疫苗增进因子(vaf)可改善禽用疫苗的效能的制作方法

专利名称：疫苗增进因子(vaf)可改善禽用疫苗的效能的制作方法
技术领域：
本发明疫苗增进因子(VACCINE ACCELERATORFACTOR，VAF)是指禽用蛋内注射时，所添加于疫苗内的核酸分子，这些核酸分子可以是一种/或多种经过构筑的DNA分子，而每个分子则可含有一个/或多个基因或基因片段，这些基因片段可以在生物体内转录及转译成禽类病毒的抗原分子。这些VAF最好的应用时机，是在禽类受精卵孵化第17至19天时，以注射方式进入羊膜腔内，VAF可同时与禽用单价/或多价的活毒/或死毒疫苗共同使用。
背景技术：
疫苗注射对家畜禽及宠物的健康维护有极大的效益，其中家禽的疫苗有各种不同的施打路径。例如雏鸡孵化后以喷雾的方式免疫早已广泛使用，当然此法也可应用于大量施打成鸡的注射方式，活毒疫苗除了上述的投与方式之外尚有传统的方式，如皮下注射(SC)雏鸡点眼、点鼻的方式，甚至是饮水的方式也非常普遍。这些方式虽然施打方式较简便，但鸡只接种的成效不一。
近年来以蛋内接种的方式已有美国EMBREX公司所开发的INOVOJECT系统已上市并广泛使用，第一台蛋内注射机由美国EMBREX所开发并于80年代末期取得专利(USP号码5056464，5699751)美国白肉鸡以目前蛋内接种疫苗方式施打，马立克疫苗已经占了8成以上并已证实安全又有效，同时世界各地以蛋内注射鸡传染性华氏囊炎和新城鸡瘟疫苗的数量也逐年增加之中。
蛋内注射疫苗的细节请参阅Sharma等人的美国专利(US.Pat.No.4458630)特别是当马立克活毒疫苗打入孵化18.5日的受精蛋时，疫苗活毒被注入羊膜腔中，并在胚中增殖，并可诱发保护性抗体(参阅Sharma(1985)，Avian Disease.29，1155，1167-1168)。
目前全世界的禽用疫苗市场除了马立克之外(MDV)，尚有传染性华氏囊炎病毒(IBDV)，新城鸡瘟病毒(NDV)，传染性支气管炎病毒(IBV)，传染性喉头气管炎病毒(ILTV)，鸡脑脊髓炎病毒(AEV)，鸡传染性贫血因子病毒(CAV)，鸡痘病毒(FPV)，禽流感病毒(AIV)，里奥病毒，鸡白血病毒(ALV)，网状内皮炎病毒(REV)，禽腺病毒和出血性肠胃炎病毒(HEV)等等。这些传染病常因重大疫情报发造成巨大的损失，其中MDV，IBDV，NDV和IBV这些重要病毒则因其本质而特别重要。马立克病(MD)是一个恶性的淋巴球增殖异常疾病，只有禽类可自然感染。病原马立克病毒是疱疹病毒(herpesvirus)的一员，该病可严重影响全世界的家禽事业，特别是企业化经营的密饲大场更不可轻忽，马立克的症状广泛，包括神经系统、生殖器官、体内各脏器以及眼睛和皮肤等处发生病变。临床上可见，神经症状及因肿瘤而造成的脏器功能受损以及营养不良等。鸡只6周龄就可被感染，本病好发于12-24周龄。本病无治疗的方法，只能由饲养管理、隔离病原的方式或育种筛选较具抵抗力的种鸡以及疫苗接种等策略，然而以饲养管理要杜绝此病成本太高，筛选抗病鸡的成效不佳，因此，只有疫苗是防治马立克的唯一途径。
传染性华氏囊炎病毒是攻击雏鸡，并可导致免疫抑制的恶性传染病。(参阅Kibenge(1988)，J.Gen.Virol，691757-1775)强毒株可导致严重的免疫抑制并对鸡只的华氏囊及脾脏产生伤害，使得鸡只对其他病原的感受性提高以及对疫苗注射的成效不佳。
IBDV是属于双RNA病毒科(Birnaviridae)，其基因体含有二段双股RNA，(Dobos，et al.(1979)，J.Virol 32593-605)其中小一点的片段B(大约2.8kb)可编码为VP1，基因的位置可转译出RNA聚合酵素。大一点的片段A(大约3kb)可编码出一个110KDa大小的前驱蛋白物，这个单一的开放阅读架(ORF)将来可以形成成熟的VP2和VP3及VP4蛋白(参阅Azad，et.al，(1985)，Virology，14335-44)以及一个未知大小的17KDa的功能小蛋白VP5(参阅Kibenge et al(1991)，J.Gen.Virol.，71569-577)其中VP2和VP3是最重要的结构蛋白，特别是VP2是可以诱发中和抗体的主要抗原。(参阅Becht et al.(1988)J.Gen.Virol.，69631-640；Fahey et al.(1989)，J.Gen.Virol.，701473-1481)VP3则被视为具有群组特异性的抗原，因为抗VP3的单株抗体可以同时认识血清1型和血清2型的VP3。(参阅Becht et al.(1988)，J.Gen.Virol.，69631-6400)至于VP4，则是表现出切割酶，其功能和病毒前身蛋白的成熟过程相关。(参阅Jagadish et al.(1988)，J.Virol.，621084-1087)在过去，防治IBD的方式不外乎以减毒株的活毒疫苗施打雏鸡或以死毒(或活毒)疫苗施打母鸡，使母鸡具有高力价移形抗体以保护雏鸡。但近年来。，在美国陆续发生在已经免疫过活毒疫苗的鸡场中分离到IBD的强毒株的现象，使得活毒疫苗效果受到很大的质疑(参阅Snyder et al.(1988)，Avian Dis.，32535-539；Van der Marel et al.(1990)，Dtsch.Tierarztl.Wschr.，9781-83)过去针对IBD开发次单位疫苗的部份也已经有许多成果(参阅Azad et al(1985)″Virology″，14335-44)其中将IBD VP2基因选殖入酵母菌并加以表现以及以鸡痘病毒为载体，构筑重组的鸡痘病毒皆有报告(参阅Macreadie et al.(1990)，Vaccine，8549-552)。若鸡只以酵母表现的VP2进行免疫注射，其诱发的抗血清可以保护IBDV的攻击，但若以重组的鸡痘病毒加以免疫(参阅Bayliss et al.(1991)，Arch.Virol.，120193-205)，则可降低强毒株攻击的死亡率，但是强毒株对华氏囊所造成的伤害则无法避免。
新城鸡瘟病毒(NDV)是具有封套、线型、单股、无片段的负股RNA病毒。一般而言，负股RNA病毒且具有封套，大列可分为无片段型(如副黏液病毒paramyxovirus和弹状病毒Rhabdovirus)及有片段型(如正黏液病毒orthomyxovirus，布尼亚病毒和砂粒病毒等等)。至于新城鸡痘病毒，则和副流感病毒、仙台病毒、猴子第5型病毒以及腮腺炎病毒都是属于副黏液病毒科。
新城鸡瘟病毒的结构包含了一层源自细胞膜的双层脂质所构成的封套以及自封套延伸出去的醣蛋白-血凝素神经胺酶(HN)。这个蛋白质同时具有血凝和神经胺酶的活性。另一个重要的蛋白质一融合蛋白(F)则是与病毒套膜结合在一起蛋白质，其转译之初是呈不活化状态，必须经过转译后的切割才构成由双硫键结合的两个多肽。被致活的F蛋白和新城鸡瘟病毒穿透入细胞有关，因其藉由和宿主细胞膜与病毒封套的融合而进行。
另一个则是间质蛋白质(M)，这个蛋白质和病毒的组装有关，同时连结核鞘蛋白(NP)和病毒封套。新城鸡瘟病毒的核鞘蛋白(NP)是呈现螺旋对称，同时和磷蛋白(P)以及RNA聚合酶(L)相互连结。磷蛋白的主要功用是调节转录作用，以及参予甲基化作用以聚腺甘酸作用(poly A denylation)。至于L基因则是表现出RNA聚合酶，这个酵素和P蛋白共同参与了RNA的合成。而这个蛋白质是病毒的蛋白质中最大的，其基因占了几乎一半的病毒基因组，也在病毒的转录及转译过程扮演重要的角色，所有的负股RNA病毒包含NDV，其复制的过程都必须先将负股的基因体先转录成正股，否则无法转译出病毒蛋白，因此，一但进入细胞这个病毒并无法先制造出必要的RNA聚合酶，此时L.P.和NP蛋白必须先随着负股基因组一起进入细胞，不管是负股(病毒股)的RNA或正股的RNA都是由核鞘蛋白帮助包装起来。唯一没被包装起来的RNA是病毒mRNA。NDV病毒RNA是在细胞质进行复制，也是转录的地方，因此病毒在胞质进行复制及病毒颗粒组装，最后以出芽的方式(Budding)释放出去。
在美国专利第542779号之中Ahamad等人曾经以胚蛋白注射NDV，但由于所有的胚蛋对NDV都非常敏感而导致死亡，因此，必须把NDV以化合物EMS(ethyl methane sulfonte)加以处理过才不具胚致死性，但是EMS本身却是一种致突变剂，因此不能拿来作为常规的使用。
传染性支气管炎病毒(IBV)是属于冠状病毒科，这个病毒是单股、正股RNA，大小约20kb，病毒颗粒大小约80-100nm，外观上有一个大约20nm的突出物(称为棘突，spike)，IBV是导致急性高传染性的疾病，同时可引起呼吸生殖和泌尿道的病变，且不限鸡龄大小。IBV病毒包含了三个结构蛋白，棘突(S)醣蛋白，膜蛋白和核鞘蛋白。由于棘突蛋白自病毒的脂层向外突出时，其最外面的形状呈现泪滴样，目前的证据指出，该蛋白质是病毒具有高免疫性的蛋白质，这方面的证据除了源自其它的冠状病毒的研究结果之外，也有抗体中和试验的证据。(参阅D.Cavanagh et al.(1984)，Avian Pathology，13，573-583)棘突蛋白包含了二个次单元，S1(90KDa)和S2(84Kda)，当醣蛋白S1和S2结合一起时，由酵素先行去除掉寡糖类，最后分子量大约为125KDa。其中S2部分是和病毒套膜接触的部位。IBV普遍散布于密室的大养鸡场，4周龄的幼鸡感受性最强，一旦感染病毒后，二次细菌感染会使得患禽的感染率和死亡率皆高。
此外，受IBV感染的鸡只也会导致产蛋率下降或产生薄壳、变形、粗糙、软壳等不良的蛋导致严重的经济损失。
胚蛋注射活毒疫苗的好处包括快速(每小时打40000颗蛋)、有效(每颗蛋100％有注射疫苗)、省工(每个孵化场一年可节省10万美元)。近年来Embrex公司已经开发出一个病毒性活毒疫苗称为VNF(ViralNeutralijing Factor)。这个VNF疫苗包含了一种针对特定病毒的抗体。这个抗体和活毒疫苗有个特定的比率同时存在，使其先形成病毒一抗体的疫苗复合物(immune complex)。
由于抗体的数量不大，因此不会造成把病毒完全中和掉或针对该病毒产生了被动免疫的效能。此外，由于抗体的添加使得活毒在胚蛋内复制的时程晚了几天。
这样延迟病毒在鸡胚中复制的结果，使得活毒疫苗在胚蛋中使用更显安全。此外，不但可以克服移行抗体干扰；同时所产生的免疫效能高于传统的减毒疫苗。因此，病毒一抗体复合物疫苗技术不管施行于胚蛋注射或幼鸡免疫，其施行后所产生的免疫力较为一致，疫苗也安全且有效。
本发明的疫苗增进因子(VAF)是一段具免疫刺激能力的核酸片段，这样的DNA片段在使用上特别适合于禽类疫苗的使用。这样的疫苗增进因子不但可以和一般商用疫苗同时使用，也可以分开使用。而疫苗增进因子的内容物可以是包含了单一的基因片段，也可以是包含了多段基因连结一起的单一核酸分子，或多个分子使用前混合一起使用。
这些所谓的基因片段通常是指一些将来可以编码成病毒抗原蛋白的基因片段，这些抗原将来可以在禽类体内诱发出体液免疫和细胞性免疫。因此，在使用上可以在胚蛋内注射适量的VAF即可达到效果。虽然本发明的VAF可以和Embrex公司VNF产品具有相同的优点，(例如较传统疫苗较为安全及有效)但是和VNF使用抗体的方式截然不同。
更重要的是VAF可以促进免疫反应，其中包括抗体的生成细胞分泌，所伴随的T细胞活化以及毒杀型T细胞的致活等等。然而VNF不过是延迟正常疫苗在体内的复制而已。本发明的VAF将会使疫苗使用者在使用一般活毒疫苗时，具有更快速的免疫反应，而产制更高量的抗体。同时，VAF的使用也不会受到移行抗体的干扰。因此，总结来说，VAF不仅可以促进雏鸡孵化前的免疫能力，更可以长时期的增进鸡只健康并使成本降低。企业化养鸡一直是食物的重要来源，因此，把VAF的技术配合适当的免疫策略，将可有效降低因疾病感染而造成的损失。

发明内容
本发明疫苗增进因子(VAF)是一种核酸片段或任何含有DNA分子的免疫刺激物可以进行胚蛋注射。VAF是一个或多个经过构筑的DNA分子，每个DNA构筑物包含了一个载体和外源性DNA，而外源性DNA部份则最少包含一个(或以上)的禽类病毒的抗原性基因。
VAF可藉由所包含的基因或DNA片段而协助刺激以及增加禽类使用病毒性疫苗后，快速增进产生免疫保护效用。共有四种型态的VAF，第一种是包含了一个外源性DNA片段，这个片段是禽类病毒的一个抗原性基因。这一种型态的VAF会针对相同的禽类病毒所使用的疫苗产生增进及加强作用。第二种也是单一的DNA构筑分子，但不同的是这个构筑物内的病毒抗原基因片段有两个(或以上)，简言之，这个构筑分子本身是具有″多价″效用的VAF。这个VAF分子虽然只有一个载体分子，但由于其包含的病毒抗原基因有二段以上，因此，其所增进免疫效果的病毒疫苗也可以达到二种以上。第三种VAF是多重DNA VAF，这种型态的VAF，本身具有二种以上的不同DNA构筑分子，每个DNA构筑分子是由一个载体包含一段病毒抗原基因，因此这种多重DNA VAF因为含有多个构筑分子，因此可以增进多种禽类病毒的免疫效果，因此也是具有″多价″效用。
第四种VAF称为多重多价的VAF，这种VAF是前面第二及第三种VAF的综合体，即这种VAF本身具有多个不同的DNA构筑分子，而每个构筑分子又包含了多个病毒的抗原基因，因此，多重多价VAF最少可以增进三种以上不同禽类病毒性疫苗的免疫效果。多种型态的病毒性疫苗(不限于活毒、死毒或基因重组型)可以结合VAF的使用，这些疫苗可以同时或阶段性的和VAF一起使用，如果胚蛋注射VAF之后，后续的传统商用疫苗只要施5分之1剂量，就可以达到良好的效果，至于这个VAF构筑分子中的载体部份为一质体(plasmid)或一病毒载体。质体的例子包括，但是不限于，pcDNA3、pVAX1、pSectag、pTracer、pDisplay、pUC系统质体(例如pUC7、pUC8、pUC18)、与pGEM系统质体。或者，也可以使用含有一激活子(promoter)例如CMV激活子、SV40激活子、RSV激活子、和β-肌动蛋白激活子等的任何质体来制备DNA构筑物。例如质体pcDNA3。较佳的病毒载体为选自杆状病毒、疱疹病毒、和痘病毒所构成的群组之中。
禽类病毒的例子包括，但不限于，马立克病病毒(MDV)、传染性华氏囊病病毒(IBDV)、新城鸡瘟病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、禽类脑脊髓炎病毒(AEV)、禽类白血病病毒(ALV)、禽痘病毒(FPV)、禽类副黏病毒(APV)、鸭肝炎病毒(DHV)和出血性肠炎病毒(HEV)。
特别适合用来诱导保护性免疫反应以对抗上面所述禽类病毒疾病的DNA分子包括，但不限于，具有SEQ ID NO1的DNA序列的整个马立克病病毒(MDV)gB基因或其片段；具有SEQ ID NO2的DNA序列的整个传染性华氏囊病病毒(IBDV)VP2基因或其片段；具有SEQ ID NO3的DNA序列(其系自第6321至第8319碱基对)的整个新城鸡瘟病毒(NDV)HN基因或其片段(亦即SEQ ID NO3为新城鸡瘟病毒的整个基因组)；具有SEQ ID NO4的DNA序列的整个传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因或其片段；具有SEQ ID NO5的DNA序列的整个传染性喉气管炎病毒(ILTV)糖蛋白G基因或其片段；整个禽类脑脊髓炎病毒(AEV)VP1、VP0、或VP3基因或其片段(VP1基因具有SEQ ID NO6的DNA序列；VP0基因具有SEQ ID NO7的DNA序列；且VP3基因具有SEQ ID NO8的DNA序列)；具有SEQID NO9的DNA序列的整个禽类副流感病毒(APV)副糖蛋白G基因或其片段；具有SEQ ID NO10的DNA序列的整个出血性肠炎病毒(HEV)A型五角体基(penton base)基因或其片段；与具有SEQ IDNO11的DNA序列的整个禽痘病毒(FPV)鞘膜抗原基因或其片段。
VAF注射于禽蛋内较佳，尤其是于禽卵羊膜腔之内。该卵较佳者是经受精约17-19天。较佳的禽类包括鸡、火鸡、鸭和鹅。
本发明也提供一种接种疫苗于禽卵的方法。该接种疫苗于禽卵的方法包括于禽蛋内注射上述VAF。该制备该VAF的方法包括将一DNA分子黏接(ligating)到一质体或病毒载体以形成一DNA构筑物；及接着将该二或更多个该DNA构筑物混合形成VAF。将DNA分子插入于载体内的步骤可以用常用方法来达成，也就是，经由在基因和适合的载体都用相同的限制酶予以酶切以藉此产生互补的DNA末端之时，使用酵素例如T4DNA黏接酶(ligase)黏接DNA分子。对于pcDNA3，常用的限制酶为BamH1和EcoR1。
具体实施例方式
传统禽类疫苗包括经化学不活化的病毒疫苗或经修改的活病毒疫苗。不活化疫苗需要加添的免疫化处理，如此不仅制造起来昂贵且执行起来繁琐。再者，某些传染性病毒粒子可能在不活化程序后存活，且可能在施打到动物后引发疾病。
整体而言，经减毒的活病毒疫苗比经不活化的疫苗较适当，因为其可在诱发时通常同时以体液和细胞两种反应为基底的免疫反应。此等疫苗通常是经由将毒性病毒株连续通到组织培养中为基础。不过，减毒程序会诱导病毒基因组的突变，产生有关毒性和免疫性质互相异质的一族群病毒粒子。此外，熟知的，传统经减毒的活病毒疫苗可能回复毒性，而导致所接种的动物的疾病爆发，并有可能将病原散布到其它动物上。
鸡只孵化后的免疫计划包含了在不同时程施打不同的疫苗，期间从一日龄到65周龄都有。其中有许多疫苗必须重复施打，其原因有些是基于疫苗免疫活性的不同，有些则是在不同的阶段以不同的路径施打。
然而，正如同施打于幼雏动物一般，蛋内接种的疫苗种毒虽然已经被驯化为更加不具毒性以及更安全，但却也失去了具有快速刺激宿主产生保护性免疫反应的能力。这个问题通常和幼雏动物体内具有移行抗体有关，移行抗体会干扰高减毒株疫苗种毒在体内的复制。因此，越是彻底减毒的病毒株，在移行抗体存在之下，常有一些个体发生无法刺激免疫反应导致免疫无效的情事。
养鸡事业者都明白，鸡群普遍存在高量移行抗体的事实，也因为移行抗体的干扰，因此必须在雏鸡出后的几周内施打多次的疫苗。正常情况之下，在孵化后所使用的疫苗是高减毒株，孵化后两周到三周的鸡只是使用中等减毒株，这种方式的用意是希望在鸡只接触到病原之前的所有个体，最少有一次的免疫时间点是正确的。以这种方式进行免疫计画在养鸡事业已经施行多年，但是大家普遍认为还是会有一定比例的鸡只并没有合宜的受到免疫保护。特别是假如第二剂的免疫施打时机不对，特定鸡群中的移行抗体尚在、或是第二次免疫的投与或施打过程不确实或不一致时。
因此，使用VAF去刺激及增强疫苗的免疫效能对养鸡事业有极大的帮助，特别是将VAF施打于受精第17-19天的受精蛋。由于VAF包含了最少一个或一段可以在受精蛋内表现的禽类病毒的基因或DNA片段，因此，在受精蛋内注入VAF将会诱发针对禽类病毒的初级免疫。
同时，在使用VAF时，可以在一般疫苗使用前使用，也可以同时和一般禽类病毒并用，都会增进该病毒疫苗的免疫效能。特别是假若有合并使用VAF再加以免疫，其使用的疫苗剂量，可以减低至传统剂量的五分之一，就可以达到相同的免疫成效。更重要的，假如使用VAF，会缩短达成免疫效果的时间。
此外，有一些大家熟知的商用病毒性疫苗，如传染性支气管炎病毒和新城鸡瘟病毒疫苗，并不适用于胚蛋注射。其原因是传染性支气管炎病毒容易对鸡胚造成伤害，而，新城鸡瘟病毒疫苗则仅仅适用于肌肉注射。若使用针对该病的VAF分子在进行病毒疫苗注射，将会增进效能进而达到全面性的预防。
为了制备VAF的目的，各基因的DNA序列不需要含有编码该多肽链的DNA所具的全长。在大部分情况中，只要撷取抗原决定部位区的基因片段应该就足够供免疫反应所用。抗原决定部位区的DNA序列，可以经由将其它病毒株的对应部份予以定序且互相比较而找出。但是主要的抗原决定位可能为显示出最大异质性(heterology)的区块。此外，这些抗原决定部位区也可能由于蛋白质的构形结构不同而不同。一个或多个抗原决定位的基因片段可以经由化学合成或重组DNA技术予以制备。于需要时，此等基因片段可以键联在一起或联结到其它DNA分子。
此外，病毒基因不一定是DNA。事实上，某些常见的禽类病毒疾病是由双股或单股RNA病毒所引起的。例如，马立克病病毒(MDV)为一种双股DNA病毒，而传染性华氏囊病病毒(IBDV)、新城鸡瘟病毒(NDV)和传染性支气管炎病毒(IBV)都是RNA病毒。不过，RNA病毒序列可以使用反转录聚合酶连锁反应(RT-PCR)技术反转录到DNA内，接着以常用的重组DNA技术将其加到载体之内。
此外，因为遗传密码的转译多元性，可能会有许多RNA和DNA序列不同但是会转译为相同的胺基酸序列。因此，可表现出具有抗体结合特性的一多肽链的所有RNA和DNA序列都为本发明所涵盖。
要构成一个重组的VAF分子，不论单价或多价者，均可将病毒基因的DNA序列黏接到于自然界中不相关或联结的其它DNA分子。视需要可将一病毒基因的DNA序列黏接另一DNA分子，即一载体，该载体含有其编码融合蛋白质序列，例如β-半乳糖苷酶之DNA，产生所谓的重组核酸分子或DNA构筑物，其可用来转殖到适当的宿主。此种载体较佳的是衍生自，例如，质体或存在于噬菌体、黏接质体或病毒中的核酸序列。
可以用来选殖根据本发明的核酸序列的特定载体都是技艺中已知的且包括质体或病毒载体。质体的例子包括，但不限于，pBR322、pcDNA3、pVAX1、pSectag、pTracer、pDisplay、pUC系统质体(例如pUC7、pUC8、pUC18)、pGEM系统质体、Bluescript质体或有包括CMV激活子、SV40激活子、RSV激活子、和β-肌动蛋白激活子等的任何其它质体。例如质体pcDNA3。病毒载体的例子包括，但不限于，噬菌体(例如，λ和M13-衍生的噬菌体)、SV40、腺病毒、多瘤病毒(polyoma)、杆状病毒、疱疹病毒(HVT)或痘病毒(例如禽痘病毒)。
构成一重组核酸分子所用的方法都是谙于此技者所知悉的。例如，核酸序列在一选殖载体中的插入，可以在基因和适合的选殖载体都用相同的限制酶予以酶切，以藉此产生互补的DNA末端时，经由使用酵素例如T4DNA聚合酶黏接而容易地达成。
或者，可能需要改变限制酶切部位来产生钝端(blunt end)，可经由酶切单股DNA或经由使用恰当的DNA聚合酶填满隐性末端而达成。随后，可以使用酵素例如T4DNA黏接酶进行钝端黏接。于需要时，可以经由将黏接臂黏接到DNA末端之上而产生任何限制酶切部位。此等黏接臂可包括编码限制酶切部位序列的特定寡核苷酸序列。经限制酶酶切过的载体和核酸序列也可经由均聚物加尾(homopolymeric tailing)予以改变。
本发明共有四种型态的VAF，第一种VAF是包含了单一个DNA构筑分子(又称为单价VAF)，这个构筑分子包含了一段DNA分子片段和载体分子，DNA分子片段可以是禽类病毒的一个抗原性基因或一部分片段，将来可编码出抗原多肽，将来可诱发出保护性免疫效果。这一种型态的VAF会针对相同的禽类病毒所使用的疫苗产生增进及加强作用。第二种VAF则是包含了数个(两个或更多)的单价VAF，即每个VAF携带了不同的DNA分子，可对抗不同的病毒。
第三种VAF，则是单一的DNA构筑分子，但不同的是这个构筑物内的病毒抗原基因片段有两个(或以上)并连接在一起，简而言之，这个构筑分子本身是具有″多价″效用的VAF(或称之多价的重组VAF)。这些基因或基因片段可经由一个质体分子或病毒所携带。这个多价的重组VAF因为可以编码出两种或两种以上的抗原多肽，因此可以提供最少两种以上病毒的保护作用。这些禽类病毒的例子包括，但不限于，马立克病病毒(MDV)、传染性华氏囊病病毒(IBDV)、新城鸡瘟病毒(NDV)和传染性支气管炎病毒(IBV)。由于这些基因或基因片段是正确的塞入载体同时符合氨基酸编码的阅读价，因此都可以正确的在宿主内表达出来。
不同的结构DNA分子被载体所携带时，可以是分别具有基因的终点序列和起始序列，如此则蛋白质是被分开表现，或者是他们可以是同一个开放阅读架的一部分，如此则被表现的蛋白是以融合蛋白的形式呈现。第四种VAF则是将单价的VAF和多价VAF混合后一起使用。
这些基因片段可以源自下列，但是不限为这些，的病毒马立克病病毒(MDV)、传染性华氏囊病病毒(IBDV)、新城鸡瘟病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、禽脑脊髓炎病毒(AEV)、禽痘病毒(FPV)、禽流感病毒(AIV)、禽白血病病毒(ALV)、鸭肝炎病毒B基因和出血性肠炎病毒(HEV)，并插入在一商业上可取得的质体。
较佳的DNA序列包括，但不限于，具有SEQ ID NO1的DNA序列的整个马立克病病毒(MDV)gB基因或其片段；具有SEQ IDNO2的DNA序列的整个传染性华氏囊病病毒(IBDV)VP2基因或其片段；具有SEQ ID NO3的DNA序列的整个新城鸡瘟病毒(NDV)HN基因或其片段；具有SEQ ID NO4的DNA序列的整个传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因或其片段。
编码马立克病病毒的gB多肽链的DNA序列具有SEQ ID NO1的核酸序列。该DNA序列包含3650个碱基对的线型DNA。
编码传染性华氏囊病病毒的VP2多肽链的DNA序列具有SEQID NO1的核酸序列。该DNA序列包含3004碱基对的线型DNA分子，其是由传染性华氏囊病病毒的RNA模板反转录而来。
整个新城鸡瘟病毒基因组的DNA序列包含15186碱基对的DNA其中(1)第56至1792碱基对是编码NP多肽链，其为一核壳体蛋白；(2)第1804-3244碱基对是编码P多肽链，其为一磷蛋白；(3)第3256-4487碱基对是编码M多肽链，其为一基质蛋白；(4)第4498-6279碱基对是编码F多肽链，其为一融合蛋白质；(5)第6321-8319碱基对是编码HN多肽链，其为血球凝集素神经胺酸酶；(6)第8370-15073碱基对是编码L多肽链，其为一大的聚合酶蛋白质。新城鸡瘟病毒基因组具有SEQ ID NO3的DNA序列。
S1多肽链的DNA序列含有如SEQ ID NO4所示1611个碱基对线型DNA序列，其是从传染性支气管炎病毒的RNA模板反转录而得。
VAF下面的实验设计为示范说明，而不用来限制本发明的范围。其中可做出合理的变异，例如合理技术操作所发生的，不违离本发明的范围。
I.材料与方法(A)病毒与疫苗禽类传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性华氏囊病(IBD)和新城鸡瘟病(ND)疫苗都购自Intervet Inc.。
(B)病毒RNA分离与反转录聚合酶连锁反应(RT-PCR)将200微升回收的减毒疫苗(Intervet Inc.)于冰冷的GTC缓冲液(4M异硫氰酸胍，25mM柠檬酸钠，pH7.0，0.5％Sarkosyl，0.1M氢硫基乙醇)和醋酸钠(pH4)之中再溶解。加入等体积的苯酚-氯仿(1∶1)于震荡之后静置于冰上15分钟。于离心之后收集水层且使用等体积的异丙醇沉淀出RNA。在4℃下以12,000rpm离心20分钟将沉淀的RNA分离出，然后悬浮在经焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的去离子水之内且贮存在-70℃。
(C)寡核苷酸反转录聚合酶连锁反应所用的寡核苷酸引子(primer)都是购自Promega，且都是分别针对禽类传染性支气管炎病毒(Beaudette CK株)、新城鸡瘟病毒(Lasota株)和禽类传染性华氏囊病病毒的基因组而设计。PCR所用的各引子的序列为IBS1F′5’CGGGATCCGCCGCCGCCATGTTGGTAACACCTCTT 3′；(SEQ ID NO12)IBS1R′5’CGGAATTCTTAACGTCTAAAACGACGTGT 3′；(SEQ ID NO13)NDF F′5’CGGGATCCGCCGCCGCCATGGGCTCCAGACCTTCTACC 3′；(SEQ ID NO14)NDF R′5’CCGCTCGAGTTACATTTTTGTAGTGGCTCTCATT 3′；(SEQ ID NO15)NDHN F′5’CGGGATCCGCCGCCGCCATGGACCGCGCCGTTAGGCAAG 3′；(SEQ IDNO16)NDHN R′5’GCTCTAGATTACTCAACTAGCCAGACCTG 3′；(SEQ ID NO17)IBDVP2F′5’CGGGATCCGCCGCCGCCATGACAAACCTGCAAGAT 3′；(SEQ ID NO18)IBDVP2R′5’CGGAATTCTTACCTTATGGCCCGGATTAT 3′；(SEQ ID NO19)(D)反转录聚合酶连锁反应(RT-PCR)传染性支气管炎病毒、新城鸡瘟病和传染性华氏囊病病毒的RNA的反转录是在42℃于2.5倍Taq缓冲液(200mM NaCl，15mMTris-HCl，pH7.4，15mM MgCl2，15mM β-氢硫基乙醇，和各0.25mM的dATP、dCTP、dGTP，和dTTP)中进行30分钟。除了Taq缓冲液之外，反应混合物(40微升)也含有病毒RNA，2.4U的禽类骨髓母细胞瘤病毒(AMV)反转录酶(Promega)，16U的RNasin(Promega)，和0.01奈莫耳(nmol)的反向引子(IBDVP2R、NDF F、NDHN F或IBS1R)。反应混合物的最后体积为40微升。于反转录之后，于反转录混合物中加入下列药剂0.02奈莫耳的各核苷三磷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)，0.01奈莫耳的前向引子(IBDVP2F、NDF R、NDHN R或IBS1F)和1.5U的Taq DNA聚合酶(Strategene)。然后加水到100微升的最后体积。反应是在一温度循环器(PerkinElmer-Cetus)内进行32个循环。每一PCR循环包括在94℃下变性(denaturation)1分钟，在57℃下炼合(annealing)1分钟，与在72℃下DNA链延长(elongation)2分钟。
(E)DNA的构筑使用分别得自传染性华氏囊病毒疫苗、传染性支气管炎病毒疫苗和新城鸡瘟病毒疫苗的VP2、S1、NDF和NDHN等基因构成质体pCMV-VP2、pCMV-S、pCMV-NDF和pCMV-NDHN，放置于市售质体pcDNA3(Invitrogen，U.S.A.)的下游处。使用限制酶BamH1、EcoR1、XbaI和XhoI将所有的基因插入到pcDNA3载体之内(引子序列中底下划线的字母)。在pcDNA3载体内的所有基因的序列都经由在两方向定序予以验证。
(F)DNA的制备和DNA的施打经由亲和层析法(Qiagen.Inc.)纯化出的质体DNA的定量是以波长为260和280奈米的分光光度计测量。将各100微克分量的DNA悬浮在100微升PBS中(0.14M氯化钠，10mM磷酸钠，pH7.4)。对于DNA传递，是使用含有20号1又1/2时针头的1cc注射筒。对于蛋内注射组，是从每一蛋的钝端用针头穿透气室将0.1毫升的DNA疫苗(100微克)注射到胚胎内(取自鸡窝盘18天大的受精且发育中的卵)。然后将该卵转移到孵化场，且放在该处直到在约21天大时孵化为止。对于IM(肌肉内)组，所有疫苗(1/5剂量的活疫苗)是在孵化后10天注射到鸡的胸肉内。
II.实验设计将无特定病原(SPF)受精蛋(n＝60)随机分成12组。所有组的所有蛋(一组5颗蛋)都分别给予100微升体积的试剂。于A组的每一颗蛋注射100微克pCMV-NDF+100微克pCMV-NDHN混合物，于B组的每一颗蛋注射100微克pCMV-S1，于C组的每一颗蛋注射100微克pCMV-VP2，于D组的每一颗蛋注射100微克pCMV-NDF+100微克pCMV-NDHN+100微克pCMV-S1(ND+IB)，于E组的每一颗蛋注射100微克pCMV-NDF+100微克pCMV-NDHN+100微克pCMV-VP2(ND+IBD)，于F组的每一颗蛋注射100微克pCMV-VP2+100微克pCMV-VP2混合物(IB+IBD)，于G组的每一颗蛋注射100微克pCMV-NDF+100微克pCMV-NDHN+100微克pCMV-S1+100微克pCMV-VP2(ND+IB+IBD)，于作为对照组的H组的每一颗蛋注射1剂量的市售蛋内IBD疫苗(Embrex，Inc)，于I、J、K和L组的每一颗蛋注射100微升的PBS。于此实验中的所有鸡都是在孵化后10天时于鸡的胸肉内注射100微升体积的疫苗(1/5剂量的活疫苗)。A和I组中的鸡是注射NDV疫苗，B和J组是注射IBV疫苗，C和K组是注射IBDV疫苗，D组是注射NDV+IB疫苗混合物，E组是注射NDV+IBD疫苗混合物，F组是注射IB+IBD疫苗混合物，且G和L组是注射NDV、IB和IBD疫苗混合物。
III.人工胚蛋注射的操作步骤胚蛋注射的方式可以用自动注射器进行(如EmbrexInovojectsystem)或人工施打进行。人工胚蛋注射的操作步骤如下1.以烛光挑选并抛弃未受精蛋、受污染蛋、颠倒蛋以及脏污的受精蛋，以避免胚蛋注射时受到细菌污染。
2.将含有气室的一端以稀释的漂白水加以消毒(以蒸馏水将漂白水10倍稀释，使次氯酸的最终浓度为0.5％)最好是使用前才新鲜配置消毒水，以棉花球沾湿消毒水，将受精蛋含有气室的一端进行涂抹消毒，碘酊可以做为消毒剂的替代品，蛋消毒能力不及次氯酸水，但是假若胚蛋都很干净，则不一定要用漂白水。
3.当受精蛋顶端表面干了之后(大约5分钟)，蛋体的表面(特别是顶端)喷洒70％异丙醇，待其再次风干之后，以1时半长的18号针头，在气室顶端正中央挖一个洞，其挖掘的深度以4分之1时至2分之1时为限，深度的控制可藉由在距离该针头尖端的适当位置，以橡胶物做为阻挡，以避免因为挖掘过深而伤害到胚胎。这个小洞是用以注射疫苗或VAF之用，注射时必须保持针的方向要垂直刺入及拔出，不能有任何角度的倾斜，必须照此操作才不会伤害鸡胚，以利正常孵化。
4.注射VAF时，最好使用1ml的小针筒，针头的使用必须以20号、一时长的针头为限，若是注射多价或多重多价VAF，必须注意混合各DNA分子时，保持无菌操作。VAF是否保持无菌状态，可以将0.5mlVAF样品注入一般惯用的细菌培养皿，如血液培养皿或胰豆蛋白培养皿，并加以培养，以确认其呈无菌状态。
5.若以胚蛋注射一般商用活毒疫苗，则必须施打0.1ml，但若与VAF合用，则可以用少量(可减少到20微升)的疫苗就可达到相同的免疫功效。
IV.血清学检测于孵化后10天(同时注射低剂量活疫苗)、17天、24天和31天收集所有血清样品。抗体效价的检测是使用购自IDEXX Laboratories，Inc.的IBV、IBDV和NDV抗体检验套组以ELISA检测。所有样品都以二重复检测。于检定之前使用样品稀释剂将检验样品稀释500倍(1∶500)。根据套组的手册施以检验程序。为了使检测正确，测量且记录在波长650奈米的吸光值，A(650)。未知样中的相对抗体含量是经由计算样品对阳性样(S/P)比例而测定出的。终点效价是使用公式Log10效价＝1.09(Log10S/P)+3.36计算出。
V.结果如表1中所示，结果证实，对于抗传染性华氏囊病抗体的检测，传染性华氏囊病毒重组抗原VP2 VP2 DNA construct(ie.，a single，monovalent DNA contruct-containing VAF)在原发刺激后可被表现且作用。在一低剂量疫苗追加之后效价迅速增加。在孵化17天之后(即，IM注射后7天)，C、E、F和G等组的效价明显地高于K和L组的效价。最重要的是，传染性华氏囊病毒抗原的表现不会受其它单价DNA疫苗(新城鸡瘟病毒和传染性支气管炎病毒)所干扰。对于传染性支气管炎和新城鸡瘟病毒DNA疫苗也有相同的结果。孵化后17天，B、D、F和G等组的效价都高于J和L组的效价(表2)且孵化后17天，A、D、E和G等组的效价都高于I和L组的效价(表3)。唯一未预料到的结果为抗新城鸡瘟病毒效价不能用三价DNA疫苗予以高度诱导出(表3，G组)，不过抗传染性华氏囊病和抗传染性支气管炎则都可以(表1和2，G组)。
表1

*PH孵化后**---低于396的平均效价(可视为IDEXX套组的阴性者)表2


*PH孵化后**---低于396的平均效价(可视为IDEXX套组的阴性者)表3

*PH孵化后**---低于396的平均效价(可视为IDEXX套组的阴性者)本发明以实际例子进行具体论述，但必须了解本发明的涵盖范围非以该项实例为限，相对的，是包括了所述各个技术层面的修饰。因此，专利的权利范围倾向于广泛的解释，并包括了各种修饰。
序列表<110>KUO，Tsun Yuang<120>VACCINE ACCELERATOR FACTOR(VAF)FOR IMPROVEMENT OF VACCINATIONS INPOULTRY<130>39734-186920<160>19<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>3650<212>DNA<213>Marek′s disease virus<400>1tcgagctcgc cggggatgtt tagtcacgat agacatcggt tcgcccagcc gtcgaataca 60gcattatatt ttagtgttga aaatgtaggg ctgcttcctc acttaaagga ggaaatggct 120cgattcatgt ttcatagcag tagaaaaaca gattggaccg tcagtaagtt tagagggttt 180tatgacttta gcactataga taatgtaact gcggcccatc gcatggcttg gaaatatatc 240aaagaactga tttttgcaac agctttattt tcttctgtat ttaaatgtgg cgaattgcac 300atctgtcgtg ccgacagttt gcagatcaac agcaatggag actatgtatg gaaaaatgga 360atatatataa catatgaaac cgaatatcca cttataatga ttctggggtc agaatcaagc 420acttcagaaa cgcaaaatat gactgcaatt attgatacag atgttttttc gttgctttat 480tctattttgc agtatatggc ccccgttacg gcagatcagg tgcgagtaga acagattacc 540aacagccacg cccccatctg acccgtccaa tattcttgtg tccctgcatt ttatctcaca 600caatttatga acagcatcat taagatcatc tcactatgca ctattttagg cggaattgca 660tttttttcct tatagttatt ctatatggta cgaactcatc tccgagtacc caaaatgtga 720catcaagaga agttgtttcg agcgtccagt tgtctgagga agagtctacg ttttatcttt 780gtcccccacc agtgggttca accgtgatcc gtctagaacc gccgcgaaaa tgtcccgaac 840ctagaaaagc caccgagtgg ggtgaaggaa tcgcgatatt atttaaagag aatatcagtc 900catataaatt taaagtgacg ctttattata aaaatatcat tcagacgacg acatggacgg 960ggacgacata tagacagatc actaatcgat atacagatag gacgcccgtt tccattgaag 1020agatcacgga tctaatcgac ggcaaaggaa gatgctcatc taaagcaaga taccttagaa 1080acaatgtata tgttgaagcg tttgacaggg atgcgggaga aaaacaagta cttctaaaac 1140catcaaaatt caacacgccc gaatctaggg catggcacac gactaatgag acgtataccg 1200tgtggggatc accatggata tatcgaacgg gaacctccgt caattgtata gtagaggaaa 1260tggatgcccg ctctgtgttt ccgtattcat attttgcaat ggccaatggc gacatcgcga 1320acatatctcc attttatggt ctatccccac cagaggctgc cgcagaaccc atgggatatc 1380cccaggataa tttcaaacaa ctagatagct atttttcaat ggatttggac aagcgtcgaa 1440aagcaagcct tccagtcaag cgtaactttc tcatcacatc acacttcaca gttgggtggg 1500actgggctcc aaaaactact cgtgtatgtt caatgactaa gtggaaagag gtgactgaaa 1560tgttgcgtgc aacagttaat gggagataca gatttatggc ccgtgaactt tcggcaacgt 1620ttatcagtaa tacgactgag tttgatccaa atcgcatcat attaggacaa tgtattaaac 1680
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权利要求
1.一种用于蛋内注射的疫苗增进因子，包括一或更多DNA构筑分子，每个DNA构筑分子包含了一个DNA分子和载体，每一个DNA分子包含了最少一个基因或基因片段，这些基因或基因片段可以分别编码出禽类病毒具抗原性的多胜肽，因此疫苗增进因子，可刺激该病毒疫苗的免疫保护效果。
2.如权利要求1所述的疫苗增进因子，这个疫苗增进因子，包含一个DNA构筑物，所谓DNA构筑物中的DNA分子包含了一个基因或基因片段。
3.如权利要求1所述的疫苗增进因子，这个疫苗增进因子，包含一个DNA构筑物，所谓DNA构筑物中的DNA分子包含了超过一个基因或基因片段。
4.如权利要求1所述的疫苗增进因子，这个疫苗增进因子，包含超过一个DNA构筑物，所谓DNA构筑物中的DNA分子包含了一个基因或基因片段。
5.如权利要求1所述的疫苗增进因子，这个疫苗增进因子，包含超过一个DNA构筑物，所谓DNA构筑物中的DNA分子包含了一个或二个或二个以上的基因或基因片段。
6.如权利要求1所述的疫苗增进因子，该禽类病毒是选自马立克病病毒(MDV)、传染性华氏囊病病毒(IBDV)、新城鸡瘟病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、禽脑脊髓炎病毒(AEV)、禽白血病病毒(ALV)、禽痘病毒(FPV)、禽副黏病毒(APV)、鸭肝炎病毒(DHV)、和出血性肠炎病毒(HEV)所构成的群组之中。
7.如权利要求1所述的疫苗增进因子，其中该载体为一质体或一病毒载体。
8.如权利要求7所述的疫苗增进因子，其中该质体是选自pcDNA3、pVAX1、pSectag、pTracer、pDisplay、pUC系统质体与pGEM系统质体所构成的群组之中。
9.如权利要求8所述的疫苗增进因子，其中该质体包括一激活子，该激活子是选自CMV激活子、SV40激活子、RSV激活子和β-肌动蛋白激活子所构成的群组之中。
10.如权利要求7所述的疫苗增进因子，其中该病毒载体包括但不限于，噬菌体、SV40、腺病毒、多瘤病毒(polyoma)、杆状病毒、疱疹病毒(HVT)或痘病毒(例如禽痘病毒)所构成的群组之中。
11.如权利要求1所述的疫苗增进因子，其中该DNA分子为具有SEQ ID NO1的DNA序列的整个马立克病病毒(MDV)gB基因或其片段。
12.如权利要求1所述的疫苗增进因子，其中该DNA分子为具有SEQ ID NO2的DNA序列的整个传染性华氏囊病病毒(IBDV)VP2基因或其片段。
13.如权利要求1所述的疫苗增进因子，其中该DNA分子为具有SEQ ID NO3中自第6321至8319碱基对的DNA序列的整个新城鸡瘟病毒(NDV)HN基因或其片段。
14.如权利要求2所述的疫苗增进因子，其中该DNA分子为具有SEQ ID NO4的DNA序列的整个传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因或其片段。
15.如权利要求1所述的疫苗增进因子，其中该DNA分子为具有SEQ ID NO5的DNA序列的整个传染性喉气管炎病毒(ILTV)糖蛋白G基因或其片段。
16.如权利要求1所述的疫苗增进因子，其中该DNA分子为整个禽类脑脊髓炎病毒(AEV)VP1、VP0、或VP3基因或其片段；其中该VP1基因具有SEQ ID NO6的DNA序列；该VP0基因具有SEQ IDNO7的DNA序列；且该VP3基因具有SEQ ID NO8的DNA序列。
17.如权利要求1所述的疫苗增进因子，其中该DNA分子为具有SEQ ID NO9的DNA序列的整个禽类副流感病毒(APV)副糖蛋白G基因或其片段。
18.如权利要求1所述的疫苗增进因子，其中该DNA分子为具有SEQ ID NO10的DNA序列的整个出血性肠炎病毒(HEV)A型五角体基(penton base)基因或其片段。
19.如权利要求1所述的疫苗增进因子，其中该DNA分子为与具有SEQ ID NO11的DNA序列的整个禽痘病毒(FPV)鞘膜抗原基因或其片段。
20.如权利要求1所述的疫苗增进因子，所谓的疫苗增进因子是注射入禽类的胚蛋之中。
21.如权利要求20所述的疫苗增进因子，所谓的疫苗增进因子是注射入胚蛋的羊膜腔内。
22.如权利要求20所述的疫苗增进因子，所谓的疫苗增进因子可和病毒疫苗同时注射胚蛋。
23.如权利要求20所述的疫苗增进因子，所谓的疫苗增进因子可在病毒疫苗使用前注射胚蛋。
24.如权利要求16所述的疫苗增进因子，其中该胚蛋是经受精约17-19天。
25.如权利要求1所述的疫苗增进因子，所谓病毒疫苗可以是禽类减毒的活毒疫苗，不活化疫苗或基因重组的DNA疫苗所构成的群组之中。
26.如权利要求23所述的疫苗增进因子，所谓病毒疫苗可以是使用于禽类孵化时以及孵化后。
27.如权利要求26所述的疫苗增进因子，于禽类病毒性疫苗的使用，可使用建议剂量的5分之1。
28.如权利要求20所述的疫苗增进因子，其中该禽类是选自鸡、火鸡、鸭和鹅所构成的群组之中。
29.针对禽类病毒性感染的免疫方法，包括根据如权利要求1所述的疫苗增进因子以有效剂量与病毒疫苗合并使用，注入胚蛋中的羊膜腔内。
30.如权利要求29所述的方法，其中该胚蛋是经受精约17-19天。
31.针对禽类病毒性感染的免疫方法，包括如权利要求1所述的疫苗增进因子以有效剂量注入受精约17-19天的胚蛋羊膜腔内，并于孵化后进行病毒疫苗免疫的方法。
全文摘要
本发明提供了一个疫苗增进因子(VAF)，这个疫苗增进因子是一种适用于蛋内接种的核甘酸免疫刺激物。VAF可以是一个或多个不同的DNA构筑分子，每一个构筑分子包含了一个DNA分子和载体，每一个DNA分子包含了一个或多个基因或基因片段，这些基因或基因片段可以分别编码出禽类病毒具抗原性的多生肽。VAF的使用时机最好是在受精后第17－19天(以鸡为例)，注入部位是位于鸡胚的羊膜腔内。VAF可以和一般病毒性疫苗合并使用，不管是单价或多价，还是活毒或死毒。另外，VAF可以使用在一般病毒疫苗的使用之前，这些病毒疫苗通常是在雏鸡孵化时或孵化后，而VAF可以刺激并且增进该病毒性疫苗的免疫效用。
文档编号A61K35/76GK1777448SQ200480010453
公开日2006年5月24日 申请日期2004年5月6日 优先权日2003年5月6日
发明者郭村勇 申请人:施怀哲股份有限公司