胞加入抑制细胞分化的试剂。在某些实施方案中，可向容器内的细胞群加入抑制分化的试剂，包括但不限于人Delta-1和人Serrate-1多肽(参见，Sakano等人，美国专利号6,337,387，名称为″抑制分化的多肽″，2002年1月8日公开)、白血病抑制因子(LIF)、干细胞因子、或其组合。
在某些实施方案中，将脐血、或一种或多种脐血来源的干细胞群递送给有需要的患者。在某些实施方案中，从单个容器或单个递送系统递送两种或多种新鲜(从未冷冻)的细胞群。
在另一个实施方案中，从单个容器或单个递送系统递送两种或多种冷冻和解冻的细胞群。
在另一个实施方案中，将两种或多种新鲜(从未冷冻)的细胞群中的每一种转移至单个容器或单个递送系统或由其递送。在另一个实施方案中，转移和递送将两种或多种冷冻和解冻的细胞群中的每一种转移至单个容器或单个递送系统或由其递送。在这些实施方案的另一个方面，从不同的IV输液袋(例如，来自Baxter，Becton-Dickinson，Medcep，National Hospital Products或Terumo)递送每个群体。可通过分开的递送系统递送各个容器(例如，IV输液袋)的内容物，或各个容器可以是″自动分段控制″，因此其内容物可在从单个递送系统递送前组合或混合。例如，可将两种或多种细胞群加入普通的流水线(例如，管道)和/或在其内混合，或可将它们注入普通的容器(例如，隔室或袋子)和/或在其内混合。
根据本发明，可在施用前、在施用或递送期间或在施用或递送同时组合细胞的两种或多种群体。
在一个实施方案中，将最少1.7×107个有核细胞/kg递送给需要其的患者。优选地，将至少2.5×107个有核细胞/kg递送给需要其的患者。
4.5.治疗的方法在一个实施方案中，本发明提供治疗或防止受试个体中疾病或紊乱的方法，包括施用于受试个体治疗有效量的本发明的干细胞，该受试个体中需要这种治疗或预防。
在另一个实施方案中，本发明提供治疗或防止受试个体中疾病或紊乱的方法，包括施用于受试个体治疗治疗有效量的脐血或脐血来源的干细胞，该受试个体中这种治疗或预防需要。
当被施用于经受炎症的个体时，预期脐血或脐血来源的干细胞具有抗炎效果。在优选的实施方案中，脐血或脐血来源的干细胞可用来治疗由炎症产生或与炎症相关的任何疾病、状况或紊乱。炎症可存在于任何器官或组织中，例如肌肉；神经系统，包括脑、脊髓和周围神经系统；血管组织，包括心脏组织；胰腺；肠或其它消化道器官；肺；肾脏；肝；生殖器官；内皮组织、或内胚层组织。
脐血或脐血来源的干细胞也可用来治疗免疫相关的紊乱，特别是自身免疫紊乱，包括与炎症相关的紊乱。因此，在某些实施方案中，本发明提供治疗患有自身免疫病或状况的个体的方法，包括对这种个体施用治疗有效量的脐血或脐血来源的干细胞，其中所述的疾病或紊乱可以是但不限于糖尿病、肌萎缩性侧索硬化、重症肌无力、糖尿病性神经病或狼疮。脐血或脐血来源的干细胞也可用来治疗急性或慢性过敏，例如季节性过敏、食物过敏、对自身抗原的过敏等。
在某些实施方案中，疾病或紊乱包括但不限于在此公开的任何疾病或紊乱，包括但不限于再生障碍性贫血、脊髓发育不良、心肌梗塞、癫痫病症、多发性硬化、中风、低血压、心跳骤停、局部缺血、炎症、年龄相关的认知功能丧失、辐射损伤、大脑性麻痹、神经变性疾病、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、Leigh病、AIDS痴呆、记忆丧失、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、缺血性肾病、脑或脊髓创伤、心肺旁路、青光眼、视网膜局部缺血、视网膜创伤、溶酶体储存疾病、例如Tay-Sachs、Niemann-Pick、Fabry′s、Gaucher′s、Hunter′s、和Hurler′s综合征，以及其它的神经节苷脂贮积症、粘多糖贮积症、糖原贮积病、先天性代谢缺陷、肾上腺脑白质、囊性纤维化、糖原贮积病、甲状腺机能减退症、镰刀形红细胞贫血病、Pearson综合征、Pompe′s病、苯丙酮尿症(PKU)、卟啉症、槭糖尿病、高胱氨酸尿症、粘多糖沉积症、慢性肉芽肿病和酪氨酸血症、泰-萨二氏病、癌症、肿瘤或其他病理学或肿瘤状况。
在其他的实施方案中，细胞可用于治疗由于创伤，特别是涉及炎症的创伤造成的任何种类的损伤。这种创伤相关状况的实例包括中枢神经系统(CNS)损伤，包括脑、脊髓、或CNS损伤周围组织至周围神经系统(PNS)的损伤；或机体的任何其它部分的损伤。这种创伤可能是由事故造成的，或可能是例如外科手术或血管成形术的医学方法的正常或异常结果。创伤也可能是血管的破裂、衰退或堵塞的结果，例如中风或静脉炎。在具体的实施方案中，该细胞可用于自体的或异体的组织再生或替代治疗或方法，包括但不限于治疗角膜上皮细胞缺损、软骨修复、面部皮肤擦除、粘膜、鼓膜、肠被膜、神经学结构(例如，视网膜、基底膜中的听觉神经元、嗅上皮中的嗅觉神经元)、用于皮肤创伤性损伤的烧伤和创伤修复，或用于其他受损害或病变器官或组织的重建。
在具体的实施方案中，疾病或紊乱是再生障碍性贫血、脊髓发育不良、白血病、骨髓失调或造血器官疾病或紊乱。在另一个具体的实施方案中，受试个体是人。
在另一个实施方案中，本发明提供治疗患有与炎症相关或由炎症产生的疾病、紊乱或状况的个体的方法。在具体的实施方案中，所述的疾病、紊乱或状况是神经系统疾病、紊乱或状况。在更具体的实施方案中，所述的神经系统疾病是肌萎缩性侧索硬化(ALS)。在另一个更具体的实施方案中，所述的神经系统疾病是帕金森氏病。在另一个具体的实施方案中，所述的疾病是血管或心血管疾病。在更具体的实施方案中，所述的疾病是动脉粥样硬化。在另一个具体的实施方案中，所述的疾病是糖尿病。
脐血或脐血来源的干细胞的特别有用的方面是不必在施用前对细胞进行HLA-分型。换言之，脐血或脐血来源的干细胞可取自异源的供体，或多个异源供体，并移植到需要这种细胞的个体，并且移植的细胞无限地保持在宿主内。这消除了对HLA分型的需要，极大地方便了移植方法本身和鉴定用于移植的供体。然而脐血或脐血来源的干细胞可能在施用前是HLA分型的。
本发明人已经发现如果预调节这些细胞，则用脐血或脐血来源的干细胞治疗个体的效果得到增强。预调节包括使细胞在大约-5至23℃、0至10℃、或优选4-5℃下储存在透气的容器中一段时期。该时段可在18小时和21天之间，在48小时和10天之间，以及优选在3-5天之间。在预处理前细胞可以是冷藏的，或优选在施用前立即预处理。
因此，在一个实施方案中，本发明提供治疗个体的方法，包括将从至少一个供体收集的脐血或脐血来源的干细胞施用于所述的个体。在此″供体″是指成人、儿童、婴儿或优选胎盘。在另一个优选的实施方案中，本方法包括将从多个供体收集并合并的脐血或脐血来源的干细胞施用于所述的个体。备选地，脐血或脐血来源的干细胞可分别取自多个供体，并且分开，例如顺序地施用。在具体的实施方案中，脐血或脐血来源的干细胞取自多个供体并且在不同的日期施用收集的量(单位)。
本发明特别有用的方面是将高剂量的干细胞施用于个体；这种数目的细胞比其来源的材料(例如，骨髓或脐血)是更显著有效的。在这里，″高剂量″表示是例如将在骨髓移植中所施用的5、10、15或20倍数目的总的有核细胞，包括干细胞，特别是脐血来源的干细胞。一般地，接受干细胞输入的患者，例如对于骨髓移植，接受1个单位的细胞，其中1个单位是大约1×109个有核细胞(相当于1-2×108个干细胞)。因此对于高剂量治疗，可对患者施用至少30亿、50亿、100亿、150亿、200亿、300亿、400亿、500亿或更多总的有核细胞，或备选地至少3单位、5单位、10单位、20单位、30单位、40单位、50单位或更多。因此，在一个实施方案中，施用于个体的脐血的量或脐血来源的干细胞的数目相当于通常在骨髓替代中所施用的至少5倍数目的有核细胞。在本方法的另一个具体的实施方案中，施用于个体的脐血的量或脐血来源的干细胞的数目相当于通常在骨髓替代中所施用的至少10倍数目的有核细胞。在本方法的另一个具体的实施方案中，施用于个体的脐血的量或脐血来源的干细胞的数目相当于通常在骨髓替代中所施用的至少15倍数目的有核细胞。在本方法的另一个实施方案中，施用于个体的包括干细胞的有核细胞的总数在每公斤体重1-100×108之间。在另一个实施方案中，所施用的总的有核细胞的数目是至少50亿个细胞。在另一个实施方案中，所施用的总的有核细胞的数目是至少150亿个细胞。
在另一个实施方案中，所述的脐血或脐血来源的干细胞可施用不止一次。在另一个实施方案中，通过在施用前储存18小时至21天而预调节所述的脐血或脐血来源的干细胞。在更具体的实施方案中，在施用前预调节细胞48小时至10天。在优选的具体实施方案中，在移植前预调节所述的细胞3-5天。在此处任何方法的优选实施方案中，所述的脐血或脐血来源的干细胞在施用于个体前不是HLA分型的。
如果疾病、紊乱或状况以任何方式得到可测定的改善，则可认为用脐血或脐血来源的干细胞治疗个体是有效的。可通过许多指标显示这种改善。可测量的指标包括，例如与特定的疾病、紊乱或状况相关的生理状况或生理状况系列的可检测变化(包括但不限于，血压、心率、呼吸率、多种血细胞类型的计数、血液中某些蛋白质的水平、碳水化合物、脂类或细胞因子或与疾病、紊乱或状况相关的遗传标记的调节表达)。如果通过变化至正常值内或接近于正常值的值，这些指标的任何一种对这种治疗起反应，可认为用本发明的干细胞或补充的细胞群治疗个体是有效的。可通过本领域已知的多种指标的正常范围，或与对照中的这种值相比来建立标准值。在医学中，也经常根据个体的印象和个体健康状态的主观感觉表征治疗效果。因此也可通过主观的指标表征改善，例如在施用本发明的干细胞或补充的细胞群后，改善个体的主观感觉、增加舒适感、增加健康状态、提高能量水平等。
可将脐血或脐血来源的干细胞以任何药物学上或医学上可接受的方式，包括通过注射或输液而施用于患者。细胞或补充的细胞群可包含或被包含于任何药物学上可接受的载体。可在任何药物学上或医学上可接受的容器，例如血袋、转送袋、塑料管或小瓶中携带、储存、或运输脐血或脐血来源的干细胞。
4.6.试剂盒本发明也提供包括装有一种或多种本发明的药物组合物成分的一种或多种容器的药包或试剂盒。任选与这种容器相关的可以是用于细胞培养的装置、装有细胞培养基或一种或多种细胞培养基成分的一种或多种容器、供递送本发明组合物之用的装置，例如用于静脉注射本发明组合物的装置、和/或以管理药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机关规定形式的说明，该说明反映了用于人类施用的制造、使用或销售的政府机关的许可。
提供下列实验性的实施例是为了例证说明而不是为了加以限制。
5.实施例5.1实施例1诱导分化成为特定的细胞类型通过暴露于生长因子诱导脐血细胞和/或分化成为特定的细胞类型。用于诱导的生长因子包括但不限于GM-CSF、IL-4、Flt3L、CD40L、IFN-α、TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6、视黄酸、碱性成纤维细胞生长因子、TGF-β-1、TGF-β-3、肝细胞生长因子、表皮生长因子、促心肌素-1、血管紧张素原、血管紧张素I(AI)、血管紧张素II(AII)、AIIAT22型受体拮抗剂、或其类似物或片段。
5.1.1诱导分化成为神经元这个实施例描述了诱导脐血细胞分化成为神经元。使用下列方法诱导神经元的分化1.使干细胞在由DMEM/20％FBS和1mM β-巯基乙醇组成的预诱导培养基中生长24hr。
2.除去预诱导的培养基并且用PBS洗涤细胞。
3.加入由DMEM和1-10mM β-巯基乙醇组成的神经元诱导培养基。备选地，由DMEM/2％DMSO/200μM丁基化羟基苯甲醚组成的诱导培养基可用来增强神经元分化的效力。
4.在某些实施方案中，可能早在暴露于无血清的培养基和β-巯基乙醇后60分钟发生形态学和分子的变化(Woodbury等人，J.Neurosci.Res.，61364-370)。RT/PCR可用来评估例如神经生长因子受体和神经丝重链基因的表达。
5.1.2诱导分化成为脂肪细胞这个实施例描述了诱导脐血细胞分化成为脂肪细胞。使用下列方法诱导产生脂肪的分化
1.使干细胞生长在MSCGM(Bio Whittaker)或补充有15％脐血血清的DMEM中。
2.使用3个循环的诱导/维持。每个循环由用脂肪形成诱导培养基(Bio Whittaker)饲养的胎盘干细胞组成，并且培养该细胞3天(在37℃，5％CO2)，然后在脂肪形成维持培养基中(Bio Whittaker)培养1-3天组成。所使用的诱导培养基包含1μM地塞米松、0.2mM吲哚美辛、0.01mg/ml胰岛素、0.5mM IBMX、DMEM-高葡萄糖、FBS、和抗生素。
3.3个诱导/维持的完全循环后，使细胞另外在脂肪形成维持培养基中培养7天，每隔2-3天替换培养基。
4.可通过利用亲脂性的染色油红O容易观察到的多个胞质内脂类泡的产生来评估脂肪形成。使用RT/PCR测定来检验脂肪酶和脂肪酸结合蛋白基因的表达。
5.1.3诱导分化成为软骨细胞这个实施例描述了诱导脐血细胞分化成为软骨细胞。使用下列方法诱导软骨形成分化1.使干细胞维持在MSCGM(Bio Whittaker)或补充有15％脐血血清的DMEM中。
2.等分胎盘干细胞到无菌的聚丙烯试管中。离心细胞(150×g，5分钟)，并且在不完全的软骨形成培养基(Bio Whittaker)中洗涤两次。
3.最后的洗涤后，将细胞以5×10(5)个细胞/ml的浓度重悬在包含0.01μg/ml TGF-β-3的完全软骨形成培养基(Bio Whittaker)中。
4.等分0.5ml的细胞到15ml的聚丙烯培养试管中。在150×g沉淀细胞5分钟。将沉淀完整地留在培养基中。
5.将松盖的试管在37℃，5％CO2培养24小时。
6.每隔2-3天用新鲜制备的完全软骨形成培养基培养细胞沉淀颗粒。
7.利用低速涡旋通过每日搅动将沉淀颗粒保持悬浮在培养基中。
8.培养14-28天后收获软骨形成细胞的沉淀颗粒。
9.软骨形成可通过例如，观察嗜酸性基质的产生，评估细胞形态，和/或使用RT/PCR检验胶原2和胶原9的基因表达而鉴定。
5.1.4诱导分化成为骨细胞这个实施例描述了诱导脐血细胞分化成为骨细胞。使用下列方法诱导成骨的分化1.将脐血来源的干细胞的附着培养物在MSCGM(BioWhittaker)或补充有15％脐血血清的DMEM中培养。
2.在组织培养瓶中静置培养物24小时。
3.通过用包含0.1μM地塞米松、0.05mM抗坏血酸-2-磷酸酯、10mMβ磷酸甘油的成骨诱导培养基(Bio Whittaker)替代MSCGM诱导成骨的分化。
4.每隔3-4天用成骨诱导培养基饲养细胞2-3周。
5.利用钙-特异的染色和用于碱性磷酸酶和骨桥蛋白基因表达的RT/PCR分析分化。
5.1.5诱导分化成为肝细胞这个实施例描述了诱导脐血细胞分化成为肝细胞。使用下列方法诱导生成肝组织的分化1.在补充有肝细胞生长因子，20ng/ml；和表皮生长因子，100ng/ml的DMEM/20％CBS中培养脐血来源的干细胞。可在FBS的替代中使用分液血清置换。
2.向诱导烧瓶加入IL-650ng/ml。
5.1.6诱导分化成为胰腺细胞这个实施例描述了诱导脐血细胞分化成为胰腺的细胞。使用下列方法诱导胰腺的分化1.在补充有碱性成纤维细胞生长因子，10ng/ml；和转化生长因子β-1，2ng/ml的DMEM/20％CBS培养脐血来源的干细胞。可在CBS的替代中使用分液血清置换。
2.向培养基加入来自nestin-阳性的神经元细胞培养物的条件培养基到浓度为50/50。
3.培养细胞14-28天，每3-4天重新饲养。
4.通过分析胰岛素蛋白质或通过RT/PCR分析胰岛素基因的表达而鉴定分化。
5.1.7诱导分化成为心脏细胞这个实施例描述了诱导脐血细胞分化成为心脏细胞。使用下列方法诱导生肌性的分化1.在补充有视黄酸，1μM；碱性成纤维细胞生长因子，10ng/ml；和转化生长因于β-1，2ng/ml；以及表皮生长因子，100ng/ml的DMEM/20％CBS中培养脐血来源的干细胞。可在CBS的替代中使用分液血清置换。
2.备选地，干细胞在补充有50ng/ml促心肌素-1的DMEM/20％CBS中培养24小时。
3.备选地，干细胞在无蛋白质的培养基中维持5-7天，然后用人心肌提取物刺激(逐步增加的剂量分析)。通过在补充有1％脐血血清的1％HEPES缓冲液中均质化1gm人心肌动蛋白产生心肌提取物。培养悬浮物60分钟，然后离心并收集上清液。
4.培养细胞10-14天，每3-4天重新饲养。
5.利用心动蛋白RT/PCR基因表达分析评估分化。
5.1.8在分化前和/或分化后表征脐血细胞利用例如流式细胞术和免疫细胞化学的技术测量形态学变化和细胞表面标记，以及利用例如PCR的技术测量基因表达变化而在分化前和/或分化后表征脐血细胞。已经暴露于生长因子和/或已经分化的细胞特征为存在或缺乏下列细胞表面标记CD10+、CD29+、CD34-、CD38-、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、SH2+、SH3+、SH4+、SSEA3-、SSEA4-、OCT-4+、和ABC-p+。优选地，在分化前通过存在细胞表面标记OCT-4+、APC-p+、CD34-和CD38-来表征脐血来源的干细胞。具有这些标记的干细胞与人胚胎干细胞一样是多能的(例如多潜能的)。在分化前通过存在细胞表面标记CD34+和CD38+来表征脐血细胞。来源于脐血细胞的分化细胞优选不表达这些标记。
5.2实施例2用脐血或脐血来源的干细胞治疗患有肌萎缩性侧索硬化的个体肌萎缩性侧索硬化(ALS)，也称为Lou Gehrig′s病，是影响皮层、脑干和脊髓的运动神经元的致命的神经变性疾病。ALS影响多达20,000个美国人，美国每年发生5,000个新病例。大部分ALS病例是偶发的(S-ALS)而约5-10％是遗传性的(家族性的-F-ALS)。当脑和脊髓中控制自主运动的特定神经细胞逐渐退化时，发生ALS。ALS的主要特性是丧失脊髓的运动神经元，导致在其控制下的肌肉变弱并且变得消耗导致麻痹。根据最初哪些肌肉变弱，ALS以不同的方式表现其自身。ALS发生在中年人中，其中男性比女性更多可能患上该疾病，是女性的1.5倍。诊断后5年内ALS通常是致命的。
ALS有家族性和偶发性的形式，并且现在已经使家族性的形式与几个独特的基因位点相联系。只有大约5-10％的ALS病例是家族性的。这些病例中，15-20％是由于编码Cu/Zn超氧化物歧化酶1(SOD1)的基因中的突变。这些似乎是赋予该酶有毒特性的″获得性的功能″突变。发现SOD突变作为ALS的原因已经为了解针对现有疾病的疾病动物模型中的一些进程铺平了道路，并且正在发展和测试关于导致细胞死亡的分子事件的假说。
下文提供了用脐血或脐血来源的干细胞治疗患有ALS的个体的实例方法。该方法包括通过外周的、临时的血管导管的静脉内输液。
最初通过进行标准的实验室分析评估患有ALS的个体。这种分析可包括代谢的图谱；伴有差示的CDC；脂类图；纤维蛋白原水平；血液的ABO rH分型；肝功能试验；和BUN/肌酸水平的测定。在移植前的当天指导个体摄取下列药物苯海拉明(BenadrylTM)，25mgt.i.d，和强的松，10mg。
从冷藏的原液解冻取出脐血或取出脐血来源的干细胞，并且在移植前在大约5℃的温度下维持大约2天。
在具有为静脉内输液、生理监护和物理观察所必须的所有设备的门诊患者临床中心进行个体的移植。在移植前大约1小时，个体接受苯海拉明(BenadrylTM)，25mg×1P.O.、和强的松，10mg×1P.O.。这是预防性的，是为了减少急性过敏反应的可能性。在输液的时候，将18G存在于外周的静脉线置入个体的四肢之一，并且通过以TKO速率输入D5生理盐水+20mEq KCl而保持开放的状态。在移植之前，检验个体，具体是注意心率、呼吸速率、体温。可进行其它的监测，例如心电图和血压测量。
然后以总计60ml液量、每小时1个单位的速率注入脐血或脐血来源的干细胞，其中1个单位是大约1-2×109个总的有核细胞。备选地，递送总液量为60ml的脐血或脐血来源的干细胞的单位。根据来自小鼠中的临床前研究的数据，每公斤体重应施用总共2.0-2.5×108个细胞。例如，70千克的个体可接受大约14-18×109个总的有核细胞。应监测该个体的过敏反应或超敏性的体征，这是立即终止输液的信号。
输液后，应监测斜卧位的个体至少60分钟，因此其可恢复正常的活动。
5.3实施例3用脐血或脐血来源的干细胞治疗患有动脉粥样硬化的个体在实施例2中列出的输液方法可用来将脐血或脐血来源的干细胞施用于患有动脉粥样硬化的患者。可将脐血或脐血来源的干细胞施用于无症状的个体、被候选进行血管成形术的个体、或最近(1周内)已经经受心脏手术的患者。
本发明不受限于在此所描述的具体实施方案的范围。实际上，除在此所描述的实施方案外，根据上述说明书本发明的各种改变对于本领域的技术人员来说是显而易见的。这种改变是属于所附的权利要求的范围内的。
在此引用的所有参考文献在此全部引入作为参考，为了所有的目的达到相同的程度，正如各个单独的出版物、专利、专利申请具体并且逐一地指明为所有目的全部引入作为参考。
引用任何出版物是为了引用在申请日之前的其所公开的内容，而不应认为是承认本发明由于在前发明的公开而不被授权。
权利要求
1.一种治疗有需要的患者的方法，包括施用包括脐血或脐血来源的干细胞的组合物，其中所述的施用递送至少5×109个总的有核细胞。
2.权利要求2的方法，其中脐血或脐血来源的干细胞适合于骨髓移植。
3.权利要求2的方法，其中脐血或脐血来源的干细胞适合施用于人。
4.权利要求2的方法，其中大量脐血来源的干细胞表达细胞表面标记CD34+和CD38-。
5.权利要求2的方法，其中大量脐带血干细胞表达细胞表面标记CD34+和CD38+。
6.权利要求2的方法，其中用生长因子处理脐血或脐血来源的干细胞。
7.权利要求6的方法，其中生长因子是细胞因子、淋巴激活素、干扰素、集落刺激因子(CSF)、干扰素、趋化因子、白细胞介素、人造血生长因子、造血生长因子配体、干细胞因子、血小板生成素(Tpo)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、白血病抑制因子、碱性成纤维细胞生长因子、胎盘来源的生长因子或表皮生长因子。
8.权利要求6的方法，其中用生长因子处理脐血或脐血来源的干细胞以诱导分化成为多种细胞类型。
9.权利要求6的方法，其中用生长因子处理脐血或脐血来源的干细胞以防止或抑制分化成为特定的细胞类型。
10.一种治疗脊髓发育不良的方法，其包括将脐血或脐血来源的干细胞施用于有需要的患者。
11.权利要求1的方法，其中所述的施用递送至少5×109个总的有核细胞。
12.权利要求1的方法，其中所述的施用递送至少10×109个总的有核细胞。
13.权利要求1的方法，其中所述的施用递送至少20×109个总的有核细胞。
14.权利要求1的方法，其中所述的患者患有包括炎症成分的疾病、紊乱或状况。
15.权利要求1的方法，其中所述的患者患有血管疾病、紊乱或状况。
16.权利要求15的方法，其中所述的疾病、紊乱或状况是动脉粥样硬化。
17.权利要求1的方法，其中所述的疾病、紊乱或状况是神经疾病、紊乱或状况。
18.权利要求17的方法，其中所述的疾病、紊乱或状况选自肌萎缩性侧索硬化和多发性硬化。
19.权利要求1的方法，其中所述的患者患有自身免疫紊乱。
20.权利要求19的方法，其中所述的自身免疫紊乱选自糖尿病和肌萎缩性侧索硬化。
21.权利要求1的方法，其中所述的状况由创伤或损伤造成或与创伤或损伤相关。
22.权利要求21的方法，其中所述的创伤或损伤是对中枢神经系统的创伤或损伤。
23.权利要求21的方法，其中所述的创伤或损伤是对周围神经系统的创伤或损伤。
24.权利要求1的方法，其中所述的至少5×109个总的有核细胞包括来源于多个供体的细胞。
25.权利要求1的方法，其中在所述的施用前，所述组合物中的所述细胞都没有进行HLA分型。
26.权利要求1的方法，其中在所述的施用前预调节所述的组合物18小时至21天。
27.权利要求1的方法，其中在所述的施用前预调节所述的组合物48小时至10天。
28.权利要求1的方法，其中在所述的施用前预调节所述的组合物3-5天。
全文摘要
本发明提供利用高剂量的脐血和脐血来源的干细胞来治疗多种状况、疾病和紊乱的方法。高剂量的脐血和脐血来源的干细胞具有许多用途和应用，包括但不限于，用于移植的治疗用途和疾病的治疗和预防、以及诊断和研究的用途。特别地，递送高剂量的，例如每次治疗递送至少30亿个有核细胞的脐血或脐血来源的干细胞，其中该治疗可包括单次或多次的输注。本发明也提供来自多个供体而不需要HLA分型的脐血或脐血来源的干细胞的用途。
文档编号A61K45/00GK1770976SQ200480009600
公开日2006年5月10日 申请日期2004年2月13日 优先权日2003年2月13日
发明者R·J·哈里里 申请人:人类起源公司